DE60123115T2 - Verfahren für die synthese eines lhrh peptides - Google Patents
Verfahren für die synthese eines lhrh peptides Download PDFInfo
- Publication number
- DE60123115T2 DE60123115T2 DE60123115T DE60123115T DE60123115T2 DE 60123115 T2 DE60123115 T2 DE 60123115T2 DE 60123115 T DE60123115 T DE 60123115T DE 60123115 T DE60123115 T DE 60123115T DE 60123115 T2 DE60123115 T2 DE 60123115T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- boc
- peptide
- resin
- solution
- gly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 13
- 101000904173 Homo sapiens Progonadoliberin-1 Proteins 0.000 title 1
- 102100024028 Progonadoliberin-1 Human genes 0.000 title 1
- 101000996723 Sus scrofa Gonadotropin-releasing hormone receptor Proteins 0.000 title 1
- XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N gonadorelin Chemical compound C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 5
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 claims abstract description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 55
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 55
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 38
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 22
- -1 organic acid salt Chemical class 0.000 claims description 21
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 12
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 12
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 9
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 claims description 9
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 8
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical class [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 7
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000003880 polar aprotic solvent Substances 0.000 claims description 6
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 claims description 5
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- 125000003941 D-tryptophan group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 claims description 4
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 4
- NQIHMZLGCZNZBN-PXNSSMCTSA-N Trp-Trp Chemical group C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)N)C(O)=O)=CNC2=C1 NQIHMZLGCZNZBN-PXNSSMCTSA-N 0.000 claims description 4
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 claims description 4
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 claims description 3
- JLLYLQLDYORLBB-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-n-methylthiophene-2-sulfonamide Chemical compound CNS(=O)(=O)C1=CC=C(Br)S1 JLLYLQLDYORLBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 2
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 abstract description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108700012941 GNRH1 Proteins 0.000 description 12
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- VRPJIFMKZZEXLR-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]acetic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCC(O)=O VRPJIFMKZZEXLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HBAHZZVIEFRTEY-UHFFFAOYSA-N 2-heptylcyclohex-2-en-1-one Chemical compound CCCCCCCC1=CCCCC1=O HBAHZZVIEFRTEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001367 Merrifield resin Polymers 0.000 description 5
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NFVNYBJCJGKVQK-CYBMUJFWSA-N (2r)-3-(1h-indol-3-yl)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 NFVNYBJCJGKVQK-CYBMUJFWSA-N 0.000 description 3
- QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N L-Homoarginine Natural products OC(=O)C(N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N L-homoarginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- NFVNYBJCJGKVQK-ZDUSSCGKSA-N N-[(Tert-butoxy)carbonyl]-L-tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 NFVNYBJCJGKVQK-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 2
- FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L caesium carbonate Chemical compound [Cs+].[Cs+].[O-]C([O-])=O FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000024 caesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- JXDYKVIHCLTXOP-UHFFFAOYSA-N isatin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(=O)NC2=C1 JXDYKVIHCLTXOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 2
- ZQEBQGAAWMOMAI-ZETCQYMHSA-N (2s)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZQEBQGAAWMOMAI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- PFUCBURAJSFZKT-MQWKRIRWSA-N (2s)-2,6-diamino-7-methyloctanoic acid Chemical compound CC(C)C(N)CCC[C@H](N)C(O)=O PFUCBURAJSFZKT-MQWKRIRWSA-N 0.000 description 1
- CHZYWEGTGDXQRY-GKAPJAKFSA-N (2s)-2,6-diamino-7-oxo-7-pyridin-2-ylheptanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC(N)C(=O)C1=CC=CC=N1 CHZYWEGTGDXQRY-GKAPJAKFSA-N 0.000 description 1
- QXHHGFRDEWBOSH-AXDSSHIGSA-N (2s)-2,6-diamino-7-oxo-7-pyridin-3-ylheptanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC(N)C(=O)C1=CC=CN=C1 QXHHGFRDEWBOSH-AXDSSHIGSA-N 0.000 description 1
- CNMAQBJBWQQZFZ-LURJTMIESA-N (2s)-2-(pyridin-2-ylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1=CC=CC=N1 CNMAQBJBWQQZFZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- HOBACDWMUXDSHY-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-(quinolin-2-ylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(N[C@@H](C)C(O)=O)=CC=C21 HOBACDWMUXDSHY-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- LAKPFBJORILZSA-ILDUYXDCSA-N (2s)-2-amino-3-[4-(pyrazine-2-carbonylamino)cyclohexyl]propanoic acid Chemical compound C1CC(C[C@H](N)C(O)=O)CCC1NC(=O)C1=CN=CC=N1 LAKPFBJORILZSA-ILDUYXDCSA-N 0.000 description 1
- CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N (2s)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- DCLJSEPKYJSEHW-HNNXBMFYSA-N (2s)-3-[1-(4-methylphenyl)sulfonylimidazol-4-yl]-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical group C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N1C=C(C[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)N=C1 DCLJSEPKYJSEHW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- JLIWGTMHYWJUPM-JEDNCBNOSA-N (2s)-3-hydroxy-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid;hydrate Chemical compound O.CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JLIWGTMHYWJUPM-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- 125000004206 2,2,2-trifluoroethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C(F)(F)F 0.000 description 1
- 125000001255 4-fluorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1F 0.000 description 1
- 239000004925 Acrylic resin Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDELGKMVZYHPPB-FJXQXJEOSA-N [(4s)-4-carboxy-4-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butyl]-(diaminomethylidene)azanium;chloride Chemical compound Cl.CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HDELGKMVZYHPPB-FJXQXJEOSA-N 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- CBHOOMGKXCMKIR-UHFFFAOYSA-N azane;methanol Chemical compound N.OC CBHOOMGKXCMKIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 150000003946 cyclohexylamines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N divinylbenzene Substances C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- OFYAYGJCPXRNBL-LBPRGKRZSA-N naphthalen-2-yl-3-alanine Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CC=CC2=C1 OFYAYGJCPXRNBL-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 125000003854 p-chlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1Cl 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- VXKHXGOKWPXYNA-PGBVPBMZSA-N triptorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 VXKHXGOKWPXYNA-PGBVPBMZSA-N 0.000 description 1
- JPZXHKDZASGCLU-LBPRGKRZSA-N β-(2-naphthyl)-alanine Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC=C21 JPZXHKDZASGCLU-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
- C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
- C07K1/068—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for heterocyclic side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/23—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH]; Related peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Indole Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
- Gebiet der Erfindung
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese eines Peptids mit einem Trp-Rest unter Verwendung einer Festphase.
- Allgemeiner Stand der Technik
- Luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon (LHRH) ist ein Neurotransmitter, der durch den Hypothalamus produziert wird, der die Sezernierung von luteinisierendem Hormon (LHRH) und Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) aus der Hypophyse stabilisiert, was wiederum die Synthese von Steroidhormonen, wie Testosteron, von den Gonaden stimuliert. Viele LHRH-Peptidanaloga (z.B. Agonisten und Antagonisten) werden gegenwärtig zur Behandlung von Endometriose, Prostatakrebs, frühzeitiger Pubertät und anderer hormonell bedingter Störungen vertrieben. Die Synthese von derartigen LHRH-Analoga ist schwierig und teuer.
- Die Festphasenpeptidsynthese wurde 1963 eingeführt, mit der Absicht, viele der mit der Lösungsphasenpeptidsynthese verbundenen Zwischenreinigungsprobleme zu bewältigen. Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., 2. Aufl.) 1984. Während der Festphasensynthese werden Aminosäuren zu einem Peptid von einer beliebigen gewünschten Sequenz zusammengeschlossen (d.h. gekuppelt), während ein Ende der Kette (d.h. der C-Terminus) an einem unlöslichen Träger verankert ist. Nachdem die gewünschte Sequenz auf dem Träger verknüpft wurde, wird dann das Peptid von dem Träger abgelöst (d.h. abgespalten).
- US-Patent Nr. 4,010,125 (1977) beschreibt die Synthese von [D-Trp6]-LHRH, in welchem die Seitenketten von vier der zehn Reste des LHRH-Agonisten geschützt sind (z.B. L-Histidyl(tosyl), Seryl(benzyl), Tyroxyl(2,6-di-Cl-Bzl), und L-Arginyl(tosyl)). Jedoch erörterten später Coy et al., Int. J. Peptide Protein Res. 14:359 (1979), die Synthese einer Anzahl von anderen LHRH-Analoga, in welchen ein minimaler Seitenkettenschutz, z.B. nur ein Salzschutz von Arginin (d.h. Arg.HCl) eine übenagende Ausbeute der entsprechenden geschützten Synthese erzeugt wurde. Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, dass trotz des Trends auf dem Fachgebiet, die Seitenketten von Aminosäuren bei der Synthese von LHRH-Analoga nicht zu schützen, der Schutz des Tryptophanrests während der Festphasensynthese tatsächlich die Ausbeute von LHRH-Analoga mit einem Tryptophanrest (z.B. [D-Trp6]LHRH) verbessert.
- US-Patent Nr. 4,569,927 offenbart Peptide, einschließlich Decapeptide. In derartigen Peptiden ist es erforderlich, dass D-Phe die zweite Aminosäure in der Sequenz ist. Es gibt keine Offenbarung über bioaktive LHRH-Derivate mit Histidin in der zweiten Rest-Position.
-
DE 3931731 offenbart die Festphasensynthese von [D-Trp6]-LHRH auf Polyacrylharz. Die Synthese nutzt den Vorteil der hydrophilen Eigenschaften, die Polyacrylharze im Gegensatz zu Polystyrolharzen, aufweisen. -
BE 904 458 - Offenbarung der Erfindung
- In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel (I) bereit,wobei der His-Rest mit einer Tosylgruppe geschützt ist und das Indol-NH von jedem beliebigen Trp-Rest geschützt ist,
umfassend die Schritte: - (a) Anlagern eines Cäsiumsalzes von Boc-Gly an ein chlormethyliertes Polystyrolharz, um Boc-Gly-Harz zu erhalten;
- (b) Entblockieren des Boc-Gly-Harzes durch Mischen des Boc-Gly-Harzes mit einem Gemisch aus einer Boc-entblockierenden organischen Säure, um ein organisches Säuresalz von H2N-Gly-Harz zu erhalten;
- (c) Neutralisieren des organischen Säuresalzes von H2N-Gly-Harz mit einer Base, um H2N-Gly-Harz zu erhalten;
- (d) Kuppeln von H2-Gly-Harz mit einer Boc-α-amin-geschützten Aminosäure, wobei die geschützte Aminosäure der für die Formel (I) definierten Aminosäure entspricht, in der vom C-Terminus zum N-Terminus dargestellten Reihenfolge, umfassend
- (i) Umsetzen von H2N-Harz mit der Boc-α-amin-geschützten Aminosäure in Gegenwart eines Peptidkupplungsmittels, um ein Bocblockiertes gekuppeltes Produkt zu erhalten;
- (ii) Entblockieren der Boc-Gruppe von dem Boc-blockierten gekuppelten Produkt durch Mischen des Boc-blockierten gekuppelten Produkts mit einer Boc-entblockierenden organischen Säure, um ein gekuppeltes Produkt zu erhalten;
- (iii) Umsetzen des gekuppelten Produkts mit einer weiteren Boc-α-amin-geschützten Aminosäure in Gegenwart eines Peptidkupplungsmittels, um ein Boc-blockiertes gekuppeltes Produkt zu erhalten;
- (iv) Entblockieren der Boc-Gruppe von dem Boc-blockierten gekuppelten Produkt durch Mischen des Boc-blockierten gekuppelten Produkts mit einer Boc-entblockierenden organischen Säure, um ein weiteres gekuppeltes Produkt zu erhalten;
- (v) Wiederholen der Schritte (d)(iii) und (d)(iv) bis die N-terminale Aminosäure des Peptids der Formel (I) gekuppelt wurde, die Boc-Gruppe der N-terminalen Aminosäure entblockiert wurde und die Tosylseitenkettenschutzgruppe des His-Rests entfernt wurde, um ein geschütztes fertiges Peptidharz zu erhalten;
- (e) Abspalten und Entschützen des geschützten fertigen Peptidharzes, um das Peptid der Formel (I) zu erhalten, umfassend:
- (i) Herstellen einer Lösung des geschützten fertigen Peptid-Harzes in einem Gemisch aus Methanol und einem inerten polaren aprotischen Lösungsmittel;
- (ii) Abkühlen der Lösung auf etwa 0 bis 10°C:
- (iii) Langsames Durchblasen von Ammoniakgas oder Ethylamingas und Beibehalten der Kühlung bis die Lösung mit Ammoniak gut gesättigt ist, um eine gesättigte Lösung zu erhalten;
- (iv) Mischen der gesättigten Lösung ohne Kühlen für eine Dauer von 15 bis 36 Stunden bis > 95% freier Methylester bei Verwendung von Ammoniakgas zu dem entsprechenden Amid oder bei Verwendung von Ethylamingas zu dem entsprechenden Ethylamid umgewandelt sind; und
- (f) Isolieren des Peptids aus der Lösung.
- Ein bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass die folgenden Boc-α-amin-Aminosäuren aufeinander folgend vom C-Terminus zum N-Terminus gekuppelt werden, N-α-Boc-L-prolin, N-α-Boc-L-ariginin·HCl, N-α-Boc-L-leucin, N-α-Boc-D-tryptophan(N'-indolformyl), N-α-Boc-L-tyrosin, N-α-Boc-L-serin-Hydrat, N-α-Boc-tryptophan(N'-indolformyl), N-α-Boc-L-histidin(tosyl)cyclohexylaminsalz und Pyroglutaminsäure.
- Ein bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass die Formylschutzgruppe der Trp-Seitenkette durch Behandlung mit einer Lösung, umfassend Ammoniak, ein primäres Amin oder ein sekundäres Amin und einen Alkohol, entfernt wird.
- Ein bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass die Lösung Ammoniak und Methanol umfasst.
- Ein bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass der Schritt des Isolierens des Peptids aus der Lösung umfasst:
- (i) Filtrieren der Lösung unter Herstellung eines Filtrats; und
- (ii) Konzentrieren des Filtrats.
- Ein bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass beim Kuppeln von N-α-Boc-D-tryptophan(N'-indolformyl), N-α-Boc-L-tyrosin, N-α-Boc-L-serin-Hydrat und N-α-Boc-tryptophan(N'-indolformyl) auch 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) verwendet wird.
- In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Festphasensynthese eines Peptids der Formel (I), hier vorstehend angegeben und definiert, bereit, wobei das Verfahren das vorübergehende Schützen eines beliebigen Tryptophanrests mit einer Seitenkettenschutzgruppe, die basenlabil ist, wobei die Schutzgruppe während der Abspaltung des Peptids der Formel (I) von dem festen träger durch Umsetzung mit einer Base entfernt wird, umfasst.
- Ein bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass die Trp- oder D-Trp-Seitenkettenschutzgruppe eine Acylgruppe ist.
- Ein bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass die Trp- oder D-Trp-Seitenkettenschutzgruppe durch Behandlung mit einer Lösung, umfassend Ammoniak, ein primäres Amin oder ein sekundäres Amin und einen Alkohol, entfernt wird.
- Ein anderes bevorzugtes Verfahren des unmittelbar vorangehenden Verfahrens besteht darin, dass die Seitenkettenschutzgruppe Formyl ist und die Base eine Ammoniak umfassende Methanollösung ist.
- Abkürzungen
-
-
- BOC
- = t-Butoxycarbonyl
- Cit
- = Citrullin
- cPzACAla
- = cis-3-(4-Pyrazinylcarbonylaminocyclohexyl)alanin
- hArg(Bu)
- = N-Guanidino(butyl)homoarginin
- hArg(Et)2
- = N,N'-Guanidino(dimethyl)homoarginin
- hArg(CH2CF3)2
- = N,N'-Guanidinobis(2,2,2-trifluorethyl)homoarginin
- HOBT
- = 1-Hydroxybenzotriazol
- Lys(iPr)
- = Nε-Isopropyllysin
- β-Nal
- = β-1-Naphthylalanin oder β-2-Naphthylalanin, wenn nicht anders angegeben.
- NicLys
- = Nε-Nicotinoyllysin
- Pal
- = Pyridylalanin
- p-Cl-Phe
- = 3-(4-Chlorphenyl)alanin
- p-F-Phe
- = 3-(4-Fluorphenyl)alanin
- PicLys
- = Nε-Picolinoyllysin
- Qal
- = Chinolylalanin
- Wenn nicht anders definiert, weisen alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, dieselbe Bedeutung auf, wie sie üblicherweise dem Durchschnittsfachmann verständlich ist.
- Ein Peptid der Formel (I) kann durch Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung von chemischen Boc-Vorgängen auf Merrifield-Harz, gefolgt von Abspaltung des Peptids von dem Harz mit Ammoniak, einem primären Amin oder einem sekundären Amin in einem Alkohol unter Erhalt des Titelpeptids, hergestellt werden.
- Der erste Schritt in einem derartigen erfindungsgemäßen Verfahren ist es, das Cäsiumsalz der C-terminalen Aminosäure, Boc-Gly, auf Merrifield-Harz durch eine Esterverknüpfung anzulagern. Das Cäsiumsalz von Boc-Gly wird durch Zugabe von Boc-Gly zu Cäsiumcarbonat in einem Gemisch aus Methanol und Wasser gebildet. Das Cäsiumsalz von Boc-Gly wird unter Vakuum getrocknet, und man lässt es dann mit den Chlormethylbenzylgruppen auf dem Polystyrol in einem wasserfreien polaren aprotischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid (DMF), reagieren. Diese Reaktion wird für eine Dauer von etwa 24 bis 48 Stunden, vorzugsweise 36 Stunden bei etwa 45°C bis 60°C, vorzugsweise 50°C, durchgeführt. Das umgesetzte Harz wird dann filtriert, mit Wasser, einem polaren aprotischen Lösungsmittel, wie DMF, und einem Alkohol, wie Methanol, gespült und dann auf ein konstantes Gewicht, vorzugsweise unter reduziertem Druck, getrocknet. Das getrocknete Harz kann zum Bestimmen des Boc-Gly-Gehalts getestet werden, der in mmol Gly pro Trockengramm Harz ausgedrückt wird. Der berechnete Wert wird zum Bestimmen des Maßstabs der Vereinigungsreaktion für die anschließende Materialverwendung und Berechnungen der theoretischen Ausbeute verwendet.
- Die Synthese eines Peptids der Formel (I) kann auf dem Boc-Gly-Harz, enthalten in einem Glasreaktor mit Sinterglasscheibenfiltern am Boden des Reaktors, durchgeführt werden. Der Reaktor wird mit einem mechanischen Rührer gerührt und durch Aufbringen von Inertgasdruck, wie Stickstoffdruck, entleert, um Flüssigkeiten durch die Sinterglasscheibe am Boden zu pressen, während das Harz im Reaktor gehalten wird. Zuerst wird die Boc-Gruppe von Boc-Gly durch zweimaliges Mischen des Gly-Harzes mit einem Gemisch aus einer organischen Säure in einem chlorierten Lösungsmittel, vorzugsweise 25%iger Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM), zuerst für eine Dauer von etwa 2 Minuten und dann für eine Dauer von etwa 25 Minuten, gefolgt von durch Stickstoffdruck unterstütztes Entleeren, von dem Gly-Harz entfernt (z.B. entblockiert). Das Gly-Harz wird dreimal mit DCM und zweimal mit einem Alkohol, wie Isopropylalkohol (IPA), gespült, und das erhaltene Amino-TFA-Salz wird zweimal mit einer Base in einem inerten Lösungsmittel, vorzugsweise einer 10%igen Triethylaminbase in DCM, für eine Dauer von jeweils etwa 5 Minuten neutralisiert und dreimal mit DCM erneut gespült. Das Harz wird dann mit 2,5 Mol-äquivalenten Gemischen von Boc-α-Amino-geschützten Aminosäuren, entsprechend den für die Formel (I) definierten Aminosäuren vom C-terminalen Ende bis zum N-terminalen Ende, unter Verwendung eines Peptidkupplungsmittels, vorzugsweise von Diisopropylcarbodiimid (DIC), in polaren aprotischen Lösungsmitteln, vorzugsweise DMF/DCM-Gemischen als Reaktionsmedien, gekuppelt. Jeder Kupplung folgen Spülungen mit DMF und DCM. Das Harz kann durch Kaiser-Ninhydrin für jede Kupplungsbeendigung getestet werden, außer Arginin, das unter Verwendung von Isatin zum Nachweis des sekundären Amins von ungekuppeltem Restprolin getestet werden kann. Die Boc-Gruppe wird von jeder gekuppelten Aminosäure im Anschluss an das wie vorstehend beschriebene Testen entfernt. Die folgenden geschützten Aminosäuren, entsprechend den Aminosäuren der Formel (I), werden vorzugsweise in einer Synthese der vorliegenden Erfindung verwendet: N-α-Boc-L-prolin, N-α-Boc-L-arginin·HCl, N-α-Boc-L-leucin, N-α-Boc-D-tryptophan(N'-Indolformyl), N-α-Boc-L-tyrosin, N-α-Boc-L-serinhydrat, N-α-Boc-L-histidin(tosyl)cyclohexylaminsalz und Pyroglutaminsäure.
- 1-Hydroxybenzotiazol (HOBT) kann beim Kuppeln der geschützten Derivate von D-Trp, Tyr, Ser und Trp ebenfalls verwendet werden (3–5 Äqu.). Die Tosylseitenketten-Schutzgruppe von Histidin wird mit zwei Behandlungen von HOBT in DMF für eine Dauer von (jeweils) einer Stunde nach der endgültigen Aminosäurekupplung entfernt. Boc-D-Tryptophan und Boc-L-Tryptophan werden mit Formyl am Stickstoff des Indolrings seitenkettengeschützt. Das Formyl wird später während der Abspaltung des Peptids von dem Harz unter Verwendung einer Base entfernt.
- Das vollständige Peptidharz wird in einem ausgewogenen Sinterglastrichter mit einem inerten chlorierten Lösungsmittel wie DCM gespült, zweimal mit einem Alkohol wie Methanol gespült und unter Vakuum getrocknet. Das getrocknete Peptidharz wird in einen Dreihalsrundkolben mit einem Volumen von 1 Liter überführt. Ein Gemisch aus 9:1 Methanol/DMF mit etwa 15 Milliliter pro Gramm des Peptidharzes wird dem Rundkolben zugesetzt. Die Lösung wird auf etwa < 10°C abgekühlt, und wenn die C-terminale Amidform des Peptids gewünscht ist, wird Ammoniakgas langsam unter starkem Kühlen bis zur guten Sättigung (eine etwa 1-stündige Zugabezeit) durchgesprudelt, wobei das Peptid von dem Harz in Form einer freien Methylesterzwischenverbindung freigesetzt wird. Man lässt die Lösung ohne Kühlen für eine Dauer von etwa 15–36 Stunden weiter mischen, wobei während dieser Zeit etwa > 95% des freien Methylesters zu dem entsprechenden Amidprodukt umgewandelt werden. Der Reaktionsverlauf kann z.B. unter Verwendung von Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) überwacht werden und kann beendet werden, wenn der gewünschte Vollständigkeitsgrad erzielt ist. Das Produkt wird in Lösung mit einem Sinterglastrichter filtriert und das Harz mit Methanol und DMF mehrmals gespült. Alle Spülungen und Filtrate werden zu einem sehr dicken Öl kondensiert. Ethylacetat wird zugesetzt und die Lösung verrieben, um das Produkt zu verfestigen, dekantiert, und das Verreiben wird erneut mit Ethylacetat wiederholt. Das Rohprodukt wird in Methanol gelöst, und ein gleiches Volumen an 4N-Essigsäure wird zugesetzt. Die Lösung wird eingeengt, um das gesamte Methanol zu entfernen. Das Produkt wird mit 4N Essigsäure verdünnt.
- Die C-terminale Ethylamidform des Peptids kann durch Ersetzen von Ethylamin für Ammoniak im Verfahren des unmittelbar vorangehenden Absatzes erhalten werden, wobei die Temperatur der Lösung unter etwa < 16°C während der Sättigung der Lösung mit Ethylamin, und vorzugsweise zwischen etwa 5°C bis etwa 15°C, gehalten wird.
- Das Rohmaterial kann durch wiederholte präparative Umkehrphasenchromatographische Durchgänge gereinigt und lyophilisiert werden, um das Endprodukt zu erhalten.
- Es ist dem Fachmann klar, dass andere Lösungsmittelsysteme verwendet werden können, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Alkohole mit niedrigem Molekulargewicht, wie Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Isobutanol, tert-Butanol und dergleichen, andere polare aprotische Lösungsmittel und Gemische davon.
- Modi zur Durchführung der Erfindung
- Beispiel
- Synthese von pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2([D-Trp6]LHRH-NH2)
- [D-Trp6]LHRH-NH2 wurde durch Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung von chemischen Boc-Vorgängen auf Merrifield-Harz, gefolgt von Abspaltung des Peptids von dem Harz mit methanolischem Ammoniak unter Erhalt des Titelpeptids, hergestellt.
- Der erste Schritt im Verfahren bestand darin, das Cäsiumsalz der C-terminalen Aminosäure, Boc-Glycin, am Merrifield-Harz durch eine Esterverknüpfung anzulagern. Das Cäsiumsalz von Boc-Glycin wird durch Umsetzen von Boc-Glycin (40,9 g) mit Cäsium/carbonat (37,9 g) in einem Gemisch aus Methanol und Was ser (80 ml/40 ml) gebildet. Das Cäsiumsalz des Boc-Glycins wurde unter Vakuum getrocknet, und man ließ es dann mit den Chlormethylbenzylgruppen auf den Polystyrolperlen (Merrifield-Harz; Advanced Chemtech, 88,2 g) in wasserfreiem Dimethylformamid (DMF; 200 ml) reagieren. Diese Reaktion wurde für eine Dauer von etwa 36 Stunden bei etwa 50°C auf einem Rotationsverdampfer des Typs BüchiTM Modell 110 durchgeführt. Das umgesetzte Harz wurde dann filtriert, mit Wasser, DMF und Methanol gespült und auf ein konstantes Gewicht bei T < 35°C im Vakuum getrocknet. Das getrocknete Harz wurde dann zum Bestimmen des Boc-Glycin-Gehalts, der in mmol Glycin pro Trockengramm Harz ausgedrückt wird, getestet. Der berechnete Wert von 0,872 mmol/Gramm wurde gefunden und zum Bestimmen des genauen Maßstabs für die Zusammenschlussreaktion für die anschließende Materialverwendung und Berechnungen der theoretischen Ausbeute verwendet.
- Die Synthese des Peptids wurde auf dem Boc-Glycin-Harz (12,5 g), enthalten in einem Glasreaktor mit Sinterglasscheibenfiltern sowohl am Boden als auch am oberen Teil des Reaktors mit 500 ml, durchgeführt. Der Reaktor wurde vom Boden her befüllt und durch Umwenden (Drehen um 180 Grad innerhalb von 3 Sekunden) geschüttelt. Zuerst wurde die Boc-Gruppe vom Glycinharz durch zweimaliges Mischen des Harzes mit 175 ml 25%iger Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) (2 Minuten und 25 Minuten), gefolgt von durch Stickstoffdruck unterstütztem Entleeren, entfernt. Das Harz wurde dreimal mit 125 ml DCM und zweimal mit 125 ml Isopropylalkohol (IPA) und dann dreimal mit 125 ml DCM gespült. Das erhaltene Amino-TFA-Salz wurde zweimal mit 125 ml 10%iger Triethylaminbase in DCM für eine Dauer von jeweils 5 Minuten neutralisiert und dreimal mit DCM erneut gespült.
- Das Harz wurde dann mit einem 2,6 Mol-äquivalenten Gemisch der folgenden Boc-geschützten Aminosäure mit 4,2 ml Diisopropylcarbodiimid (DIC) in 16 ml DMF und 47 ml gekuppelt und entblockiert; 5,84 Boc-L-prolin, 8,93 g Boc-L- arginin-HCl, 6,77 g Boc-L-leucin, 9,0 g Boc-D-tryptophan(formyl), 7,64 g Boc-L-tyrosin, 9,0 g Boc-L-tryptophan(formyl), 6,06 g Boc-L-serinhydrat, 16 g Boc-L-histidin(tosyl)·Cyclohexylaminsalz und 13,5 g Pyroglutaminsäure. 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) wurde ebenfalls verwendet (3–5 Äqu.) in D-Trp, Tyr, Ser und Trp-Kupplungen. 75 ml Dimethylacetamid (DMA) wurde anstelle von DMF und DCM beim Kuppeln von Arg verwendet. Das Harz wurde mit DMF und DCM gespült und durch Kaiser-Ninhydrin auf Kupplungsbeendigung getestet. Die Boc-Gruppe wurde von jeder gekuppelten Aminosäure, wie vorstehend beschrieben, entfernt. Histidin wurde mit Tosyl an der Seitenkette geschützt, das mit zwei Behandlungen von 4,16 g HOBT in 105 ml DMF für eine Dauer von einer Stunde (jeweils) nach der endgültigen Aminosäurekupplung entfernt wurde. Boc-D-Tryptophan und Boc-L-Tryptophan wurden mit Formyl, das während der Abspaltung des Peptids von dem Harz entfernt wurde, seitenkettengeschützt.
- Das vollständige Peptid-Harz wurde in einem ausgewogenen Sinterglastrichter mit DCM gespült, zweimal mit Methanol gespült und unter Vakuum getrocknet. Das getrocknete Peptid-Harz wurde in einen Dreihalsrundkolben mit einem Volumen von einem Liter überführt. 15 ml/Gramm des Peptidharzes in 9:1 Methanol/DMF (380 ml für einen Maßstab von 10,9 mM) wurde dem Kolben zugesetzt. Die Lösung wurde auf etwa < 10°C abgekühlt, und Ammoniakgas wurde langsam unter starkem Kühlen bis zur guten Sättigung (eine Zugabezeit von etwa 1 Stunde) durchgesprudelt. Man ließ die Lösung ohne Kühlen für eine Dauer von etwa 15–36 Stunden weiter mischen, bis > 95% freier Methylester zum Amidprodukt umgewandelt wurde, wie durch Überwachen mit Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) bestimmt. Das Produkt wurde in Lösung mit einem Sinterglastrichter filtriert, und das Harz wurde mit Methanol und DMF mehrmals gespült. Alle Spülungen und Filtrate wurden zu einem sehr dicken Öl auf einem Rotationsverdampfer bei T < 40°C kondensiert. Ethylacetat (0,08 Liter) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde zum Verfestigen des Produkts verrieben, dekantiert und wiederholt mit 0,08 Litern Ethylacetat verrieben. Das harte, gum miartige Produkt wurde in Ethylacetat über Nacht getaucht und dekantiert. Das Rohprodukt wurde in Methanol (0,07 Liter) gelöst, und ein gleiches Volumen von 4N Essigsäure wurde zugesetzt. Die Lösung wurde zum Entfernen des gesamten Methanols auf einem Rotationsverdampfer bei T < 40°C eingeengt. Das Produkt wurde auf etwa 35 Gramm Produkt/Liter mit 4N Essigsäure verdünnt.
- Das Rohmaterial wurde dann durch wiederholte Umkehrphasenchromatographische Durchgänge gereinigt und lyophilisiert, um das Endprodukt (8,4 g, 59%ige Ausbeute) als weißen Feststoff mit > 99%iger Reinheit zu erhalten.
Claims (9)
- Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel (I)wobei der His-Rest mit einer Tosylgruppe geschützt ist und das Indol-NH jedes Trp-Rests geschützt ist, umfassend die Schritte: (a) Anlagern eines Cäsiumsalzes von Boc-Gly an ein chlormethyliertes Polystyrolharz, um Boc-Gly-Harz zu erhalten; (b) Entblockieren des Boc-Gly-Harzes durch Mischen des Boc-Gly-Harzes mit einem Gemisch aus einer Boc-entblockierenden organischen Säure, um ein organisches Säuresalz von H2N-Gly-Harz zu erhalten; (c) Neutralisieren des organischen Säuresalzes von H2N-Gly-Harz mit einer Base, um H2N-Gly-Harz zu erhalten; (d) Kuppeln von H2-Gly-Harz mit einer Boc-α-amin-geschützten Aminosäure, wobei die geschützte Aminosäure einer für die Formel (I) definierten Aminosäure entspricht, in der vom C-Terminus zum N-Terminus dargestellten Reihenfolge, umfassend (i) Umsetzen von H2N-Harz mit der Boc-α-amin-geschützten Aminosäure in Gegenwart eines Peptidkupplungsmittels, um ein Boc-blockiertes gekuppeltes Produkt zu erhalten; (ii) Entblockieren der Boc-Gruppe von dem Boc-blockierten gekuppelten Produkt durch Mischen des Boc-blockierten gekuppelten Produkts mit einer Boc-entblockierenden organischen Säure, um ein gekuppeltes Produkt zu erhalten; (iii) Umsetzen des gekuppelten Produkts mit einer weiteren Boc-α-amin-geschützten Aminosäure in Gegenwart eines Peptidkupplungsmittels, um ein Boc-blockiertes gekuppeltes Produkt zu erhalten; (iv) Entblockieren der Boc-Gruppe von dem Boc-blockierten gekuppelten Produkt durch Mischen des Boc-blockierten gekuppelten Produkts mit einer Boc-entblockierenden organischen Säure, um ein weiteres gekuppeltes Produkt zu erhalten; (v) Wiederholen der Schritte (d)(iii) und (d)(iv) bis die N-terminale Aminosäure des Peptids der Formel (I) gekuppelt wurde, die Boc-Gruppe der N-terminalen Aminosäure entblockiert wurde und die Tosylseitenkettenschutzgruppe des His-Rests entfernt wurde, um ein geschütztes fertiges Peptidharz zu erhalten; (e) Abspalten und Entschützen des geschützten fertigen Peptidharzes, um das Peptid der Formel (I) zu erhalten, wobei das Abspalten und Entschützen Folgendes umfasst: (i) Herstellen einer Lösung des geschützten fertigen Peptid-Harzes in einem Gemisch aus Methanol und einem inerten polaren aprotischen Lösungsmittel; (ii) Abkühlen der Lösung auf etwa 0 bis 10°C: (iii) Langsames Durchleiten von Ammoniakgas oder Ethylamingas und Beibehalten der Kühlung bis die Lösung mit Ammoniak gut gesättigt ist, um eine gesättigte Lösung zu erhalten; (iv) Mischen der gesättigten Lösung ohne Kühlen für eine Dauer von 15 bis 36 Stunden bis > 95% freier Methylester bei Verwendung von Ammoniakgas zu dem entsprechenden Amid oder bei Verwendung von Ethylamingas zu dem entsprechenden Ethylamid umgewandelt sind; und (f) Isolieren des Peptids aus der Lösung.
- Verfahren nach Anspruch 1, wobei die folgenden Boc-α-amin-Aminosäuren aufeinander folgend vom C-Terminus zum N-Terminus gekuppelt werden, N-α-Boc-L-prolin, N-α-Boc-L-ariginin·HCl, N-α-Boc-L-leucin, N-α-Boc-D-tryptophan(N'-indolformyl), N-α-Boc-L-tyrosin, N-α-Boc-L-serin-Hydrat, N-α-Boc-tryptophan(N'-indolformyl), N-α-Boc-L-histidin(tosyl)cyclohexylaminsalz und Pyroglutaminsäure.
- Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Formylschutzgruppe der Trp-Seitenkette durch Behandlung mit einer Lösung, umfassend Ammoniak, ein primäres Amin oder ein sekundäres Amin und einen Alkohol, entfernt wird.
- Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Lösung Ammoniak und Methanol umfasst.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, wobei beim Kuppeln von N-α-Boc-D-tryptophan(N'-indolformyl), N-α-Boc-L-tyrosin, N-α-Boc-L-serin- Hydrat und N-α-Boc-tryptophan(N'-indolformyl) auch 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) verwendet wird.
- Verfahren nach Anspruch 1 zur Festphasensynthese eines Peptids der Formel (I), das in Anspruch 1 angegeben und definiert ist, umfassend das vorübergehende Schützen jedweder Tryptophanreste mit einer Seitenkettenschutzgruppe, die basenlabil ist, wobei die Schutzgruppe während der Abspaltung des Peptids der Formel (I) von dem festen Träger durch Umsetzung mit einer Base entfernt wird.
- Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Trp- oder D-Trp-Seitenkettenschutzgruppe eine Acylgruppe ist.
- Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Trp- oder D-Trp-Seitenkettenschutzgruppe durch Behandlung mit einer Lösung, umfassend Ammoniak, ein primäres Amin oder ein sekundäres Amin und einen Alkohol, entfernt wird.
- Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Seitenkettenschutzgruppe Formyl ist und die Base eine Ammoniak umfassende Methanollösung ist.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IE20001079 | 2000-12-22 | ||
| IE20001079 | 2000-12-22 | ||
| PCT/IE2001/000159 WO2002051861A2 (en) | 2000-12-22 | 2001-12-19 | Process for the synthesis of a peptide having a tryptophan residue |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE60123115D1 DE60123115D1 (de) | 2006-10-26 |
| DE60123115T2 true DE60123115T2 (de) | 2007-03-29 |
Family
ID=11042704
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE60123115T Expired - Lifetime DE60123115T2 (de) | 2000-12-22 | 2001-12-19 | Verfahren für die synthese eines lhrh peptides |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7122628B2 (de) |
| EP (1) | EP1343808B1 (de) |
| JP (1) | JP4064817B2 (de) |
| KR (1) | KR100591832B1 (de) |
| CN (2) | CN1481389A (de) |
| AT (1) | ATE339442T1 (de) |
| AU (1) | AU2002222439C1 (de) |
| BR (1) | BR0116447B1 (de) |
| CA (1) | CA2432708C (de) |
| CZ (1) | CZ299141B6 (de) |
| DE (1) | DE60123115T2 (de) |
| DK (1) | DK1343808T3 (de) |
| ES (1) | ES2266104T3 (de) |
| HK (1) | HK1055749A1 (de) |
| HU (2) | HU230601B1 (de) |
| IE (1) | IES20011090A2 (de) |
| IL (2) | IL156258A0 (de) |
| MX (1) | MXPA03005678A (de) |
| NO (1) | NO325038B1 (de) |
| NZ (1) | NZ526990A (de) |
| PL (1) | PL205949B1 (de) |
| PT (1) | PT1343808E (de) |
| RU (1) | RU2276156C2 (de) |
| WO (1) | WO2002051861A2 (de) |
| ZA (1) | ZA200304809B (de) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7091311B2 (en) | 1996-06-07 | 2006-08-15 | Smithkline Beecham Corporation | Peptides and compounds that bind to a receptor |
| DK1542714T3 (da) | 2002-09-18 | 2014-05-26 | Janssen Pharmaceuticals Inc | Fremgangsmåder til forøgelse af produktion af blodplader og hæmatopoietiske stamceller |
| DK1675606T3 (en) * | 2003-08-28 | 2017-06-19 | Janssen Pharmaceuticals Inc | Peptides and compound that bind to thrombopoietin receptors |
| EP1968995A1 (de) * | 2005-12-30 | 2008-09-17 | F. Hoffmann-la Roche AG | Verfahren zur synthese argininhaltiger peptide |
| WO2014047822A1 (zh) * | 2012-09-27 | 2014-04-03 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种制备布舍瑞林的方法 |
| US9969769B2 (en) | 2014-12-19 | 2018-05-15 | Cem Corporation | Coupling method for peptide synthesis at elevated temperatures |
| US10308677B2 (en) | 2014-12-19 | 2019-06-04 | Cem Corporation | Coupling method for peptide synthesis at elevated temperatures |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4211693A (en) | 1977-09-20 | 1980-07-08 | The Salk Institute For Biological Studies | Peptides with para-substituted phenylalanine |
| US4569927A (en) * | 1984-02-23 | 1986-02-11 | The Salk Institute For Biological Studies | GnRH Antagonists IV |
| IL74827A (en) | 1984-05-21 | 1989-06-30 | Salk Inst For Biological Studi | Peptides active as gnrh antagonists and pharmaceutical compositions containing them |
| IT1203600B (it) * | 1985-12-06 | 1989-02-15 | Phidea Srl | Metodo per preparare il (d-trp6)-lhrh |
| US5175254A (en) * | 1988-09-24 | 1992-12-29 | Societe D'expansion Scientifque Expansia | Solid phase peptide synthesis using a polyacrylic support in aqueous solution |
| GB8822502D0 (en) * | 1988-09-24 | 1988-10-26 | Expansia Sa | New peptide synthesis method |
| JPH05331188A (ja) | 1992-05-28 | 1993-12-14 | Nippon Chemiphar Co Ltd | トリペプチド、その製造方法及びエンドセリン拮抗剤 |
-
2001
- 2001-12-19 AU AU2002222439A patent/AU2002222439C1/en not_active Expired
- 2001-12-19 WO PCT/IE2001/000159 patent/WO2002051861A2/en active IP Right Grant
- 2001-12-19 MX MXPA03005678A patent/MXPA03005678A/es active IP Right Grant
- 2001-12-19 JP JP2002552954A patent/JP4064817B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-19 PT PT01272223T patent/PT1343808E/pt unknown
- 2001-12-19 IL IL15625801A patent/IL156258A0/xx active IP Right Grant
- 2001-12-19 EP EP01272223A patent/EP1343808B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-19 AT AT01272223T patent/ATE339442T1/de active
- 2001-12-19 ES ES01272223T patent/ES2266104T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-19 CN CNA018210384A patent/CN1481389A/zh active Pending
- 2001-12-19 KR KR1020037008232A patent/KR100591832B1/ko active IP Right Grant
- 2001-12-19 HU HU1400157A patent/HU230601B1/hu unknown
- 2001-12-19 HU HU0302633A patent/HU229701B1/hu unknown
- 2001-12-19 CA CA2432708A patent/CA2432708C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-19 DK DK01272223T patent/DK1343808T3/da active
- 2001-12-19 BR BRPI0116447-3B1A patent/BR0116447B1/pt active IP Right Grant
- 2001-12-19 US US10/451,486 patent/US7122628B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-19 RU RU2003122779/04A patent/RU2276156C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-12-19 PL PL361993A patent/PL205949B1/pl unknown
- 2001-12-19 CN CNA2007100047879A patent/CN101003563A/zh active Pending
- 2001-12-19 CZ CZ20031634A patent/CZ299141B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-12-19 NZ NZ526990A patent/NZ526990A/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-12-19 DE DE60123115T patent/DE60123115T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-20 IE IE20011090A patent/IES20011090A2/en not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-06-02 IL IL156258A patent/IL156258A/en unknown
- 2003-06-20 NO NO20032852A patent/NO325038B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-06-20 ZA ZA200304809A patent/ZA200304809B/en unknown
- 2003-11-04 HK HK03107934A patent/HK1055749A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE2509783C2 (de) | Decapeptidamide und Verfahren zu deren Herstellung | |
| DE68919213T2 (de) | Polypeptidverbindungen mit wachstumshormonfreisetzender aktivität. | |
| DE68922602T2 (de) | Polypeptide mit hormonwachstumsbefreiender wirkung. | |
| EP0299402B1 (de) | LHRH Antagonisten, deren Herstellung und entsprechende pharmazeutische Zubereitungen | |
| CA1248700A (en) | Gnrh agonists | |
| DE69227462T2 (de) | Peptide mit wachstumshormonfreisetzender aktivität | |
| Pietta et al. | Preparation and use of benzhydrylamine polymers in peptide synthesis. II. Synthesis of thyrotropin releasing hormone, thyrocalcitonin 26-32, and eledoisin | |
| DE3587016T2 (de) | Nona- und dekapeptidanaloga von lhrh, welche als lhrh-antagonisten dienen. | |
| DE69222091T2 (de) | Peptid-Synthese an fester Phase | |
| Bajusz et al. | Highly potent analogues of luteinizing hormone-releasing hormone containing D-phenylalanine nitrogen mustard in position 6. | |
| DE69231404T2 (de) | Endothelinantagonisten | |
| DE68912775T2 (de) | Polypeptid-verbindungen mit hormonwachstumsbefreiender wirkung. | |
| DE69105207T2 (de) | Peptidverbindungen mit wachstumshormonfreisetzender aktivität. | |
| DE60123115T2 (de) | Verfahren für die synthese eines lhrh peptides | |
| DE69219672T2 (de) | Peptid-Synthese an fester Phase | |
| AU2002222439A1 (en) | Process for the synthesis of a peptide having a tryptophan residue | |
| EP0320785A2 (de) | Peptide mit beeinflussender Wirkung auf die Hypophyse von Säugern | |
| KORNREICH et al. | Peptide N‐alkylamides by solid phase synthesis | |
| DE69102659T2 (de) | Synthese von LH-RH-Analogen unter Anwendung eines zeitlich begrenzten minimalen Schutzes. | |
| DE4014230A1 (de) | Bombesin-antagonisten | |
| Perlman | The syntheses and binding studies of fourteen peptide analogs of the C-terminal segments of avian pancreatic polypeptide and neuropeptide [gamma] | |
| AU2005202990A1 (en) | Process for the synthesis of a peptide having a tryptophan residue | |
| DD232500A1 (de) | Verfahren zur herstellung von gn-rh und seiner analogen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition |