DE60123115T2 - Verfahren für die synthese eines lhrh peptides - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese eines Peptids mit einem Trp-Rest unter Verwendung einer Festphase.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • Luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon (LHRH) ist ein Neurotransmitter, der durch den Hypothalamus produziert wird, der die Sezernierung von luteinisierendem Hormon (LHRH) und Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) aus der Hypophyse stabilisiert, was wiederum die Synthese von Steroidhormonen, wie Testosteron, von den Gonaden stimuliert. Viele LHRH-Peptidanaloga (z.B. Agonisten und Antagonisten) werden gegenwärtig zur Behandlung von Endometriose, Prostatakrebs, frühzeitiger Pubertät und anderer hormonell bedingter Störungen vertrieben. Die Synthese von derartigen LHRH-Analoga ist schwierig und teuer.
  • Die Festphasenpeptidsynthese wurde 1963 eingeführt, mit der Absicht, viele der mit der Lösungsphasenpeptidsynthese verbundenen Zwischenreinigungsprobleme zu bewältigen. Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., 2. Aufl.) 1984. Während der Festphasensynthese werden Aminosäuren zu einem Peptid von einer beliebigen gewünschten Sequenz zusammengeschlossen (d.h. gekuppelt), während ein Ende der Kette (d.h. der C-Terminus) an einem unlöslichen Träger verankert ist. Nachdem die gewünschte Sequenz auf dem Träger verknüpft wurde, wird dann das Peptid von dem Träger abgelöst (d.h. abgespalten).
  • US-Patent Nr. 4,010,125 (1977) beschreibt die Synthese von [D-Trp6]-LHRH, in welchem die Seitenketten von vier der zehn Reste des LHRH-Agonisten geschützt sind (z.B. L-Histidyl(tosyl), Seryl(benzyl), Tyroxyl(2,6-di-Cl-Bzl), und L-Arginyl(tosyl)). Jedoch erörterten später Coy et al., Int. J. Peptide Protein Res. 14:359 (1979), die Synthese einer Anzahl von anderen LHRH-Analoga, in welchen ein minimaler Seitenkettenschutz, z.B. nur ein Salzschutz von Arginin (d.h. Arg.HCl) eine übenagende Ausbeute der entsprechenden geschützten Synthese erzeugt wurde. Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, dass trotz des Trends auf dem Fachgebiet, die Seitenketten von Aminosäuren bei der Synthese von LHRH-Analoga nicht zu schützen, der Schutz des Tryptophanrests während der Festphasensynthese tatsächlich die Ausbeute von LHRH-Analoga mit einem Tryptophanrest (z.B. [D-Trp6]LHRH) verbessert.
  • US-Patent Nr. 4,569,927 offenbart Peptide, einschließlich Decapeptide. In derartigen Peptiden ist es erforderlich, dass D-Phe die zweite Aminosäure in der Sequenz ist. Es gibt keine Offenbarung über bioaktive LHRH-Derivate mit Histidin in der zweiten Rest-Position.
  • DE 3931731 offenbart die Festphasensynthese von [D-Trp6]-LHRH auf Polyacrylharz. Die Synthese nutzt den Vorteil der hydrophilen Eigenschaften, die Polyacrylharze im Gegensatz zu Polystyrolharzen, aufweisen.
  • BE 904 458 offenbart die Festphasensynthese von [D-Trp6]-LHRH, wobei die Indolgruppe von Tryptophan mit Formyl geschützt ist und in welchem das Peptid an das Benzhydrylamino-Polymer eines Benzhydrylamino-Polystyrol-1%-Divinylbenzol-Copolymers gebunden ist. Das Benzhydrylaminopolymer weist hydrophile Eigenschaften auf.
  • Offenbarung der Erfindung
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel (I) bereit,
    Figure 00030001
    wobei der His-Rest mit einer Tosylgruppe geschützt ist und das Indol-NH von jedem beliebigen Trp-Rest geschützt ist,
    umfassend die Schritte:
    • (a) Anlagern eines Cäsiumsalzes von Boc-Gly an ein chlormethyliertes Polystyrolharz, um Boc-Gly-Harz zu erhalten;
    • (b) Entblockieren des Boc-Gly-Harzes durch Mischen des Boc-Gly-Harzes mit einem Gemisch aus einer Boc-entblockierenden organischen Säure, um ein organisches Säuresalz von H2N-Gly-Harz zu erhalten;
    • (c) Neutralisieren des organischen Säuresalzes von H2N-Gly-Harz mit einer Base, um H2N-Gly-Harz zu erhalten;
    • (d) Kuppeln von H2-Gly-Harz mit einer Boc-α-amin-geschützten Aminosäure, wobei die geschützte Aminosäure der für die Formel (I) definierten Aminosäure entspricht, in der vom C-Terminus zum N-Terminus dargestellten Reihenfolge, umfassend
    • (i) Umsetzen von H2N-Harz mit der Boc-α-amin-geschützten Aminosäure in Gegenwart eines Peptidkupplungsmittels, um ein Bocblockiertes gekuppeltes Produkt zu erhalten;
    • (ii) Entblockieren der Boc-Gruppe von dem Boc-blockierten gekuppelten Produkt durch Mischen des Boc-blockierten gekuppelten Produkts mit einer Boc-entblockierenden organischen Säure, um ein gekuppeltes Produkt zu erhalten;
    • (iii) Umsetzen des gekuppelten Produkts mit einer weiteren Boc-α-amin-geschützten Aminosäure in Gegenwart eines Peptidkupplungsmittels, um ein Boc-blockiertes gekuppeltes Produkt zu erhalten;
    • (iv) Entblockieren der Boc-Gruppe von dem Boc-blockierten gekuppelten Produkt durch Mischen des Boc-blockierten gekuppelten Produkts mit einer Boc-entblockierenden organischen Säure, um ein weiteres gekuppeltes Produkt zu erhalten;
    • (v) Wiederholen der Schritte (d)(iii) und (d)(iv) bis die N-terminale Aminosäure des Peptids der Formel (I) gekuppelt wurde, die Boc-Gruppe der N-terminalen Aminosäure entblockiert wurde und die Tosylseitenkettenschutzgruppe des His-Rests entfernt wurde, um ein geschütztes fertiges Peptidharz zu erhalten;
    • (e) Abspalten und Entschützen des geschützten fertigen Peptidharzes, um das Peptid der Formel (I) zu erhalten, umfassend:
    • (i) Herstellen einer Lösung des geschützten fertigen Peptid-Harzes in einem Gemisch aus Methanol und einem inerten polaren aprotischen Lösungsmittel;
    • (ii) Abkühlen der Lösung auf etwa 0 bis 10°C:
    • (iii) Langsames Durchblasen von Ammoniakgas oder Ethylamingas und Beibehalten der Kühlung bis die Lösung mit Ammoniak gut gesättigt ist, um eine gesättigte Lösung zu erhalten;
    • (iv) Mischen der gesättigten Lösung ohne Kühlen für eine Dauer von 15 bis 36 Stunden bis > 95% freier Methylester bei Verwendung von Ammoniakgas zu dem entsprechenden Amid oder bei Verwendung von Ethylamingas zu dem entsprechenden Ethylamid umgewandelt sind; und
    • (f) Isolieren des Peptids aus der Lösung.
  • Ein bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass die folgenden Boc-α-amin-Aminosäuren aufeinander folgend vom C-Terminus zum N-Terminus gekuppelt werden, N-α-Boc-L-prolin, N-α-Boc-L-ariginin·HCl, N-α-Boc-L-leucin, N-α-Boc-D-tryptophan(N'-indolformyl), N-α-Boc-L-tyrosin, N-α-Boc-L-serin-Hydrat, N-α-Boc-tryptophan(N'-indolformyl), N-α-Boc-L-histidin(tosyl)cyclohexylaminsalz und Pyroglutaminsäure.
  • Ein bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass die Formylschutzgruppe der Trp-Seitenkette durch Behandlung mit einer Lösung, umfassend Ammoniak, ein primäres Amin oder ein sekundäres Amin und einen Alkohol, entfernt wird.
  • Ein bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass die Lösung Ammoniak und Methanol umfasst.
  • Ein bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass der Schritt des Isolierens des Peptids aus der Lösung umfasst:
    • (i) Filtrieren der Lösung unter Herstellung eines Filtrats; und
    • (ii) Konzentrieren des Filtrats.
  • Ein bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass beim Kuppeln von N-α-Boc-D-tryptophan(N'-indolformyl), N-α-Boc-L-tyrosin, N-α-Boc-L-serin-Hydrat und N-α-Boc-tryptophan(N'-indolformyl) auch 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) verwendet wird.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Festphasensynthese eines Peptids der Formel (I), hier vorstehend angegeben und definiert, bereit, wobei das Verfahren das vorübergehende Schützen eines beliebigen Tryptophanrests mit einer Seitenkettenschutzgruppe, die basenlabil ist, wobei die Schutzgruppe während der Abspaltung des Peptids der Formel (I) von dem festen träger durch Umsetzung mit einer Base entfernt wird, umfasst.
  • Ein bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass die Trp- oder D-Trp-Seitenkettenschutzgruppe eine Acylgruppe ist.
  • Ein bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass die Trp- oder D-Trp-Seitenkettenschutzgruppe durch Behandlung mit einer Lösung, umfassend Ammoniak, ein primäres Amin oder ein sekundäres Amin und einen Alkohol, entfernt wird.
  • Ein anderes bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass die Seitenkettenschutzgruppe Formyl ist und die Base eine Ammoniak umfassende Methanollösung ist.
  • Abkürzungen
    • BOC
      = t-Butoxycarbonyl
      Cit
      = Citrullin
      cPzACAla
      = cis-3-(4-Pyrazinylcarbonylaminocyclohexyl)alanin
      hArg(Bu)
      = N-Guanidino(butyl)homoarginin
      hArg(Et)2
      = N,N'-Guanidino(dimethyl)homoarginin
      hArg(CH2CF3)2
      = N,N'-Guanidinobis(2,2,2-trifluorethyl)homoarginin
      HOBT
      = 1-Hydroxybenzotriazol
      Lys(iPr)
      = Nε-Isopropyllysin
      β-Nal
      = β-1-Naphthylalanin oder β-2-Naphthylalanin, wenn nicht anders angegeben.
      NicLys
      = Nε-Nicotinoyllysin
      Pal
      = Pyridylalanin
      p-Cl-Phe
      = 3-(4-Chlorphenyl)alanin
      p-F-Phe
      = 3-(4-Fluorphenyl)alanin
      PicLys
      = Nε-Picolinoyllysin
      Qal
      = Chinolylalanin
  • Wenn nicht anders definiert, weisen alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, dieselbe Bedeutung auf, wie sie üblicherweise dem Durchschnittsfachmann verständlich ist.
  • Ein Peptid der Formel (I) kann durch Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung von chemischen Boc-Vorgängen auf Merrifield-Harz, gefolgt von Abspaltung des Peptids von dem Harz mit Ammoniak, einem primären Amin oder einem sekundären Amin in einem Alkohol unter Erhalt des Titelpeptids, hergestellt werden.
  • Der erste Schritt in einem derartigen erfindungsgemäßen Verfahren ist es, das Cäsiumsalz der C-terminalen Aminosäure, Boc-Gly, auf Merrifield-Harz durch eine Esterverknüpfung anzulagern. Das Cäsiumsalz von Boc-Gly wird durch Zugabe von Boc-Gly zu Cäsiumcarbonat in einem Gemisch aus Methanol und Wasser gebildet. Das Cäsiumsalz von Boc-Gly wird unter Vakuum getrocknet, und man lässt es dann mit den Chlormethylbenzylgruppen auf dem Polystyrol in einem wasserfreien polaren aprotischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid (DMF), reagieren. Diese Reaktion wird für eine Dauer von etwa 24 bis 48 Stunden, vorzugsweise 36 Stunden bei etwa 45°C bis 60°C, vorzugsweise 50°C, durchgeführt. Das umgesetzte Harz wird dann filtriert, mit Wasser, einem polaren aprotischen Lösungsmittel, wie DMF, und einem Alkohol, wie Methanol, gespült und dann auf ein konstantes Gewicht, vorzugsweise unter reduziertem Druck, getrocknet. Das getrocknete Harz kann zum Bestimmen des Boc-Gly-Gehalts getestet werden, der in mmol Gly pro Trockengramm Harz ausgedrückt wird. Der berechnete Wert wird zum Bestimmen des Maßstabs der Vereinigungsreaktion für die anschließende Materialverwendung und Berechnungen der theoretischen Ausbeute verwendet.
  • Die Synthese eines Peptids der Formel (I) kann auf dem Boc-Gly-Harz, enthalten in einem Glasreaktor mit Sinterglasscheibenfiltern am Boden des Reaktors, durchgeführt werden. Der Reaktor wird mit einem mechanischen Rührer gerührt und durch Aufbringen von Inertgasdruck, wie Stickstoffdruck, entleert, um Flüssigkeiten durch die Sinterglasscheibe am Boden zu pressen, während das Harz im Reaktor gehalten wird. Zuerst wird die Boc-Gruppe von Boc-Gly durch zweimaliges Mischen des Gly-Harzes mit einem Gemisch aus einer organischen Säure in einem chlorierten Lösungsmittel, vorzugsweise 25%iger Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM), zuerst für eine Dauer von etwa 2 Minuten und dann für eine Dauer von etwa 25 Minuten, gefolgt von durch Stickstoffdruck unterstütztes Entleeren, von dem Gly-Harz entfernt (z.B. entblockiert). Das Gly-Harz wird dreimal mit DCM und zweimal mit einem Alkohol, wie Isopropylalkohol (IPA), gespült, und das erhaltene Amino-TFA-Salz wird zweimal mit einer Base in einem inerten Lösungsmittel, vorzugsweise einer 10%igen Triethylaminbase in DCM, für eine Dauer von jeweils etwa 5 Minuten neutralisiert und dreimal mit DCM erneut gespült. Das Harz wird dann mit 2,5 Mol-äquivalenten Gemischen von Boc-α-Amino-geschützten Aminosäuren, entsprechend den für die Formel (I) definierten Aminosäuren vom C-terminalen Ende bis zum N-terminalen Ende, unter Verwendung eines Peptidkupplungsmittels, vorzugsweise von Diisopropylcarbodiimid (DIC), in polaren aprotischen Lösungsmitteln, vorzugsweise DMF/DCM-Gemischen als Reaktionsmedien, gekuppelt. Jeder Kupplung folgen Spülungen mit DMF und DCM. Das Harz kann durch Kaiser-Ninhydrin für jede Kupplungsbeendigung getestet werden, außer Arginin, das unter Verwendung von Isatin zum Nachweis des sekundären Amins von ungekuppeltem Restprolin getestet werden kann. Die Boc-Gruppe wird von jeder gekuppelten Aminosäure im Anschluss an das wie vorstehend beschriebene Testen entfernt. Die folgenden geschützten Aminosäuren, entsprechend den Aminosäuren der Formel (I), werden vorzugsweise in einer Synthese der vorliegenden Erfindung verwendet: N-α-Boc-L-prolin, N-α-Boc-L-arginin·HCl, N-α-Boc-L-leucin, N-α-Boc-D-tryptophan(N'-Indolformyl), N-α-Boc-L-tyrosin, N-α-Boc-L-serinhydrat, N-α-Boc-L-histidin(tosyl)cyclohexylaminsalz und Pyroglutaminsäure.
  • 1-Hydroxybenzotiazol (HOBT) kann beim Kuppeln der geschützten Derivate von D-Trp, Tyr, Ser und Trp ebenfalls verwendet werden (3–5 Äqu.). Die Tosylseitenketten-Schutzgruppe von Histidin wird mit zwei Behandlungen von HOBT in DMF für eine Dauer von (jeweils) einer Stunde nach der endgültigen Aminosäurekupplung entfernt. Boc-D-Tryptophan und Boc-L-Tryptophan werden mit Formyl am Stickstoff des Indolrings seitenkettengeschützt. Das Formyl wird später während der Abspaltung des Peptids von dem Harz unter Verwendung einer Base entfernt.
  • Das vollständige Peptidharz wird in einem ausgewogenen Sinterglastrichter mit einem inerten chlorierten Lösungsmittel wie DCM gespült, zweimal mit einem Alkohol wie Methanol gespült und unter Vakuum getrocknet. Das getrocknete Peptidharz wird in einen Dreihalsrundkolben mit einem Volumen von 1 Liter überführt. Ein Gemisch aus 9:1 Methanol/DMF mit etwa 15 Milliliter pro Gramm des Peptidharzes wird dem Rundkolben zugesetzt. Die Lösung wird auf etwa < 10°C abgekühlt, und wenn die C-terminale Amidform des Peptids gewünscht ist, wird Ammoniakgas langsam unter starkem Kühlen bis zur guten Sättigung (eine etwa 1-stündige Zugabezeit) durchgesprudelt, wobei das Peptid von dem Harz in Form einer freien Methylesterzwischenverbindung freigesetzt wird. Man lässt die Lösung ohne Kühlen für eine Dauer von etwa 15–36 Stunden weiter mischen, wobei während dieser Zeit etwa > 95% des freien Methylesters zu dem entsprechenden Amidprodukt umgewandelt werden. Der Reaktionsverlauf kann z.B. unter Verwendung von Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) überwacht werden und kann beendet werden, wenn der gewünschte Vollständigkeitsgrad erzielt ist. Das Produkt wird in Lösung mit einem Sinterglastrichter filtriert und das Harz mit Methanol und DMF mehrmals gespült. Alle Spülungen und Filtrate werden zu einem sehr dicken Öl kondensiert. Ethylacetat wird zugesetzt und die Lösung verrieben, um das Produkt zu verfestigen, dekantiert, und das Verreiben wird erneut mit Ethylacetat wiederholt. Das Rohprodukt wird in Methanol gelöst, und ein gleiches Volumen an 4N-Essigsäure wird zugesetzt. Die Lösung wird eingeengt, um das gesamte Methanol zu entfernen. Das Produkt wird mit 4N Essigsäure verdünnt.
  • Die C-terminale Ethylamidform des Peptids kann durch Ersetzen von Ethylamin für Ammoniak im Verfahren des unmittelbar vorangehenden Absatzes erhalten werden, wobei die Temperatur der Lösung unter etwa < 16°C während der Sättigung der Lösung mit Ethylamin, und vorzugsweise zwischen etwa 5°C bis etwa 15°C, gehalten wird.
  • Das Rohmaterial kann durch wiederholte präparative Umkehrphasenchromatographische Durchgänge gereinigt und lyophilisiert werden, um das Endprodukt zu erhalten.
  • Es ist dem Fachmann klar, dass andere Lösungsmittelsysteme verwendet werden können, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Alkohole mit niedrigem Molekulargewicht, wie Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Isobutanol, tert-Butanol und dergleichen, andere polare aprotische Lösungsmittel und Gemische davon.
  • Modi zur Durchführung der Erfindung
  • Beispiel
  • Synthese von pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2([D-Trp6]LHRH-NH2)
  • [D-Trp6]LHRH-NH2 wurde durch Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung von chemischen Boc-Vorgängen auf Merrifield-Harz, gefolgt von Abspaltung des Peptids von dem Harz mit methanolischem Ammoniak unter Erhalt des Titelpeptids, hergestellt.
  • Der erste Schritt im Verfahren bestand darin, das Cäsiumsalz der C-terminalen Aminosäure, Boc-Glycin, am Merrifield-Harz durch eine Esterverknüpfung anzulagern. Das Cäsiumsalz von Boc-Glycin wird durch Umsetzen von Boc-Glycin (40,9 g) mit Cäsium/carbonat (37,9 g) in einem Gemisch aus Methanol und Was ser (80 ml/40 ml) gebildet. Das Cäsiumsalz des Boc-Glycins wurde unter Vakuum getrocknet, und man ließ es dann mit den Chlormethylbenzylgruppen auf den Polystyrolperlen (Merrifield-Harz; Advanced Chemtech, 88,2 g) in wasserfreiem Dimethylformamid (DMF; 200 ml) reagieren. Diese Reaktion wurde für eine Dauer von etwa 36 Stunden bei etwa 50°C auf einem Rotationsverdampfer des Typs BüchiTM Modell 110 durchgeführt. Das umgesetzte Harz wurde dann filtriert, mit Wasser, DMF und Methanol gespült und auf ein konstantes Gewicht bei T < 35°C im Vakuum getrocknet. Das getrocknete Harz wurde dann zum Bestimmen des Boc-Glycin-Gehalts, der in mmol Glycin pro Trockengramm Harz ausgedrückt wird, getestet. Der berechnete Wert von 0,872 mmol/Gramm wurde gefunden und zum Bestimmen des genauen Maßstabs für die Zusammenschlussreaktion für die anschließende Materialverwendung und Berechnungen der theoretischen Ausbeute verwendet.
  • Die Synthese des Peptids wurde auf dem Boc-Glycin-Harz (12,5 g), enthalten in einem Glasreaktor mit Sinterglasscheibenfiltern sowohl am Boden als auch am oberen Teil des Reaktors mit 500 ml, durchgeführt. Der Reaktor wurde vom Boden her befüllt und durch Umwenden (Drehen um 180 Grad innerhalb von 3 Sekunden) geschüttelt. Zuerst wurde die Boc-Gruppe vom Glycinharz durch zweimaliges Mischen des Harzes mit 175 ml 25%iger Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) (2 Minuten und 25 Minuten), gefolgt von durch Stickstoffdruck unterstütztem Entleeren, entfernt. Das Harz wurde dreimal mit 125 ml DCM und zweimal mit 125 ml Isopropylalkohol (IPA) und dann dreimal mit 125 ml DCM gespült. Das erhaltene Amino-TFA-Salz wurde zweimal mit 125 ml 10%iger Triethylaminbase in DCM für eine Dauer von jeweils 5 Minuten neutralisiert und dreimal mit DCM erneut gespült.
  • Das Harz wurde dann mit einem 2,6 Mol-äquivalenten Gemisch der folgenden Boc-geschützten Aminosäure mit 4,2 ml Diisopropylcarbodiimid (DIC) in 16 ml DMF und 47 ml gekuppelt und entblockiert; 5,84 Boc-L-prolin, 8,93 g Boc-L- arginin-HCl, 6,77 g Boc-L-leucin, 9,0 g Boc-D-tryptophan(formyl), 7,64 g Boc-L-tyrosin, 9,0 g Boc-L-tryptophan(formyl), 6,06 g Boc-L-serinhydrat, 16 g Boc-L-histidin(tosyl)·Cyclohexylaminsalz und 13,5 g Pyroglutaminsäure. 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) wurde ebenfalls verwendet (3–5 Äqu.) in D-Trp, Tyr, Ser und Trp-Kupplungen. 75 ml Dimethylacetamid (DMA) wurde anstelle von DMF und DCM beim Kuppeln von Arg verwendet. Das Harz wurde mit DMF und DCM gespült und durch Kaiser-Ninhydrin auf Kupplungsbeendigung getestet. Die Boc-Gruppe wurde von jeder gekuppelten Aminosäure, wie vorstehend beschrieben, entfernt. Histidin wurde mit Tosyl an der Seitenkette geschützt, das mit zwei Behandlungen von 4,16 g HOBT in 105 ml DMF für eine Dauer von einer Stunde (jeweils) nach der endgültigen Aminosäurekupplung entfernt wurde. Boc-D-Tryptophan und Boc-L-Tryptophan wurden mit Formyl, das während der Abspaltung des Peptids von dem Harz entfernt wurde, seitenkettengeschützt.
  • Das vollständige Peptid-Harz wurde in einem ausgewogenen Sinterglastrichter mit DCM gespült, zweimal mit Methanol gespült und unter Vakuum getrocknet. Das getrocknete Peptid-Harz wurde in einen Dreihalsrundkolben mit einem Volumen von einem Liter überführt. 15 ml/Gramm des Peptidharzes in 9:1 Methanol/DMF (380 ml für einen Maßstab von 10,9 mM) wurde dem Kolben zugesetzt. Die Lösung wurde auf etwa < 10°C abgekühlt, und Ammoniakgas wurde langsam unter starkem Kühlen bis zur guten Sättigung (eine Zugabezeit von etwa 1 Stunde) durchgesprudelt. Man ließ die Lösung ohne Kühlen für eine Dauer von etwa 15–36 Stunden weiter mischen, bis > 95% freier Methylester zum Amidprodukt umgewandelt wurde, wie durch Überwachen mit Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) bestimmt. Das Produkt wurde in Lösung mit einem Sinterglastrichter filtriert, und das Harz wurde mit Methanol und DMF mehrmals gespült. Alle Spülungen und Filtrate wurden zu einem sehr dicken Öl auf einem Rotationsverdampfer bei T < 40°C kondensiert. Ethylacetat (0,08 Liter) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde zum Verfestigen des Produkts verrieben, dekantiert und wiederholt mit 0,08 Litern Ethylacetat verrieben. Das harte, gum miartige Produkt wurde in Ethylacetat über Nacht getaucht und dekantiert. Das Rohprodukt wurde in Methanol (0,07 Liter) gelöst, und ein gleiches Volumen von 4N Essigsäure wurde zugesetzt. Die Lösung wurde zum Entfernen des gesamten Methanols auf einem Rotationsverdampfer bei T < 40°C eingeengt. Das Produkt wurde auf etwa 35 Gramm Produkt/Liter mit 4N Essigsäure verdünnt.
  • Das Rohmaterial wurde dann durch wiederholte Umkehrphasenchromatographische Durchgänge gereinigt und lyophilisiert, um das Endprodukt (8,4 g, 59%ige Ausbeute) als weißen Feststoff mit > 99%iger Reinheit zu erhalten.

Claims (9)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel (I)
    Figure 00150001
    wobei der His-Rest mit einer Tosylgruppe geschützt ist und das Indol-NH jedes Trp-Rests geschützt ist, umfassend die Schritte: (a) Anlagern eines Cäsiumsalzes von Boc-Gly an ein chlormethyliertes Polystyrolharz, um Boc-Gly-Harz zu erhalten; (b) Entblockieren des Boc-Gly-Harzes durch Mischen des Boc-Gly-Harzes mit einem Gemisch aus einer Boc-entblockierenden organischen Säure, um ein organisches Säuresalz von H2N-Gly-Harz zu erhalten; (c) Neutralisieren des organischen Säuresalzes von H2N-Gly-Harz mit einer Base, um H2N-Gly-Harz zu erhalten; (d) Kuppeln von H2-Gly-Harz mit einer Boc-α-amin-geschützten Aminosäure, wobei die geschützte Aminosäure einer für die Formel (I) definierten Aminosäure entspricht, in der vom C-Terminus zum N-Terminus dargestellten Reihenfolge, umfassend (i) Umsetzen von H2N-Harz mit der Boc-α-amin-geschützten Aminosäure in Gegenwart eines Peptidkupplungsmittels, um ein Boc-blockiertes gekuppeltes Produkt zu erhalten; (ii) Entblockieren der Boc-Gruppe von dem Boc-blockierten gekuppelten Produkt durch Mischen des Boc-blockierten gekuppelten Produkts mit einer Boc-entblockierenden organischen Säure, um ein gekuppeltes Produkt zu erhalten; (iii) Umsetzen des gekuppelten Produkts mit einer weiteren Boc-α-amin-geschützten Aminosäure in Gegenwart eines Peptidkupplungsmittels, um ein Boc-blockiertes gekuppeltes Produkt zu erhalten; (iv) Entblockieren der Boc-Gruppe von dem Boc-blockierten gekuppelten Produkt durch Mischen des Boc-blockierten gekuppelten Produkts mit einer Boc-entblockierenden organischen Säure, um ein weiteres gekuppeltes Produkt zu erhalten; (v) Wiederholen der Schritte (d)(iii) und (d)(iv) bis die N-terminale Aminosäure des Peptids der Formel (I) gekuppelt wurde, die Boc-Gruppe der N-terminalen Aminosäure entblockiert wurde und die Tosylseitenkettenschutzgruppe des His-Rests entfernt wurde, um ein geschütztes fertiges Peptidharz zu erhalten; (e) Abspalten und Entschützen des geschützten fertigen Peptidharzes, um das Peptid der Formel (I) zu erhalten, wobei das Abspalten und Entschützen Folgendes umfasst: (i) Herstellen einer Lösung des geschützten fertigen Peptid-Harzes in einem Gemisch aus Methanol und einem inerten polaren aprotischen Lösungsmittel; (ii) Abkühlen der Lösung auf etwa 0 bis 10°C: (iii) Langsames Durchleiten von Ammoniakgas oder Ethylamingas und Beibehalten der Kühlung bis die Lösung mit Ammoniak gut gesättigt ist, um eine gesättigte Lösung zu erhalten; (iv) Mischen der gesättigten Lösung ohne Kühlen für eine Dauer von 15 bis 36 Stunden bis > 95% freier Methylester bei Verwendung von Ammoniakgas zu dem entsprechenden Amid oder bei Verwendung von Ethylamingas zu dem entsprechenden Ethylamid umgewandelt sind; und (f) Isolieren des Peptids aus der Lösung.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die folgenden Boc-α-amin-Aminosäuren aufeinander folgend vom C-Terminus zum N-Terminus gekuppelt werden, N-α-Boc-L-prolin, N-α-Boc-L-ariginin·HCl, N-α-Boc-L-leucin, N-α-Boc-D-tryptophan(N'-indolformyl), N-α-Boc-L-tyrosin, N-α-Boc-L-serin-Hydrat, N-α-Boc-tryptophan(N'-indolformyl), N-α-Boc-L-histidin(tosyl)cyclohexylaminsalz und Pyroglutaminsäure.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Formylschutzgruppe der Trp-Seitenkette durch Behandlung mit einer Lösung, umfassend Ammoniak, ein primäres Amin oder ein sekundäres Amin und einen Alkohol, entfernt wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Lösung Ammoniak und Methanol umfasst.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, wobei beim Kuppeln von N-α-Boc-D-tryptophan(N'-indolformyl), N-α-Boc-L-tyrosin, N-α-Boc-L-serin- Hydrat und N-α-Boc-tryptophan(N'-indolformyl) auch 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) verwendet wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 1 zur Festphasensynthese eines Peptids der Formel (I), das in Anspruch 1 angegeben und definiert ist, umfassend das vorübergehende Schützen jedweder Tryptophanreste mit einer Seitenkettenschutzgruppe, die basenlabil ist, wobei die Schutzgruppe während der Abspaltung des Peptids der Formel (I) von dem festen Träger durch Umsetzung mit einer Base entfernt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Trp- oder D-Trp-Seitenkettenschutzgruppe eine Acylgruppe ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Trp- oder D-Trp-Seitenkettenschutzgruppe durch Behandlung mit einer Lösung, umfassend Ammoniak, ein primäres Amin oder ein sekundäres Amin und einen Alkohol, entfernt wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Seitenkettenschutzgruppe Formyl ist und die Base eine Ammoniak umfassende Methanollösung ist.
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