CS255616B1

CS255616B1 - Způsob výroby (2-0-metyltyrosin)deamino-1-karbaoxytocinu

Info

Publication number: CS255616B1
Application number: CS865461A
Authority: CS
Inventors: Petr Simek; Vaclav Jares; Ludek Lepsa; Adolf Geisler; Viktor Krchnak; Milan Krojidlo; Jiri Kolinsky; Michal Lebl
Original assignee: Petr Simek; Vaclav Jares; Ludek Lepsa; Adolf Geisler; Viktor Krchnak; Milan Krojidlo; Jiri Kolinsky; Michal Lebl
Priority date: 1986-07-18
Filing date: 1986-07-18
Publication date: 1988-03-15
Also published as: CS546186A1

Abstract

Řešení se týká výroby (2-0-metyltyro- sin)deamino-l-karbaoxytocinu. Nejprve se syntézou na pevném nosiči připraví hep- tapeptid vzorce I Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-O- (7) (I), kde Z je benzyloxykarbonyl, který se převede do roztoku odštěpením z nosiče působením metanolického roztoku amoniaku za vzniku chráněného heptapeptidu II Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2 (II)t ze kterého se odštěpí chránící skupiny roztokem sodíku v kapalném amoniaku, alkyluje se sulfhydrilová skupina cysteinu etylesterem kyseliny «Γ -brommáselné a esterová skupina se hydrolyzuje roztokem hydroxidu sodného, čímž se připraví volný heptapeptidamid III H-Ile-Gln-Asn-Cys(C3H6COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2 (III), ke kterému se přikondenzuje derivát tyrosinu IV X-Tyr(Me)-OH (IV), kde X je tercřbutyloxykarbonylová nebo o-nitrofenylsulfenylová skupina, za vzniku oktapeptidamidu V X-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys(C3H6COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2 (V), kde X má již uvedený význam, načež se odštěpí chránící skupina a volný oktapeptidamid se cyklizuje rozpuštěním v pufrovaném roztoku dimetylformamidu s přídavkem difenylfosforazidu nebo pomocí N,N*-dicyklohexylkarbodiimidu a N-hydroxybenztriazolu. Produkt je používán ve veterinární medicíně.

Description

Vynález se týká způsobu výroby (2-0-metyltyrosin)deamino-l-karbaoxytocinu, analoga přírodního hormonu oxytocinu, jenž je metabolicky odolnější, tzn. že má ve srovnání s oxytocinem několikanásobně prodloužený účinek, což je při klinické aplikaci vítanou vlastností.

Tento analog, který má charakter cyklického peptidů, je známý a rovněž jeho příprava byla popsána (čs. pat. spis. č. 149 028, Čs. AO č. 230 542). Nověji byla jeho tradiční syntéza v roztoku nahrazena tzv. syntézou v pevné fázi,.tj. na vhodném nosiči (čs. autorské osvědčení č. 237 944). Obě jmenované metody neposkytují dostatečné výtěžky a kromě toho jsou při převádění do většího měřítka neúnosně pracné. Metoda s použitím pevného nosiče poskytuje sice mnoho výhod, včetně zkrácení jednotlivých stupňů, ovšem výtěžky při posledním stupni, tj. při cyklizaci oktapeptidamidu jsou nízké, produkt nemá potřebnou čistotu a dostatečné čištění znamená opět ztráty a zdržení, čímž jsou výhody předcházejících stupňů znehodnoceny.

Ve snaze odstranit tyto nevýhody byly hledány optimální podmínky syntézy (2-0-metyltyrosin)deamino-l-karbaoxytocinu, při nichž by bylo možno využít osvědčené přednosti známých metod. I když mnoho strukturně blízkých derivátů bylo možno na pevném nosiči cyklizovat s uspokojujícími výtěžky, nebylo tomu tak v případě (2-0-metyltyrosin)deamino-1-karbaoxytocinu, kdy zejména izolace konečného produktu po cyklizaci se ukázala mimo očekávání jako velice pracná, časově náročná a ztrátová, což byly základní překážky, které bránily jejímu přenesení do žádoucího většího, tj. provozního měřítka.

Zmíněné nevýhody se s překvapením podařilo odstranit účelným využitím obou známých metod a nověji popsaných výhodných činidel pro cyklizaci, především dífenylfosforazidu.

Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby (2-0-metyltyrosin)deamino-l-karbaoxytocinu, jehož podstata spočívá v tom, že se nejprve peptidamid vzorce I

Ζ-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-O-@ kde Z je benzyloxykarbonyl, Bzl je benzyl a odštěpením z nosiče působením metanolického peptidů II

Z-Ile-Gln-Agn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-Ní^ syntézou na pevném nosiči připraví hepta(I) , ©je nosič, který se převede do roztoku roztoku amoniaku za vzniku chráněného hepta(II) , ze kterého se odštěpí chránící skupiny roztokem sodíku v kapalném amoniaku, alkyluje se sulfhydrilová skupina cysteinu etylesterem kyseliny f'* -brommáselné a esterová skupina se hydrolyzuje roztokem hydroxidu sodného, čímž se připraví volný heptapeptidamid III

Η-Ile-Gln-Asn-Cys(C^HgCOOH)-Pro-Leu-Gly-Ní^ (III), ke kterému se přikondenzuje derivát tyrosinu IV

X-Tyr(Me)-OH (IV), kde X je terč.butyloxykarbonylová nebo o-nitrofenylsulfenylová skupina a Me je metyl, za vzniku oktapeptidamidu V

X-Tyr (Me)-Ile-Gln-Asn-Cys (C^COOH) -Pro-Leu-Gly-NH₂ (V) , kde X a Me mají již uvedený význam, načež se odštěpí chránící skupina a volný oktapeptidamid se cyklizuje rozpuštěním v pufrovaném roztoku dimetylformamidu s přídavkem difenylfosforazidu, nebo pomocí N,N’-dicyklohexylkarbodiimidu a N-hydroxybenztriazolu.

Při provedení způsobu podle vynálezu se nejprve na vhodném nosiči, zpravidla chlormetylovaném kopolymeru styren-l%divinylbenzenu, fixuje chráněný derivát glycinu a postupným připojováním potřebných chráněných derivátů aminokyselin se vytvoří heptapeptidamid vzorce I, který se z nosiče uvolní a se kterým se potom až do konce syntézy pracuje v roztoku podle některého ze známých postupů. V závěru syntézy, tj. při cyklizaci oktapeptidamidu vzorce V (po odštěpení chránící skupiny) na žádaný (2-0-metyltyrosin)deamino-l-karbaoxytocin, se výhodně osvědčilo použití difenylfosforazidu.

Jak z uvedeného vyplývá, spojuje způsob podle vynálezu výhody obou známých metod. Rozhodujícím momentem bylo nalezení vhodného stupně, kdy přerušit syntézu na pevném nosiči a přijít na provedení zbývajících stupňů v roztoku, k němuž přispěly systematické srovnávací pokusy. Způsobem podle vynálezu došlo ke zvýšené výrobě žádaného peptidu při současném snížen materiálových nákladů, úspoře surovin i pracovních sil, přičemž získaný peptid má vynikající kvalitu.

Způsob podle vynálezu je blíže popsán v následujících příkladech provedení, které tento způsob pouze ilustrují, ale nikterak neomezují.

Přiklad 1

a) Amid benzyloxykarbonyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-propyl-leucyl-glycinu (látka II)

100 g chlorometylovaného kopolymeru (styren-1% divinylbenzenu), na který byl navázán Boc-Gly v množství 1 mmol/g, se postupně kondenzuje pomocí třímolárního přebytku Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimidu, N-hydroxybenztriazolu a vhodného derivátu aminokyseliny s těmito aminokyselinami: Boc-Leu, Boc-Pro, Boc-Cys(Bzl), Boc-Asn, Boc-Gln a Z-Ile, za vzniku látky I. K odštěpování terč.butyloxykarbonylové skupiny se používá roztok kyseliny trifluoroctové v metylenchloridu, resp. v dimetylformamidu.

Po ukončení syntézy se pryskyřice oddělí, vysuší a suspenduje se ve 3 litrech absolutního metanolu. Suspenze se ochladí na -10 °C a nasytí se plynným amoniakem. Po 24 h stání se pryskyřice odfiltruje a extrahuje se třikrát třemi litry dimetylformamidu o teplotě 80 °C. Extrakt se zahustí ve vakuu na objem cca 200 ml a z odparku se přídavkem 2 litrů éteru vysráží produkt. Po odfiltrování a vysušení se získá 70 g (tj. 72% teorie) látky II, která je identická s produktem připraveným metodou v roztoku. Tato shoda byla potvrzena aminokyselinovým složením, chromatografii na tenké vrstvě a vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii.

b) Amid isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-y-karboxypropionylcysteinyl-propyl-leucyl-glycinu (látka III) g látky II se rozpustí v roztoku 0,5 g amidu sodného v 6 litrech vroucího kapalného amoniaku a redukuje se sodíkem (asi 12 g) do vzniku modrého zbarvení roztoku stálého po dobu 20 sekund. Roztok se odbarví přidáním asi 16 g chloridu amonného a přidá se 75 ml (101,3 g) etylesteru kyseliny -brommáselné. Amoniak se odpaří ve vakuu a odparek se rozpustí v 1,5 1 0,2 N hydroxidu sodného. Po 45 minutách míchání se roztok odfiltruje, nanese se na kolonu katexu v H⁺-cyklu (DOWEX 50) a produkt se vytěsní 10% vodným roztokem pyridinu. Pyridinový eluát se odpaří do sucha, odparek se rozpustí ve 230 ml 90% vodného metanolu a produkt se vysráží 7,5 litru éteru. Po odfiltrování a vysušení se získá 44 g (tj. 85% teorie) látky III, která je identická s produktem připraveným metodou v roztoku.

c) Amid o-nitrofenylsulfenyl-O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-Υ-karboxypropionyl-prolyl-leucyl-glycinu (látka V)

K roztoku 38,3 látky III v 500 ml dimetylformamidu se přidá 7,9 g N-hydroxybenztriazolu a 22,7 g p-nitrofenylesteru o-nitrobenzensulfenyl-O-metyltyrosinu. Po 24 hodinách se přidá dalších 13,3 g aktivního esteru a ponechá se stát do druhého dne. Po vysrážení směsi éteru (2,7 1) s etylacetátem (1,13 1) se získá 46 g (tj. 86% teorie) látky V, identické s produktem připraveným metodou v roztoku.

d) (2-0-metyltyrosin)deamino-l-karbaoxytocin g látky V se za tepla rozpustí ve 300 ml dimetylformamidu a ochladí se na teplotu místnosti, přičemž látka V se znovu vyloučí z roztoku. K suspenzi se přidá 50 ml 2 N roztoku chlorovodíku v dioxanu. Po 15 minutách stání při teplotě místnosti se vzniklý roztok vlije do 4 1 éteru. Vyloučená sraženina se odsaje a rozpustí ve 4 1 dimetylformamidu. Roztok se ochladí na 0 °C, za míchání se přidají 4 g hydrogenfosforečnanu draselného a 11,5 g difenylfosforazidu. Průběh reakce se sleduje vysokoúČinnou kapalinovou chromatografií a v reakci se pokračuje do vymizení výchozí látky. Reakční směs se zfiltruje, filtrát se zahustí ve vakuu do vydestilování většiny diemtylformamidu. Zbytek se rozpustí v cca 1 000 ml 20% kyseliny octové, roztok se zfiltruje a přímo se použije k čištění surového produktu vysokoúČinnou kapalinovou chromatografií. Získá se 8 g (2-0-metyltyrosin)deamino-l-karbaoxytocinu (vztaženo na 100% látku), která svými vlastnostmi odpovídá produktu získávanému klasickým způsobem syntézy v roztoku.

Příklad 2

Podle postupu v příkladě 1 se postupuje až do látky V, načež se 60 g látky V rozpustí za tepla v 900 ml koncentrované kyseliny octové, ochladí se na teplotu místnosti a přidá se 75 ml 8 N roztoku chlorovodíku v dioxanu. Po 20 minutách stání při teplotě místnosti se roztok vlije do 10 1 absolutního éteru. Vyloučená sraženina se odsaje, vysuší a rozpustí se v 940 ml dimetylformamidu a 670 ml dioxanu, přidá se 79 g N-hydroxybenztriazolu a roztok se vychladí na -10 °C. Přidá se roztok 86 g N,N’-dicyklohexylkarbodiimidu ve 100 ml dimetylformamidu a míchá se 2 hodiny při teplotě místnosti. Potom se reakční směs přikape do roztoku 150 ml trietylaminu v 6 1 metanolu zahřátého na teplotu 40 °C rychlostí kolem 1 1 za hodinu. Reakční směs se ponechá stát přes noc, okyselí se kyselinou octovou a rozpouštědla se odpaří ve vakuu. Odparek se rozpustí vil 20% kyseliny octové, roztok se zfiltruje a přímo se použije k čištění surového produktu vysokoúČinnou kapalinovou chromatografií. Získá se 10 g (2-0-metyltyrosin)deamino-l-karbaoxytocinu (vztaženo na 100% látku), který svými vlastnostmi odpovídá produktu získávanému klasickým způsobem syntézy v roztoku.

Příklad 3

Podle postupu v příkladech 1 a 2 bylo dosaženo stejných výsledků, jestliže pro oktapeptidamid vzorce V byla místo o-nitrofenylsulfenylové skupiny použita skupina terc.butyloxykarbonylová.

Seznam zkratek použitých v textu

Z- benzyloxykarbonylová skupina

Boc- terč.butyloxykarbonylová skupina (p\ - kopolymer (styren-1% divinylbenzenu)

Bzl- benzylová skupina

Me- metylová skupina

Tyr tyrosin

Ile isoleucin

Gin glutamin

Asn asparagin

Cys cystein

Pro prolin

Leu

Gly leucin glycin

-C^HgCOOH -karboxypropionylová skupina

HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Claims

Způsob výroby {2-0-metyltyrosin)deamino-1-karbaoxytocinu vyznačující se tím, že se nejprve syntézou na pevném nosiči připraví heptapeptid vzorce I

Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-O-(I i, kde Z je benzyloxykarbonylová skupina, Qp) je nosič, Bzl je benzyl, který se převede do roztoku odštěpením z nosiče působením metanolického roztoku amoniaku za vzniku chráněného heptapeptidu II

Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH^ (II), kde Z a Bzl mají již uvedený význam, ze kterého se odštěpí chránící skupiny roztokem sodíku v kapalném amoniaku, alkyluje se sulfhydrilová skupina cysteinu etylesterem kyseliny ^-brommáselné a esterová skupina se hydrolyzuje roztokem hydroxidu sodného, čímž se připraví volný heptapeptidamid III

Η-Ile-Gln-Asn-Cys (C^COOH) -Pro-Leu-Gly-NH₂ (III) , ke kterému se přikondenzuje derivát tyrosinu IV

X-Tyr(Me)-OH (IV), kde X je terč.butyloxykarbonylová nebo o-nitrofenylsulfenylová skupina a Me je metyl, za vzniku oktapeptidu V

X-Tyr (Me) -Ile-Gln-Asn-Cys (C^COOH) -Pro-Leu-Gly-NH₂ (V) , kde X a Me mají již uvedený význam, načež se odštěpí chránící skupina a volný oktapeptidamid se cyklizuje rozpuštěním v pufrovaném roztoku dimetylformamidu s přídavkem difenylfosforazidu nebo pomocí N,Ν'-dicyklohexylkarbodiimidu a N-hydroxybenztriazolu.