FI73699B

FI73699B - Foerfarande foer framstaellning av nya, som laekemedel anvaendbara peptider.

Info

Publication number: FI73699B
Application number: FI802876A
Authority: FI
Inventors: Castiglione Roberto De; Giuseppe Perseo; Silvano Piani; Francesco Santangelo; Fiorenzo Faoro
Original assignee: Erba Farmitalia
Priority date: 1979-09-20
Filing date: 1980-09-15
Publication date: 1987-07-31
Also published as: CH645342A5; ATA463580A; CA1156221A; NL8005121A; GB2070618B; SE448879B; IT1196916B; DK149754C; IL61037A; FI802876A; IE801947L; IT8024755A0; YU240880A; FR2465713A1; AT381100B; AU6240380A; NZ194961A; IE50793B1; US4350627A; HU186749B

Description

7 3 6 9 9 MENETELMÄ UUSIEN LÄÄKEAINEENA KÄYTETTÄVIEN PEPTIDIEN VALMISTAMISEKSI - FÖRFARANDE FÖR FRAMSTALLNING AV NYA, SOM LAKE-

MEDEL ANVANDSARA PEPTIDER

T 3 ni ä n keksinnön kohteena on mene teinä uusien lääkeaineena käytettävien peptidien valmistamiseksi, joiden k a a v a on H-Tyr-A-Phe-B-C-W , (I) jossa - A on D-aminohappotähde, joka on valittu D-ala niinin, D - me -tioniinin ja D-metioniinisulfoksidin muodostamasta ryhmäs-t- ä - <— t - B on glysiinitähde tai N-metyyliaminohappotähde, joka on joko sarkosiini tai L-N-metyy1iFenyy1ia 1 aniini , tai neutraali L-amino happo tähde, joka on joko fenyylia!aniini tai proliini, - C on tripeptiditähde, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat L-tyrosyy1i-L-prolyy1i-L-seryyLi , (Q-bentsyyli )- L-tyrosyyli-L-prolyyli-L-seryyli , L-tyrosyyli-L-hydroksi-prolyyli-L-seryyli, (O-bentsyyli)-L-tyrosyyli-L-hydroksi-propyyli-L-seryyli, (O-bentsyyli)-L-tyrosyyli-L-hydroksi-propyyli-(0-bentsyyli)-L-seryyli, L-tyrosyyli-L-valyyli-L-seryy1i, L-tyrosyy1iglysyyli-L-seryy1i, L-fenyy1ia 1anyy -li-L-hydroksipropyyli-L-seryyli, L-tryptofyyii-L-propyyli-L-seryyli, L-fenyy1ia1anyy1i-L-pro lyy1i-L-seryy1i , L-fe-nyyli-alanyyli-L-hydroksiprolyyli-(0-bentsyyli)-L-seryyli, glysyyli-L-prolyyli-L-seryyli, L-tyrosyyli-L-pipekolyy1 i -L-seryy 1 i , L-ty rosyy 1 i - L -1 i a t s o 1 i dy y 1 i - L - s er y y 1 i., L-tyro-syyli-L-3,4-dehydropropyy1i-L-seryy1i, L-tyrosyyli-D-3,4-dehydroprolyyli-L-seryyli, L-tyrosyyli-L-prolyyli-L-fl-ami-nobutyryyli, L-tyrosyy1i-L-prolyy1ig 1ysyy 1i, (O-bentsyy-li)-L-tyrosyyli-L-prolyyli-(O-bentsyyli)L-seryyli, L-tyro-syyli-L-prolyyli-(0-bentsyyli)-L-seryyli, (4-nitro)-L-fe-nyylialanyyli-L-prolyyli-L-seryyli, (4-fluoro)-L-fenyyli-alanyyli-L-prolyyli-L-seryyli, L-heksahydroksifenyyliala-nyyli-L-proIyyli-L-seryyli, L-fenyyliglysyyliL-prolyyli-seryvli ja 2 73699 - W on OH, OR, NH2, NHR, NHNH2, NHNHR ' , jossa R on C^-C^-al-kyyli ja R' on bentsyy 1 ioksikarbonyy1i, tai mainittujen peptidien farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi.

Mainitut farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat voivat olla esim. trif1uorietikkahapon, f1uorivetyhapon, etikkahapon tai suolahapon muodostamia suoloja.

Keksinnön mukaisesti valmistetut peptidit muodostavat täysin uuden opioidipeptidiryhmän, jolle on ominaista 3-asemassa oleva Phe-tähde. ä s t ä poiketen on kaikissa luonnollisissa opioidipeptideis sä, ns. endogoenisissä opioidipeptideissä eli enkefaliineissa Gly3-tähde. Näin on laita esim. FI-patenttijulkaisun 6 68^2 ja FI-patenttihakemuksen /’71040 kuvaamissa peptideissä. Gly3-tähteen korvaaminen Phe-tähteollä keksinnön mukaisesti valmistetussa peptidiketjussa tuottaa johdannaisia, joilla on yllättävästi entistä suurempi anal-geettinen aktiviteetti, mikä on vastoin sitä yleistä aiempaa käsitystä, ettei opioidipeptidien 3 -a se m aa voisi substit. uoi-da. Tämän suhteen viitataan J.S. Morleyn Artikkeliin lehdessä Ann. Rev. Pharmacol. Toxico., 20 (1980), s. 88 sekä Y. Kison et ai artikkeliin lehdessä J. Pharm. Dyn. 7, S-91 ( 1984 ) .

Keksinnön mukainen kaavan (I) mukaisten peptidien valmistus tapahtuu siten, että yleisen kaavan mukaisesta yhdisteestä

X - Tyr - A - Phe - B - C - W

jossa A, B, C ja W tarkoittavat samaa kuin edellä ja X on tert-butyy1ioksikarbonyy1iryhmä , poistetaan suojaryhmä kä sittelemällä sitä trif1uoroetikkahapo1la tai k 1oorivetyhapolla orgaanisessa liuottimessa lämpötilassa, joka on 0 1C:n ja huoneenlämpötilan välillä.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti saatavien peptidien synteesi voidaan suorittaa joko käyttämällä ns. klassisia liuo-

II

3 7 3 6 9 9 tusneneteiniä tai suorittamalla se kiinteässä faasissa käyttämällä ns. polymeerien kantönineitä. Esimerkkejä molemmista menetelmistä on selostettu lähemmin seuraavassa. Klassisessa 1 i u o t usme.ne t e 1 mäs s ä tapahtuu synteesi oleellisesti käyttämällä suojattujen aminohappojen tai peptidien peräkkäisiä kondensaatioita. Kondensaatio suoritetaan sillä tavoin, että saaduissa peptideissä on halutussa järjestyksessä seitsemän aminohappotähdettä. Niissä aminohapoissa ja peptideissä, jotka ovat polypeptidikem iässä sinänsä tunnetulla tavalla kondensoidut, on niiden sellaisia a mi ti o- ja karboksyy 1 i ryhmiä , jotka eivät ole peptidLsidoks e n muodostuessa niihin liittyneet. Nämä ovat sopivalla suoj aryhmäl 1 ä suojatut.

Hydrolysoitujen aminohappojen hydroksyylifunktiot voidaan suo j a t a sopivilla suo jaryh m i 11 ä (joko k ok o s y r. t e ·' s i n aikana tai ainoastaan sen joissakin vaiheissa) taikka ne voida a n jättää suojaamattomiksi . Suoj aava t ryhmät void iän poistaa asidolyysillä, saippuoimalla tai hydrogenolyysillä.

Aminoryhmien suojaamiseksi voidaan käyttää esimerkiksi s e u -raavia suojaavia ryhmiä: bentsyy1ioks ikarbonyy 1 i (7), tort-butyylioksikarbonyyli (Boc), tri tyyli , formyyli, trifluori-ase tyyli , o-nitrofenyylioui f enyyli .

Karboksyy1iryhmien suojaamiseksi voidaan käyttää esimerkiksi seuraavia suojausryhmiä : metyyli, etyyli, tert-butyy li , bentsyyli , p-n. i t roben t syy 1 i .

Hydroksiryhmien suojaamiseksi voidaan käyttää seuraavia suo-jausryhmiä: asetyyli, tert-butyylioksikarbonyyli, bentsyyli-oksikarbonyyli. 2-bromibentsyylioksikarbonyyli, tetrahydro-pyranyyli, tert-butyyli, trityyli, bentsyyli, 2,4-dikloori-bentsyyli, metyyli.

Xondensaatioreaktio molekyylin aminoryhmän ja toisen molekyylin karboksyyliryhmän kesken pepfidisidoksen muodostamiseksi voidaan suorittaa siten, että käytetään aktivoitua asyyltjohdannaista kuten sellaisten seosta, joka s i aä Itää 7 3 6 9 9 4 anhydridiä, atsidia, aktivoitua esteriä tai sentapaisia, taikka suorittamalla suora kodensaatioreaktio vapaan amino-ryhmän ja vapaan karboksyyliryhnän kesken kondensaatioaineen kuten disyk 1 oheksyy 1ikarbodi-imidin läsnäollessa joko sellaisenaan tai yhdessä raseminoitumisreaktiota estävän aineen kuten N'-hydroksisukkinimidin tai l-hydroksibenhsotri.r solin läsnäollessa.

Kondensaatioreaktio voidaan suorittaa liuot timessa kuten d i me tyy 1 i f ormaci i d i s s a , py r i d i i n i ssä , ase töni tr i i 1 isää , tet-rahydrof uraanissa tai sen tapaisessa.

Reaktio Lämpötila voi vaihdella arvosta -30 ’ C huoneenlämpötilaan.

Reaktioaika on yleensä rajoissa 1-120 tuntia.

Synteesinkaava, suojaryhmät ja kondensaatioaineet valitaan kaikki sillä tavalla, että rasetoitumisen vaara saadaan vältetyksi .

Reaktioissa suojaryhmien poistamiseksi käytetään poLypepti-dikemiassa sinänsä tunnettuja menetelmiä.

Peptidit, joissa W on 0R, valmistetaan esimerkiksi käyttämällä lähtöaineina sellaisia aminohappoja, joiden molekyyi-ketjun päässä on C-atomi, joka on esteröity sopivalla alkoholilla. Sellaisia peptidejä, joissa W on OH, voidaan valmistaa esimerkiksi hydrolysoimalla peptidejä, joissa W on 0R. Sellaisia peptidejä, joissa W tarkoittaa NH^, NHR ja NR^, voidaan valmistaa suorittamalla ammonolyysi vastaavan esterin kanssa.

Kiinteäfaasimenetelmässä käytetään polymeeristä kantoainet-ta. Polymeeri on sopivimmin styrolin kopolymeeri 1-2 prosentin kanssa divmyy1ibentseeniä ketjuuntumisen muodosturnisai-neena, mikä seikka aiheuttaa sen, että polystyreenipolymeeri on useimpiin orgaanisiin liuottimiin täysin liukenematon

II

7 3 6 9 9 s

Synteesi aloitetaan peptidin hiili ketjun päässä olevasta C-ntomista, jolloin haluttu aminohappo kiinnitetään kloori-n»f'v.lisoiVviun hartsiin, hydroksimetyylihar t s i i n tai b e n ts- hydryylianinohartsiin .

Amino- ja sivuketjusuojaryhmät ovat sellaisia, joita on selostettu klassisissa liuotinsynteeseissä.

Valmistettaessa tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä kytketään amino suojattu aminohappo käyttämällä esimerkiksi kesi-υ m k a r b o n a a 11 i k a t a 1y s a a 11 o r i a k 1oorimety1 oi tuu n h artsiin tai käyttämällä kcndensaatioainetta kuten disykloheksyylikarbo-di-imidiä. h y d r o k s i m e t y y 1 i - tai bentshydryy 1 i a m i. i n i h a rt i i n .

Ensimmäisen kytkentä reaktion jälkeen poistetaan iminosuoja-ryhmä käyttämällä sopivia reagensseja kuten t r i *'l uc r i e t i k k a -happo- tai suolahappoliuoksia orgaanisissa liuottimissa huoneenlämpötilassa. Aminosuojaryhmän poistamisen jälkeen poistetaan loput suojaavista aminohapoissa askelitt iin halutussa järjestyksessä, jotta aikaansaataisiin haluttu o e p t i d i.

'Kaikki suo j aavat aminohapot saatetaan reagoimaan yleensä kolminkertaisen ylimäärän kanssa käyttämällä sopivaa karbok-syyiiryhmän aktivaattoria kuten disykloheksyyLLkarbodi-imi- dia liuoksessa, esimerkiksi metyleenikloridi-dinetyyiifor- r a m i d i - s e o k s i a .

Sen jälkeen kun haluttu aminohappojen sarja on saavutettu, poistetaan haluttu peptidi hartsirunkoaineesta käsittelemällä reagenssi11 a kuten f 1uorivedy 11 ä , joka ei ainoastaan lohkaise peptidiä irti hartsista vaan myös lohkaisee suurimman osan jäljelle jääneistä sivuketjusuojaryhmistä. Kun käytetään kloorimetyloitua tai hydroksimetyloitua hartsia, johtaa fluorivetykäsittely vapaiden peptidi happojen (W = 0 H ) muodostumiseen. Kun bentshydryy1iail in ihartsia käytetään, johtaa f 1 u orivet y k ä s ittely suoraan vapaisiin p e p t i d i a m i d e i li i n 6 73699 (W = N H ) . Kun käytetään kloorimetyloitua tai hydroksimetyloi-tua hartsia, voidaan toisaalta sivuketjulla suojattu peptidi lohkaista käsitte 1 emällä peptidihartsia ammoniakilla tai alkyyli- tai dialkyyliamiinia, jolloin saadaan haluttua sivuketju suojattu a amidia, alkyyliamidia tai dialkyyliamidia (W = N H 2> NHR tai NR > . Sivuketjusuojaryhmä voidaan tämän jälkeen poistaa sinänsä tunnetulla tavalla.

Valmistettaessa esteriä esillä olevan keksinnön mukaan ( W-OP. } käytetään hartseja hapon valmistukseen ( W = OH ) ja s i -vuketjusuojattu' peptidi lohkaistaan käyttämällä emästä ja sopivaa alkoholia. Sivuketjusuojaryhmä poistetaan tämän jälkeen tavalliseen tapaan.

Toisaalta voidaan saada peptidihappoja ja -amideja peptidi-estereistä saippuoimalla tai ammonoimalla.

Keksinnön mukaisia hydratsido- tai substituoituja hydratsi-dojohdannais ia saadaan kondensoima 11 a N-suojatut peptidit tai aminohappo sopivalla substituoidulla hydratsiinilla kuten bentsyy 1ikarbatsaati 11 a , fenyy1ihydratsiini11 a tai ada-Ta n tyyli hydratsiinilla tai suorittamalla N-suojatun peptidin tai aminohappohydratsiinin reaktio sopivan aikylointiaineen kuten a 1 kyy1ik 1 oridin kanssa taikka käyttämällä sopivaa asy-lointiainetta kuten bentsyyliklooriformiaattia, tertiääristä butyyliklooriformiaattia ja adanantyylifluori forniaattia.

Tässä käytetyt symbolit ovat samoja, joita käytetään tavallisesti peptidikemiassa. Seuraavissa esimerkeissä ovat D-aminohappotähteet merkityt pienillä kirjaimilla, esimerkiksi ala = D-ala.

Rf-arvot määritettiin käyttämällä ennalta päällystettyä si-likageeliä 60 F ^ (Merck)-levyt, kerroksen paksuus 0,25 mm, levyn pituus 20 cm käyttämällä seuraavaa kehitysjärjestel-mää : 11 73699

Systeemi A: bcr. tseeni- e tyy 1 iaset aa tti-etikk.n happo-vesi (10:10:2:1) (ylempi faasi)

Systeemi 3: fcontseeni-e tyyli;isotaa tti-etikkahappo-vesi ( 100:100:40: I 5) (ylempi faasi;

Systemmi C: n-butyylialkoholi-etikkahappo-vesi (4:1:1) Systeemi D : kloroformi-metyylialkoholi -3 2% a m m o r. i u n hydroksidi (65:45:20)

Systeemi E: kioroformi-m etyy1ialkoholi (8:2).

0 h u t k e r r o s k r o m a t o g r a f i a - a n a 1 y y s i suoritettiin käy t tänä *: t ä tandardio losuhtei ta . Tämän johdosta voivat R f - · r v o t varsinkin erilaisissa lämpötiloissa muuttua. Sulamispisteet määritettiin k a y 11 ä mailä avoimia kapillaareja ja niitä o i ole korjattu. Useimmat johdannaisista tulevat pehmo.koi ja h a -joavat ennen sulamista. Liuottimet kiteytystä, saostusta tai jauhamista varten ovat esitetyt sulkeissa.

Suuri jännitepäperielektroforeesi suoritetaan käyttämällä f e -rograafi-Original-Frakfurt tyyppiä 64 olevaa laitetta sekä Schleicher & Schull paperia No. 23 17 j .onnistaen oi Less a 16 00 V (40 V/o m) ja pH:n ollessa 1,2 (muurahaishap po-e 1 : k k a -happo-vesi. 12 5:100:77 7). Eleketroforeettiset liikkuvuudet (E 1,2) on. esitetty glctami inihapon vastaavaan arvoon verrattuna.

Yleisen kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä on kiintoisia farmakologisia vaikutuksia 1 a b o r a t o ri o k o e-e 1ä m i11 e suoritetuissa kokeissa. Varsinkin on yleisen kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä vaikutusta keskushermostojärjestelmään a n a 1g eettisinä, antipsykoottisina ja neuroendokrinologisina lääkeaineina.

Analgeettista vaikutusta testattiin käyttämällä koe-e1 äiminä hiiriä hännänhei1autus testin mukaan, jonka Haffner on esittänyt julkaisussa Deutsch. Med Woc he ns c hr i f f t 5_5, (1929) s. 731 Testatut yhdisteet annettiin koe-eläimi 11 e suonen- 3 7 3 6 9 9 sisäisesti, ihonalaisesti, intraperitoneaalisesti tai oraalisesti. Suoritettaessa annostus suonensisäisesti tai ihonalaisesti on testattuja tuotteita yleensä annettu annoksina 0,2-50 mg/kg (ei annlgeettista vaikutusta).

Keskimääräinen analgeettinen vaikutus (hännänhoilaurus- ja kuumalevytestit) määritettiin rotilla "in vivo" in tr.a sere b-roventrikulaarisella menetelmällä. Vaikutus mitattiin kah-della-kcImellä annostusmäärällä käyttäen rottia viiden yksi- 1 o n r v r. n i n s .

Käytetyt rotat olivat koiraspuolisia Wistar-rottia, jotka pain oivat 240-20 g. Dermorfiini ja sen tapaiset a i n ·* *» t ruiskutettiin intraserebroventriku Laarisesti 10 μ 1 s s a suola-liuosta julkaisun Chermat H. & Simon P. , J. P h a r m a c . i Paris) 6, ( 1 9 7 o ) s . 4 3 9-492 mukaisesti. Hännänhei lautus testissä, joka on kuvattu julkaisussa d'Amour F . Ξ . ^ Smith D.L., J.

Pharmac. exp. Ther. 72_ (1941) s 74-79, säteilylanmönkoh- teeksi saatetun hännän poisvetämisen viive mitattiin automaattisesti 0,1 s:n tarkuude1la Yksittäisissä kokeissa käytettiin kymmenen eläimen ryhmiä. Peagointiajat sätei Ly lämpöön ja kuumalevyyn mitattiin 30 ja 15 minuuttia ennen ruisketta sekä joka 15. minuutti ruiskeen antamista seuraavan tunnin aikana ja sitten joka 30. minuutti seuraavar. kolmen tunnin ajan. Ξ D ^ ® ^ % ·' n varmuusrajat laskettiin siten, kuin julkaisuissa on kuvattu hiirille.

Yhdisteen H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH .TFA akti i v i s uudelle annettiin arvo 10C vaikutusten ollessa seuraavat: k u u - malevy = 13,3 p m o 1/rotta ( E D ^ ) ja hännänhei! au tus = 23 pmol/rotta (ED). Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa .

11 7 3 6 9 9 9

TAULUKKO

'Esimerkki Yhdiste (ala=D-ala-tähde) Vaikutus _

Kuumalevy Hännän- _ heilau tus 1 H-Tyr-aia-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH^.TFA 100 100 LIV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-Me.HCl 30 1 LV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-Et.HC1 5 1 CIV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-NH^·2HC1 70-90 7-15 6 H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z HC1 120 25-70

Bzl LXXX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-öer-NH .HCl 20 8 LXXVIII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Gly-NH .HC1 20 8 XXXI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH .HCl 90-110 70-80 XXXV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Val-Ser-NH .TFA 5 2 XXXVII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Gly-Ser-NH .TFA 10 2 XXXIX) H-?yr-ala-Phe-Gly-Phe-Pro-Ser-NH?.HCl 70 10-20 XLV) H-Tyr-aia-Phe-Gly-Trp-Pro-Ser-NH .HCl 30 3-5 LII) H-Tyr-ala-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH .HC1 100 70 XLVII) H-Tyr-ala-Phe-Phe-Tyr-Pro-Ser-NH2.HC1 10 4 XLI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Phe-Hyp-Ser-NH^·HC1 70 5

Bzl Bzl

I I

XXXII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH .HCl 10 2

Bzl l XLII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Phe-Hyp-Ser-NH^·HC1 55 8 LXXA) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-L-Δ3-Pro-Ser-NH2.HCl 20 15 LXXB) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-D-ä*-Pro-Ser-NH .HCl 2 1 LXXVII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Abu-NH2.HCl 2.5 1 LXIX) H-Tyr-ala-Phe-Pro-Tyr-Pro-Ser-NH2 3 1 LXX) H-Tyr-ala-Phe-MePhe-Tyr-Pro-Ser-NH2.HCl 7 2

Standardi H-Tyr-ala-Gly-Phe-Met-NH2 0.01 0.01

Tulokset osoittavat, että keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden biologinen vaikutus on 10-10 000 kertainen enkefa 1iini-tyyppis ten peptidien vaikutukseen verrattuna.

- ;Λ 7 3 6 9 9

Yleisen kaavan (I) nukaisilla yhdisteillä on reseptorisif i-niteettia keskushermoston analg e tilkassa, kun niitä annettiin "in vitro" rotan aivoihin siten kuin Pert ja Dnyder ovat selostaneet Molec . Pharmacol . , 1_0 , (1974), s . 8 7 8, jolloin tätä menetelmää käytettiin testeissä. Tämän mukaan voivat yleisen kaavan (I) mukaiset yhdisteet saada terapeuttista käyttöä tuskia lievittävinä aineina.

Yleisen kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä on myös vaikutusta keskushernostojärjestelmään tyypillisiltä o m i n a i s u k k s i11 aa n a r t i p s y k o o 11 i s i r. a aineina, kuten on selostettu k o k e i s s a Janssen, J age ne au ja C h e 11 e k e n s .julkaisussa Psychopharma- cologia (berl.) 1, (I960), s. 389, .jolloin koe-eläiminä oli ve, t rotat. Aktiiviset annokset olivat y 1 e e n s ä 0,2-60 mg/k g Täten voi <i aan y 1 e i s e n k a a v a n ( I ) m u k a i s i a y h d i s t e i t ä k :i y t. 1 ä ä terapeutti s e s t i anti psykoottisina aine i n a.

Yleisen kaavan (I) mukaiset yhdisteet stimuloivat mm. kasvuhormonin ja prolaktiinin erittymistä, jotka radioimmuunikokee t osoittavat rottia käytettäessä, jota on selostettu julkaisussa Niswender, Chen, Midgloy, Mettes, Ellis. Proc. S o c . Exp.Bioi.Med. , 13 0, (1968), s.793 käyttämällä tässä selos tettua "’enetelmää. Aktiiviset annokset ovat yleensä 0,01-10 ng/kg. Tämän mukaan voidaan kaavan (I) mukaisia yhdisteitä käyttää terapeuttisesti stimuloitaessa kasvuhormo-nin ja prolaktiinin erittymistä.

Iät e n kuuluvat myös yleisen, kaavan (I) terapeuttiset käyttötavat esillä o 1 e v a n keksinnön s u o j a p i r i i n . Terapeuttisia tarkoituksia varten käytetään yleiskaavan (I) mukaisia yhdisteitä ja niiden suoloja yhdessä saatavissa olevien farmaseuttisesti hyväksyttävien alusaineiden tai 1 aimennus aineiden kanssa .

Seuraavissa esimerkeissä havainnollistetaan esillä olevaa keksintöä tarkemmin ilman, että nämä esimerkit rajoittaisi- v ;· t k ta innon s u o j a p i i r i ä .

tl 11 73699 ESIMERKKI 1: Aineen H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2.CF3 COOH (XIII) valmistus

Vaihe 1: Boc-Pro-Ser-NH^ (1)

Sellaisen liuoksen valmistamiseksi, jossa on 1,0 g (4,65 mmol) Bo C-Pro-OH 10 m 1:s s a vedetöntä tetrahydrofur ääniä, lisättiin peräkkäin 0,52 ml (4,65 mmol) N-metyylinorfo-liinia ja 0,45 ml (4,65 mmol) etyy1iklooriformiaattia peräkkäin lämpötilassa -120 C . Kun seosta oli sekoitettu tässä lämpötilassa 2 minuuttia, lisättiin siihen kylmä liuos, jossa oli 0,48 g (4,65 mmol) H-Ser-NH0 (R.W. Hanson & H.N. Rydon, J. Chem.Soc·, 1964, s. 836) 10 mlrssa dimetyy1iforma- idia. Reaktioseos sekoitettiin 3 h lämpötilassa -10 ° C ja i h lämpötilassa 20°C, minkä jälkeen suolat poistettiin suodattamalla ja seos haihdutettiin kuiviin. Jäännös kiteytettiin tetrahydrofuraanista ja suodatettiin ja liuos haihdutettiin vielä kerran tyhjössä kuiviin. Kun kiteytys oli suoritettu metanolin ja dietyy1ieetterin seoksesta, saatiin 1,1 g yhdistettä (I), sp. 138° C , [<*] 25 = -58,9°C , (c = l, MeOH ) , Rf = r\ 0,15, Rf =0,33.

O

Vaihe 2: H-Pro-Ser-NH2. CF^OOH (II) 1,0 g (3,3 mmol) Boc-Pro-Ser-NH^ (I) liuotettiin 10 ml:aan trif1uorietikkahappoa lämpötilassa 0°C. 30 minuutin kuluttua lämpötilassa 0°C haihdutettiin liuos tyhjössä kuiviin, laimennettiin metanolilla ja haihdutettiin vielä kerran kuiviin tyhjössä. Tuote (II) eristettiin dietyy1ieetterin ja petro-1ieetterin seoksesta. Saanti 1,0 g, sp. 48-50°C, Rfc = 0,10.

Vaihe 3: Boc-Tyr-(Bz1)-Pro-Ser-NH2 (III)

Liuos, jossa oli 1,0 g (3,2 mmol) H-Pro-Ser-NH .CF C00H (II)

c O

35 ml.ssa dimetyy1iformamidia, jäähdytettiin lämpötilaan 0°C, minkä jälkeen lisättiin 0,36 ml (3,2 mmol) N-metyyli-morfoli inia ja tämän jälkeen 1,2 g (3,2 mmol) Boc-Tyr-(Bzl ) - 7 3 6 9 9 12 OH, 0,43 g (3,2 mmol) 1-hydroksibentsotriatsolia ja 0,73 g (3,52 mmol) disyk 1oheksyy1ikarbodi-imidia. Reaktioseosta sekoitettiin 1 h lämpötilassa 0°C ja yön yli huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen se suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä kuiviin, jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja liuosta pestiin peräkkäin NaC1-ky1lastety1lä liuoksella IM sitruunahapolla, IM NaHCO^illa ja vedellä. Orgaaniset liuokset kuivattiin vedettömällä Na^SO^llä ja liuotin poistettiin käyttämällä tyhjöä. Tuotetta (III) saatiin 1,4 g kiteyttämällä etyyliasetaatin ja petrolieetterin seoksesta, sp. 11 5 0 C , foe] 25 = 22,9° ( c = 1 , MeOH:ssa), RfA=0,20.

Vaihe 4: H-Tyr-(Bzl)-Pro-Ser-NH0.CF„C00H (IV) 1 1 Ί C. i

Meneteltiin kuten vaiheessa 2, jolloin saatiin 1,0 g (1,8 mmol) tuotetta Boc-Tyr-(bzl)-Pro-Ser-NH^ (III) 1,0 g yhdistettä (IV), [oi J 25 = -7,4° , (c = l, MeOHrssa) Rfc=0,59, sp .

5 4 - 5 7 ° C (hajoaa).

Vaihe 5: Boc-Phe-Gly-NH-NH-Z (V) 0,42 ml (3,8 mmol) N-metyylimorfoliinia ja 0,3 ml (3,8 mmol) etyy1ik 1ooriformiaa11ia lisättiin peräkkäin lämpötilassa -1 2 3 C liuokseen, jossa oli 1,0 g (3,8 mmol) Boc-Phe-OH 10 ml:ssa vedetöntä tetrahydrof uraania . Kun sekoitusta oli suoritettu tässä lämpötilassa 2 minuuttia, lisättiin kylmä liuos, jossa oli 0,95 g (2,7 mmol) H-Gly-NH-NH-Z-CHl (K. Hofman et ai., J.Amer.Chem.Soc., 94, s. 6171, ja 0,4 ml (3,7 mmol) N-metyylimorfoliinia 15 ml :ssa dimetyy1iformami-dia. Reaktioseosta sekoitettiin 3 h lämpötilassa -10°C ja 1 h lämpötilassa 20°C, jonka jälkeen suolat tislattiin pois ja suoritettiin haihdutus tyhjössä. Jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja sitä pestiin useita kertoja peräkkäin natriumkloridilla kyllästetyllä liuoksella, IM sitruunahapolla, IM NaHCO^lla ja vedellä. Orgaaninen kerros kuivattiin vedettömällä Na^SO^lla ja liuotin poistettiin käyttämällä tyhjöä. Tuotetta (V) saatiin 1,4 g metanoli-di-isopro-pyylieetteristä, sp. 143JC, [o*-J 2 J = t-5,6° (c-L, MeOH), Rf - 0,63.

II.

7 3 6 9 9 13

Vaihe 6: H-Phe-Gly-NH-NH-Z-CH1 (VI) .1,0 g (2,1 mmol) Boc-Phe-Gly-NH-NH-Z (V) käsiteltiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa 10 m 1 : 11 a 1,3 n lii;osta, jossa oli kloorivetyä jääetikassa. liuottimen poistamisen jälkeen tyhjössä lämpötilassa 303C ja jäännöksen jauhamisen jälkeen dietyy1ieetteri1lä saatiin 0,89 g yhdistettä (VI), sp.

o pr 1 78 0 C , [<*] = +45° ( c = 1 , M e 0 H ) , Rfc=0,78.

Vaihe 7: Boc-a 1a-Phe-Gly-NH-NH-Z (VII) Käyttämällä lähtöaineina 1,0 g (5,3 mmol) tuotetta Boc-nla--0H ja 2,09 g (5,1 mmol) tuotetta H-Phe-Gly-NH-NH-Z.HC1 (VI), jolloin meneteltiin vaiheessa 5 selostetulla tavalla, saatiin 2,5 g yhdistettä (VII) metanoli-di-isopnopyylieette-ri-seoksesta, sp. 165°C, [oc] = +8° (c — 1 , MeOH), R f =0.51.

Vaihe 8: H-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z.HC1 (VIII) Käyttämällä lähtöaineina 1,0 g (1,8 mmol) Boc-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z (VII), jolloin meneteltiin vaiheessa 6 selostetulla tavalla, saatiin 0,84 g yhdistettä (VIII), sp. 180JC, [c*J 25 = -p 0,2° (c = l, MeOH), Rfc=0,75.

Vaihe 9: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z (IX) Käyttämällä lähtöaineina 1,0 g (3,5 mmol) Boc-Tyr-0H ja 1,65 g (3.4 mmol) H-a1a-Phe-Gly-NH-NH-Z.HC1 (VIII), jolloin meneteltiin vaiheessa 5 selostetulla tavalla, saatiin 2,24 g yhdistettä (IX) (kiteytys metanolin ja di-isopropyylieette-rin seoksesta), sp. 148^0, |p<] = +16,2° (c = l, MeOH), Rf = 0,38.

Vaihe 10: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH^ (X) 1,0 g (1,4 mmol) Eoc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z (IX) 10 missä 14 73699 metanolia hydrattiin huoneenlämpötilassa, jolloin läsnä oli 0,72 g 10 % Pd/C. Katalysaattori poistettiin suodattamalla ja liuos haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Etyyliasetaatilla suoritetun laimennuksen jälkeen saatin 0,64 g yhdistettä (X) , sp. 14 80 C , [Oi] 25 = +26° (c = l, MeOH ) , RfB=0,34.

Vaihe 11: Boc-Tyr-a1a-Phe-Gly-Tyr-(Bz1)-Pro-Ser-NH^ (XI)

Liuokseen, jossa oli 1,0 g (3,5 mmol) Boc-Tyr-a 1a-Phe-G ly-NH-NH^ (X) 20 ml:ssa vedetöntä dimetyy1iformamidia, lisät

tiin 2,18 ml (8,75 mmol) 4n kloorivetyä vedettömässä tetra-hydrofuraanissa ja 0,45 ml (3,85 mmol) n-butyylinitriittiä peräkkäin lämpötilassa -30°C. Kun sekoitusta oli suoritettu tässä lämpötilassa 30 minuuttia, lisättiin 1 ml (8,75 mmol) N-metyylinorfoiiinia ja tämän jälkeen kylmä liuos (-30JC), jossa oli 1,66 g (2,91 mmol) H-Tyr-(Bz1)-Pro-Ser-NH2.CF COOH

(IV) ja 0,33 ml (2,91 mmol) N-metyylimorfoliinia 40 ml.ssa di metyy1iformamidia. Reaktioseosta pidettiin 3 päivää lämpötilassa 9°C reagoimassa, minkä jälkeen suola poistettiin suodattamalla, liuotin poistettiin tyhjöstä ja tuote seostettiin seoksesta metanoli-asetaa11ietyy1iee11eri11ä . Raaka tuote puhdistettiin py1väskromatograafis e sti käyttämällä silikageeliä (Merck, 7 0 - 2 3 o mesh), jolloin suoritettiin eluointi seoksesta ° tyy 1 i as e taa 11 i-metano 1 i 11 a (8:2). Tällöin saatiin 2,0 g yhdistettä (XI) metanoii-dietyy1iee11eris eok -sesta, sp. 135°C, [(X]25 = -5,3° (c = l, MeOH), RfB = 0,24.

Vaihe 12: Boc-tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH^ (XII) 1,3 g (1,3 mmol) Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-(Bzl)-Pro-Ser-NH^ (XI) liuotettuna 20 ml:aan metanolia, hydrattiin lämpötilassa 35°C käyttämällä 0,30 g ja 10 % Pd/C. Katalysaattori poistettiin suodattamalla ja liuos haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Dietyy1ieetteri11ä suoritetun laimennuksen jälkeen 2 5 saatin 1,1 g yhdistettä (XII), sp. 160-163°C (hajoaa, [(*] =-7,6° (c=l, MeOH), Rf_=0,ll, Rf„=0,80.

D L

11

Vaihe 13: H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH .CF COOH (XIII) 15 73699 1,0 g (1,1 mmol) Boc-tyr-a1 a-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH (XII) käsiteltiin 30 minuuttia lämpötilassa 0CC 10 ml: 11a tri f luo-rietikkahappoa . Liuotin poistettiin käyttämällä tyhjöä ja jäännös jauhettiin dietyylieetterillä, jolloin saatiin 0,90 g yhdistettä (XIII), sp. 159-160°C, M25 = .5,5» (c = 1, M e 0 H) , R f^ =0,51.

ESIMERKKI 2: Tuotteen H-Tyr-a1a-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-NH- Z.HC1 (XIV') valmistus

Vaihe 1: Boc-Ser-NH-NH-Z (I1)

Liuokseen, jossa oli 1,0 g (4,87 m m o 1 ) Boc-Ser-OH 20 mi ssä vedetöntä tetrahydrofuraania, lisättiin 0,55 ml (4,87 mmol) N-metyy1imorfo 1iinia ja 0,49 ml (4,87 mmol) etyy1ik 1oori-formiaattia peräkkäin läPotilassa -.12'C. Kun seosta oli sekoitettu tässä lämpötilassa 2 minuuttia, lisättiin kylmään liuokseen 1,0 g (4,87 mmol) H^N-NH-Z.NCl ja 0,55 ml (4,87 mmol) N-metyylimorfoliinia 20 ml :ssa dimetyy1iformami-dia. Reaktioseosta sekoitettiin 3 tuntia -100 C ja 1 h lämpö-tilasssa 20JC, minkä jälkeen suolat poistettiin suodattamalla ja seos haihdutettiin tyhjössä kuiviin.

Jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja sitä pestiin useita kertoja peräkkäin natriumkloridilla kyllästetyllä liuoksella, IM sitruunahapolla, IM NaHCO^'-lla ja vedellä. Orgaaninen kerros kuivattiin vedettömällä Na^SO^lla ja liuotin poistettiin tyhjössä. Tuote puhdistettiin py1väskromatografisesti silikageelillä, jolloin eluoinnissa käytettiin CHCl^rMeOH =98:2. Ohutkerroskromatografisesti homogeeniset fraktiot kerättiin yhteen ja liuotin poistettiin tyhjössä.

Suorittamalla jauhaminen dietyy1ieetteri-petrolieetterin

kanssa saatiin 1,4 g yhdistettä I'), sp. 42-46°C, [c# J

-25,83 (c = 1 , Me OH ) , RfA = 0,52.

Vaihe 2: H-Ser-NH-NH-Z.HC1 (II') 16 73699 1.0 g (2,83 mmol) tuotetta Boc-Ser-NH-NH-Z (!') liuotettiin 10 ml:aan k 1 oor i ve t y hapon 4n liuosta vedettömässä tetrahyd-rofuraanissa huoneenlämpötilassa. 30 minuutin kuluttua huoneenlämpötilassa lisättiin dietyylieetteriä ja sakka poistettiin suodattamalla.

Raaka tuote kiteytettiin uudelleen etanolin ja dietyylieet- terin absoluuttisesta seoksesta, jolloin saatiin 0,7 g otsi-

2 S

kossa mainittua yhdistettä. Sp. 110-115°C, [fct] = +20,7° (c = 1, M e 0 H) , R f -0,49; E =1,16.

X J £-

Bzl

Vaihe 3: 3oc-Tyr-Pro-0H (III') 1.0 g (8,7 mmol) H-Pro-0H liuotettiin huoneenlämpötilassa 4,35 ml .aan 2n NaOH.ta. Tämän jälkeen jäähdytettiin liuos lämpötilaan 0°C, laimennettiin 10 ml:lla dimetyy1iformamidia ja liuotin poistettiin tyhjössä lämpötilassa 35°C. Jäännös suspendoitiin 10 ml:aan dimetyy 1 iformamidia ja siihen lisät-

Ij! z 1 tiin 4,3 g (8,7 mmol) yhdistettä Boc-Tyr-ONp. Reaktioseosta sekoitettiin yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen se haihdutettiin tyhjössä kuiviin.

Jäännös liuotettiin veteen ja sitä pestiin useita kertoja etyyliasetaatilla. Vesipitoinen kerros jäähdytettiin lämpötilaan 0°C, tehtiin happameksi 5n vesipitoisella kloorivety-liuoksella pH-arvoon 2 ja uutettiin tämän jälkeen etyyliase-taati11a.

Orgaaninen liuos pestiin natriumkloridilla kyllästetyllä vesipitoisella liuoksella neutraaliksi ja kuivattiin vedettömällä Na SO^:llä. Liuottimen poistamisen jälkeen lämpötilassa 30°C saatiin 3,7 g yhdistettä (III’), sp. 97-100'C ("hajoaa), 1¾25 = -15,7° (c = l, M e 0 H) , Rf =0,70; E =0,35.

f\ D i O

il

Vaihe 4: Boc-Tyr-Pro-OH (IV') 17 73699 B z 1 1,0 g (2,13 mmol) Boc-Tyr-Pro-OH (III') 15 ml:ssa metanolia hydrattiin käyttämällä 0,27 g 10 % Pd/C lämpötilassa 30°C . Katalysaattori poistettiin suodattamalla ja liuos laimennettiin etyy1i ase taa ti 1la ja väkevöitiin tyhjössä siten, että tuote saostui. Tällöin saatiin 0,7 g yhdistettä (IV';, sp.

1 36-138°C, [*]25 = -25,0° (c = l, M e 0 H) , Rf^O.42; F. ^ ^=0,52

Vaihe 5: Boc-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z (V1) Käyttämällä lähtöaineena 1,0 g (2,65 m mol) Boc-Tyr-Pro-OH (IV } ja CC7 g (2,65 mmol ) H-Ser-NH-NH-Z . HC1 ( II * ) , jolloin käytettiin vaiheen 1 mukaista menetelmää, s··; itiin 1,46 g yhdistettä (V') (kiteytys dietyylieetterin ja petrolieptte-rin seoksesta), sp. 116-11S°C, [oc] 2 ^ - -46,5' ( c = 1 , K e 0 H ) ,

RfA=0,17, Rfg=0,37.

Vaihe 6: H-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z.HC1 (VI’) Käyttämällä lähtöaineena 1,0 g (1,63 mmol) Boc-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z (V1), jolloin käytettiin vaiheen 2 mukaista menetelmää, saatiin 0,78 g yhdistettä (VI1) dietyy1ieetteristä, sp. 172-174°C, [<*j25 = -38,4° (c=l, MeOH), Rf =0,46; E =0,79.

1 t C

Vaihe 7: Boc-Phe-Gly-NH-NH-Z (VII’) Käyttämällä lähtöaineena 1,0 g (3,8 mmol) Boc-Phe-OH ja 0,95 g (3,7 nmol) H-Gly-NH-NH-Z.HC1 (K. Hofmann et ai., J . Am.Chem.Soc. 94, 1972, s. 6171), jolloin meneteltiin vai heen 1 mukaisesti, saatiin 1,4 g yhdistettä (VII1) metanolin 2 5 ja di-isopropyylieet. terin seoksesta, sp. 143°C, (j*] = +5,6° (c=l, MeOH), Rf =0,63.

Vaihe 8: H-Phe-Gly-NH-NH-Z.HC1 (VIII1) 1,0 g (2,1 mmol) 3oc-?he-Gly-NH-NH-Z (VII1) käsiteltiin 30 18 73699

minuuttia huoneenlämpötilassa 10 nhlla 1,3n liuoksella, jossa oli kloorivetyä jääetikassa. Liuottimen poistamisen jälkeen tyhjössä lämpötilassa iO°C ja jäännöksen jauhamisen jälkeen dietyylieetterin kansia saatiin 0,89 g yhdistettä (VIII·), sp. 17 8c C , [OCJ 25 = +45° (c = l, M eOH ) , Rf ?0,78; E

v X. f -0,88.

Vaihe 9: Boc-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z (IX') Käyttämällä lähtöaineena 1,0 g (5,3 mmol) Boc-ala-OH ja 2,09 g (5,1 mmol) K-Phe-GLy-NH-NH-Z.HC1 (VIII'), jolloin meneteltiin vaiheen 1 mukaisesti, saatiin 2,5 g yhdistettä (IX') netanolin ja di-isopropyylieetterin seoksesta, sp.

1 6 5 C , = + 3° ( c = 1 , yteOH) , Rf =0,51.

Vaihe 10 : H-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z.HCl (X’ ) Käyttämällä lähtöaineena 1,0 g (1,8 mmol) Boc-a 1a-Phe-G1y-NH-NH-Z (IX1), jolloin käytettiin vaiheen 6 mukaista menetelmää, saatiin 0,84 g yhdistettä (X1), sp. 18 0°C, [oi] 2 = 0,2° (eri, M e OH} , Rf =0,75; E =0,80.

V-/ 1 I C

Vaihe 11: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH-Z (XI’) Käyttämällä lähtöaineena 2,0 g (3,5 mmol) Boc-Tyr-OH ja 1,65 g ; ?,4 mmol) H-a1a-Phe-G ly-NH-NH-Z.HC1 (X'\ jolloin meneteltiin vaiheen 5 mukaisella tavalla, saatiin 2,24 g yhdistetä (XI1) (kiteytys metancii-di-isopropyylieetteris-tä), sp. 148 5 C , [v] = +16,2° ( c = 1 , MeOH ) , Rf =0,38.

Λ

Vaihe 12: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-NH-NH2 (XII’) 1,0 g (1,4 mmol) Boc-Tyr-a 1 a-Phe-Gly-NH-NH-Z (XI') 10 ml.ssa metanolia hydrattiin huoneenlämpötilassa, jolloin käytettiin 0,27 g 10 % Pd/c. Suoritus toteutettiin kuten vaiheessa 4, jolloin saatiin o,64 g yhdistettä (X11: ), sp. 148°C, [*]25 = +26,6° (c=l, MeOH), Rf =0,34; E, =0,57.

B 1,2

II

19 73699

Vaihe 13: Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z (XIII')

Liuokseen, jossa oli 1 g (1,75 mmol) Boc-Tyr-ala-Phe-Gly-N H-N H (XII1) 15 m 1:s s a vedetöntä dimetyyliformamidia lisättiin 1,1 ml (4,38 mmol) 4n kloorivetyä vedettömässä tetra-hydrofuraanissa ja 0,2 ml (1,93 mmol) n-butyylinitriittiä peräkkäin lämpötilassa - 3 0 u C . Kun sekoittamista oli tässä lämpötilassa jatkettu 30 minuuttia, lisättiin 0,5 ml (4,38 mmol) N-metyylimorfoliinia, minkä jälkeen kylmä liuos (- 3 00 C ) , jossa oli 0,803 g (1,46 mmol) H-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z.HC1 (VI’) ja 0,16 ml (1,46 mmol) N-metyylimorfoliinia 15 ml:ssa vedetöntä dimetyyliformaraidia lisättiin seokseen. Reakiioseoksen annettiin reagoida kaksi vuorokautta lämpötilassa -90 C, minkä jälkeen suolat poistettiin suodattamalla, liuotin poistettiin tyhjössä ja tuote kaadettiin lämpötilaan 0°C jäähdytettyyn sitruunahappoliuokseen. Sakka poistettiin suodattamalla, pestiin vedellä neutraaliksi ja kuivattiin tyhjössä. Tuote toistokiteytettiin etyyliasetaatin ja di-etyy1ieetterin seoksesta, jolloin saatin 1,15 g yhdistettä (XIII'), sp. 140-1500 C , £oiJ 2 5 = -20,3C (c = l, MeOH), R f = 0,17, R f =0,92.

Vaihe 14: H-Tyr-a1a-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z.HC1 (XIV) Käyttämällä lähtöaineena 1,0 g (0,95 mmol) Boc-Tyr-a1a-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH-NH-Z (XIII'), jolloin meneteltiin vaiheessa 2 esitetyllä tavalla, saatiin 0,89 g yhdistettä cr (XIV') etyyliasetaatista, sp. 17 0 0 C (hajoaa), [ot] = -1,8-1 (c = 1 , MeOH), [öc]25 = + 1,03 (c = l, AcOH), Rfc = 0,69; E ^ 2=0,50.

Käyttämällä klassisia 1iuotusmenetelmiä syntetisoitiin myöskin seuraavat muut johdannaiset: XXXI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH0 . HC1 , sp. 210-220’JC (hajoaa) (isopropyylialkoholi-dietyylipetteri ) ;

Rf =0,44; R f = 0,66; E, -=0,51.

O U i , 7 3699 XXXII ' H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-(Bzl)-Hyp-Ser-(3zl) -NH„-HC1 , so. 175-180JC (hajoaa) (metyylialkoholi-dietyyi- eetteri); R f = 0,6 7 ; Ξ ^ -0,44.

XXXV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Va.l-Ser-NH . CF C00H , g p . 20 3- 2 0 0 0 C (hajoaa) (dietyylieetteri); R f . 0,71; r = o a i ' 1 . 2 XXXVII) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Gly-Ser-NH^FCOOH, sp. 180-190°C (hajoaa) (die‘yylieetteri); R f = 0,51 ; Hfn =0,7 3; E, =0,52.

w *- ϊ <- XXXTX ' H-Tyr-al a-Phe-Gly-Phe-Pro-Ser-NH . HC1 , go. 190-195°C (hajoaa) ('”e tyy 1 ialkohol i-di e tyy 1 ieet-fceri ) ; ?.f =0,84 ; E , p=0,52 .

XLI) H-Tyr-?. 1 a-Phe-Gly-Phe-Hyp-Ser-NHp.HCl , s p . 10 0 " C h -11 j o a a ) ( m e t y ylialko holi-e tyyliä go-aat- t i ; ; Rf„=0,47; Rf =0,75;-, „=0,51.

J i , 4 X L 11 ) H-Tyr-ala-rhe-Gly-Pne-Hyp-Ser-(Bzl)-NH.HCl, sp. 160-170 °C (hajoaa) ( isopropyylialkoholi-etyyliasetaatti); R f = 0,6 5 ; E = C,5 0.

vj 1 I <1 XLV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Trp-Pro-Sr - N H „ . HC1 , sp. 210-220QC (hajoaa) ( isor ropyylialkoholi-etyyliasetaatti); Rf =0,54; R f „ = 0,7 9 ; E „ = 0,50.

XLVII) H-Tyr-ala-Phe-Phe-Tyr-Pro-Ser-NH . H C1 , sp. 19S-200°C

(hajoaa) (dietyylieetteri); R f^ = 0,6 6 ; R f^ = 0,3 2 ; E1i2=0,50.

X.LVIH ; H-Tyr-ala-Phe-Phe-Tyr-ί 3z 1 )-Pro-Ser-NHHCl , ? p . 160-180 °C (hajoaa) (etyylialkoholi-dietyylieet- <-eri ) ; ,-0,72; Rf =0,90; E, =0,46.

U .L J C.

LII) H-Tyr-a. ia-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH CHI, sp. 195-200°C (hajoaa) (dietyylieetteri); Rf =0,49;

r . 2 7 C

E, „ = 0,49 ; jxJ -=+18° '0 = 1, MeOH) .

L111 ) H-Tyr-a la-P.he-Gly-Gly-Pro-Ser-NH .HCl, ^ 20 sp. 180°C (hajoaa) (dietyylieetteri); [pc] =0 (d = l, M e 0 H ) ; Rf =0,32; E, =0,53.

LIV ) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NHMe.HC1 , 2 ft sp. 2 4 0 3 C (hajoaa) (dietyylieetteri); [oc] = 0 ( c = 1 ,

MeOH); Rfc=0,55: Εχ ?=0,52.

73699 LV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NHÄt. HC1 ,

•5 Q

sp . 2 3 5 0 C (hajoaa) ( d ie ty y 1 i e e 11 e r i ) ; [öt] ^ = -.3,54J (c=l, MeOH); Rf =0,62; Εχ 2=C,52.

LVI) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-OMe.H C1, sp. 2 400 C (hajoaa) (dietyylieetteri); [t* ]' ~ 8 = - 4,5 0 C (c = l,MeOH); Rfc=0,66; F. χ 2=0,55.

LXV 111) H-Tyr-met-Phe-G1y-Tyr-Fro-Ser-NH0.HC1 ; cl

Rfp=0,56; E =0,50.

LXIX) H-Tyr-ala-Phe-Pro-Tyr-Pro-Ser-NH.HCl, sp . 200- 205°C (hajoaa) (dietyy 1 ieetter i ) ; Rf^,=0,46: E = 0,51; x>c] 25 = -29,80C, ( c = 1 , MeOH'».

LXX) H-Tyr-ala-Phe-MePhe-Tyr-Pro-Ser-NH .HCl, sp. 210°C (hajoaa) (etyyliasetaatti); R1^=0,74; E, =0,44; [oil i^_22 = -4f‘, 9° (Cl, DMF).

LXXII ) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Ppa-Ser-NH . HC 1 , sp. 222°C (hajoaa) (etyyliasetaatti); R f = 0,7.3 ; E1 2 = 0,52; [«] 1 9-22 = + 1 , 1 ° (c = l, MeOH).

LXXIV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Tia-Ser-NH.HCl, sp. 225-226°C (hajoaa) (dietyy1ieetteri) Rf =0,73; 1 Q — P 9 ^ E12 = 0,51; [Oc] =-8,9° (c = l, MeOH).

LXXV) A) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr- kpr-Ser-NH .HC1 B) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr- ^Pr-Ser-NH.HCl B) sp. 188°C (hajoaa) (dietyylieetteri); Rf =0,58; 20 ^

El,2 = 0,52: W ='40,6' (c = 1 , MeOH).

A) sp. 18 50 C (hajoaa) (dietyylieetteri); Rf =0,62; 20 ^ E =0,52; [dc.] = + 106,9° (c = l, MeOH).

J- » LXXV11 ) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Abu-NH .HCl, EU2 = 0,52.

LXXVIII)H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Gly-NH.HCl, sp. 179-185°C (hajoaa) (metyy1ia 1 koho 1idi-isopropyy-lieetteri ) ; Rfc = 0,57; Εχ 2=0,51; [<*] 22 = + 14,8 ° (c = l,

MeOH) .

LXXIX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr(Bzl)-Pro-Ser(Bzl)-NH HC1, sp. 160°C (hajoaa) (isopropyy1ialkoho1i-dietyy11ee^ teri); Rfc=0,81; E^^q.44; [kJ20 = + 9,9° (c = l, MeOH ) LXXX) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser(Bzl)-NH2HCl, sp. 1740 C (dietyylieetteri); Rf =0,79; E = Q * q r a 19-22 . _a , , C 1,2 L*-J =^4,83 (c = l , MeOH ) .

2? 73699 LXXXin H-tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-OH.HC1, sp . 21rj°C (hajoaa) (isopropyy1ialkoho1i-diefyy1ieet-teri); Rf =0,57; E =0,50; [o<J 22 - + 2,4 (c = l, MeOH). C111 ) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr(Bzl)-Fro-Ser-NH .HCl, sp. 169 - C (hajoaa) (inetyyll alkoholi -e tyy liasetaat- Ο Π hi); Rf =0,65; E. „=0,46; [(*] =+5,4J (c = l, MeOH).

CIV) H-Tyr-ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NHNH 2HC1, sp. 198-2 0 0'C (hajoaa) { isopropyy 1ia 1 koho 1i-etyy 1 i -asetaatti) ; Rfc=0,52; E1 =0,86; [ot] 2 5 = - 1,4 J (c = l,

MeOH).

II

Claims

7 3 6 9 9 PATENTTIVAATIMUS Menetelmä uusien lääkeaineena käytettävien peptidien valmistamiseksi, joiden kaava on H - Tyr - A - Phe - B - C - W , (I ) jossa - A on D-aminohappotähde, joka on valittu D-alani in in , D - m e -tioniinin ja D-metioniinisulfoksidin muodostamasta ryhmästä , - B on glysiinitähde tai N-metyyliaminohappotähde, joka on joko sar k osiini tai L-N-metyylifenyylialaniini, tai neutraali L-aminohappotähde, joka on joko fenyy1i a lan i i n i tai proli in i, - C on tripeptiditähde, joka on valittu ryhmästä, jonka muo dostavat L-tyrosyyli-L-prolyyli-L-seryyli, (O-bentsyyli)-L-tyrosyyli-L-prolyyli-L-seryyli, L-tyrosyyli-L-hydroksi-prolyyli-L-seryyli , (O-bentsyyli)-L-tyrosyyli-L-hydroksi- propyyii-L-seryyli , (O-bentsyyli)-L-tyrosyyli-L-hydroksi— propyyli-(0-bentsyy li)-L-seryyli, L-tyrosyyli-L-valyyii-L-seryyli, L-tyrosyy1ig1ysyy1i-L-seryy1i, L-fenyy1ia 1 anyy-li-L-hydroksipropyy li-L-seryyli, L-tryptofyyli-L-propyyli-L-seryy1i, L-fenyy 1 ia 1 anyy1i-L-pro1yy1i-L-seryy1i , L-fe- nyyli-aLanyyli-L-hydroksiprolyyli-(0-bentsyyli)-L-seryyli, glysyyli—L — prolyyli — L — seryyli, L — t yrosyyli — L — pipekolyyli-L-seryy1i, L-tyrosyy1i-L-tiatso1idyy1i-L-se ryy 1 i , L-tyro-syyli-L-3,4-dehydropropyy1i-L-seryy1i, L-tyrosyyli-D-3,4-dehydroprolyyli-L-seryyli, L-tyrosyy1i-L-pro 1yy1i-L-K-ami-no bu ty ry yli, L-tyrosyy1i-L-prolyy1iglysyyIi , (O-bentsyy-1i)-L-tyrosyy1i-L-prolyy1i-(Q-bentsyyli)L-seryy1i, L-tyro-syyli-L-prolyyli-(0-bentsyyli)-L-seryyli, (4-nitro)-L-fe-nyylialanyyli-L-prolyyl i-L-seryyli, (4-fluoro)-L-fenyyli-a1anyy1i-L-prolyyli-L-seryyli, L-heksahydroksifenyyliala-nyyli-L-prolyyli-L-seryyli, L-fenyy1ig 1ysyy:tL_pΓΟχyyλL_ seryyli ja 7 3 699 - W on OH, OR, NH2, NHR, N H N H 2, NHNHR' , jossa R on C.-C^-al-kyyli ja R’ on bentsyy1ioksikarbonyy1i, tai mainittujen peptidien farmaseuttisesti hyväksyt 1ävien suolojen valmistamiseksi, t u n e t t u siitä, että yleisen kaavan mukaisesta yhdisteestä X _ Tyr - A -Phe - B - C - W jossa A, B, C ja W tarkoittavat samaa kuin edellä ja X on tert-butyylioksikarbonyy1iryhmä , poistetaan suojaryhmä käsittelemällä sitä trifluorietikkahapolla tai kloorivetyha-polla orgaanisessa liuottimessa lämpötilassa, joka on 0’C:n ja huoneenlämpötilan välillä. Il 73699 Förfarande för framställning av nya peptider vilka används som läkemedel, vilkas formel är H - Tyr - A - Phe - B - C - M, (I) där - A är en D-aminosyrarest, som har valts ur en grupp bildad av D-alanin, D-metionin och D-metioninsulfoxid, - B är en glysinrest eller en N-metylaminosyrarest, som an-tingen är en sarkos eller en L-N-metylfenylalanin. eller en neutral L-aminosyrarest, som är antingen fenylalanin eller prolin. - C är en tripeptidrest, som är vald ur en grupp som utgörs av L-tyrocyl-L-prolyl-L-seryl, (O-benzyl)-L-tyrocyl-L-prolyl-L-seryl, L-tyrccyl-L-hydrox-prolyl-L-sery1, (0- benzy1)-L-tyrocyl-L-hydroxpropy1-L-seryl, (0-benzy1)-L-tyrocyl-L-nydroxpropy1-(0-benzy1)-L-seryl, L-tyrocy1-L-valyl-L-seryl, L-tyrocylglycyl-L-seryl, L-fenylalanyl-L-hydroxpropyl-L-seryl, L-tryptofy1-L-propy1-L-seryl, L- fenylalany1-L-proly1-L-seryl, L-fenyl-alany1-L-hydrox-prolyl-(0-benzy1)-L-seryl, glycyl-L-prolyl-L-sery1, L-tyrocyl-L-pipekolyl-L-seryl, L-tyrocyl-L-tiazoldyl-L-s eryl, L-tyrocyl-L-3,4-dehydropropy1-L-seryl, L-tyrocyl-D-3,4-dehydropropyl-L-sery1, L-tyrocyl-L-prolyl-L~c<-aminobutyryl, L-tyrocy1-L-prolylglycyl, (0-benzy1)-L-tyrocy1-L-proly1-(0-benzyl)-L-seryl, L-tyrocy1-L-proly1-(0-benzy1)-L-sery1, (4-nitro)-L-fenylalanyl-L-prolyl-L-seryl, (4-fluoro)-L-fenyl-alany1-L-proly1-L-seryl, L-hexahydroxfenylalany1-L-proly1-L- seryl, L-fenylglycyl-L-prolyl-seryl och - W är OH, OR, NH*, NHR, NHNH3, NHNHR’, där R är en C»-C^-alkyl och R’ en benzyloxikarbonyl,