KR20030081355A - 트립토판 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정 - Google Patents

트립토판 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정 Download PDF

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KR20030081355A KR10-2003-7008232A KR20037008232A KR20030081355A KR 20030081355 A KR20030081355 A KR 20030081355A KR 20037008232 A KR20037008232 A KR 20037008232A KR 20030081355 A KR20030081355 A KR 20030081355A
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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 트립토판 잔기를 갖는 펩티드의 고체상 합성공정에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 상기 트립토판 잔기의 인돌 링을 염기에 불안정한 측쇄 보호기로 잠정적으로 보호하고 상기 보호기는 고체 지지체로 부터 상기 펩티드의 단리 간에 제거되는 것을 포함한다.

Description

트립토판 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정{Process for the synthesis of a peptide having a Trp residue}
황체형성호르몬-방출 호르몬(LHRH)은 뇌하수체로 부터 여포-자극 호르몬(FSH)와 황체형성호르몬(LHRH)의 분비를 안정화하고, 차례로 생식선으로 부터 테스토스테론과 같은 스테로이드 호르몬의 합성을 자극하는 시상하부에 의해 생산된 신경전달물질이다. 많은 LHRH 펩티드 유사화합물(즉, 어고니스트 및 안타고니스트)이 자궁내막증, 전립선 암, 조춘증 및 기타 호르몬 관련 질환의 치료를 위해 시판되고 있다. 이런 LHRH 펩티드 유사화합물의 합성은 어렵고 비용이 많이 든다.
고체상 펩티드 합성은 액체상 펩티드 합성과 관련된 많은 중간물질 정제 문제를 극복하기 위한 의도로 1963년 도입되었다. 스테워트(Stewart) 등의 고체상 펩티드 합성(Pierce Chemical Co., 2d ed)이 1984년 개시되었다. 고체상 합성 간에, 아미노 산이 소망하는 펩티드에 조합(즉, 결합)되고 사슬의 일단(즉, C-말단)은 불용성 지지체에 고착된다. 일단 소망하는 시퀀스가 지지체에 함께 연결되면, 그런 다음 펩티드가 지지체로 부터 떨어진다(즉, 단리된다).
U.S.특허 제4,010,125(1977)호는 LHRH 어고니스트의 10잔기 중 네 개의 측쇄가 보호된(즉, L-히스티딜(토실), 세릴(벤질), 티로실(2,6-디-Cl-Bzl) 및 L-아르기닐(토실))[D-Trp6]-LHRH의 합성을 기술한다. 그러나, 코이(Coy) 등의 Int. J. Peptide Protein Res. 14:359(1979)는 후에 최소한의 측쇄 보호, 즉 단지 아르기닌의 염 보호(즉, Arg.HCl)가 대응하는 합성에 대해 월등한 수율을 생산하는 다수의 기타 LHRH 유사화합물의 합성을 보고하였다. 본 발명은 LHRH 유사화합물의 합성에서 아미노산의 측쇄를 보호하지 않은 종래 기술에서의 경향에도 불구하고, 고체상 합성 간에 트립토판 잔기의 보호가 실제 트립토판 잔기를 갖는 LHRH 유사화합물(즉, [D-Trp6]-LHRH)의 수율을 개선하는 것을 발견하기 위한 것이다.
본 발명은 고체상태를 사용하여 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정에 관한 것이다.
일 측면에 따르면, 본 발명은 다음 구조식(I)
A1-A2-A3-Ser-A5-D-Trp-Leu-A8-Pro-A10-R1(I)
여기서,
A1은 pGlu 또는 N-Ac-D-β-Nal이고;
A2는 His, D-p-Cl-Phe, 또는 D-p-F-Phe이고;
A3는 Trp 또는 D-Trp이고;
A5는 Tyr, NicLys, cPzACAla, 또는 PicLys이고;
A8은 Arg, hArg(Et)2, hArg(Bu), hArg(CH2CF3)2, 또는 Lys(iPr)이고;
A10은 Gly, D-Ala, 또는 결손된 것이고;
R1은 NH2또는 NHEt임;
의 펩티드를 제조하는 공정에서 다음의 단계를 포함하는 공정을 제공한다:
(a) Boc-A10-레신 또는 Boc-Pro-레신을 각각 생산하기 위하여 클로로메틸화된 폴리스틸렌 레신 상에, 만일 A10이 존재하면, Boc-A10의 세슘 염을, 만일 A10이 존재하지 않으면, Boc-Pro를 부착하는 단계;
(b) N2H-A10-레신의 유기산염 또는 N2H-Pro-레신의 유기산염을 각각 생산하기 위하여 Boc-디블록킹 유기산의 혼합물로 N2H-A10-레신 또는 N2H-Pro-레신을 혼합함에 의해 N2H-A10-레신 또는 N2H-Pro-레신을 탈 블록킹하는 단계;
(c) N2H-A10-레신 또는 N2H-Pro-레신을 각각 생산하기 위하여 염기로 N2H-A10-레신의 유기산염 또는 N2H-Pro-레신의 유기산염을 중화하는 단계;
(d) Boc-α-아민 보호 아미노산으로 N2H-A10-레신 또는 N2H-Pro-레신에 커플링하는 단계로 다음을 포함함, 상기 보호된 아미노산은 C-말단에서 N-말단으로 도시된 순서로 구조식(I)에서 정의된 아미노산에 상당하는 것임,
(i) Boc-블록된 결합된 산물을 생산하기 위해 N2H-A10-레신 또는 N2H-Pro-레신을 펩티드 커플링제의 존재하에 Boc-α-아민 보호 아미노산과 반응하는 단계;
(ii) 결합된 산물을 생산하기 위해 Boc-블록된 결합된 산물을 Boc-디블록킹 유기산과 혼합함에 의해 Boc-블록된 결합된 산물로 부터 Boc 기를 디블록킹하는 단계;
(iii) Boc-블록된 결합된 산물을 생산하기 위해 결합된 산물을 펩티드 커플링제의 존재하에 다음 Boc-α-아민 보호 아미노산과 반응하는 단계;
(iv) 다음 결합된 산물을 생산하기 위해 Boc-블록된 결합된 산물을 Boc-디블록킹 유기산과 혼합함에 의해 Boc-블록된 결합된 산물로 부터 Boc 기를 디블록킹하는 단계;
(v) 보호된 완전한 펩티드-레신을 생산하기 위해 구조식(I)의 펩티드의 N-말단 아미노산이 커플되고 N-말단 아미노산의 Boc 기가 탈 블록될 때까지 단계(d)(iii)와 (d)(iv)를 반복하는 단계;
(e) 구조식(I)의 펩티드를 생산하기 위해, 다음을 포함하는 보호된 완전한 펩티드-레신을 단리하고 탈보호하는 단계;
(i) 알코올/비활성 극성 비극성 용매 혼합물에서 보호된 완전한 펩티드-레신의 용액 제조;
(ii) 용액을 약 0℃ 내지 약 10℃로 냉각;
(iii) 포화용액을 얻기 위하여 용액이 암모니아로 잘 포화될 때까지 암모니아 가스 또는 에틸아민 가스를 용액 내로 서서히 불어넣어 냉각을 유지;
(iv) >95%의 유리 메틸 에스테르가 암모니아 가스가 사용될 때는 대응하는 아미드로 전환되고, 에틸아민 가스가 사용될 때는 대응하는 에틸아미드로 전환될 때까지 약 15-36시간 동안 냉각없이 포화용액을 혼합;
(f) 상기 용액으로 부터 상기 펩티드를 분리하는 단계.
상술한 공정 중 바람직한 공정은 A10이 Gly인 경우이다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 다음 Boc-α-아민 아미노산이 C-말단에서 N-말단으로 N-α-Boc-L-프롤린, N-α-Boc-L-아르기닌ㆍHCl, N-α-Boc-L-류이신, N-α-Boc-D-트립토판(N'-인돌-포밀), N-α-Boc-L-티로신, N-α-Boc-L-세린 수화물, N-α-Boc-트립토판(N'-인돌-포밀), N-α-Boc-L-히스티딘(토실)-시클로헥실아민 염, 및 피로글루탐산이 연속적으로 결합되는 경우이다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 Trp 측쇄의 포밀 보호기는 암모니아, 일차 아민, 이차 아민 및 알코올을 포함하는 용액으로 처리함에 의해 제거되는 경우이다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 상기 용액이 암모니아 및 메탄올을 포함하는 경우이다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 상기 용액으로 부터 상기 펩티드를 분리하는 단계는:
(i) 여액을 생산하기 위해 상기 용액을 여과하는 것; 및
(ii) 상기 여액을 농축하는 것
을포함하는 경우이다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 상기 구조식(I)의 펩티드가 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2인 경우이다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBT)이 N-α-Boc-D-트립토판(N'-인돌-포밀), N-α-Boc-L-티로신, N-α-Boc-L-세린 수화물, N-α-Boc-트립토판(N'-인돌-포밀)을 커플링 시 또한 사용되는 경우이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 다음 구조식(II)
A1-A2-A3-Ser-A5-A6-Leu-A8-Pro-A10-R1(II)
여기서,
A1은 pGlu 또는 N-Ac-D-β-Nal이고;
A2는 His, D-p-Cl-Phe, 또는 D-p-F-Phe이고;
A3는 Trp, D-Trp, D-β-Nal 또는 D-Pal이고;
A5는 Tyr, NicLys, cPzACAla, 또는 PicLys이고;
A6은 D-β-Nal, D-hArg(Et)2, D-Lys(iPr), D-hArg(Bu), D-hArg(CH2CF3)2, D-His(Bzl), D-Leu, D-Pal, D-Ser(tBu), D-Trp, D-Cit, D-Arg, D-NicLys, D-PicLys또는 D-Qal이고;
A8은 Arg, hArg(Et)2, hArg(Bu), hArg(CH2CF3)2, 또는 Lys(iPr)이고;
A10은 Gly, NHNHCO 또는 D-Ala, 또는 결손된 것이고;
R1은 NH2또는 NHEt임;
의 펩티드의 고체상 합성 공정을 제공하고, 여기서 A3또는 A6의 적어도 하나는 Trp 또는 D-Trp이고, 상기 방법은 염에 대해 불안정한 측쇄 보호기로 트립토판 잔기를 잠정적으로 보호하는 것을 포함하고 여기서 상기 보호기는 염기와 반응에 의해 고체 지지체로 부터 구조식(II)의 펩티드의 단리과정에서 제거된다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 상기 Trp 또는 D-Trp 측쇄 보호기는 아실기인 경우이다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 Trp 또는 D-Trp 측쇄 보호기는 암모니아, 일차 아민, 이차 아민 및 알코올을 포함하는 용액으로 처리함에 의해 제거되는 경우이다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 상기 측쇄 보호기는 포밀기이고 상기 염기는 암모니아를 포함하는 메탄올 용액인 경우이다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 상기 A3이 Trp인 경우이다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 상기 A1이 pGlu이고, A2는 His이고, A5는 Tyr이고, A6는 D-Trp이고, A8이 Arg이고, A10은 Gly이고, R1은 NH2인 경우이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 다음 보호된 아미노산: Boc-Gly, Boc-Pro, Boc-Arg.HCl, Boc-Leu, Boc-D-Trp(PG-1), Boc-Tyr, Boc-Ser, Boc-Trp(PG-1), Boc-His(PG-2)을 고상 지지체 상에 연속적으로 커플링하는 단계를 포함하는 구조식 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2의 펩티드의 고체상 합성공정에 관한 것으로, 여기서 PG-1은 염에 대해 불안정한 보호기이고 PG-2는 His에 대한 보호기이고, 상기 공정은 상기 지지체로 부터 상기 펩티드의 단리공정과 염을 포함하는 용액으로 상기 트립토판 잔기로 부터 상기 PG-1을 제거하는 공정을 모두 포함한다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 상기 PG-1은 아실기인 경우이다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 상기 용액은 암모니아, 일차 아민, 또는 이차 아민을 포함하는 경우이다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 상기 PG-2는 토실기인 경우이다.
바로 전에 기술한 공정 중 바람직한 공정은 상기 PG-1은 포밀기이고 상기 용액은 암모니아를 포함하는 경우이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 본 발명의 상세한 설명과 그 청구범위로 부터 명확하게 될것이다.
약어
BOC=t-부톡시카르보닐
Cit=시트룰린
cPzACAla=시스-3-(4-피라지닐카르보닐아미노시클로헥실)알라닌
hArg(Bu)=N-구아니디노-(부틸)-호모아르기닌
hArg(Et)2=N,N'-구아니디노-(디메틸)-호모아르기닌
hArg(CH2CF3)2=N,N'-구아니디노-비스-(2,2,2-트리플루오로에틸)-호모아르기닌
HOBT=1-하이드록시벤조트리아졸
Lys(iPr)=Nε-이소프로필라이신
β-Nal=특정 지시가 없다면, β-1-나프틸알라닌 또는 β-2-나프틸알라닌
NicLys=Nε-니코티노일라이신
Pal=피리딜알라닌
p-Cl-Phe=3-(4-클로로페닐)알라닌
p-F-Phe=3-(4-플루오로페닐)알라닌
PicLys=Nε-피코리노일라이신
Qal=퀴노릴알라닌
이 분야의 통상인이라면, 여기에 기술된 상세한 설명에 기하여, 본 발명을 완전한 정도까지 이용할 수 있을 것으로 이해된다. 따라서, 다음의 특정 실시형태는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 해석되고 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것으로 해석되지는 않는다.
달리 정의하지 않는다면, 여기서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 분야의 통상인에 의해 공통적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 여기서 언급된 모든 공보, 특허출원, 특허 및 기타 참고문헌은 참고로 나타나 있다.
구조식(I)의 펩티드는 표제의 화합물을 수득하기 위하여 알코올에서 암모니아, 일차 아민 또는 이차 아민으로 레진으로 부터 펩티드의 단리에 따르는 메리필드 레진 상에서 Boc 케미스트리를 사용하는 고체상 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 이런 과정에서 제일 단계는 에스테르 연결을 통해 메리필드 레진 상에 C-말단 아미노산, Boc-A10의 세슘염을 부착하는 것이다. Boc-A10의 세슘염은 메탄올 및 물의 혼합물에서 세슘 카보네이트에 Boc-A10를 부가함에 의해 형성된다. Boc-A10의 세슘염은 진공하에서 건고되고 그런 다음 디메틸포름아미드(DMF)와 같은 무수 극성 비극성 용매에서 폴리스틸렌 상에서 클로로메틸 벤질기와 반응 시킨다. 이 반응은 45℃ 내지 60℃에서, 바람직하기로는 50℃에서, 약 24시간 내지 48시간, 바람직하기로는 36시간 동안 수행된다. 반응된 수지는 그런 다음 여과되어, 물, DMF와 같은 극성 비극성 용매 및 메탄올과 같은 알코올로 수세되고 나서 바람직하기로는 감압하에서 일정 중량으로 건조된다. 건조된 레진은 시험되어 레진의 건조 그램 당 A10의 mmole로 나타나는 Boc-A10함량을 결정한다. 계산된 값은 연속하는 물질 용도에 대한 조합 반응의 스케일과 이론적 수율 계산을 결정하는데 사용된다.
구조식(I)의 펩티드의 합성은 반응조의 바닥에 소결된 글라스 디스크 필터를 갖춘 유리 반응조에 함유된 Boc-A10-레진 상에서 수행될 수 있다. 이 반응조는 기계적 교반자로 교반되고 반응조에 수지를 유지하는 동안 바닥에 소결된 디스크를 통해 액체에 압을 가하기 위해 질소압과 같은 불활성 가스압을 적용함에 의해 배출된다. 먼저, Boc-A10의 Boc 기는 염소화된 용매에서 유기산, 바람직하기로는 디클로로메탄(DCM)에서 25% 트리플루오로초산의 혼합물로 먼저 약 2분 간 그리고 나서 질소압에 의해 보조된 배출 후 약 25분 동안 A10-레진 두배를 혼합함에 의해 A10-레진으로 부터 제거(즉, 탈블럭화)된다. 이 A10-레진은 DCM으로 삼회 그리고 이소프로필 알코올(IPA)과 같은 알코올로 이회 수세되고, 얻어진 아미노-TFA 염은 불활성 용매에서 염기, 바람직하기로는 DCM에서 10% 트리에틸아민 염기로 각각 약 5분간 두 배로 중화되고 DCM으로 삼회 다시 수세된다. 그런 다음 레진은 반응 배지로 극성 비극성 용매, 바람직하기로는 DMF/DCM 혼합물에서 펩티드 커플링제, 바람직하기로는 디이소프로필카르보디이미드(DIC)를 사용하여, C-말단에서 N-말단으로 진행하는 구조식(I)에 한정된 아미노산에 대응하는 Boc α-아미노 보호 아미노산의 2.5 몰 당량으로 커플된다. 각 커플링 후 DMF 및 DCM으로 수세된다. 레진은 잔여 비커플된 프롤린의 이차 아민을 검지하기 위해 이사틴(isatin)을 사용하여 시험될 수 있는 아르기닌을 제외한 각 커플링 성취에 대해 카이저 닌하이드린(Kaiser Ninhydrin)에의해 시험될 수 있다. Boc 기는 상술한 바와 같은 시험에 따라 각 커플된 아미노산으로 부터 제거된다. 구조식(I)의 아미노산에 대응하는 다음의 보호된 아미노산은 바람직하기로는 본 발명의 합성에 사용된다: N-α-Boc-L-프롤린, N-α-Boc-L-아르기닌ㆍHCl, N-α-Boc-L-류이신, N-α-Boc-D-트립토판(N'-인돌-포밀), N-α-Boc-L-티로신, N-α-Boc-L-세린 수화물, N-α-Boc-L-히스티딘(토실)-시클로헥실아민 염, 및 피로글루탐산.
1-하이드록시벤조트리아졸(HOBT) 또한 D-Trp, Tyr, Ser, 및 Trp의 보호된 유도체를 커플링 할 때 사용(3-5 eq.)될 수 있다. 히스티딘의 토실 측쇄 보호기는 최종 아미노산 커플링 후 한 시간 동안(각각) DMF 내 HOBT의 두 번 처리로 제거된다. Boc-D-트립토판과 Boc-L-트립토판은 인돌링의 질소 상에서 포밀기로 측쇄 보호된다. 이 후 포밀기는 염기를 사용하여 수지로 부터 펩티드의 단리 과정 동안에 제거된다.
완성된 펩티드-레진은 타르된 탕화 유리 깔대기에서 DCM과 같은 비활성 염소화 용매로 수세되고, 메탄올과 같은 알코올로 두번 수세되고, 그리고 나서 진공하에서 건조된다. 건조된 펩티드-레진은 일 리터들이 둥근 바닥의 삼구 플라스크로 옮겨진다. 펩티드-레진의 그램 당 약 15밀리리터로 9:1의 메탄올/DMF의 혼합물을 상기 플라스크에 부가한다. 이 용액은 약 <10℃로 냉각되고, 펩티드로 부터 C-말단 아미드가 바람직하다면, 암모니아 가스가 잘 포화될 때 까지 강하게 냉각하면서 서서히 불어넣고(약 1시간의 부가 시간), 여기서 펩티드는 레진으로 부터 떨어져 유리 메틸 에스테르 중간체의 형태로 된다. 이 용액은 약 15-36시간 동안 냉각없이더 혼합하여 이 시간 동안 대략 >95%의 유리 메틸 에스테르가 대응하는 아미드 산물로 전환된다. 반응 과정은 예를 들어, 고압 액체 크로마토그라피(HPLC)을 사용하여 조사되고 소망하는 정도의 성취가 얻어지면 종료될 수 있다. 이 산물은 탕화 유리 깔때기로 용액에서 여과되고, 수지는 메탄올과 DMF로 수회 세척된다. 모든 수세액 및 여액은 매우 두꺼운 오일로 농축된다. 에틸 아세테이트가 부가되어 용액은 적정되어 산물이 응고되고, 따루어지고, 그리고 에틸 아세테이트로 적정이 반복된다. 조 산물은 메탄올에 용해되고 동량의 4N 초산이 부가된다. 이 용액은 모든 메탄올을 제거하기 위해 농축된다. 이 산물은 4N 초산으로 희석된다.
C-말단 에틸아미드 형태의 펩티드는 바로 앞에서 기술한 과정에서 암모니아 대신 에틸아민으로 치환함에 의해 얻을 수 있고, 여기서 용액의 온도는 에틸아민으로 용액의 포화 간에 약<16℃ 이하로, 바람직하기로는 약 5℃ 내지 약 15℃ 사이로 유지된다.
조 물질은 반복된 역상 크로마토그라피를 수행함에 의해 정제될 수 있고 동결건조하여 최종산물을 얻는다.
이에 한정되지는 않지만, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 이소부탄올, tert-부탄올 등과 같은 저분자량 알코올, 기타 극성 비극성 용매, 및 이들의 혼합물을 포함하는 기타 용매계가 사용될 수 있다는 것은 이 분야의 통상인에게 명백할 것이다.
다음 실시예는 본 발명의 방법을 보다 자세히 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아닌다.
실시예
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2([D-Trp6]LHRH-NH2)의 합성
[D-Trp6]LHRH-NH2는 표제의 펩티드를 얻기위해 메탄올성 암모니아로 수지로 부터 펩티드의 단리가 따르는 메리필드 레진 상에 Boc 화학을 사용하여 고체상 펩티드 합성에 의해 제조된다.
이 과정의 제일 단계는 에스테르 결합을 통해 메리필드 수지에 세슘-염의 C-말단 아미노산인 Boc-글리신을 부착하는 것이다. Boc-글리신의 세슘 염은 Boc-글리신을 메탄올과 물의 혼합물(80 ml/40 ml)에서 세슘 카보네이트(37.9g)와 반응시킴에 의해 형성된다. Boc-글리신의 세슘 염은 진공하에서 건조되고 무수 디메틸포름아미드(DMF; 200ml)에서 폴리스틸렌 구슬(메리필드 수지; 어드밴스드 켐텍, 88.2g) 상에서 클로로메틸 벤질기와 반응된다. 이 반응은 Buchi™모델 110 로터리 농축기에서 약 50℃에서 약 36시간 동안 진행된다. 반응된 수지는 그런 다음 여과되고 물, DMF 및 메탄올로 수세되고 나서 진공에서 T<35℃에서 일정한 중량으로 건조된다. 그런 다음 건조된 수지는 건조 수지의 그램 당 글리신의 미리몰로 표현되는 Boc-글리신의 함량을 결정하기 위해 시험된다. 0.872mmole/gram의 계산된 값을 얻어 이론적 수율 계산과 연속하는 물질 용도에 대한 조합 반응의 스케일을 결정하는데 사용된다.
펩티드의 합성은 반응조의 상단과 바닥 양쪽에 소결된 글라스 디스크 필터를 갖춘 500ml 유리 반응조에 함유된 Boc-글리신 레진(12.5g) 상에서 수행된다. 이 반응조는 바닥으로부터 채워져 뒤집음(3초에 180도 회전)에 의해 흔들어진다. 먼저, Boc 기는 디클로로메탄(DCM)에 25% 트리플루오로초산(TFA) 175ml로 두번(약 2분 및 25분) 레진과 혼합하고 질소압에 의해 보조된 배출에 의해 글리신 레진으로 부터 제거(즉, 탈블럭화)된다. 이 레진은 125ml의 DCM으로 삼회 그리고 125ml의 이소프로필 알코올(IPA)로 이회 그리고 나서 125ml의 DCM으로 삼회 수세된다. 얻어진 아미노-TFA 염은 DCM에서 10% 트리에틸아민 염기로 이회 중화되고 DCM으로 삼회 다시 수세된다.
그런 다음, 레진은 16ml의 DMF와 47ml의 DCM에서 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 4.2ml로 다음의 Boc-보호 아미노산의 2.5 몰 당량 혼합물로 커플되고 탈블럭화 된다: 5.84g Boc-L-프롤린, 8.93g Boc-L-아르기닌ㆍHCl, 6.77g L-류이신, 9.0g Boc-D-트립토판(포밀), 7.64g Boc-L-티로신, 9.0g Boc-L-트립토판(포밀), 6.06g Boc-L-세린 수화물, 16g Boc-L-히스티딘(토실).시클로헥실아민 염, 및 13.5g 피로글루탐산. 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBT) 또한 D-Trp, Tyr, Ser, 및 Trp의 커플링에 사용(3-5 eq.)된다. 75ml의 디메틸아세트아미드(DMA)가 Arg 커플링에 있어 DMF와 DCM 대신 사용된다. 수지는 DMF와 DCM으로 수세되고 커플링 성취에 대해 카이저 닌하이드린(Kaiser Ninhydrin)에 의해 시험된다. Boc 기는 상술한 바와 같이 각 커플된 아미노산으로 부터 제거된다. 히스티딘은 최종 아미노산 커플링 후 약 1시간(각각) 동안 105ml의 DMF 내 4.16g의 HOBT의 두 번 처리로 제거되는 토실로 보호된 측쇄이다. Boc-D-트립토판과 Boc-L-트립토판은 수지로 부터 펩티드의 단리 과정 동안에 제거되는 포밀기로 보호된 측쇄이다.
완성된 펩티드-레진은 타르된 탕화 유리 깔대기에서 DCM으로 수세되고, 메탄올로 두번 수세되고, 그리고 나서 진공하에서 건조된다. 건조된 펩티드-레진은 일 리터들이 둥근 바닥의 삼구 플라스크로 옮겨진다. 9:1의 메탄올/DMF(10.9mM 스케일에 대해 380ml) 내 15ml/gram의 펩티드-레진이 플라스크에 부가된다. 이 용액은 약 <10℃로 냉각되고, 암모니아 가스가 잘 포화될 때 까지 강하게 냉각하면서 서서히 불어넣어진다(약 1시간의 부가 시간). 고압 액체 크로마토그라피(HPLC)로 조사됨으로 결정되는 >95%의 유리 메틸 에스테르가 아미드 산물로 전환될 때 까지 이 용액은 약 15-36시간 동안 냉각없이 더 혼합된다. 이 산물은 탕화 유리 깔때기로 용액에서 여과되고, 수지는 메탄올과 DMF로 수회 세척된다. 모든 수세액 및 여액은 로터리 농축기에서 T<40℃에서 매우 두꺼운 오일로 농축된다. 에틸 아세테이트(0.08리터)가 부가되어 용액은 적정되어 산물이 응고되고, 따루어지고, 그리고 0.08리터의 에틸 아세테이트로 적정이 반복된다. 단단한 검상의 산물이 에틸 아세테이트에서 밤새도록 침지되고 나서 따루어 낸다. 조 산물은 메탄올(0.07리터)에 용해되고 동량의 4N 초산이 부가된다. 이 용액은 모든 메탄올을 제거하기 위해 로터리 농축기에서 T<40℃에서 농축된다. 이 산물은 4N 초산으로 대략 35 그램 산물/리터로 희석된다.
그런 다음 조 물질은 반복된 역상 크로마토그라피를 수행함에 의해 정제될 수 있고 동결건조하여 순도 >99%로 백색 고체로 최종산물(8.4그램, 59%수율)을 얻는다.
다른 실시형태
상기 상세한 설명으로 부터, 본 발명의 범위로 부터 떨어지지 않은 본 발명의 필수적인 특징을 쉽게 확인할 수 있을 것이고, 각종 사용과 조건에 본 발명을 적용하기 위해 본 발명의 다양한 변경이나 개선을 할 수 있을 것은 이 분야의 통상인에게 명백할 것이다. 따라서, 다른 실시형태 또한 본 청구범위에 속한다.

Claims (18)

  1. 다음 구조식(I)
    A1-A2-A3-Ser-A5-D-Trp-Leu-A8-Pro-A10-R1(I)
    여기서,
    A1은 pGlu 또는 N-Ac-D-β-Nal이고;
    A2는 His, D-p-Cl-Phe, 또는 D-p-F-Phe이고;
    A3는 Trp 또는 D-Trp이고;
    A5는 Tyr, NicLys, cPzACAla, 또는 PicLys이고;
    A8은 Arg, hArg(Et)2, hArg(Bu), hArg(CH2CF3)2, 또는 Lys(iPr)이고;
    A10은 Gly, D-Ala, 또는 결손된 것이고;
    R1은 NH2또는 NHEt임;
    의 펩티드를 제조하는 공정에서 다음의 단계를 포함함을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정:
    (a) Boc-A10-레신 또는 Boc-Pro-레신을 각각 생산하기 위하여 클로로메틸화된폴리스틸렌 레신 상에, 만일 A10이 존재하면, Boc-A10의 세슘 염을, 만일 A10이 존재하지 않으면, Boc-Pro를 부착하는 단계;
    (b) N2H-A10-레신의 유기산염 또는 N2H-Pro-레신의 유기산염을 각각 생산하기 위하여 Boc-디블록킹 유기산의 혼합물로 N2H-A10-레신 또는 N2H-Pro-레신을 혼합함에 의해 N2H-A10-레신 또는 N2H-Pro-레신을 탈 블록킹하는 단계;
    (c) N2H-A10-레신 또는 N2H-Pro-레신을 각각 생산하기 위하여 염기로 N2H-A10-레신의 유기산염 또는 N2H-Pro-레신의 유기산염을 중화하는 단계;
    (d) Boc-α-아민 보호 아미노산으로 N2H-A10-레신 또는 N2H-Pro-레신에 커플링하는 단계로 다음을 포함함, 상기 보호된 아미노산은 C-말단에서 N-말단으로 도시된 순서로 구조식(I)에서 정의된 아미노산에 상당하는 것임,
    (i) Boc-블록된 결합된 산물을 생산하기 위해 N2H-A10-레신 또는 N2H-Pro-레신을 펩티드 커플링제의 존재하에 Boc-α-아민 보호 아미노산과 반응하는 단계;
    (ii) 결합된 산물을 생산하기 위해 Boc-블록된 결합된 산물을 Boc-디블록킹 유기산과 혼합함에 의해 Boc-블록된 결합된 산물로 부터 Boc 기를 디블록킹하는 단계;
    (iii) Boc-블록된 결합된 산물을 생산하기 위해 결합된 산물을 펩티드 커플링제의 존재하에 다음 Boc-α-아민 보호 아미노산과 반응하는 단계;
    (iv) 다음 결합된 산물을 생산하기 위해 Boc-블록된 결합된 산물을 Boc-디블록킹 유기산과 혼합함에 의해 Boc-블록된 결합된 산물로 부터 Boc 기를 디블록킹하는 단계;
    (v) 보호된 완전한 펩티드-레신을 생산하기 위해 구조식(I)의 펩티드의 N-말단 아미노산이 커플되고 N-말단 아미노산의 Boc 기가 탈 블록될 때까지 단계(d)(iii)와 (d)(iv)를 반복하는 단계;
    (e) 구조식(I)의 펩티드를 생산하기 위해 보호된 완전한 펩티드-레신을 단리하고 탈보호하는 단계, 여기서 상기 단리 및 탈보호는 다음을 포함함;
    (i) 알코올/비활성 극성 비극성 용매 혼합물에서 보호된 완전한 펩티드-레신의 용액 제조;
    (ii) 용액을 약 0℃ 내지 약 10℃로 냉각;
    (iii) 포화용액을 얻기 위하여 용액이 암모니아로 잘 포화될 때까지 암모니아 가스 또는 에틸아민 가스를 용액 내로 서서히 불어넣어 냉각을 유지;
    (iv) >95%의 유리 메틸 에스테르가 암모니아 가스가 사용될 때는 대응하는 아미드로 전환되고, 에틸아민 가스가 사용될 때는 대응하는 에틸아미드로 전환될 때까지 약 15-36시간 동안 냉각없이 포화용액을 혼합;
    (f) 상기 용액으로 부터 상기 펩티드를 분리하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, A10이 Gly임을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
  3. 제 2항에 있어서, 다음 Boc-α-아민 아미노산이 C-말단에서 N-말단으로 N-α-Boc-L-프롤린, N-α-Boc-L-아르기닌ㆍHCl, N-α-Boc-L-류이신, N-α-Boc-D-트립토판(N'-인돌-포밀), N-α-Boc-L-티로신, N-α-Boc-L-세린 수화물, N-α-Boc-트립토판(N'-인돌-포밀), N-α-Boc-L-히스티딘(토실)-시클로헥실아민 염, 및 피로글루탐산이 연속적으로 결합됨을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
  4. 제 3항에 있어서, Trp 측쇄의 포밀 보호기는 암모니아, 일차 아민, 이차 아민 및 알코올을 포함하는 용액으로 처리함에 의해 제거됨을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 용액이 암모니아 및 메탄올을 포함함을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 구조식(I)의 펩티드가 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2임을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
  7. 제 6항에 있어서, 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBT)이 또한 N-α-Boc-D-트립토판(N'-인돌-포밀), N-α-Boc-L-티로신, N-α-Boc-L-세린 수화물, N-α-Boc-트립토판(N'-인돌-포밀)을 커플링 시 사용됨을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
  8. 다음 구조식(II)
    A1-A2-A3-Ser-A5-A6-Leu-A8-Pro-A10-R1(II)
    여기서,
    A1은 pGlu 또는 N-Ac-D-β-Nal이고;
    A2는 His, D-p-Cl-Phe, 또는 D-p-F-Phe이고;
    A3는 Trp, D-Trp, D-β-Nal 또는 D-Pal이고;
    A5는 Tyr, NicLys, cPzACAla, 또는 PicLys이고;
    A6은 D-β-Nal, D-hArg(Et)2, D-Lys(iPr), D-hArg(Bu), D-hArg(CH2CF3)2, D-His(Bzl), D-Leu, D-Pal, D-Ser(tBu), D-Trp, D-Cit, D-Arg, D-NicLys, D-PicLys 또는 D-Qal이고;
    A8은 Arg, hArg(Et)2, hArg(Bu), hArg(CH2CF3)2, 또는 Lys(iPr)이고;
    A10은 Gly, NHNHCO 또는 D-Ala, 또는 결손된 것이고;
    R1은 NH2또는 NHEt임;
    의 펩티드의 고체상 합성 공정에서, 여기서 A3또는 A6의 적어도 하나는 Trp 또는 D-Trp이고, 상기 방법은 염에 대해 불안정한 측쇄 보호기로 트립토판 잔기를 잠정적으로 보호하는 것을 포함하고 여기서 상기 보호기는 염기와 반응에 의해 고체 지지체로 부터 구조식(II)의 펩티드의 단리과정에서 제거됨을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정..
  9. 제 8항에 있어서, 상기 Trp 또는 D-Trp 측쇄 보호기는 아실기임을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 Trp 또는 D-Trp 측쇄 보호기는 암모니아, 일차 아민, 이차 아민 및 알코올을 포함하는 용액으로 처리함에 의해 제거됨을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 측쇄 보호기는 포밀기이고 상기 염기는 암모니아를 포함하는 메탄올 용액임을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 A3이 Trp임을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 A1이 pGlu이고, A2는 His이고, A5는 Tyr이고, A6는 D-Trp이고, A8이 Arg이고, A10은 Gly이고, R1은 NH2임을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
  14. 다음의 보호된 아미노산: Boc-Gly, Boc-Pro, Boc-Arg.HCl, Boc-Leu, Boc-D-Trp(PG-1), Boc-Tyr, Boc-Ser, Boc-Trp(PG-1), Boc-His(PG-2)을 고상 지지체 상에 연속적으로 커플링하는 단계를 포함하는 구조식 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2의 펩티드의 고체상 합성공정에 있어서, 여기서 PG-1은 염에 대해 불안정한 보호기이고 PG-2는 His에 대한 보호기이고, 상기 공정은 상기 지지체로 부터 상기 펩티드의 단리공정과 염을 포함하는 용액으로 상기 트립토판 잔기로 부터 상기 PG-1을 제거하는 공정을 모두 포함함을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.한다.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 PG-1은 아실기임을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 용액은 암모니아, 일차 아민, 또는 이차 아민을 포함함을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 PG-2는 토실기임을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
  18. 제 14항에 있어서, 상기 PG-1은 포밀기이고 상기 용액은 암모니아를 포함함을 특징으로 하는 Trp 잔기를 갖는 펩티드의 합성공정.
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