RU2063979C1 - Пептиды последовательности окситоцина - Google Patents

Abstract

Использование: в химии, биологии и медицине для синтеза окситоцина. Сущность изобретения: пептиды последовательности окситоцина общей формулы: Rоc- A-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH₂; A=Asn (1), Ile-Gln-Asn (2), Cys(Trt)Tyr-Ile-Gln-Asn (3) в качествe промежуточных соединений в синтезе окситоцина, которые получают конденсацией С-концевого трипептида с соответствующим производным дипептида методом активированых эфиров с использованием ДЦГК и гидроксибензотриазола, полученный пентапептид после удаления BOC-защитной группы используют для получения 2 конденсацией 1 с соответствующим производным дипептида аналогичным методом. Новый гектапептид после удаления BOC-защитной группы используют в синтезе нонапептида окситоцина путем сочетания с соответствующим дипептидом методом активированных эфиров. Окситоцин (α) $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{20}}{\text{D}}$ = -28^o (С 1,1%, AcOH), биологическая активность 250-390 ED/мт.

Description

Изобретение относится к новым соединениям пента-, гептаи нонапептиду последовательности окситоцина, которые могут найти применение в качестве промежуточных соединений для синтеза окситоцина и родственных ему соединений, например дезаминоокситоцина, используемых в биологии и медицине.

Известно применение в качестве промежуточного продукта при получении окситоцина нонапептида, получаемого по способу, предложенному фирмой Циба-Гейги [1] Исходным соединением для получения нонапептида формулы BOC-Cys(Trt)-Tyr(OBu^t)-Ilt-Gln-Asn-Cys(Trt)- Pro-Leu-Gly-NH₂ служит тетрапептид формулы Trt-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH₂. Нонапептид получают конденсацией амида C-концевого тетрапептида с пентапептидом. Детритилирование с одновременным образованием дисульфидной связи осуществляют действием йода в спирт-содержащем растворе. BOC- и -OBu^t защитные группы удаляют в водном растворе соляной кислоты. Полученный окситоцин подвергают дальнейшей очистке.

Недостатком известного нонапептида является возможное наличие в нем дегидратированного аспарагина, возникающего при использовании в качестве исходного соединения С-концевого амида тетрапептида при синтезе нонапептида, что приводит к загрязнению нонапептида.

Наиболее близким по строению к предлагаемому нонапептиду является нонапептид Trt-Cys(Trt)Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gln- NH₂ [2] Исходными соединениями для синтеза этого нонапептида являются C-концевые эфиры (метиловые) тетра- и гексапептидов, содержащие алкиловые эфиры глутаминовой и аспарагиновой кислот (γ и β соответственно) или соответствующие амиды этих кислот [3] В качестве временной защиты N^a-аминофункции используют тритильную группу. Амидирование эфиров глицина, глутаминовой и аспарагиновой кислот осуществляют на стадии получения нонапептида. N,S,S'-тритритильное производное окситоцина детритилируют в одну стадию в кислой среде в присутствии апротонных растворителей. Образование дисульфидной связи осуществляют окислением в водной среде. Полученный таким образом окситоцин имеет биологическую активность 100-150 ЕД/мг.

Недостатком известного нонапептида является то, что при использовании N, S, S'-тритритилокситоцина по данному методу удается получить субстанцию с активностью не более 150 ЕД/мг. Кроме того, конденсация фрагментов N-концевого трипептида и С-концевого гексапептида с использованием N,N'-дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) может привести к рацемизации изолейцина.

Цель изобретения новые промежуточные продукты, которые используются в синтезе окситоцина и родственных ему веществ пептидной природы, например дезаминоокситоцина.

Поставленная цель достигается тем, что используют новые пептиды общей формулы BOC-A-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH₂ (I-III), где A Asn (I), Ile-Gln-Asn (II), Cys(Trt)-Tyr-Ile-Gln-Asn (III), BOC трет.-бутилоксикарбонил, Trt трифенилметил, в качестве промежуточных соединений в синтезе окситоцина и родственных веществ пептидной природы, например дезаминоокситоцина.

Новый пентапептид формулы I получают конденсацией амида C-концевого трипептида с соответствующим производным дипептида методом активированных эфиров с использованием ДЦГК и гидроксибензотриазола (ОБТ) или иным методом, использование этого пентапептида при получении окситоцина на его основе позволяет значительно улучшить качество конечного продукта.

Пентапептид используют после удаления BOC-защитной группы в дальнейшем для получения нового гептапептида формула II конденсацией его с соответствующим производным дипептида методом, аналогичным методу получения пентапептида.

Новый гептапептид формулы II после удаления BOC-защитной группы используют в синтезе нонапептида окситоцина или дезаминоокситоцина путем сочетания методом активированных эфиров или иным способом с соответствующим дипептидом. Использование гептапептида формулы II позволяет значительно упростить схему синтеза нонапептида и избежать рацемизации изолейцина.

Новый нонапептид формулы III используют с целью получения окситоцина на его основе. Окситоцин получают дутом деблокирования защитных групп тиольных функций цистеина с одновременным образованием дисульфидной связи действием йода в метанольном или другом спирт-содержащем растворителе. N^α-BOC-защитную группу удаляют действием хлористого водорода в уксусной кислоте. Полученный окситоцин обладает биологической активностью (вазодепрессорная у кур) 250-390 ЕД/мг, что в 2,5 раза превышает аналогичную активность окситоцина, получаемого из нонапептида, соответствующего прототипу.

Нижеследующие примеры поясняют сущность предлагаемого изобретения. В примерах температуры плавления образцов определяли в открытых капиллярах без коррекции, углы оптического вращения на поляриметре ЭПО Московского экспериментального завода ВНИИЭКИППродмаш. Хроматографическую чистоту и подвижность на пластинках "Силуфол-254" (ЧСФР) в системах А:В=30:18,5 (S₁), 30:9,25 (S₂), где А этилацетат, В смесь пиридин:уксусная кислота:вода 20:6:11 (соотношения объемные) и в системе н-бутанол:вода:уксусная кислота 10:3:1 (F).

Пример 1. Амид N^α-трет.-бутилоксикарбонил-L-аспарагинил-S- тритил-L-цистеинил-L-пролил-L-лейцил-глицина (пентапептид I).

В 80 мл диметилформамида (ДМФА) последовательно растворяют 15,7 г (0,027 моль) N^α-трет.-бутилоксикарбонил-L-аспарагинил-S- тритил-L-цистеина, 7,75 г (0,027 моль) амида L-пролил-L-лейцилглицина, 4,8 г (0,030 моль) ОБТ. Раствор охлаждают и при минус 15^oC, прибавляют 6,1 г (0,30 моль) ДЦГК в 10 мл ДМФА (порциями по 3 мл). Реакционную массу выдерживают 1 ч при минус 5^oС, 16 ч при 0^oС и 24 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок N,N'-дициклогексилмочевины (ДЦГМ) отфильтровывают. К фильтрату прибавляют 300 мл хлористого метилена и последовательно промывают 10%-ним раствором уксусной кислоты, водой, 5%-ным раствором гидрокарбоната натрия, водой и упаривают в вакууме. Остаток растирают с 200 мл горячего этилацетата и оставляют кристаллизоваться при комнатной температуре на 48 ч. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и сушат в вакууме при 40-50^oС до постоянной массы. Получают 14,4 г пентапептида I (63% от теор.) в виде белого порошка. R_f 0,60 (S₂), (α) $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{20}}{\text{D}}$ -21^o (C 1, ДМФА), т.пл. 170-175^oС.

Пример 2. Амид N^α-трет.-бутилоксикарбонил-L-изолейцил-L- глутаминил-L-аспарагинил-S-тритил-L-цистеинил-L-пролил-L-лейцилглицина (гептапептид II).

А. Амид L-аспарагинил-L-тритил-L-цистеинил-L-пролил-L-лейцил-глицина. К раствору 3,57 г (0,020 моль) n-толуолсульфокислоты в 20 мл ледяной уксусной кислоты прибавляют раствор 7 г (0,006 моль) амида N^α-трет.-бутилоксикарбонил-L-аспарагинил-S-тритил-L- цистеинил-L-пролил-L-лейцил-глицина в 20 мл ледяной уксусной кислоты и перемешивают 2 ч. Реакционную массу разбавляют 100 мл хлороформа, 50 мл изопропилового спирта и промывают 2М раствором гидроксида натрия до рН водного слоя 9-10, затем водой. Органический слой осушают безводным сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Продукт сушат в вакууме до постоянной массы при 40-50^oС. Получают 5,8 г (94% от теор.) белого порошка. R_f 0,60 (S₁), (α) $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{20}}{\text{D}}$ -14^o (C 1, ДМФА), т.пл. 124-126^oC.

Б. Гептапептид II. В 30 мл ДМФА при перемешивании последовательно растворяют 5,8 г (0,0078 моль) амида L-аспарагинил-S-тритил-L-цистеинил-L-пролил-L-лейцил-глицина, 3,53 г (0,0098 моль) N^α-трет.-бутилоксикарбонил-L-изолейцил-L-глутамина, 1,52 г (0,0094 моль) ОБТ, охлаждают до минус 15^oC, прибавляют 1,94 г (0,0094 моль) ДЦГК, перемешивают 2 ч при температуре от минус 15 до минус 10^oС и оставляют на 48 ч при комнатной температуре. Отфильтровывают осадок ДЦГМ. К фильтрату прибавляют 150 мл хлористого метилена и последовательно промывают 10%-ным раствором уксусной кислоты, водой, 4%-ным раствором карбоната натрия, водой. Органический слой осушают безводным сульфатом натрия и упаривают в вакууме до получения густого масла, которое растирают со 100 мл горячего этилацетата и оставляют кристаллизоваться на 24 ч при 0-2^oC. Выпавший продукт отфильтровывают и сушат в вакууме до постоянной массы. Получают 7 г гептапептида II (82% от теор.) в виде сухого порошка, R_f 0,77 (S₁), (α) $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{20}}{\text{D}}$ -16^o (C 1, ДМФА), т.пл. 136-138^oС.

Пример 3. N^α-трет.-бутилоксикарбонил-S,S'-дитритилокситоцин (нонапептид III).

А. Амид L-изолейцил-L-глутаминил-L-аспарагинил-S-тритил-L- циcтеинил-L-пролил-L-лейцил-глицина. К раствор 4,13 г (0,22 моль n-толуолгульфокиcлоты в 24 мл ледяной уксусной кислоты добавляют 6,6 г (0,006 моль) амида N^α-трет. -бутилоксикарбонил-L-изолейцил-L- глутаминил-L-аспарагинил-S-тритил-L-цистеинил-L-прoпил-L-лейцил-глицина и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Реакционную массу разбавляют 100 мл хлороформа, 50 мл изопропилового спирта и промывают 2М раствором гидроксида натрия до рН водного слоя 9-10, затем водой. Органический слой осушают безводным сульфатом натрия, упаривают в вакууме до объема 10-15 мл, добавляют 150 мл этилацетата и оставляют на 24 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают и сушат в вакууме до постоянной массы. Получают 5,3 г (89% от теор.) белого порошка R_f 0,32 (S₁), (α) $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{20}}{\text{D}}$ 14,5 (C 1, ДМФА).

Б. N^α -трет. -бутилокcикарбонил-S-тритил-L-цистеинил-L-тирозин. 8 г (0,044 моль) тирозина, 34 мл хлористого метилена и 34 мл (0,139 моль) бис-триметилсилил-ацетамида перемешивают при 30-40^oС до полного растворения аминокислоты.

В 80 мл хлористого метилена растворяют 20,4 г (0,044 моль) N^α-трет.-бутилоксикарбонил-S-тритил-L-цистеина, охлаждают до минус 15^oС, прибавляют 6,4 мл (0,044 моль) пивалоилхлорида и выдерживают 20 мин при минус 5^oС. К реакционной массе добавляют охлажденный до минус 10^oC раствор силилированного тирозина, 6,15 мл (0,044 моль) триэтиламина, перемешивают 2 ч при 0-2^oC. К реакционной массе прибавляют 300 мл хлористого метилена и последовательно промывают 0,1М НСl, водой, 4%-ным раствором гидрокарбоната натрия, 0,1М HСl до рН водного слоя 3, водой. Органический слой осушают безводным сульфатом натрия и упаривают в вакууме, остаток растворяют в 60 мл метанола и упаривают. Полученный продукт переосаждают 150 мл гексана из его раствора в 50 мл эфира и сушат в вакууме. Получают 27,8 г (100% от теор.) порошка. R_f 0,31 (S₁), (α) $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{20}}{\text{D}}$ -28,5^o (C 1, этанол), т.пл. 100-104^oС.

В. Нонапептид III. В 40 мл ДМФА растворяют 5,2 г (0,0053 моль) амида L-изолейцил-L-глутаминил-L-аcпараги- нил-S-тритил-L-цистеинил-L-пролил-L-лейцил-глицина, 3,89 г (0,0062 моль) N^α-трет.-бутилоксикарбонил-S-тритил-L-цистеинил-L-тирозина, 0,837 г (0,0062 моль) ОБТ охлаждают до минус 15^oС, прибавляют 1,28 г (0,0062 моль) ДЦГК, перемешивают 2 ч при минус 5^oС, 4 ч при 0^oС и оставляют на 48 ч при комнатной температуре. Отфильтровывают осадок ДЦГМ. К фильтрату прибавляют 150 мл хлористого метилена и последовательно промывают 5%-ным раствором уксусной кислоты, насыщенным раствором гидрокарбоната натрия, водой, 5%-ным раствором уксусной кислоты (до рН 4-5), водой. Органический слой осушают безводным сульфатом натрия, упаривают в вакууме до объема 20 мл, приливают 200 мл этилацетата и оставляют при комнатной температуре. Выпавший продукт отфильтровывают и высушивают в вакууме. Получают 6,8 г нонапептида III (80% от теор.) в виде белого порошка. R_f 0,68 (S₂), (α) $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{20}}{\text{D}}$ -7^o (C 1, ДМФА), т. пл. 148-153^oС.

Пример 4. Окситоцин.

А. N^α-трет. -бутилоксикарбонилокситоцин. К раствору 1,26 г (0,005 моль) йода в 300 мл метанола при сильном перемешивании в течение 5-6 ч прикапывают 1 г защищенного нонапептида III в 200 мл метанола. Реакционную массу перемешивают 1 ч, охлаждают до 0^oС и обесцвечивают осторожным добавлением 10%-ного раствора тиосульфата натрия. Органический растворитель упаривают в вакууме, остаток растворяют в 300 мл воды и промывают эфиром. Продукт извлекают из водного слоя экстракцией н-бутанолом, бутанол упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 10 мл ДМФА, отфильтровывают нерастворившуюся часть и переосаждают продукт в 200 мл эфира. Отфильтровывают продукт и сушат в вакууме. Получают 0,44 (63% от теор.) порошка. R_f 0,43 (F), (α) $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{20}}{\text{D}}$ -52^o (C 1, этанол).

Б. Окситоцин. 1,1 (0,00033 моль) N^α-трет.-бутилоксикарбонилокситоцина растворяют в 15 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют 13 мл 2,7 М раствора хлористого водорода в ледяной уксусной кислоте и выдерживают 5 мин при комнатной температуре. К реакционной массе приливают 200 мл эфира, выпавший осадок отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакууме над гидроокисью натрия. излучают 1,04 (100% от теор.) окситоцина. (α) $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{20}}{\text{D}}$ -28^o (C 1,1% уксусная кислота).

Claims (1)

1. Пептиды последовательности окситоцина общей формулы:
   Вос A Cуs (Trt) Pro Leu Gly NH₂
   где А Аsn (I), Jle Gln Asn (II),
   Сys (T_rt) Тyr Jle Gln Asn (III),
   в качестве промежуточных соединений в синтезе окситоцина.