DK149754B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af et dermorphinanalogt tetra-, penta-, hexa- eller heptapeptidderivat eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf - Google Patents

Description

o 1 149754

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangs-måde til fremstilling af hidtil ukendte dermorphinana-loge tetra-, penta-, hexa- eller heptapeptider og deres farmaceutisk acceptable salte. Disse forbindelser har kraftig 5 virkning på centralnervesystemet og udviser specielt gunstig analgetisk virkning og er derfor anvendelige i sådanne terapeutiske midler.

De ifølge opfindelsen fremstillede peptidderivater har den almene formel 10 Y

X - Tyr - A - Phe - B - C - W (I) hvori Y er hydrogen eller benzyl, A er en D-aminosyrerest valgt blandt D-alanin, D-methionin og D-methioninsulfoxid, 15 B er en glycin-, en sarcosin-, en L-N-methylphenylalanin-, en phenylalanin- eller en prolinrest, C kan være tilstedeværende eller fraværende, og såfremt den er til stede, er C en aminosyrerest valgt blandt L-tyrosin, D-tyrosin, L-leucin, L-methionin, L-methioninsulfoxid, L-prolin, 20 L-serin og L-norvalin eller et dipeptid valgt blandt (O-benzyl)-L-tyrosyl-L-propyl, L-tyrosyl-L-prolyl, L-tyro-syl-L-seryl og L-prolyl-L-seryl eller en tripeptidrest valgt blandt L-tyrosyl-L-prolyl-L-seryl, (0-benzyl)-L-tyrosyl--L-prolyl-L-seryl, L-tyrosyl-L-3- eller -4-hydroxy-prolyl-25 -L-seryl, (0-benzyl)-L-tyrosyl-L-3- eller -4-hydroxy-prolyl-L-seryl, (0-benzyl)-L-tyrosyl-L-3- eller -4-hy-droxyprolyl-(0-benzyl)-L-seryl, L-tyrosyl-L-valyl-L-seryl, L-tyrosylglycyl-L-seryl, L-phenylalanyl-L-3- eller -4-hy-droxyprolyl-L-seryl, L-tryptophyl-L-prolyl-L-seryl, 30 L-phenylalanyl-L-prolyl-L-seryl, L-phenylalanyl-L-3- eller -4-hydroxyprolyl-(0-benzyl)-L-seryl, glycyl-L-prolyl--L-seryl, L-tyrosyl-L-pipecolyl-L-seryl, L-tyrosyl-L--thiazolidyl-4-carbonyl-L-seryl, L-tyrosyl-L-3,4-dehy-droprolyl-L-seryl, L-tyrosyl-D-3,4-dehydroprolyl-L-seryl, 35 L-tyrosyl-L-prolyl-L-a-aminobutyryl, L-tyrosyl-L-prolyl- 2 149754 o glycyl, (O-benzyl)-L-tyrosyl-L-prolyl-(O-benzyl)-L-seryl, . L-tyrosyl-L-prolyl-(O-benzyl)-L-seryl og (4-nitro)-L- -phenylalanyl-L-prolyl-L-seryl, og W er OH, OR, NH2, NHR, NHNH2 eller NHNHR', hvori R er C-^-alkyl, adaman-5 tyl eller 2,2,2-trifluorethyl, og R' er benzyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, tert.butyloxycarbony1, butyryl, lauryl, benzoyl, D-tyrosyl eller phenyl, eller er et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

Fra beskrivelserne til fire tilgængelige danske an-10 søgninger nr. 331/77, 1580/77, 4347/78 og 1782/79 kendes beslægtede peptider med enkephalin-struktur. I modsætning hertil er de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser dermorphinanaloge peptidderivater og udgør som sådanne en helt ny klasse peptider, der nu har vist sig at have opioid 15 aktivitet. De fra ovennævnte danske ansøgninger, kendte forbindelser er derimod enkephalin-lignende peptider. Disse udviser således altid en glycingruppe (Gly) i 3-stillingen regnet fra peptidkædens N-ende. Dette er ikke tilfældet med de ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede for-20 bindeiser med den almene formel I, hvoraf tydeligt ses, at den fremstillede peptidsekvens altid indeholder en phenyl-alaningruppe (Phe) i 3-stillingen regnet på samme måde.

Til tydeliggørelse af disse forhold tjener den følgende oversigtstabel over de typer af forbindelser, som frem-25 stilles ifølge de nævnte danske patentansøgninger, idet der herfra er udvalgt sæt af strukturelt tilsvarende forbindelser. Denne tabel indeholder tillige de tilsvarende referencestandardforbindelser, som er benyttet i de hermed nedenfor anførte sammenligningsforsøg over biologisk ak-30 tivitet, nemlig CNS virkning og specielt analgesis.

35 3 149754

Si 0) β & tj> I Λ τ3 ° — σ' . _.

3 υ O' ^ Η ίΊ >(Γ» · · · χ m σι Μ·-* μ · Μ · y · ft Η β fito G W G Μ <υ - . . μ μ .¾ υχ Ο · 03 · β · 0) · 0) G Φ * Ο -> mX α ω ω

0) ιβ ιο ·Η ο β β βΙ β I G I

μ βΗ |5(Ν β β β «* β Η ιη · · - · r~ · αο · σι m G η p γ* ρ £- Pr- Ρ r* β ,¾ β -Η Ο β Γ" β\ β\ β \ (¾ ofl ·> ft\ ft° ftt" ft 01 μ -H > · Γ' · H *00 · -ri* · oo β ω tl x! co ^ m a m Kci Kf'

S rtj &H p ro q H Q'tf Q H

G β •H ,¾ i—! β β W β Λ I Ό Οι -Ρ -Η β mg β χ s (3

> G I

-β Η CM β I I I J

13 I β ·Η I I I 1

LO r-1 pH

β ril β

·· β I P

β PI P 04 β --------r P H J- m y β a 1 p a a a \ / m o a o 's trJ ^ p g ii i i g ™ β -H s a P Η β P >1 β 1 § tpH tn β β Η β ·~· ®

®-Η p s o P © S

HP e , mm li i i g i β "" η -η βββ βββ

** A A , A A A A

ιβΌ ft ft ft ft ft ft β β g g i i__I__I__I__1 J-| · >1 >t >t >1 >1

βΡ nHH Η H HH

mm OCJO U O O

h a----—.----

β β I I

Γβ m i i i β >1 β >1 βββ

HH CM Η Η Η H "H rH

Xj O rij (5 ri! <! ri!

μ H I III

O β I P I p p O

in i I III

u U U U U U M

ββ H>)>1 >1 >1 >1>1 P fe EhEhEh Eh Eh &h

'O

fi , III III

S a a a a a a 4 T497S4 o

En sammenligning af strukturerne i ovennævnte tabel med den ovenfor anførte almene formel I: Y 3

5 H - Tyr - A - Phe - B - C - W

hvori symbolerne Y, A, B, C og W er som defineret i kravet, viser med ønskelig tydelighed en klar strukturel forskel, eftersom de ifølge ansøgernes opfindelse fremstillede peptider altid har en phenylalaningruppe (Phe) i 3-stillingen.

Det vil således forstås, at der er tale om en helt ny klasse peptider.

Netop på grund af denne strukturforskel i peptidkædens opbygning har det vist sig, at de ny peptider fremstillet ifølge opfindelsen udviser en ganske særegen og meget for-15 delagtig biologisk virkning sammenlignet med de kendte forbindelsers.

Det er således ved forsøg godtgjort, at forbindelserne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse udviser langt den kraftigste aktivitet i centralnervesystemet sammenlignet 20 med de almindelige enkephalin-analoge peptider således som f.eks. kendt fra de ovenfor anførte danske patentansøgningers beskrivelser. Dette fremgår tydeligt af det nedenfor anførte forsøgsmateriale ( se tabellen), der vedrører forsøg med rotter anbragt på en varm plade såvel som den nedenfor omtalte hale-25 piskeprøve.

Ved disse forsøg er som referencestandardforbindelser an-5 2 vendt henholdsvis Leu -enkephalin og D-Ala -Met-enkephalin-amid, som er kendte forbindelser, der er tilgængelige på markedet.

30

Det bemærkes specielt, at de i beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 331/77 beskrevne forbindelser er nært beslægtede med Leu -enkephalin. Således som det fremgår af ovennævnte tabel, har man udskiftet den sidste aminosyrerest i kæden (Leu) med en anden aminosyrerest (Gly). Endvidere be-35 5 US-7'64 o mærkes, at de ifølge dansk patentansøgning nr. 1580/77, 1782/79 og 4347/78 fremstillede peptider på den anden side har større strukturel lighed med den anden referencestandard-2 forbindelse D-Ala -Met-enkephalinamid, hvor de modificerede 5 grupper er peptidkædens OH-ende eller Phe-resten i 4-stil-1ingen.

I alle de anførte beskrivelser ses tydeligt, at samtlige peptidkæder i 3-stillingen indeholder en glycinrest. Forklaringen herpå er, at det naturlige humane β-endorphin (se 10 Merck indeks 10. udg. side 516) udviser dette strukturtræk, der hidtil har været anset for essentielt under hensyn til den biologiske aktivitet. Det må derfor regnes for udtalt overraskende, når det nu med den foreliggende opfindelse påvises, at man ved at vende sekvensen Gly3-Phe^ hos enke-15 phalin om (således at man får sekvensen Phe -Gly ) tilvejebringer peptider, for hvilke det først nu er godtgjort med de foreliggende forsøg, at disse udviser en langt bedre aktivitet i centralnervesystemet, jfr. den nedenfor anførte tabel, som viser,at samtlige derivater fremstillet ifølge 20 den foreliggende opfindelse er fra 10 til 10.000 gange mere aktive end referencestandardforbindelserne.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles faktisk ikke et enkephalin-analogt peptidderivat, men derimod et dermorphin-analogt peptidderivat. Derfor udgør de her 25 omhandlede peptider som defineret i formel I en fuldstændig ny klasse opioide peptider, der karakteriseres ved tilstedeværelsen af en Phe-rest i 3-stillingen.

I modsætning hertil udviser alle de naturlige opioide peptider (de såkaldte endogene opioide peptider(enkefaliner), 30 der er biogenetisk afledt fra pro-opionmelanokortin, pro-enkefalin A og pro-enkefalin B eller pro-dynorfin) en 3 35

Gly -rest, således som tilfældet er med de i de ovennævnte fire danske ansøgninger omhandlede peptider.

o 6 149754 3

Udskiftningen af Gly med Phe udgør dog ikke blot en simpel "ændring", således som man måske umiddelbart kunne antage.

I virkeligheden fører denne udskiftning eller ombytning 5 i peptidkæden hos de ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede peptider nemlig overraskende nok til derivater, der udviser en højere analgetisk aktivitet, hvorimod det i almindelighed har været rapporteret og hævdet, at man ikke kunne tolerere substituering i 3-stil-10 lingen (jfr. således J.S. Morley Ann. Rev. Pharmacol.

Toxicol. 20 (1980) side 88, samt Yoshiaki Kiso med flere J. Pharm. Dyn 8 8-91 (1984).

Peptidgrundkæden, der udgør afstandsleddet mellem de to aromatiske rester (Tyr og Phe) udgør endnu et særegent 15 trask, hvorved de to klasser peptider kan sondres (nemlig henholdsvis de her omhandlede forbindelser og endogene opio-ide peptider), og dette er en af de vigtigste faktorer, der bestemmer opiat-receptor-profilen (og derfor de respektive forbindelsers pharmakologiske aktivitet).

20 Et 1-4-indskud (således som hos enkephalin) begun stiger cf -receptorselektivitet, hvorimod et 1-3 indskud (således som hos de her omhandlede peptider) i høj grad forbedrer selektiviteten over for μ-receptorerne. Dette fremgår således af R. de Castiglione, Highlights in Recep-25 tor Chemistry (1984) udgivet på forlaget Elseviers Publishers, B.V. p. 168.

Dette kan afgøres direkte ved bindingsundersøgelser eller kan udledes tilnærmelsesvis ud fra de klassiske in vitro prøver for opioid aktivitet: muse vas defena (MVD) og 30 marsvine ileum (GPI) for henholdsvis 6- og μ-receptorer.

Analgesi medieres eller styres således i hovedsagen af ^-receptorer, navnlig på superspinalt niveau.

Substitueringer eller elimineringer i andre stillinger kan modificere de opioide peptiders farmakologiske 35 profil ved ændring af f.eks. den iboende aktivitet, affi- o 7 140754 nitet, absorption, distribution, enzymatiske stabiliteter osv., men er sekundære i forhold til det ovenfor omtalte 1 4 grundkædeindskud mellem Tyr og Phe (således som dette forekommer hos de naturlige opioide peptider, enkephalinerne og 5 hos de fra ovennævnte litteratursteder kendte forbindelser) eller Phe (således som dette forekommer hos de dermorphin-analoge peptider fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse) .

Således ses, at 10 a) de her omhandlede peptider og de fra ovennævnte ældre ansøgninger kendte peptider tilhører to forskellige klasser, der karakteriseres for det første ved aminosyren i 3-stillingen og for det andet ved indskudsstykket mellem de to aromatiske rester (Tyr og Phe), og de har 15 derfor forskellig pharmakologisk profil, og b) før den foreliggende opfindelse blev det antaget, at de opioide peptider uden Gly i 3-stillingen var inaktive.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at aminosyrer, aminosyrederivater og/eller peptid-20 fragmenter ved opløsningsmetoder eller i fast fase kondenseres i den rækkefølge, hvori de indgår i det ønskede peptid, idet en eventuel usubstitueret eller substitueret hydrazidogruppe ved C-terminalen i det ønskede peptid indføres på et vilkårligt trin af syntesen, og idet ved 25 hver kondensation enten en endestillet carboxylsyregruppe eller en endestillet aminogruppe er aktiveret til dannelse af den pågældende peptidbinding og de øvrige reaktionsdygtige grupper om nødvendigt er beskyttet midlertidigt, hvorefter tilstedeværende beskyttelsesgrupper om nødvendigt 30 fjernes, og en fremstillet forbindelse med formlen I, hvori W er OR, om ønsket omdannes til en forbindelse med formlen I, hvori W er OH, eller NHR, hvorefter det fremkomne peptid om ønsket omdannes til et farmaceutisk acceptabel salt deraf.

35 3 149754 o

Acceptable salte af forbindelser med den almene formel I kan fås med trifluoreddikesyre, flussyre, eddikesyre, saltsyre, brombrintesyre samt andre farmaceutisk acceptable syrer.

5 Syntesen af peptiderne ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan enten gennemføres efter i og for sig klassiske opløsningsmetoder eller i fast fase på polymere bærere. Eksempler på de to fremgangsmådetyper er anført nedenfor. Ved den klassiske opløsningsmetode består syntesen i 10 det væsentlige i egnede efter hinanden følgende kondensationer af beskyttede aminosyrer eller peptider. Kondensationen gennemføres således, at de opnåede peptider udviser den ønskede rækkefølge eller sekvens på 4-7 aminosyrerester. Aminosyrerne og peptiderne, der kondenseres ved den inden 15 for polypeptidkemien i og for sig kendte metode, har de af deres amino- og carboxylgrupper, som ikke er involveret ved peptidbindingens dannelse, beskyttet med én eller flere egnede beskyttelsesgrupper.

De hydroxylerede aminosyrers hydroxylfunktioner 20 kan beskyttes med egnede beskyttelsesgrupper (under hele syntesen eller kun på enkelte trin), eller de kan lades helt ubeskyttede. Beskyttelsesgrupperne kan fjernes ved acidolyse, forsæbning eller hydrogenolyse.

Til beskyttelse af aminogrupperne kan anvendes 25 f.eks. følgende beskyttelsesgrupper: benzyloxycarbonyl (Z), tert.butyloxycarbony1 (Boc), trityl, formyl, tri-fluoracetyl og/eller o-nitrophenylsulfenyl.

S'' X' s'~' 9 149754

O

Til beskyttelse af carboxylgrupperne kan f.eks. anvendes følgende beskyttelsesgrupper: methyl, ethyl, tert.-butyl, benzyl og/eller p-nitrobenzyl.

Til beskyttelse af hydroxygrupperne kan f.eks. an-5 vendes følgende beskyttelsesgrupper: acetyl, tert.butyl-oxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, 2-brombenzyloxycarbonyl, tetrahydropyrany1, tert.butyl, trityl, benzyl, 2,4-di-chlorbenzyl og/eller methyl.

Kondensationen mellem en aminogruppe i et mole-10 kyle og en carboxylgruppe i et andet molekyle til dannelse af peptidbindingen kan ske via et aktiveret acylderi-vat såsom et blandet anhydrid, et azid, en aktiveret ester og lignende eller ved direkte kondensation mellem en fri aminogruppe og en fri carboxylgruppe i nærværelse 15 af et kondensationsmiddel såsom dicyclohexylcarbodiimid, der kan foreligge alene eller sammen med et middel til forhindring af racemerisering såsom N-hydroxysuccinimid eller 1-hydroxybenzotriazol.

Kondensationen kan gennemføres i et opløsnings-20 middel såsom dimethylformamid, pyridin, acetonitril, tetrahydrofuran eller lignende.

Reaktionstemperaturen kan ligge fra -30°C til stuetemperatur.

Reaktionstiden udgør i almindelighed fra 1 til 25 120 timer.

Synteseskemaet, beskyttelsesgrupperne og kondensationsmidlerne vælges alle således, at faren for race-merisering undgås.

Reaktioner til fjernelse af beskyttelsesgrupperne 30 udvirkes efter i og for sig kendte metoder inden for po-lypeptidkemien.

Peptider, hvori W er OR, fremstilles f.eks. ved at gå ud fra aminosyren med endestillet C-atom, der er forestret med en i dette øjemed hensigtsmæssig alkohol.

35 Peptider, hvor W betyder OH, kan f.eks. fås ved hydrolyse af peptider, hvori W er OR. Peptider, hvori W har betydningen NH2, NHR eller NR2, kan fås ved hjælp af ammonolyse af den tilsvarende ester.

o 149754 ίο

Ved fastfasemetoden anvendes en polymer bærer.

Polymeren er fortrinsvis en copolymer af styren med 1 til 2 vægtprocent divinylbenzen som tværbindingsmiddel, hvilket bevirker, at polystyrenpolymeren er fuldstæn-5 dig uopløselig i de fleste organiske opløsningsmidler.

Syntesen begyndes ved peptidets endestillede C--atom, idet den ønskede aminosyre hægtes på eller kobles til en chlormethyleret harpiks, en hydroxymethylharpiks eller en benzhydrylaminharpiks.

Amino- og sidekædebeskyttelsesgrupperne er sådanne, som er beskrevet ved den klassiske syntese i opløsningsmiddel .

Ved forbindelsernes fremstilling ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kobles en aminobeskyttet aminosyre 15 ved hjælp af f.eks. en cæsiumbicarbonatkatalysator til den chlormethylerede harpiks eller ved hjælp af et kondensationsmiddel såsom dicyclohexylcarbodiimid til en hydroxymethyl- eller benzhydrylaminharpiks.

Efter den første kobling fjernes aminobeskyttel-20 sesgruppen ved hjælp af egnede reagenser, herunder tri-fluoreddikesyre- eller saltsyreopløsninger i organiske opløsningsmidler ved stuetemperatur. Efter aminogruppens fjernelse kobles resten af de beskyttede aminosyrer trinvis i den ønskede rækkefølge til opnåelse af det ønskede 25 peptid.

Hver beskyttet aminosyre omsættes i almindelighed i trefoldigt overskud under anvendelse af en egnet carb-oxylgruppeaktivator såsom dicyclohexylcarbodiimid i opløsning, f.eks. i methylenchlorid—dimethylformamidblan-30 dinger.

Efter at den ønskede aminosyresekvens er opnået, fjernes det ønskede peptid fra harpiksbæreren ved behandling med et reagens såsom hydrogenfluorid, der ikke alene spalter peptidet fra harpiksen, men også fraspalter stør-35 stedelen af de tilbageblivende sidekædebeskyttelsesgrupper.

Når der anvendes en chlormethyleret eller hydroxymethyle- o 11 149754 ret harpiks, fører behandlingen med hydrogenfluorid til dannelse af den frie peptidsyre (W = OH). Når der anvendes en benzhydrylaminharpiks, fører behandlingen med hydrogenfluorid direkte til det fri peptidamid (W = NH2).

5 Når der anvendes en chlormethyleret eller hydroxyme- thyleret harpiks, kan på den anden side det sidekædebe-skyttede peptid spaltes ved behandling af peptidharpiksen med ammoniak eller med en alkyl- eller dialkylamin, hvorved det ønskede sidekædebeskyttede amid, alkylamid 10 eller dialkylamid fås (W = NH2, NHR eller NR2). Side-kædebeskyttelsesgruppen kan så fjernes på i og for sig kendt måde.

Ved fremstillingen ifølge opfindelsen af esteren (W = OR) anvendes harpiksen til fremstilling af syren 15 (w = OH), og det sidekædebeskyttede peptid spaltes med en base og den hertil egnede alkohol. Sidekædebeskyttelsesgruppen fjernes på sædvanlig måde.

På den anden side kan peptidsyrerne og -amiderne fås ud fra peptidestrene ved forsæbning eller ammonolyse.

20 Hydrazido- eller substituerede hydrazidoderiva- ter fås ifølge opfindelsen ved kondensation af det N-beskyttede peptid eller af aminosyren med en passende substitueret hydrazin såsom benzylcarbazat, tert.butylcarb-azat, adamantylcarbazat, phenylhydrazin eller adamantyl-25 hydrazin eller ved omsætning af det N-beskyttede peptid eller aminosyrehydrazid med et egnet alkyleringsmiddel såsom et alkylchlorid eller med et egnet acyleringsmiddel såsom benzylchlorformiat, tert.butylchlorformiat og ada-mantylfluorformiat.

30 De her anvendte symboler er dem, der sædvanlig vis benyttes inden for peptidkemien. I den følgende beskrivelse er D-aminosyrerester angivet ved brugen af små bogstaver, idet f.eks. ala = D-Ala.

Rf-værdierne et bestemt under anvendelse af i for-35 vejen udvalsede silicagel 60 F254 Pla<^er (fra Merck) med lagtykkelsen 0,25 mm og pladelængden 20 cm under anvendel- 12 149764 Ο se af følgende udviklingssystemer (elueringsmidler):

System A: Benzen-ethylacetat-eddikesyre-vand (10:10:2:1) (øvre fase)

System B: Benzen-ethylacetat-eddikesyre-vand (100:100:40:15) 5 (øvre fase)

System C: n-butylalkohol-eddikesyre-vand (4:1:1)

System D: Chloroform-methylalkohol- 32%'s ammoniumhydroxid (65:45:20)

System E: Chloroform-methylalkohol (8:2).

10 Tyndtlagschromatografianalyser er ikke gennemført under standardbetingelser. Derfor kan R^-værdierne, især ved forskellige temperaturer, ændre sig. Smeltepunkterne er bestemt i åbent kapillarrør og er ukorrigerede. De fleste af derivaterne bliver bløde og sønderdeles før 15 smeltning. Opløsningsmiddel for krystallisation, udfældning og formaling er anført i parentes.

Høj spændingspapirelektroforese er gennemført med et Pherograph-Original-Frankfurt type 64-apparat på papir fra Schleicher og Schull nr. 2317 ved 1600 V (40 v/cm) 20 og pH 1,2 (myresyre-eddikesyre-vand 123:100:777). Elektroforetiske mobiliteter (E. _) er anført med hensyn til glutaminsyres.

Forbindelser med den almene formel I udviser interessante farmakologiske aktiviteter ved forsøg gennemført 25 på laboratoriedyr. Især viser forbindelserne med den almene formel I virkning på centralnervesystemet som analge- tika, antipsykotica og neuroendokrinologiske midler.

Den analgetiske virkning er undersøgt på mus ved halepiskeprøven således som beskrevet af Haffner i Deutsch.

30 Med. Wochenschrift 55, side 731, (1929). De afprøvede forbindelser indgives intravenøst, subcutant, intraperitone-alt eller oralt. Ved intravenøs eller subcutan indgivelse viser de afprøvede produkter analgetisk virkning i doser, som i almindelighed ligger fra 0,2 til 50 mg/kg.

35 Forbindelser med den almene formel I udviser receptoraffiniteter overfor centralanalgetika, når de af- 13 149754

O

prøves "in vitro" på rottehjerner ifølge den af Pert og Snyder i Molec.Pharmacol. 10, 878, (1974) beskrevne fremgangsmåde. I overensstemmelse hermed kan forbindelser med den almene formel I finde terapeutisk anvendelse ved be-5 handling af smerter.

Forbindelser med den almene formel I udviser også aktivitet på centralnervesystemet med de karakteristiske egenskaber for antipsykotica således som påvist ved forsøg, der er gennemført ifølge den af Janssen, Jageneau og Schellekens i Psychopharmacologia (Berl.) 1, 389 (1960) beskrevne fremgangsmåde på rotter. Aktive doser udgør i almindelighed fra 0,2 til 60 mg/kg. Forbindelserne med den almene formel I kan altså finde terapeutisk anvendelse som antipsykotica.

15 Forbindelser med den almene formel I stimulerer blandt andet frigivelsen af væksthormonet og af prolactin således som påvist ved radioimmunforsøg på rotter, der er gennemført ifølge den af Niswender, Chen, Midgley, Mettes,

Ellis i Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 130, 793, (1968) beskrev- 20 ne fremgangsmåde. Aktive doser er i almindelighed fra 0,01 til 10 mg/kg. i overensstemmelse hermed kan forbindelserne med formlen I finde terapeutisk anvendelse ved stimulering af frigivelsen af væksthormon og af prolactin.

I overensstemmelse hermed kan de ved fremgangs- 25 måden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser med den almene formel I og/eller deres salte ved anvendelse til terapeutiske formål bringes sammen med gængse farmaceutisk acceptable bærere eller fortyndingsmidler til fremstilling af sædvanlige præparationsformer.

30

Biologisk afprøvning af repræsentative forbindelser med ovenstående formel I fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er foretaget på følgende måde og med de i følgende tabel anførte resultater: 35 149754 14 o

Biologisk afprøvning

Forbindelsernes aktivitet i centralnervesystemet og herunder specielt deres analgesiske virkning afprøves in vivo på rotter ad intracerebroventriculær vej (ved haleudsvings-g prøven og ved varmepladeprøven). Styrken bedømmes ved 2 til 3 dosisniveauer, og til hver enkelt niveau anvendes en gruppe på 5 rotter.

Der benyttes hanrotter af stammen Wistar med en vægt på 240 til 260 g. Dermophinanaloge-peptidderivater og dermed 10 beslægtede forbindelser injiceres intracerebroventriculært således som beskrevet af Chermat & Simon (1975) i et rumfang på 10 jil saltvandsopløsning. Ved haleudsvingsprøven (der gennemføres ifølge D'Amour & Smith (1941)) måles rotternes latente trang til at fjerne halen, når den udsættes for strå-15 lingsvarme, hvilket gennemføres automatisk med en nøjagtighed på 0,1 sekund. Der anvendes grupper på 10 dyr til hvert enkelt forsøg.

Reaktionstiderne efter udsættelse for strålingsvarme og ved anbringelse på varmeplade måles henholdsvis 20 30 og 15 minutter før injektion og derpå hver 15. minut un der den første post-injektion og derpå hver 30. minut i løbet af de næstfølgende timer. ED^q og 95%'s pålideligheds-grænserne beregnes som beskrevet for mus. Aktiviteten for forbindelsen med formlen 25

H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2.TFA

ansættes til 100 som sammenligningsgrundlag, og dennes styrke er som følger: bestemt ved varmeplade ED5Q = 13,3 pmol/-30 rotte og bestemt ved haleudsvingsprøven ED^q = 23 pmol/rot-te. Resultaterne er iøvrigt anført i nedenstående tabel.

o 15 149754

Bibliografi 1. CHERMAT R. & SIMON P. (1975) Injection intraventricu laire cérebrale chez le rat anesthésié. J. Pharmac. (Paris) 5 6, 489-492.

2. D'AMOUR F.E. & SMITH D.L. (1941) A method of evaluating analgesic activity in the rat. J. Pharmac. exp. Ther. 72, 74-79 10 Tabe 1

Rotte (i.c.v.) varme- hale-

Eks. nr. Formel plade udsving 1 H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 · TFA ' 100 100 LIV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-Me · HC1 30 1 15 L V) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-Et · HC1 5 1 CIV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-NH2 · 2HC1 70-80 7-15 6 H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z · HC1 120 25-30

Bzl LXXX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 · HC1 20 8 LXXVIII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Gly-NH2 · HC1 20 8 20 XXI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2 * HC1 90-110 70-80 o 16 149754 XXXV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Val-Ser-NH2 · TFA 5 2 XXXVII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Gly-Ser-NH2 · TFA 10 2 XXXIX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Phe-Pro-Ser-NH2 · HC1 70 10-20 XLV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Trp-Pro-Ser-NH2 · HC1 30 3-5 5 LII) H-Tyr-ala-Phe-Sar-Tur-Pro-Ser-NH2 · HC1 100 70 XLVII) H-Tyr-ala-Phe-Phe-Tyr-Pro-Ser-NH2 · HC1 10 4 XLI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Phe-Hyp-Ser-NH2 * HC1 70 5

Bzl Bzl

I I

XXXII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2 · HCl 10 2 10 Bzl XLII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Phe-Hyp-Ser-NH2 · HCl 55 8 XXV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-NH2 * TFA 25 14

Bzl XXVI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-NH2 * TFA 2 1 15 XXIX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Ser-NH2 * TFA 8 1 2 H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NH2 * TFA 27 12 CVIII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-OTNH · 2 HCl 20-30 6 7 H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NHNHZ * HCl 20-40 12 LXV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-tyr-NH2 * HCl 6 1,5 20 L) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Leu-NH2 * HCl 0,5 0,1 LXXXVI) H-Tyr-ala-Phe-Sar-Tyr-NH-NH-Z * HCl 20-40 14 5) H-Tyr-ala-Phe-Gly-NH2 ‘ HCl 22 12 4) H-Tyr-ala-Phe-Gly-OB 6 1 XX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH2 ’ 2HC1 12 0,5 25 8 H-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z -HCl 8 2 3 H-Tyr-ala-Phe-Gly-OMe 1 0,5 LVII) H-Tyr-met-Phe-Gly-NHNHZ'HCl 1 0,5 LVIII) H-Tyr-met(O)-Phe-Gly-NHNHZ * HCl 1 0,5 LXIX) H-Tyr-ala-Phe-Pro-Tyr-Pro-Ser-NH2 3 1 30 CVII) H-Tyr(Bzl)-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2-HCl 2 0,5 LXIII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Pro-NH2'HCl 0,5 0,5 LXIV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Ser-NH2*HCl 6 4 CVI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Nva-NH2’HCl 1 0,5 CII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Pro-Ser-NH2‘HCl 2,5 1 35 17 149754 o CIII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr(Bzl)-Pro-Ser-NH2*HCl 2 0,5 LIU) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Gly-Pro-Ser-NH2 'HCl 0,5 0,1 LXXII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Ppa-Ser-NH2 *HCl 1 0,5 LXXIV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Tia-Ser-NH 'HC1 1 0,5 5 LXXA) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-L-Δ3 Pro-Ser-NH *HC1 20 15 * ^ LXXB) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-D-4 Pro-Ser-NH2’HCl 2 1 LXXVII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Abu-NH2 * HCl 2,5 1 LXXIX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr(Bzl)-Pro-Ser(Bzl)- 0,5 1 -nh2'hci 10 LXI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-NHNH-Adoc.HCl 2 0,5 LXII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-NHNH-Boc.HCl 1 0,5 9 H-Tyr-ala-Phe-Gly-NHNH-BufHCl 1 0,5 LIX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-NHNH-Lr1.HCl 2 1 LX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-NHNH-Bnl.HCl 2 0,5 15 10 H-Tyr-ala-Phe-Gly-NHNH-tyr.2HC1 0,5 0,5 LXXXI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NH-Ad.HCl 6 4 LXXXIII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NH-CH2CF3.HCl 1 0,5 XCIII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NHNHPh 3 1 LXX) H-Tyr-ala-Phe-MePhe-Tyr-Pro-Ser-NH2.HCl 7 2 20 LI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Met-NH2.HCl 18 12 CV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Met(0)-NH2.HCl 6 2

Standard H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH 0,01 0,01 " H-Tyr-ala-Gly-Phe-Met-NH2 0,01 0,01 25 18 149754 o Følgende eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

5 Eksempel 1

Fremstilling af H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 "CF^ COOH

(XIII)_

Trin 1: Boc-Pro-Ser-NH2 (I)

Til en opløsning af 1,0 g (4,65 mmol) Boc-Pro-OH 10 i 10 ml vandfri tetrahydrofuran tilsættes 0,52 ml (4,65 mmol) N-methylmorpholin og 0,45 ml (4,65 mmol) ethyl-chlorformiat efter hinanden ved en temperatur på -12°C.

Efter omrøring i 2 minutter tilsættes en kold opløsning af 0,48 g (4,65 mmol) H-Ser-NE^ (R.W. Hanson og H.N. Rydon 15 J.Chem.Soc., 836, 1964) i 10 ml dimethylformamid. Reaktionsblandingen omrøres i 3 timer ved -10°C og i 1 time ved 20°C, hvorpå salte filtreres fra og opløsningen inddampes i vakuum. Remanensen optages i tetrahydrofuran og filtreres, og opløsningen inddampes endnu engang i vakuum.

20 Ved krystallisation fra methanol-diethylether fås 1,1 g af forbindelsen (I) med smeltepunkt 138°C [a]^ = ~58,9° (c = 1 i methanol) , Rf* = 0,15, Rf_ = 0,33.

Ά 13

Trin 2: H-Pro-Ser-NH2.CF3COOH (II) 25 1,0 g (3,3 mmo) Boc-Pro-Ser-NH2 (I) opløses i 10 ml trifluoreddikesyre ved 0°C. Efter 30 minutter ved 0°C inddampes opløsningen i vakuum, fortyndes med methanol og inddampes endnu engang i vakuum. Produktet (II) isoleres fra diethylether-petroleumsether i et udbytte på 30 1,0 g med smeltepunkt 48-50°C, Rf^ = 0,10.

Trin 3: Boc-Tyr (Bzl)-Pro-Ser-NH2 (III)

En opløsning af 1,0 g (3,0 mmol) H-Pro-Ser-NH2.CF3~ COOH (II) i 35 ml dimethylformamid køles til 0°C, hvorpå qr tilsættes 0,36 ml (3,2 mmol) N-methylmorpholin og deref- o 19 149754 ter 1,2 g (3,2 mmol) Boc-Tyr (Bzl)-OH, 0,43 g (3,2 mmol) 1-hydroxybenzotriazol og 0,73 g (3,52 mmol) dicyclohexyl-carbodiimid. Reaktionsblandingen omrøres i 1 time ved 0°C og natten over ved stuetemperatur, hvorefter den filtre-5 res og inddampes i vakuum. Remanensen opløses i ethyl-acetat, og opløsningen vaskes successivt med NaCl-mæt-tede opløsninger af 1M citronsyre, 1M NaHC03 og vand.

Den organiske opløsning tørres over vandfrit Na^O^, og opløsningsmidlet fjernes i vakuum. Produktet (III) udvin-10 des i et udbytte på 1,4 g ved krystallisation fra ethyl-acetat-petroleumsether, smeltepunkt 115°C, [a]^ = -22,9° (c = i methanol) Rf^ = 0,20.

Trin 4: Η-Tyr (Bzl)-Pro-Ser-NH2.CF3COOH (IV) 15 Der gås frem i 2 trin, idet der ud fra 1,0 g (1,8 mmol) Boc-Tyr (Bzl)-Pro-Ser-NH2 (IIII) fås 1,0 g af forbindelsen (IV), [a]^ = -7,4° (c = i methanol),

Rfc = 0,59, smeltepunkt 54-57°C (sønderdeling).

20 Trin 5: Boc-Phe-Gly-NH-NH-Z (V) 0,42 ml (3,8 mmol) N-methylmorpholin og 0,3 ml (3,8 mmol) ethylchlorformiat tilsættes efter hinanden ved -12°C til en opløsning af 1,0 g (3,8 mmol) Boc-Phe--OH i 10 ml vandfri tetrahydrofuran. Efter omrøring ved 25 denne temperatur i 2 minutter tilsættes en kold opløsning af 0,95 g (3,7 mmol) H-Gly-NH-NH-Z-Hcl (K. Hofmann m.fl.

J.Amer.Chem.Soc. 94, 6171, 1972) og 0,4 ml (3,7 mmol) N-methylmorpholin i 15 ml dimethylformamid. Reaktionsblandingen omrøres i 3 timer ved -10°C og i 1 time ved 30 20°C, hvorpå salte filtreres fra og der inddampes i vakuum.

Remanensen opløses i ethylacetat og vaskes flere gange efter hinanden med NaCl-mættede opløsninger af 1M citronsyre, 1M NaHCC>3 og vand. Det organiske lag tørres over vandfrit Na~SO. og opløsningsmidlet fjernes i vakuum. Pro- 35 λ 4 duktet (V) udvindes i et udbytte på 1,4 g fra methanol--diisopropylether, smeltepunkt 143°C, [a]^ = +5,6° (c = 1 i methanol), RfA = 0,63.

0 149754 20

Trin 6: H-Phe-Gly-NH-NH-Z.HCl (VI) 1.0 g (2,1 mmol) Boc-Phe-Gly-NH-NH-Z (V) behandles i 30 minutter ved stuetemperatur med 10 ml af en 1,3 N opløsning af hydrogenchlorid i iseddike. Ved fjernelse af op- 5 løsningsmidlet i vakuum ved 30°C og formaling af remanensen med diethylether fås 0,89 g af forbindelsen (VI), smeltepunkt 178°C, [α]ρ5 = +45° (c = 1 i methanol), Rfc = 0,78.

Trin 7: Boc-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z (VII)

Idet man går ud fra 1,0 g (5,3 mmol) Boc-ala-OH og 2,09 g (5,1 mmol) H-Phe-Gly-NH-NH-Z.HCl (VI), og idet man går frem som i trin 5, fås 2,5 g af forbindelsen (VII) fra 25 o methanol-diisopropylether, smeltepunkt 165°C, [a]p = +8° (c = 1 i methanol), RfA = 0,51.

15

Trin 8: H-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z.HCl (VIII)

Ved at gå ud fra 1,0 g (1,8 mmol) Boc-ala-Phe-Gly--NH-NH-Z (VII), idet man går frem som i trin 6, fås 0,84 g af forbindelsen (VIII), smeltepunkt 180°C, [a]^ = +0,2° 20 (c = 1 i methanol), Rfc = 0,75.

Trin 9: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z (IX)

Ved at gå ud fra 1,0 g (3,5 mmol) Boc-Tyr-OH og 1,65 g (3,4 mmol) H-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z.HCl (VIII), idet 25 der gås frem som i trin 5, fås 2,24 g af forbindelsen (IX), der efter krystallisation fra methanol-diisopropylether har smeltepunkt 148°C og specifik optisk drej-25 o ning [a]^ = +16,2 (c = 1 i methanol) og referencevær dien Rf^ = 0,38.

30

Trin 10: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH2 (X) 1.0 g (1,4 mmol) Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z (IX) i 10 ml methanol hydrogeneres ved stuetemperatur i nærværelse af 0,27 g 10%'s Pd/C. Katalysatoren filtreres fra, og 35 opløsningen inddampes i vakuum. Ved fortynding med ethyl-acetat fås 0,64 g af forbindelsen (X), smeltepunkt 148°C, 21 149754

O

[α]ρ5 = +26,6° (c = 1 i methanol), Rfg = 0,34.

Trin 11: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr (Bzl)-Pro-Sér-NH2 (XI)

Til en opløsning af 2,0 g (3,5 mmol) Boc-Tyr-ala-5 -Phe-Gly-NH—NH2 (X) i 20 ml vandfri dimethylformamid tilsættes 2,18 ml (8,75 mmol) 4 N hydrogenchlorid i vandfri tetrahydrofuran og 0,45 ml (3,85 mmol) n-butylnitrit efter hinanden ved en temperatur på -30°C. Efter omrøring ved denne temperatur i 30 minutter tilsættes 1 ml 10 (8,75 mmol) N-methylmorpholin og derpå en kold opløsning (-30°C) af 1,66 g (2,91 mmol) Η-Tyr (Bzl)-Pro-Ser-NH^CF^-COOH (IV) og 0,33 ml (2,91 mmol) N-methylmorpholin i 40 ml dimethylformamid. Reaktionsblandingen lades reagere i 3 dage ved -9°C, hvorpå saltene filtreres fra, opløs-ningsmidlet fjernes i vakuum, og produktet udfældes fra methanol-ethylacetat-diethylether. Det rå produkt renses ved søjlechromatografi på silicagel (Merck 70-230 mesh), idet der elueres med ethylacetat-methanol (8:2).

Herved fås 2,0 g af forbindelsen (XI) fra methanol-di-20 ethylether, smeltepunkt 135°C, [ct]^ = -5,3° (c = 1 i methanol), Rfg = 0,24.

Trin 12: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 (XII) 1,3 g (1,3 mmol) Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr (Bzl)-25 -Pro-Ser-NH2 (XI) opløst i 20 ml methanol hydrogeneres ved 35°C i nærværelse af 0,30 g 10%'s Pd/C. Katalysatoren filtreres fra, og opløsningen inddampes i vakuum.

Ved fortynding med diethylether fås 1,1 g af forbindelsen (XII) , smeltepunkt 160-163°C (sønderdeling) , [a]^5 = 30 “7,6° (c = 1 i methanol), Rf_ = 0,11, Rf_ = 0,80.

D C

Trin 13: H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2.CF3COOH (XIII) 1,0 g (1,1 mmol) Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro--Ser-NH2 (XII) behandles med 10 ml trifluoreddikesyre 33 i 30 minutter ved 0°C. Opløsningsmidlet fjernes i vakuum, og remanensen formales med diethylether, hvorved fås 0,90 g af forbindelsen (XIII) , smeltepunkt 159-160°C, [a]^ = +5,5° (c = 1 i methanol), Rfc = 0,51.

149754 22

O

Eksempel 2

Fremstilling af H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NH^.CF^COOH (XV)

Trin 1: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NI^ (XIV) 2,74 g (4,8 mmol) Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH—NH2 5 (x) opløses i 50 ml vandfri dimethylformamid og afkøles til -30°C. 2,0 ml (12 mmol) 6 N hydrogenchlorid i vandfri tetrahydrofuran og 0,63 ml (5,28 mmol) n-butylnitrit tilsættes efter hinanden, og reaktionsblandingen omrøres i 30 minutter ved -30°C. 1,34 ml (12 mmol) N-methylmor-10 pholin tilsættes ved -40°C, hvorpå en forkølet (~40°C) opløsning af 0,856 g (4,0 mmol) H-Tyr-N^.HCl (K. Blau og S.G. Waley, Biochem.J. 57, 538, 1954) og 0,456 ml (4,0 mmol) N-methylmorpholin i 50 ml dimethylformamid tilsættes. Reaktionsblandingen lades reagere i 7 dage 15 ved -10°C, hvorpå den inddampes til et lille rumfang, salte filtreres fra, og produktet udfældes ved fortynding med chloroform. Ved krystallisation fra methylal-kohol-chloroform fås 2,0 g af forbindelsen (XIV), smeltepunkt 127-129°C, [a]^ = +19,9° (c = 1 i methanol), 20 Rf = 0,15, RfB = 0,56.

Trin 2: H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NI^ .CF^COOH (XV) 1,0 g (1,4 mmol) Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NI^ (XIV) lades reagere med 12 ml trifluoreddikesyre i 30 25 minutter ved 0°C. Syren afdampes i vakuum, og remanensen males med diethylether. Ved krystallisation fra iso-propylalkohol-diisopropylether fås 0,94 g af forbindelsen (XV), smeltepunkt 145-146°C, [a]p5 = +34,5° (c = 1 i methanol), Rfc = 0,65.

30

Fastfasesyntese:

Syntesen på en polymer bærer kan f.eks. gennemføres ifølge én af følgende fremgangsmåder.

Fremgangsmåde A: 35 Fremstilling af Boc- (AA)n~ (AA) n_^. · · · (AA) ^-hydroxymethyl- -polystyrenester___

Chlormethyleret polystyrenharpiks forestres med den første Boc-aminosyre (Boc-AA^-OH) ifølge Gisin, Helv.Chim.

O

23 149764

Acta 56, 1476 (1973). Polystyrenesteren behandles ifølge forskrift A til indlæmning af Boc-(AA)2-0H, ....Boc-(AA)n~ -0H til opnåelse af den i overskriften nævnte harpiks.

Forskrift A: 5 1) der vaskes tre gange med CH2C12, 2) der behandles to gange med TFA-CH2C12 (1:1) i løbet af 1 minut, 3) der behandles med TFA-CH2C12 (1:1) i 30 minutter, ^0 4) der vaskes fire gange med CH2C12, 5) der behandles to gange med 10% TEA i CH2C12 i 1 minut, 6) der behandles med 10% TEA i CH2C12 i 10 minutter, 7) der vaskes tre gange med CH2Cl2, 15 8) der vaskes tre gange med DMF, 9) der vaskes tre gange med CH2Cl2, 10) der tilsættes 2 eller 3 ækvivalenter af det symetriske anhydrid af det tilsvarende aminosyre-derivat fremstillet således som beskrevet af 20 Hagenmayer og Frank i Heppe-Seyler's Z.Physiol.

Chem. 353, 1973 (1972) opløst i CH2C12, idet reaktionstiden udgør 1 til 2 timer, 11) der vaskes tre gange med CH2Cl2, 12) der vaskes tre gange med isopropylalkohol, 25 13) aer vaskes tre gange med CH2C12, og 14) der prøves ved ninhydrinreaktion ifølge Kaiser m.fl. Annal.Biochem. 34, 595 (1970). I tilfælde af ufuldstændig reaktion gentages operationerne 4 til 14.

30 De i ovenstående forskrift A anvendte forkortelser for opløsningsmidler og reagenser er som følger: TFA betyder trifluoreddikesyre TEA betyder triethylamin DMF betyder dimethylformamid.

35

O

24 U*76*

Fremgangsmåde B:

Fremstilling af H- (AA) n~ (AA) ... (AA) .^hydroxymethyl- -polystyrenester_

Efter indføring af det sidste aminosyrederivat ^ ifølge forskrift A (fremgangsmåde A) vaskes harpiksen tre gange med eddikesyre, hvorpå operationerne 1-9 gentages, og der vaskes fire gange med isopropylalkohol.

Fremgangsmåde C: 10 Fremstilling af Boc- (AA) n~ (AA) .. (AA) .^-benzhydrylamin- harpiks_

Boc-(AA)^-OH bindes via dicyclohexylcarbodiimid til benzhydrylaminharpiks således som beskrevet af Piet-ta m.fl. i J.Org.Chem. 39, 44 (1974). Ikke-omsatte amino-^ grupper acetyleres med acetanhydrid/pyridin/CH2Cl (2:1:10) .

Polystyrenamidet behandles så ifølge ovenstående forskrift A (fremgangsmåde A) til indlæmning af de andre aminosyre-rester til opnåelse af den i overskriften nævnte harpiks.

^ Fremgangsmåde D:

Fremstilling af H- (AA) n~ (AA) n_]_ · ·«· (AA) ^-benzhydrylamin- harpiks_

Der arbejdes som ved fremgangsmåde B, idet man dog går ud fra peptidharpiksen opnået ved fremgangsmåde C.

25

Eksempel 3

Fremstilling af H-Tyr-ala-Phe-Gly-Ome (XVI) 1 g peptidharpiks fra fremgangsmåde B med den fornødne sekvens af aminosyreestere (indført som Boc-Gly-OH, Boc-Phe-OH, Boc-ala-OH og Boc-Tyr-OH i denne rækkefølge) suspenderes i 25 ml methylalkohol og 2 ml trimethylamin i 3 dage ved stuetemperatur. Harpiksen frafiltreres, vaskes med dimethylformamid og befries for opløsningsmiddel ved afdampning i vakuum. Ved krystallisation af remanensen fra isopropylalkohol fås 0,16 g af den i overskriften nævnte forbindelse (XVI), smeltepunkt 216-218°C, [α3 = -32,6° (c = 1 i DMF), Rfc = 0,70. Aminosyreforhold: Gly o 25 149754 1,04, ala 1,06, Tyr 0,99, Phe 1,00.

Eksempel 4

Fremstilling af H-Tyr-ala-Phe-Gly-OH (XVII) 5 i) 1 g af den samme peptidharpiks som i eksempel 3 behandles i 45 minutter ved 0°C med 10 ml vandfri HF (destilleret over CoF^) med et indhold på 1 ml anisol. Hydrogenfluoridet afdampes under nedsat tryk, og anisolen fjernes ved vaskning med diisopropylether. Det rå peptid 10 ekstraheres fra harpiksen med 50%'s eddikesyre, hvorpå det renses ved chromatografi på en søjle af "Sephadex" ® G-15 ved eluering med 0,5 N eddikesyre og overføres derefter ved behandling med "Amberlite" ®IRA-45 (CH^COO ) til acetatet.

15 ii) På den anden side suspenderes 0,10 g peptid ester (XVI) i 5 ml H20 og 3 ml methylalkohol og forsæbes med 0,32 ml 1 N NaOH i 90 minutter ved stuetemperatur.

0,32 ml 1 N HC1 tilsættes, og opløsningen koncentreres i vakuum. Ved fortynding med 95% ethanol fås 0,08 g af den 20 i overskriften nævnte forbindelse (XVII), smeltepunkt 250-252°C (sønderdeling), [a]^8 = -2,8° (c = 1 i DMF),

Rfc = 0,56. Aminosyreforhold: Gly 1,04, ala 0,94, Tyr 1,00, Phe 1,05.

25 Eksempel 5

Fremstiling af H-Tyr-ala-Phe-Gly-NH^ (XIX) 1 g af den samme peptidharpiks som anført ovenfor i eksempel 3 suspenderes i 10 ml af en (1:1) blanding af methylalkohol og dimethylformamid og mættes med ammoniak 30 ved 0°C. Reaktionsblandingen omrøres i 3 dage ved stuetemperatur, hvorpå harpiksen frafiltreres, vaskes med dimethyl-formamid og befries for opløsningsmiddel ved inddampning i vakuum. Remanensen behandles med en opløsning af hy-drogenchlorid i vandfri tetrahydrofuran, og produktet ud-35 vindes som hydrochloridet fra isopropylalkohol. Der fås 0,09 g af den i overskrift nævnte forbindelse (XIX), smel- 26 143754 o tepunkt 206°C, [a]^ = +49,9° (c = 1 i methanol), Rfc = 0,58. Aminosyreforhold: Gly 1,05, ala 1,00, Tyr 0,91,

Phe 1,03.

5

Eksempel 6

Fremstilling af H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z.HC1 (XIV)_ 10 Trin 1: Boc-Ser-NH-NH-Z (I·)

Til en opløsning af 1,0 g (4,87 mmol) Boc-Ser-OH i 20 ml vandfri tetrahydrofuran tilsættes 0,55 ml (4,87 mmol) N-methylmorpholin og 0,49 ml (4,87 mmol) ethyl-chlorformiat efter hinanden ved en temperatur på -12°C.

15 Efter omrøring ved denne temperatur i 2 minutter tilsættes en kold opløsning af 1,0 g (0,87 mmol) I^N-NH-Z.HCl og 0,55 ml (4,87 mmol) N-methylmorpholin i 20 ml dimethyl-formamid. Reaktionsblandingen omrøres i 3 timer ved -10°C og i 1 time ved 20°C, hvorpå salte filtreres fra og der 20 inddampes i vakuum.

Remanensen opløses i ethylacetat og vaskes flere gange efter hinanden med NaCl-mættede opløsninger af 1M citronsyre, 1M NaHCC>3 og vand. Det organiske lag tørres over vandfrit Na2S04, og opløsningsmidlet fjernes i vakuum.

25 Produktet renses ved søjlechromatografi på silicagel, idet der elueres med CHClgiMeOH = 98:2. De ved tyndtlags-chromatografi som homogene bestemte fraktioner samles, og opløsningsmidlet fjernes i vakuum.

Ved formaling med diethylether-petroleumsether 30 fås 1,4 g af forbindelsen (I1), smeltepunkt 42-46°C, [a]J5 = -25,8° (c = 1 i methanol), RfA = 0,52.

O

27 149754

Trin 2: H-Ser-NH-NH-Z.HCl (II') 1.0 g (2,83 mmol) Boc-Ser-NH-NH-Z (I') opløses i 10 ml af en 4 N opløsning af hydrogenchlorid i vandfri tetrahydrofuran ved stuetemperatur. Efter 30 minutter ved 5 stuetemperatur tilsættes diethylether, og bundfaldet filtreres fra.

Det rå produkt omkrystalliseres fra absolut etha-nol-diethylether, hvorved fås 0,7 g af den i overskriften nævnte forbindelse, smeltepunkt 110-115°C, [a]^ = +20,7° 10 (c = 1 i methanol), Rfc = 0,49, 2 = 1*16.

Bzl f

Trin 3: Boc-Tyr-Pro-OH (III1) 1.0 g (8,7 mmol) H-Pro-OH opløses ved stuetemperatur i 4,35 ml 2 N NaOH. Derpå afkøles opløsningen til 0°C, 15 fortyndes med 10 ml dimethylformamid og befries for opløsningsmiddel, som fjernes i vakuum ved 35°C. Remanensen suspenderes i 10 ml dimethylformamid, og 4,3 g (8,7 mmol)

Bzl

Boc-Tyr-ONp tilsættes. Reaktionsblandingen omrøres ved 20 stuetemperatur og inddampes så i vakuum.

Remanensen opløses i vand og vaskes flere gange med ethylacetat. Det vandige lag afkøles til 0°C, syrnes med 5 N vandig saltsyreopløsning til pH 2 og ekstraheres så med ethylacetat. Det organiske lag vaskes med NaCl-mæt-25 tet vandig opløsning til neutralitet og tørres over vandfrit Na2SO^. Ved fjernelse af opløsningsmidlet ved 30°C fås 3,7 g af forbindelsen (III1), smeltepunkt 97-100°C (sønderdeling), [a]= -15,7° (c = 1 i methanol), RfA = 0,70, Eg g = 0,35.

30

Trin 4: Boc-Tyr-Pro-OH (IV)

Bzl 1.0 g (2,13 mmol) Boc-Tyr-Pro-OH (III') i 15 ml methanol hydrogeneres i nærværelse af 0,27 g 10%'s Pd/Cl.

35 Katalysatoren filtreres fra, og opløsningen fortyndes med ethylacetat og koncentreres i vakuum til udfældning. Her- 28

O

149754 ved fås 0,7 g af forbindelsen (IV), smeltepunkt 136-138°C, [<x]p5 = -25,0° (c = 1 i methanol), RfA = 0,42, E^g = 0,52.

Trin 5: Boc-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z (V)

5 Ved at gå ud fra 1,0 g (2,65 mmol) Boc-Tyr-Pro-OH

(IV) og 0,77 g (2,65 mmol) H-Ser-NH-NH-Z.HCl (II'), idet der gås frem som i eksempel 1, fås 1,46 g af forbindelsen (V) , som efter krystallisation fra diethylether-petro-leumsether har smeltepunkt 116-118°C, [a]j^ = -46,5° (c = 1 10 i methanol), Rf_ = 0,17, Rf„ = 0,37.

A o

Trin 6: H-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z.HCl (VI')

Idet der gås ud fra 1,0 g (1,63 mmol) Boc-Tyr-Pro--Ser-NH-NH-Z (V), og idet der gås frem som i eksempel 2 15 ovenfor anført, fås 0,78 g af forbindelsen (VI'), der ved omkrystallisation fra diethylether har smeltepunkt 172--174°C, [a]p5 = -38,4° (c = 1 i methanol), Rfc = 0,46, =1,2 - °'79· 20 Trin 7: Boc-Phe-Gly-NH-NH-Z (VII’)

Ved at gå ud fra 1,0 g (3,8 mmol) Boc-Phe-OH og 0,95 g (3,7 mmol) H-Gly-NH-NH-Z.HCl (K. Hofmann m.fl. J.Am.Chem.Soc. 94, 6171 (1972)) og ved at gå frem som anført i trin 1 fås 1,4 g af forbindelsen (VII'), der om-25 krystalliseret fra methanol-diisopropylether har smelte punkt 143°C, [a]^ = +5,6° (c = 1 i methanol), Rf^ = 0,63.

Trin 8: H-Phe-Gly-NH-NH-Z.HC1 (VIII') 1,0 g (2,1 mmol) Boc-Phe-Gly-NH-NH-Z (VII') behand-30 les i 30 minutter ved stuetemperatur med 10 ml af en 1,3 N opløsning af hydrogenchlorid i eddikesyre. Ved fjernelse af opløsningsmidlet i vakuum ved 30°C og formaling af remanensen med diethylether fås 0,89 g af forbindelsen (VIII'), smeltepunkt 178°C, [a]p5 = +45° (c = 1 i methanol), Rfc = 35 0,78, E1 2 = 0,88.

29

O

149754

Trin 9: Boc-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z (IX')

Idet man går ud fra 1,0 g (5,3 mmol) Boc-ala-OH og 2,09 g (5,1 mmol) H-Phe-Gly-NH-NH-Z.HCl (VIII*), og idet man går frem som anført i trin 5 ovenfor, får man 5 2,5 g af forbindelsen (IX') efter omkrystallisation ud fra methanol-diisopropylether med smeltepunkt 165°C, [a]^ = +8° (c = 1 i methanol), Rf^ = 0,51.

Trin 10: H-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z.HCl (X') 10 Ved at gå ud fra 1,0 g (1,8 mmol) Boc-ala-Phe- -Gly-NH-NH-Z (XI') og ved at gå frem som anført ovenfor i trin 6 fås 0,84 g af forbindelsen (X')» smeltepunkt 180°C, [o]p5 = +0,2° (c = 1 i methanol), Rfc = 0,75, E1 2 = °'80· 15 '

Trin 11: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z (XI')

Ved at gå ud fra 1,0 g (3,5 mmol) Boc-Tyr-OH og 1,65 g (3,4 mmol) H-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z.HC1 (X*) og ved at gå frem som anført ovenfor under trin 5 fås 4,24 g af 20 forbindelsen (XI'), som efter krystallisation fra metha- nol-diisopropylether har smeltepunkt 148°C, [a]^ = +16,2° (c = 1 i methanol), RfA = 0,38.

Trin 12: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH2 (XII')

25 1,0 g (1,4 mmol) Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z

(XI') i 10 ml methanol hydrogeneres ved stuetemperatur i nærværelse af 0,27 g 10% Pd/C. Ved at arbejde som i trin 4 ovenfor anført fås 0,64 g af forbindelsen (XII'), smeltepunkt 148°C, [a]p5 = +26,6° (c = 1 i methanol), 30 RfB - 0,34, Εχ 2 - 0,57.

Trin 13: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z (XIII')

Til en opløsning af 5 g (1,75 mmol) Boc-Tyr-ala--Phe-Gly-NH-NH2 (XII') i 15 ml vandfri dimethylformamid 35 tilsættes efter hinanden 1,1 ml (4,38 mmol) 4 N hydrogen-chlorid i vandfri tetrahydrofuran og 0,2 ml (1,93 mmol) 0 149754 30 n-butylnitrit ved en temperatur på -30°C. Efter omrøring ved denne temperatur i 30 minutter tilsættes 0,5 ml (4,38 mraol) N-methylmorpholin, hvorpå en kold opløsning (-30°C) af 0,803 g (1,46 mmol) H-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z.HC1 (VI') 5 og 0,16 ml (1,46 mmol) N-methylmorpholin i 15 ml vandfri dimethylformamid tilsættes. Reaktionsblandingen lades reagere i 2 dage ved -9°C, hvorpå saltene filtreres fra, opløsningsmidlet fjernes i vakuum, og produktet udhældes i 10%'s citronsyreopløsning afkølet til 0°C. Bundle faldet filtreres fra, vaskes med vand til neutralitet og tørres i vakuum. Produktet omkrystalliseres fra ethylace-tat-diethylether, hvorved fås 1,15 g af forbindelsen (XIII1), smeltepunkt 140-150°C, [a]^ = -20,3° (c = 1 i methanol) ,

Rfg = 0,17, Rfc = 0,92.

15

Trin 14: H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z .HC1 (XIV)

Ved at gå ud fra 1,0 g (0,95 mmol) Boc-Tyr-ala-Phe--Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z (XIII1) og ved at gå frem som anført ovenfor i trin 2 fås 0,89 g af forbindelsen (XIV) ud 2 5 20 fra ethylacetat, smeltepunkt 170°C (sønderdeling), [a]^ = -1,08° (c = 1 i methanol), [a]g^ = +1/0° (c = 1 i eddikesyre), Rfc = 0,69, E1 2 = 0,50.

Eksempel 7 25 Fremstilling af H-tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NH-NH-Z.HC1 (XVIII1)

Trin 1: Boc-Tyr-NH-NH-Z (XV)

Til en opløsning af 1,0 g (3,55 mmol) Boc-Tyr-OH i 20 ml vandfri tetrahydrofuran tilsættes 0,4 ml (3,55 mmol) N-methylmorpholin og 0,48 ml (3,55 mmol) isobutylchlor-30 formiat efter hinanden ved en temperatur på -12°C. Efter omrøring ved denne temperatur i 2 minutter tilsættes en kold opløsning af 0,72 g (3,55 mmol) ^N-NH-Z.HCl og 0,4 ml N-methylmorpholin i 20 ml dimethylformamid. Reaktionsblandingen omrøres i 90 minutter ved -10°C, hvorpå salte 35 filtreres fra, og der inddampes i vakuum. Remanensen opløses i ethylacetat og vaskes flere gange efter hinanden 31

O

149754 med en vandig opløsning af 1M citronsyre, 1M NaHCO^ og mættet NaCl.

Det organiske lag tørres over vandfrit Na2S0^ og befries for opløsningsmiddel, hvorved fås 1,3 g af for-^ bindeisen (XV'), smeltepunkt 68-70°C, [a]^5 = -5,85° (c = 2 i methanol), RfÅ = 0,76.

Trin 2: H-Tyr-NH-NH-Z.HC1 (XVI') 1,0 g (2,33 mmol) Boc-Tyr-NH-NH-ζ (XV) opløses i io ml af en 4 N opløsning af hydrogenchlorid i vandfri te-trahydrofuran ved stuetemperatur. Efter 30 minutter ved stuetemperatur fjernes opløsningsmidlet i vakuum, og produktet udfældes fra isopropylalkohol-diethylether. Der fås 0,76 g af forbindelsen (XVI'j, smeltepunkt 103-105°C, 15 [<x]p5 = +48,8° (c = 1 i methanol), Rfc = 0,70, 2 = 0,92.

Trin 3: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NH-NH-Z (XVII'j

Til en opløsning af 1,0 g (1,75 mmol) Boc-Tyr-ala--Phe-Gly-NH-N^ (XII') i 15 ml vandfri dimethylformamid 20 tilsættes efter hinanden 1,1 ml (4,38 mmol) 4 N hydrogenchlorid i vandfri tetrahydrofuran og 0,2 ml (1,93 mmol) N-butylnitrit ved en temperatur på -30°C. Efter omrøring ved denne temperatur i 30 minutter tilsættes 0,5 ml (4,38 mmol) N-methylmorpholin og derefter en kold opløs-25 ning (-30°C) af 0,535 g (1,46 mmol) H-Tyr-NH-NH-Z.HC1 (XVI') og 0,16 ml (1,46 mmol) N-morpholin i 15 ml vandfri dimethylformamid. Reaktionsblandingen lades reagere i 3 dage ved -9°C, hvorefter saltene filtreres fra, og opløsningsmidlet fjernes i vakuum. Produktet hældes i en 30 til 0°C afkølet 10%'s vandig citronsyreopløsning. Bundfaldet filtreres, vaskes til neutralitet med vand og tørres i vakuum.

Produktet omkrystalliseres fra isopropylalkohol--diethylether. Der fås 0,85 g af forbindelsen (XVII'), 35 smeltepunkt 137-150°C [a]^ = +3,8° (c = 1 i methanol) ,

RfA = 0,27, Rfg = 0,52.

32

O

149754

Trin 4: H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NH-NH-Z.HC1 (XVIII')

Ved at gå ud fra 1,0 g (1,15 iranol) Boc-Tyr-ala--Phe-Gly-Tyr-NH-NH-Z (XVII') og ved at gå frem som anført ovenfor i trin 2 fås 0,83 g af forbindelsen (XVIII') 5 ud fra ethylacetat, smeltepunkt 190-192°C (sønderdeling), [a]^5 = +19,9° (c = 1 i methanol), Rfc = 0,81, Ε± 2 = 0,59.

Eksempel 8

Fremstilling af H-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z.HC1 (XIX1) 10 Ved at gå ud fra 1,0 g (0,60 mmol) Boc-Tyr-ala- -Phe-Gly-NH-NH-Z (XI') og ved at gå frem som anført ovenfor i trin 8 i eksempel 6 fås 0,70 g af forbindelsen (XIX') ud fra ethylacetat, smeltepunkt 215°C, [a]^ = +33° (c = 1 i methanol), Rf^ = 0,70, E^ 2 = 0,62.

15

Eksempel 9

Fremstilling af H-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-CO-CH2-CH2-CH3.HC1 (XXI')__

Trin 1: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-CO-CH2-CH2“CH3 (XX') 20 Ved at gå ud fra 0,12 ml (1,3 mmol) smørsyre og 0,742 g (1,3 mmol) Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH2 (XII') og ved at gå frem som anført ovenfor i trin 1 i eksempel 6 fås 0,8 g af forbindelsen (XX') ud fra ethylacetat, smeltepunkt 125°C (sønderdeling), [a]^5 = +18,3° (c = 1 i me-25 thanol), Rfg = 0,37.

Trin 2: H-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-CO-CH2-CH2-CH3.HCl (XXI')

Ved at gå ud fra 1,0 g (1,46 mmol) Boc-Tyr-ala--Phe-Gly-NH-NH-CO-CH2-CH2-CH3 (XX') og ved at gå frem som 30 anført ovenfor i trin 2 i eksempel 6 fås efter rensning ved søjlechromatografi på silicagel og eluering med chloroform-methanol (9:1) 0,58 g af forbindelsen (XXI'), der ved omkrystallisation ud fra isopropylalkohol-diethyl- o 25 ether har smeltepunkt 215-218 C (sønderdeling) , [a]D = 35 +40,1 (c = 1 i methanol), Rfc = 0,67, Rf^ = 0,84, E^ 2 = 0,75.

o 33 149754

Eksempel 10 ^

Fremstilling af H-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-CO-CH-CH2-/q \-OH. - m2 2 HC1 (H-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-tyr-H,2HC1) (XXIII') 5 Trin 1: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-tyr-Boc (XXII')

Ved at gå ud fra 1,0 g (3,55 mmol) Boc-tyr-OH og 2,03 g (3,55 mmol) Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH2 (XII') og ved at gå frem som anført ovenfor under trin 1 i eksempel 6 fås 2,3 g af forbindelsen (XXII1) ud fra ethylacetat, 10 smeltepunkt 145-150°C, [a]^ = +14,8° (c = 1 i methanol),

RfA = 0,26, RfB = 0,39.

Trin 2: H-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-tyr-H.2HC1 (XXIII')

Ved at gå fra 1,0 g (1,2 mmol) Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-15 -NH-NH-tyr-Boc (XXII') og ved at gå frem som anført ovenfor under trin 2 i eksempel 1 fås 0,760 g af forbindelsen (XXIII') fra diethylether, smeltepunkt 210-215°C (sønderdeling), [a]^ = +13,5° (c = 1 i methanol), Rf^, = 0,48, E. 0 - 0,84.

20 x * *

Endvidere syntetiseres følgende yderligere derivater ifølge den klassiske opløsningsfremgangsmåde:

XX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH0.2 HC1, smp. 190-195°C

25 ^ (Søndd.) (Diethylether); Rf^, 0,50; E^ 2 1/09.

XXI) H-Tyr-ala-Phe-Sar-NH-NH2.2 HC1, smp. 193-197°C

(Søndd.) (Tetrahydrofuran); Rfc 0,47; 2 1,12.

XXII) H-Tyr-Ala-Phe-Sar-NH-NH-Z.HCl, smp. 150-155°C

(Søndd.) (Ethylacetat); Rf^, 0,70; E, _ 0,59.

30 ^ i.,δ 0

XXV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-NH2.HCl, smp. ca. 200 C

(Søndd.) (Ethylacetat); Rfc 0,58; E^ 2 0,59.

XXVI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr(Bzl)-Pro-NH2.HCl, smp.

ca. 180°C (Søndd.) (Diethylether); Rfc 0,63; E, 9 0,53.

35 1/2 o 34 149754 XXIX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Ser-NH2.CF3COOH, smp. 150--153°C (Søndd.) (Diethylether); Rfc 0,59; E^ 2 0,57, XXXI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2.HC1, smp. 210- 5 -220°C (Søndd.) (Isopropylalkohol-Diethylether);

Rfc 0,44; RfD 0,66; ^ 2 0,51.

XXXII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-(Bzl)-Hyp-Ser(Bzl)-NH2.HC1, smp. 175-180°C (Søndd.) (Methylalkohol-Diethyl-ether); Rfc 0,67; E^ 2 0,44.

10 XXXV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Val-Ser-NH2.CF3COOH, smp.

203-206°C (Søndd.) (Diethylether); Rfc 0,71; E1 2 0,51.

XXXVII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Gly-Ser-NH2.F-jCOOH, smp. 180-190°C (Søndd.) (Diethylether); Rfc 0,51.

15 RfD 0,73; 2 0,52.

XXXIX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Phe-Pro-Ser-NH2.HC1, smp. 190--195°C (søndd.) (Methylalkohol-Diethylether);

Rfn 0,84; E. „ 0,52.

XLI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Phe-Hyp-Ser-NH2.HC1, smp. 300 C 20 (Søndd.) (Methylalkohol-Ethylacetat) ;

Rfc 0,47; RfD 0,75; Εχ 2 0,51.

XLII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Phe-Hyp-Ser(Bzl)-NH2.HCl, smp. 160-170°C (søndd.) (Isopropylalkohol-Ethyl-acetat); Rf^ 0,65; E^ 2 0,5Q.

25 XLy) H-Tyr-ala-Phé-Gly-Trp-Pro-Ser-NH2.HCl, smp. 210- -220°C (Søndd.) (Isopropylalkohol-Ethylacetat);

Rfc 0,54; RfD 0,79; 2 0,50.

XLVII) H-Tyr-ala-Phe-Phe-Tyr-Pro-Ser-NH2.HCl, smp. 195- -200°C (Søndd.) (Diethylether); Rfc 0,66; 30 RfD 0,82; E1 2 0,50.

XLVIII) H-Tyr-ala-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Pro-Ser-NH2.HCl, smp.

160-180°C (Søndd.) (Ethylalkohol-Diethylether);

Rfc 0,72; RfD 0,90; Εχ 2 0,46.

L) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Leu-NH9.HCl, smp. 143-147°C

^ 28 o 35 (Isopropylalkohol-Diethylether); [a]D +8,1 (c l, MeOH) ; Rfc 0,73; E-j^ 2 0,62.

35 149754

O

LI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Met-NH2.HCl, smp. 220-225°C

(Isopropylalkohol-Diisopropylether); [cc] 33 + 13,5° (c 1, MeOH); RfQ 0,68; Εχ 2 0,63.

5 LII) H-Tyr-ala-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2.HCl, Smp.

195-200°C (Søndd.) (Diethylether); Rf^ 0,49;

El 2 0,49; [a]33 + 18,0° (c 1, MeOH).

LUI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Gly-Pro-Ser-NH2.HC1, Smp.

180°C (Søndd.) (Diethylether); [a]38 0 (c 1, 10 MeOH); Rfc 0,32; E1 2 0,58.

LIV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NHMe.HCl, Smp.

28 240°C (Søndd.) (Diethylether); [α]D 0 (c 1,

MeOH); Rf^ 0,55; E^ 2 0,52.

LV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NHEt.HCl, Smp.

15 235°C (Søndd.) (Diethylether); [a]38 - 3,54° (c 1, MeOH); Rf 0,62; Εχ 2 0,52.

LVI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-OMe.HCl, Smp.

240°C (Søndd. (Diethylether) ; [a]^8 -4,5° (c 1,

MeOH); Rfn 0,66; E. 9 0,55.

20 LVII) H.Tyr-met-Phe-Gly-NHNHZ.HCl, Smp. 140-143 C

(CHC13/Diethylether); [a]38 - 21,6° (c 1, DMF);

Rfc 0,79; E1 2 0,54.

LVIII) H-Tyr-met(O)-Phe-Gly-NHNHZ.HCl, Smp. 115-120°C

(CHC13/Diethylether); [a]38 - 23,2° (c 1, DMF); 25 Rf 0,69; E1 2 0,53.

LIX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-NHNHLrl.HCl, Smp. 191-198°C

23 (Søndd·) (Isopropylalkohol-Diethylether); [a]^ + 46,0° (c 1, MeOH); Rf_ 0,84 E1 _ 0,41.

LX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-NHNHBnl.HCl, Smp. 254-258 C

30 (Søndd.) (CH3OH/CHCl3/ethylacetat); [a]36 + 41,4° (c 1, MeOH) Rf 0,79; E1 2 0,63.

LXI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-NHNHAdoc, Smp. 142-144°C (Søndd.)

Isopropylalkohol/Diethylether) ; [cc]33 + 20,7° (c 1, MeOH); Rf 0,78; 2 0,47.

35 LXII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-NHNHBoc, Smp. 154°c (Søndd.) (Diethylether); Rfc 0,79; E-j^ 2 0,60; [a]33 + 2η go (c 1, MeOH).

o 36 1 4 9 7 54 LXIII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Pro-NH^-HCISm.p.: 235°C (diethylether);

Rfc 0,46; Εχ 2 0,64;

RcJ25 + 2,3° (c 1 MeOH) c LXIV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Ser-NH„.HCISm.p.: 100°C (dec.)(isopropyl-5 x alkohol/diisopropylether);

Rfc 0,52; E 0,65; fsj20 + 40,7° (c 1 MeOH).

LXV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-tyr-NH2-HCISm.p.: 230°C (diethylether); 10 Kfc 0,76; E1 2 0,57; + 49,4° (c 1 MeOH) .

LXVIII) H-Tyr-met-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH„.HC1: Rf 0,56; E 0,50.

ώ C X / 6 LXIX) H-Tyr-ala-Phe-Pro-Tur-Pro-Ser-NH2·HCISm.p.: 200°-205°C (dec.) _ (diethylether); Rf 0,46; lo V*.

E1 2 0,51; fij25 -29,8° (c 1 MeOH).

LXX) H-Tyr-ala-Phe-MePhe-Tyr-Pro-Ser-NH2.HCISm.p.: 210°C (dec.) (ethylacetat); 20 Rfc 0,74; E 0,44; ^19-22 _49,g° (c i, DMF).

LXXII)H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Ppa-Ser-NH2.HCISm.p.: 222°C (dec.) (ethylacetat); Rf 0,73; E 0,52; L X f Δ, 25 B€^22 +1/1° (c 1 MeOH) LXXIV)H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Tia^Ser-NH2.HCl:Sm.p. 225°-228°C (dec.) (diethylether) Rf^ 0,73;

El,2 0,51; 30 A7d9"22 "8'9° (c 1 MeOH).

A) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-^pr-Ser-NH2.HCl LXXV) B) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-4Pr-Ser-NH2.HCl B) Sm.p. 188°C (dec.) (diethylether); Rf^ 0,58; E. „ 0,52; få™ - 40,6° (c 1 MeOH).

35 X i χ u A) Sm.p. 185°C (dec.) (diethylether)? Rf 0,62? - 20 C El,2 °,52f +106,9° (c 1 MeOH).

37 «9754 o LXXVII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Abu-NH2.HC1 E^ 2 0,52.

LXXVIII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Gly-NH2.HCISm.p.: 179°-185°C (dec.) (methylalkoholdiisopropylether);

Hfc 0,57; 5 E 0,51; M2* + 14,8° (c 1 MeOH).

LXXIX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr(Bzl)-Pro-Ser(Bzl)-NH^.HC1

Sm.p. 160°C (dec.) (isopropylalkoholdiethylether);

Rf 0,81; E. . 0,44; fø20 +9,9° (c 1 MeOH) O X / L· ΰ 1 o LXXX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser(Bzl)-NH2.HCl Sm.p. 174°C (diethylether);

RfC 0,79; Εχ 2 0,48; M^~22 + 4,8° (c 1 MeOH).

LXXX1)H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NHAd.HCISm.p. 160°C (diethylether);

Rf_. 0,90; E. , 0,52; b9^ 15 +17,2 (c 1 MeOH).

LXXX1I) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-OH.HCISm.p. 215° (dec.) (isopropylalkoholdiethylether);

Rfc 0,57; Εχ 2 0,50; 22 o +2,4 (cl MeOH).

20 LXXXIII) H“Tyr-ala-Phe-Gly~Tyr-NHCH2CF3 . HCISm.p. 200°-230°C

(chloroform-die thyle ther-petroleum-ether); Rfc 0,88;

Blf2 0,57; Sg2° +32,4° LXXXV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-tyr-NHNHZ.HCl 25 Sm.p. 225°C (diethylether); Rf 0,85; E 0,50-,

C* x / A

+48,1° (c 1 MeOH) LXXXVI) H-Tyr-ala-Phe-Sar-Tyr-NHNHZ: Rf_>0,90; Rf_ 0,15; E. . 0,53; C S If 2 +30,6° (c 1 MeOH) .

LXXXVII)H - Tyr - ala - Phe - Sar - NH - NH - Z . HCl, 30 o

Smp. 150-155 C (Søndd.) (Ethylacetat); Rf = 0,70; XCII1) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NHNHPh.HCl

Sm.p. 220°C (dec.) (isopropylalkoholdiisopropylether)

Rf 0,85; E 0,52; +8,6° (som fri base, C c=l MeOH).

35 38

O

CII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Pro-Ser-NH -HC1 Rf 0,32? E 0,67

^ L A^ / A

CIII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr(Bzl)-Pro-Ser-NH2.HCl

Sm.p. 169°C (dec.) (methylalkoholethylacetat);

Rf 0,65? E 0,46? +5,4° (c 1 MeOH) .

L> A. f A U

g CIV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NHNH2.2HCl

Sm.p. 198°-200°C (dec.)(isopropylalkoholethylacetat)?

Rf 0,52? E 0,86? f^25 -1,4° (c 1 MeOH)

C A. f A D

CV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Met(0)-NH2.HClSm.p. 125°C (dec.) (diisopropylether)? 10 Rfc 0,37? Εχ 2 0,60.

CVI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Nva-NH2.HCISm.p. 210°C (diethylether)?

Rfc 0,70? E 0,63? +27,9° (c 1 MeOH) .

CVII) Η-Tyr(Bzl)-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH„.HC1 15 ^

Sm.p. 189°-192 C (dec.) (methylalkoholdiisopropyl- ether)? Rfc 0,66? E^ 2 0,45.

CVIII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-NHNH2.2HC1

Sm.p. 203°-204°C (dec.)(ethylacetatdiethylether)

Rfc 0,63? E 1,01 20 I ovenstående formler har de anførte symboler eller forkortelser følgende betydning:

O

39 uem . Me = CH3 ; Et = CH2CH3 ; Z = Benzyloxycarbonyl; Lrl = Lauryl ;

Bnl = Benzoyl; Bzl = Benzyl ;

Ad = Adamantyl ; met(O) = D-Methionin-sulfoxyd; 5 MePhe = N-Methylphenyl- Ppa = Pipecolinsyre; alanin;

Aze = 2-Azetidincarbon- Tia = 4-Thiazolidincarboxylsyre; syre;

Pr = —jr Phe(N02) = p-Nitro-phenylalanin;

10 V^COOH

H

Abu = a-Amino-n-smørsyre; Tyr(Bzl) = Tyrosin-O-benzylether;

Ser(Bzl)=Serin-0-benzyl- Cha = Hexahydrophenylalanin ; ether;

Phg = Phenylglycin ; Phe(F) = p-Fluorphenylalanin; 15 3Ala = β-Alanin ; allo Hyp = 4-Allohydroxyprolin; 3Hyp=enten 3-hydroxy- NvA = Norvalin

prolin eller 3-Allo- Tyr(Me) = Tyrosin-O-methylether; hydroxyprolxn; J

Adoc = Adamantyloxy- Boc = tert.Butyloxycarbonyl; carbonyl; But. = Butyryl;

Claims (1)

1. O 40 149754 Patentkrav« Analogifremgangsmåde til fremstilling af et der-morphinanalogt peptid med den almene formel 5 Y H - Tyr - A - Phe - B - C - W (I) hvori Y er hydrogen eller benzyl, A er en D-aminosyrerest valgt blandt D-alanin, D-methionin og D-methioninsulfoxid, B er en glycin-, en sarcosin-, en L-N-methylphenylalanin-, en phenylalanin- eller en prolinrest, C kan være tilstedeværende eller fraværende, og såfremt den er til stede, er C en aminosyrerest valgt blandt L-tyrosin, D-tyrosin, L-leucin, L-methionin, L-methioninsulphoxid, L-prolin, L- -serin og L-norvalin eller et dipeptid valgt blandt (0-15 -benzyl)-L-tyrosyl-L-prolyl, L-tyrosyl-L-prolyl, L-tyro-syl-L-seryl og L-prolyl-L-seryl eller en tripeptidrest valgt blandt L-tyrosyl-L-prolyl-L-seryl, (O-benzyl)-L--tyrosyl-L-prolyl-L-seryl, L-tyrosyl-L-3- eller -4-hydroxy-proly1-L-seryl, (O-benzyl)-L-tyrosyl-L-3- eller -4-hydroxy- 20 prolyl-L-seryl, (O-benzyl)-L-tyrosyl-L-3- eller -4-hy- droxyprolyl-(O-benzyl)-L-seryl, L-tyrosyl-L-valyl-L-seryl, L-tyrosylglycyl-L-seryl, L-phenylalanyl-L-3- eller -4-hy- droxyprolyl-L-seryl, L-tryptophyl-L-prolyl-L-seryl, L-phe- nylalanyl-L-prolyl-L-seryl, L-phenylalanyl-L-3- eller -4-25 -hydroxyprolyl-(O-benzyl)-L-seryl, glycyl-L-prolyl-L-se- ryl, L-tyrosyl-L-pipecolyl-L-seryl, L-tyrosyl-L-thiazo- lidyl-4-carbonyl-L-seryl, L-tyrosyl-L-3,4-dehydroprolyl- -L-seryl, L-tyrosyl-D-3,4-dehydroprolyl-L-seryl, L-tyrosyl- -L-prolyl-L-a-aminobutyryl, L-tyrosyl-L-prolylglycyl, 30 (O-benzyl)-L-tyrosyl-L-prolyl-(O-benzyl)-L-seryl, L-tyro- syl-L-prolyl-(O-benzyl)-L-seryl og (4-nitro)-L-phenyl- alanyl-L-prolyl-L-seryl og W er OH, OR, , NHR, eller NHNHR', hvori R er -alkyl, adamantyl eller 2,2,2-trifluorethyl, og R1 er benzyloxycarbonyl, adaman-35