DD232500A1 - Verfahren zur herstellung von gn-rh und seiner analogen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Gn-RH und seiner Analogen der allgemeinen Formel pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Yin der X fuer Gly, D-Phe. D-Leu, D-Ala oder D-Trp und Y fuer GlyNH2 oder NHC2H5 stehen, die in der Veterinaermedizin zur Ovulationssynchronisation und zur Behandlung von Ovarialzysten und in der Humanmedizin zur Therapie von Fertilitaetsstoerungen Verwendung finden. Erfindungsgemaess erfolgt die Synthese dieser Verbindungen durch Fragmentkondensationen, wobei die Fragmente und die erforderlichen Schutzgruppenkombinationen so gewaehlt werden, dass die Synthese der Teilfragmente durch die Anwendung einer Peptidschnellsynthesetechnik in Loesung ohne Isolierung von Zwischenstufen moeglich ist. Das Verfahren gestattet eine hocheffektive Synthese geeigneter Fragmente des Gn-RH, die nach in der Peptidchemie bekannten Methoden in sehr guten Ausbeuten zum Gn-RH oder seinen Analogen verknuepft werden koennen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Gonadotropinfreisetzendem Hormon (Gn-RH, LH-RH, Luliberin), dem im Hypothalamus gebildeten Freisetzungshormon der hypophysären gonadotropine, und seiner synthetischen Analoga. Das Dekapeptid Gn-RH und eine Reihe seiner Analoga finden in der Veterinärmedizin zurOvulationssynchronisation in größeren Tierbeständen und zur Behandlung von Ovarialzysten sowie in der Humanmedizin zur Therapie von Fertilitätsstörungen Verwendung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Zur Synthese des Peptidwirkstoffs Gn-RH, p-G I u-His-Trp-Ser-Tyr-G Iy-Leu-Arg-Pro-G Iy-N H₂,

und seiner Analogen sind bereits zahlreiche Verfahren beschrieben worden. Dabei bedient man sich entweder konventioneller Fragmentkupplungsmethoden oder des Aufbaus an polymeren Trägern, gegebenenfalls auch einer Kombination aus beiden Methoden. Eine Übersicht über beschriebene derartige Verfahren findet man bei M. VOELTER (Fortschritte der Chemie org. Naturstoffe 34,440-564 [1977]). Wichtige neuere Synthesen wurden von Kasafirek et al. (Coll. Czech, ehem. Commun. 42, 2018 [1977]); Coy et al. (int. J. Peptide Prot. Res. 14,339 [1979]) und Fukuda et al. (Chem. Pharm. Bull. [Japan] 30,2825 [1982]) sowie in den Patentschriften DD-WP 135078 und DE-OS 2905502 beschrieben. Die konventionellen Syntheseverfariren liefern sehr reine Produkte, sind in der Regel jedoch sehr zeitaufwendig. Demgegenüber haben die Festphasensyntheseverfahren den Vorteil des geringere ι Zeitbedarfs und der Automatisierbarkeit, liefern jedoch wesentlich weniger reine Produkte, so daß aufwendige Reinigungsverfahren mit entsprechenden Ausbeuteverlusten angeschlossen werden müssen. Peptidsynthesemethoden, die in homogener Phase quantitative Kupplungen durch Anwendung von Carboxylkomponentenüberschüssen gewährleisten und in Verbindung mit einer geeigneten Abtrennung der Reagensüberschüsse die Synthese von Peptiden ohne Isolierung von Zwischenstufen ermöglichen, sog. Schnellsynthesen in Lösung (vgl. Übersicht in G. R. Pettit, „Synthetic Peptides", Vol. 4,33 [1976]; neuere Varianten: G.T. Young, J.Chem.Soc.,Perkin 11979,1901; H. RoIIi et al.. Int. J. Peptide Prot. Res. 15,411. (1980); S. Nozaki, Chem. Letters 1977,1 057; R. Dölling et al. DD-WP 160415), vereinen die Vorteile der Festphasensynthesemethoden, Schnelligkeit und relativ geringer Aufwand, und der

konventionellen Verfahren hinsichtlich Reinheit und Ausbeute der Produkte. Das Dekapeptid Gn-RH ist für diese vorteilhaften Verfahren jedoch nicht besonders gut geeignet, da die meist gute Wasserlöslichkeit der Pro-Gly-Derivate und die problematische Arg/Pro-Kupplung bereits im C-terminalen Bereich der Sequenz für diese Methoden erhebliche Schwierigkeiten bereitet. Es ist dementsprechend auch nur ein derartiges Gn-RH-Syntheseverfahren bisher beschrieben worden (H. C. Beyermann et al., Resc. Trav. Chim. Pays-Bas95,143 [1976]), dem die sog. REMA-Technik (Repeptitive Mixed Anhydride Technique) zugrunde liegt. Abgesehen davon, daß diese Methode unter den verschiedenen Schnellsynthesetechniken die Nachteile hat, daß bei Kupplungen sterisch gehinderter Aminosäuren Fehlacylierungen auftreten und das wachsende Peptid sehr oft zwischengefällt werden muß, können die am Gn-RH erzielten Ergebnisse wenig überzeugen. Wegen der genannten Schwierigkeiten im C-terminalen Bereich mußte mit einer Fragmentsynthese Z-Arg(NO2)Pro-OH + H-GIyOEt begonnen werden, und bei den folgenden Schnellsyntheseschritten wurden meist nur Ausbeuten von 70 bis 80% erreicht, so daß Gn-RH nur nach mehrfacher chromatografischer Reinigung in schlechten Ausbeuten gewonnen werden konnte.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist es, ein Syntheseverfahren für Gn-RH und seiner Analogen aufzuzeigen, das auf der Grundlage eines konventionellen Fragmentkondensationsschemas die Vorzüge einer Schnellsynthese in Lösung für die Darstellung von Teilfragmenten nutzt. Das Fragmentkondensationsschema soll so gewählt werden, daß die Teilfragmente mittels einer solchen Methode in guten Ausbeuten und hoher Reinheit schnell synthetisiert und aus ihnen Gn-RH bzw. bestimmte Analoge mit einer hohen Verfahrenseffektivität gewonnen werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Gn-RH und seiner Analogen zu entwickeln, das im Rahmen einer geeignet gewählten Fragmentkondensationsstrategie die notwendigen Teilfragmente besonders effektiv über Schnellsynthesen in Lösung ohne Isolierung von Zwischenstufen bereitstellt und nach dem über günstig verlaufende Fragmentkondensationschritte und Schutzgruppenabspaltungsschritte Gn-RH bzw. Analoge davon mit relativ geringem Zeitaufwand in hoher Ausbeute und Reinheit gewonnen werden können.

Bisher bekannte technische Lösungen der Gn-RH-Synthese sind entweder sehr aufwendig, wenn sie klassische peptidsynthetische Methoden verwenden oder liefern keine genügend reinen Produkte, wenn sie nach dem Festphasenverfahren arbeiten, was entsprechenden Reinigungsaufwand und Ausbeuteverluste nach sich zieht. Der einzige Versuch, eine Schnellsynthese in Lösung am Gn-RH zu erproben, verlief über das REMA-Verfahren in bezug auf Ausbeute und Produktqualität nicht befriedigend.

Unter Verwendung dieser Nachteile ist durch die Erfindung die Aufgabe zu lösen, ein Gn-RH-Fragmentsyntheseschema zu entwickeln, das an den abgeleiteten Teilfragmenten den Einsatz einer besonders günstigen Schnellsynthesetechnik ermöglicht, so daß über die schnelle und wenig aufwendige Synthese sehr reiner Zwischenfragmente eine insgesamt sehr vorteilhafte Darstellung des reinen Gn-RH gewährleistet wird. Weiterhin soll diese Lösung der Aufgabeso erfolgen, daß nach dem gleichen Fragmentkondensationsschema unter Beibehaltung der vorteilhaften Schnellsynthesen der Teilfragmente die wichtigsten verstärkt wirksamen Analoga des Gn-RH, die in Position 6 D-Aminosäuren und anstelle des C-terminalen Glycinamidrestes ein Alkylamid der vorletzten Aminosäure Prolin enthalten, gleichfalls effektiv dargestellt werden können. Eine auf dem gegenwärtigen Entwicklungsstand besonders effektive Schnellsynthese in Lösung ist das Zweiphasenkupplungsverfahren mit Boc-Aminosäureaktivestern von N-Hydroxyverbindungen (R.Dölling, DD-WP 160415). Bei diesem Verfahren erfolgen die Peptidkupplungen mit relativ geringen Überschüssen an Boc-Aminosäureaktivestern von N-Hydroxyverbindungen im Zweiphasensystem Dichlorethan/wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung, die Entfernung des Carboxylkomponentenüberschusses nach erfolgter quantitativer Umsetzung durch Überführung des Aktivesters in ein basisches Amid und folgender Extraktion mit wäßriger Salzsäure und die Boc-Gruppenabspaltung mitMethansulfonsäureinder Dichlorethanphase, gefolgt von einer Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonatlösung, so daß das wachsende Peptid niemals zwischengefällt oder anderweitig isoliert zu werden braucht. Das Verfahren erlaubt in etwa 4 Stunden die Anknüpfung einer Aminosäure und liefert ausgezeichnete Ausbeuten und sehr reine Produkte, wenn die Startaminokomponente und alle folgenden sowohl N-terminal geschützten als auch freien Sequenzen gut in Dichlorethan und nicht in Wasser löslich sind, die Kupplungen quantitativ und nebenreaktionsfrei durchgeführt werden können und die basischen Amide der Boc-Aminosäuren hinreichend hydrophil sind, um mit wäßrigen Säuren extrahiert werden zu können. Darausfolgt, daß sich nach dieser Methode nicht alle Peptide herstellen lassen. Insbesondere stellen Kupplungen, die mit genannten Aktivestern nicht nebenreaktionsfrei durchgeführt werden können, eine wesentliche Einschränkung dar. Auch stark sterisch gehinderte Kupplungen bereiten Schwierigkeiten. Andererseits kann man durch geeignete Wahl derterminalen und Seitenkettenschutzgruppen auf das Löslichkeitsverhalten der wachsenden Peptide in der gewünschten Weise Einfluß nehmen. In jedem Fall bleibt es schwierig, aus einer längeren Sequenz für das Verfahren optimal geeignete Fragmente auszuwählen und dazu eine den Löslichkeitsanforderungen Rechnung tragende Schutzgruppenkombination vorzuschlagen. Gelingt diese Optimierung jedoch, bietet dieses Verfahren mit seinen hohen Ausbeuten und sehr reinen Produkten und seiner schnellen Durchführbarkeit insbesondere für technische Aufgabenstellungen wesentliche Vorteile.

Erfindungsgemäß erfolgt die Synthese des Peptidwirkstoffs Gn-RH und seiner Analogen nach einem 2 + 5 + 3(2)-Fragmentkondensationsschema, wobei das mittlere Pentapeptidfragment und das C-terminale Tripeptidfragment (bei einigen Analogen ein Dipeptidfragment) nach dem oben diskutierten Schnellsyntheseverfahren (DD-WP 160415) hergestellt werden. Das mittlere Pentapeptidfragment, das der Gn-RH-Sequenz 3-7 entspricht, enthält keine Aminosäuren, deren Ankupplung besondere sterische Hinderungen oder schwer auszuschließende Nebenreaktionen erwarten läßt. Dies gilt auch für die entsprechenden Fragmente der Gn-RH-Analogen, in denen das Glycin in Position 6 gegen beispislsweise D^P-he, D-Leu oder D-AIa ausgetauscht wird. Die relativ hydrophobe Aminosäure Leucin am C-Terminus dieser Fragmente begünstigt die Schnellsynthese im Zweiphasensystem. Der zu wählende Leucinester als Startkomponente dürfte unkritisch sein. Die Hydroxyaminosäuren Serin und Tyrosin in der Sequenz müssen an der Seitenkette geschützt werden (zumindest das Tyrosin), da die Methode mit Carboxylkomponentenüberschüssen arbeitet und so durch O-Acylierung Depsipeptide ais Nebenprodukte entstehen würden.

Die Schnellsynthese dieses Fragmentes mit der allgemeinen Formel I Boc-Trp-Ser(R₁)-Tyr(R_l)-X-Leu-OR₂ (I),

in der Bocfürtert.-Butyloxycarbonyl, Ri für Wasserstoff oder eine der bekannten OH-Schutzgruppen, R₂ für einen beliebigen Alkyl- oder Aralkylrest und X für GIy, D-Phe, D-AIa, D-Leu oder D-Trp steht, mit Ri gleich Wasserstoff am Serin, R₁ gleich Benzyl am Tyrosin, R₂ gleich Methyl und X gleich Glycin lieferte in etwa 70%iger Ausbeute ein Produkt von ausgezeichneter Reinheit, die nach HPLC-Untersuchungen über 98% lag. Dabei erwies es sich allerdings als notwendig, die Ankupplung des Boc-O-benzyltyrosinaktivesters im Zweiphasensystem Essigester/wäßr. NaHCOs anstelle von Dichlorethan/wäßr. NaHCO₃ vorzunehmen, weil sich die recht hydrophoben Boc-O-benzyltyrosinderivate (aus dem Aktivester durch Hydrolyse gebildete freie Säure und mit ³N,N-Dimethylaminopropylamin gebildetes Amid) nur aus Essigester quantitativ extrahieren lassen.

Die extrem hohe Reinheit des Produktes überrascht, da die Aminosäure Serin ohne Hydroxylschutz eingesetzt wurde. Bei den Kupplungen mit den Aktivesterüberschüssen hätten nach aller Erfahrung nachweisbare Mengen an Depsipeptiden entstehen müssen.

Tatsächlich ließ sich an Modellen zeigen, daß derartige Depsipeptide durch die Behandlung mit dem prim./tert.Diamin, die in der Schnellsynthese zur Beseitigung des Aktivesterüberschusses vorgenommen wird, in die Zielpeptide der Synthese gespalten werden.

Boc-AS- OR + NH₂(CH₂J₃N(CH₃J₂-* BoC-AS-NH(CH₂J₃N(CH₃) + HOR

(Reaktion zur Beseitigung der Aktivesterüberschüsse)

Boc-AS

Boc-Ser-... + NH₂(CH₂)₃N(CH₃)₂-> Boc-AS-NH(CH₂)₃N(CH₃)₂ + Boc-Ser-...

(Depsipeptidabspaltung)

Wie die Untersuchung ergab, gilt das auch für am seitenkettenungeschützten Tyrosin gebildete Depsipeptide, so daß das Schnellsyntheseschema nach DD-WP 160415 es überraschend erlaubt, trotz der Aktivesterüberschußkupplungen mitOH-freien Hydroxyaminosäuren zu arbeiten. Damit entfällt der Aufwand zur Herstellung entsprechender O-geschützter Derivate des Serins und Tyrosins, und der oben beschriebene Wechsel der organischen Phase beim Ankuppeln von Boc-O-benzyl-tyrosin kann gleichfalls vermieden werden. Allerdings werden die Peptide beim Einbau OH-ungeschützter Hydroxyaminosäuren wesentlich hydrophiler, so daß ein lipophilerer C-terminaler Carboxylschutz notwendig wird. Es konnte gezeigt werden, daß für die vorliegende Pentapeptidsequenz des Gn-RH ein C-terminaler Benzylesterschutz geeignet ist. Insbesondere die Verwendung eines 4-Nitrobenzylesters erlaubt einwandfreie Schnellsynthesen mit den OH-freien Boc-Aminosäureaktivestern des Tyrosins

und Serins. __ -—

AnzweiPentapeptid-Schnellsynthesen des Fragments der allgemeinen Formel !,einmal mit X gleich GIy und einmal mit X gleich D-Phe, bei denen R₁ für Serin und Tyrosin gleich Wasserstoff (ohne Schutzgruppe!) und R₂ gleich 4-Nitrobenzyl gewählt wurde, konnte die gute Eignung der vorgeschlagenen Schutzgruppenkombination demonstriert werden. Ohne Isolierung irgendeiner Zwischenstufe ließen sich die beiden Pentapeptidfragmenteinjeetwa24 Stunden wiederum mit etwa jeweils 70%iger Ausbeute und in sehr hoher Reinheit darstellen. Es wurde keine Racemisierung, Depsipeptidbildung oder Dehydroalaninbildung in den Endprodukten gefunden. Damit ist ein wesentlicher Baustein der Synthesen von Gn-RH oder seiner D-6-Analogen in einer äußerst rationellen Weise zugänglich. Zur weiteren Verwendung dieser Fragmente muß die C-terminale Estergruppe in geeigneterWeise verseift werden, zumindest wenn die Synthesestrategie wie hier vorgeschlagen, zunächst eine Verknüpfung der beiden C-terminalen Fragmente vorsieht. Im Falle der 4-Nitrobenzylester der Fragmente der allgemeinen Formel I gelingt die Esterspaltung sehr bequem und quantitativ durch katalytische Hydrierung. Auf diese Weise entstehen dann Gn-RH-Fragmente der allgemeinen Formel Il

Boc-Trp-Ser(R! JTyHR₁J-X-LeU-OH (II),

in der Boc, R₁ und X die oben angegebene Bedeutung haben, und die erfindungsgemäß vorzugsweise mit R₁ gleich Wasserstoff, also Hydroxyl-ungeschützt, synthetisiert werden.

Das C-terminale Tripeptidfragment, das der Gn-RH-Sequenz 8-10 entspricht, ist für den schnellsynthetischen Aufbau weniger gut geeignet. Die relativ gute Wasserlöslichkeit vieler Glycin-und Prolylglycin-Derivate verlangt einen sehr hydrophoben C-terminalen Schutz und die Kupplung von Argininaktivestern an Prolin dürfte sterisch gehindert sein. Außerdem bilden N", N^G-geschützte aktivierte Argininderivate sehr leicht Lactame, die nicht durch alkalische oder saure wäßrige Extraktion entfernt werden können. In den interessierenden Analogen des Gn-RH ist die C-terminale Tripeptidsequenz meist auf ein Arg-Pro-N-alkylamid verkürzt, so daß in diesem Fall die Anwendung der Schnellsynthese nach DD-WP 160415 nur noch formalen Charakter hat,, da nur eine Kupplung ausgeführt werden muß. Der für das Arginin zu wählende Seitenkettenschutz richtet sich nach der Gesamtstrategie der Gn-RH-Synthese und bestimmt wesentlich die Endabspaltung der Schutzgruppen. Die Schnellsynthese dieses Fragmentes mit der allgemeinen Formel III

H-Arg(R₃)-Pro-W (III),

in der R₃für eine geeignet acidolytisch deblockierbare N^G-Schutzgruppeund W für GIy-OBzI oder OBzI steht, mit R₃ gleich Mesitylensulfonyl (Mts) (H. Yajima, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1978,482) und W gleich GIy-OBzI, liefert in N-Boc-geschützter Form ein Produkt in 80%iger Ausbeute, das mit etwas Boc-Arg(Mts)-Lactam verunreinigt ist. Die Lactambildung kann durch Ausführung der Kupplung bei tieferen Temperaturen eingeschränkt werden, läßt sich jedoch nicht völlig verhindern. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit, das Fragment zu isolieren und in geeigneter Weise zu reinigen, was recht gut durch Umfallen aus THF/Petrolether möglich ist. Die erfindungsgemäße Fragmentwahl gestattet dies, ohne Unterbrechung der Schnellsynthese, was den Vorteil des vorgeschlagenen Verfahrens unterstreicht. Nach solchen Reinigungsschritten an N°-Boc-geschützten Tripeptidfragmenten und nachfolgender N°-Deblockierung mit beispielsweise Trifluoressigsäure werden die Fragmente der allgemeinen Formel III mit W gleich GIyOBzI in 65 bis 75%iger Ausbeute rein dargestellt.

Die für die Synthese von Gn-RH-Analoga benötigten Fragmente der allgemeinen Formel III mit W gleich IBzI sind durch eine der Schnellsynihese nach DD-WP160415 entsprechenden Kupplung von Boc Arg(MtsJ-ONB-ester mit H-Pro-OBzi im Zweiphasensystem und der dabei üblichen Aufarbeitung ebenfalls gut zugänglich, wobei auch hier eine Abtrennung des mitgebiideten Argininlactams notwendig ist. Die Ausbeuten liegen nach Reinigung und N°-Deblockierung mit Trifluoressigsäure bei 70 bis 80%. Natürlich bietet die Schnellsynthesemethodik hier keinen besonderen Vorteil, so daß auch andere alternative Kupplungsmethoden zur Herstellung des Dipeptidesters herangezogen werden können. Aus den Fragmenten der allgemeinen Formeln Il und III erhält man nach in der Peptidchemie üblichen Fragmentkondensationsmethoden, beispielsweise durch Verknüpfung mit Dicyclohexylcarbodiimid und einer N-Hydroxyverbindung in 80 bis 90%iger Ausbeute geschützte Oktapeptidfragmente der allgemeinen Formel IV

Boc-Trp-SerlFM-TyrlFM-X-Leu-ArgfRsi-Pro-W (IV),

in der Boc, Ri, R3, X und Y die vorstehend genannte Bedeutung besitzen, die infolge der ausgezeichneten Reinheit der eingesetzten Fragmente Il und III und des nahezu quantitativen Verlaufs dieser Kupplung keiner besonderen Reinigung bedürfen. Praktisch quantitativ verlaufen auch die folgenden Schritte der Ammonolyse des C-terminalen Esters mit methanolischer Ammoniaklösung für die Verbindungen der allgemeinen Formel IV mit W gleich GIy-OBzI und der Aminolyse des Esters mit methanolischer N-Ethylaminiösung für die Verbindungen mit W gleich OBzI sowie die nachfolgende N"-Deblockierung mit beispielsweise Methansulfonsäure in Dioxan nach jeweils bekannten Verfahren. Im Ergebnis dieser Reaktionen entstehen Oktapeptidfragmente des Gn-RH bzw. seiner Analogen der allgemeinen Formel V

H-Trp-SerlR! (-Ty^R₁ )-X-Leu-Arg(R₃)-Pro-Y (V),

in der R₁, R₃ und X die oben genannte Bedeutung besitzen und Y für GIy-NH₂ oder NHC₂H₅ steht. Für das Beispiel der Synthese von V mit Ri gleich Wasserstoff, R₃ gleich Mesitylensulfonyl, X gleich Glycin und Y gleich GIyNH₂ wurde die Verbindung, bezogen auf die bei der Fragmentkondensation eingesetzten äquimolaren Mengen von Il und III, in 71%iger Ausbeute dargestellt. Die abschließende Verlängerung der Fragmente der allgemeinen Formel V zum geschützten Gn-RH seiner Analogen erfolgt mit dem bekannten Dipeptid Z-pGlu-His-OH (N.Fujino et al., Chem. Pharm. Bull. (Japan) 22,1857 [1974]), das jedoch infolge seiner schlechten Löslichkeit und den unbefriedigend verlaufenden Kupplungen zunächst noch am Imidazolring des Histidins mit einer Urethanschutzgruppe versehen wird. Auf diese Weise entstehen die bisher unbekannten Dipeptidfragmente der allgemeinen Formel Vl

Z-pGlu-His(R₄)-OH (Vl),

in der Z für Benzyloxycarbonyl und R₄für eine beliebige, mit Säuren deblockierbare N'^m-Urethanschutzgruppe stehen. Man erhält diese Verbindungen, indem map das Dipeptid Z-pGluHis-OH in wäßrig organischen Medien unter Zusatz einer tertiären Stickstoffbase mit den üblichen Einführungsreagenzien der Urethanschutzgruppen umsetzt. So gelingt beispielsweise die Einführung des tert.-Butyloxycarbonyirestes in Dioxan/Wasser mit Boc-pyrocarbonat in Gegenwart von einem Äquivalent Triethylamin überraschend glatt. Das gebildete Z-pGlu-His(Boc)-OH zeigt sich bezüglich Löslichkeitseigenschaften und Kupplungsverhalten dem Z-pGlu-His-OH unerwartet deutlich überlegen. Die Dipeptide der allgemeinen Formel IV sind in vielen zu Peptidkupplungen geeigneten organischen Lösungsmitteln, wie Essigester, Tetrahydrofuran, Dioxan, ja sogar in Dichlorethan löslich, während die N'^m-ungeschützte Verbindung nur in DMF oder ähnlichen Lösungsmitteln gelöst werden kann. Bei der Verknüpfung der Verbindungen der allgemeinen Formel Vl mit Gn-RH-Fragmenten des Sequenzabschnittes 3-10, also Verbindungen der allgemeinen Formel V, nach in der Peptidsynthese bekannten Fragmentkupplungsmethoden, zum Beispiel mit Dicyclohexylcarbodiimid und einer N-Hydroxyverbindung, werden quantitative Umsetzungen erreicht, die wiederum keine aufwendige Reinigung der entstehenden geschützten Gn-RH-Derivate der allgemeinen Formel VII

Z-pGlu-His(R₄ l-Trp-SerlRJ-TyrtRJ-X-LeuArgfRsJ-Pro-Y (VII),

in der Z, R₁, R₃, R₄, X und Y die oben angegebene Bedeutung haben, erforderlich macht.

Von den Verbindungen des Typs VIl werden ,die Schutzgruppen mit Säuren in Gegenwart geeigneter Kationenfängersysteme abgespalten. Die zu verwendende Säure oder Methansulfonsäure, die beiden letzteren gegebenenfalls in Kombination mit Thioanisol, richtet sich nach der Art der Schutzgruppen R₁, R₃ und R₄. Als Kationenfänger kommen bekannte Verbindungen wie Anisol, Kresol, 1,2-Ethandithiol, Indol, Skatol u.a. sowie Kombinationen dieser Stoffe in Frage. Im Beispiel der Synthese eines Gn-RH-Derivats der allgemeinen Formel VII mit R₁ gleich Wasserstoff, R₃ gleich Mesitylensulfonyl, R₄ gleich tert-Butyloxycarbonyl, X gleich Glycin und Y gleich GIy-NH₂ kann die Schutzgruppenabspaltung vorteilhaft mit einer Mischung aus Methansulfonsäure/Trifluoressigsäure/Thioanisol/mKresol/Skatol (Methansulfonsäure und Thioanisol je M in Trifluoressigsäure; Fängerkonzentration je 2%) vorgenommen werden. Die Schutzgruppenabspaltung verläuft in diesem Fall nebenreaktionsfrei und nahezu vollständig, so daß auf diese Weise nach üblicher Fällung des Peptidmaterials mit Ether und einer Gelfiltration an Sephadex-LH20 in Chloroform/Methanol (9:1) in 80%iger Ausbeute hoch reines Gn-RH erhalten wird. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Wirkstoffs Gn-RH und seiner Analogen nutzt die Vorteile eines bekannten Schnellsyntheseverfahrens für Peptide (DD-WP 160415), die sich aus dem stufenweisen Peptidaufbau ohne Isolierung von •Zwischenstufen, den schnell und quantitativ verlaufenden Kupplungs- und Deblockierungsschritten und den erzielbaren sehr guten Ausbeuten an hochreinen Peptiden ergeben, indem eine für die Anwendung dieses Verfahrens geeignete Fragmentkondensationsstrategie entwickelt und für die Herstellung der Fragmente eine günstige, optimierte Schutzgruppenkombination vorgeschlagen wird, die zum Teil die Anwendung des Schnellsyntheseverfahrens überhaupt erst

Verfahrensgemäß erfolgt die Herstellung von Gn-RH und seiner Analogen über eine 2 + 5 + 3(2)-Fragmentsynthese, wobei das Penta- und das Tripeptidfragment über die Schnellsynthesetechnik in guten Ausbeuten und hoher Reinheit hergestellt werden. Dabei werden Lösungen für die Schutzgruppenkombinationen in den Fragmenten vorgeschlagen, die einerseits die komplikationslose Schnellsynthese ermöglichen und andererseits zum ersten Mal solche Synthesen mit Reagensüberschußkupplungen ohne Seitenkettenschutz der Hydroxyaminosäuren zulassen, was den nicht unbedeutenden Aufwand zur Herstellung entsprechender OH-geschützter Hydroxyaminosäurederivate vermeidet. Die Verknüpfungen der Fragmente und die notwendigen Schutzgruppenabspaltungsschritte lehnen sich an bekannte allgemeine Methoden der Peptidchemie an, verlaufen in der entwickelten Synthesestrategie jedoch unerwartet günstig mit jeweils Ausbeuten zwischen 80 und 100%, so daß ohne besonderen Reinigungsaufwand bis zum Gn-RH Produkte von ausgezeichneter Reinheit entstehen. Im Vergleich zu bekannten Gn-RH-Synthesen zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren durch eine neuartige, verbesserte Synthesestrategie aus, die unter Benutzung einer Schnellsynthesetechnikfür die Herstellung von Teilfragmenten des Gn-RH die Darstellung von sehr reinem Gn-RH mit relativ geringem zeitlichen und materiellen Aufwand ermöglicht.

Ausführungsbeispiele

Abkürzungen:	DCCI	= Dicyclohexylcarbodiimid
	HONB	= N-Hydroxy-ö-norbornen^^-dicarbonsäureamid
	-ONB	= Ester des N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarbonsäureiI>iids
	-OMe	= Methyiester
	-OBzI	= Benzylester
	-ONBzi	= 4-Nitrobenzylester
	Mts	= Mesitylensulfonyl-

-5- 628 04

Boc = tert.-Butyloxycarbonyl

Z = Benzyloxycarbonyl

TFA = Trifluoressigsäure *

DMF = Dimethylformamid

CM = Chloroform/Methanol

CMN = Chloroform/Methanol/Ammoniak

CMA = Chloroform/Methanol/Eisessig

CMAW = Chloroform/Methanol/Eisessig/Wasser

BPAW = n-Butanol/Pyridin/Eisessig/Wasser

„M" = DC-Fertigplatten Kieselgel 60 (Merck)

„S" = DC-Fertigplatten Kieselgel Silufol (Fa. Kavalier, CSSR)

Allgemeine Arbeitsvorschrift für die Peptidschnellsynthese ohne Isolierung von Zwischenstufen:

6,0bis7,5mMol Boc-Aminosäure-ONB-esterund5mMol der Aminokomponente werden in 100ml Dichlorethan im Gemisch mit 2OmM N NaHCO₃-Lösung 0,5 bis 2 Stunden biszurdünnschichtchromatographisch nachgewiesenen vollständigen Umsetzung der Aminokomponente intensiv gerührt. Danach wird die wäßrige Phase abgetrennt, die Dichlorethanlösung mit 5 bis 1OmMoI 3-Dimethylamino-propylamin versetzt und weitere 20 Min. gerührt. Im Reaktionsgefäß wird anschließend je dreimal mit 1 N HCI, 1 N NaHCO3 und Wasser gewaschen und danach die Boc-Gruppe abgespalten. Dies erfolgt entweder durch Zusatz von 3,25 ml Methansulfonsäure und 20 Min. Rühren bei Raumtemperatur oder durch Einengen der Dichlorethanlösung und 30 Min. Rühren des Rückstandes mit einem Gemisch aus 20ml TFA und 20 ml Dichlorethan ebenfalls bei Raumtemperatur. Im ersteren, normalerweise praktizierten Verfahren wird anschließend mit 1 N NaHCC^-Lösung neutralisiert und so das Zweiphasensystem für die nächste Kupplung wieder hergestellt. Bei derTFA-Deblockierung wird nach erfolgter Abspaltung i.V. eingeengt, der Rückstand in 100ml Dichlorethan aufgenommen und mit 1 N NaHCO₃ neutralisiert.

Beispiel 1

Boc-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-OH

1,51 g (5mMol) H-LeuONBzl · HCI werden in 100 ml Dichlorethan nach der allgemeinen Sch η el I Synthesevorschrift mit Boc-Gly-ONB, Boc-Tyr-ONB und Boc-Ser-ONB schrittweise verlängert, wobei die N^a-Deblockierungen mit Methansulfonsäure vorgenommen werden. Nach der Anknüpfung von Serin und der Extraktion des Reagensüberschusses wird von der organischen Phase das Dichlorethan abdestilliert und der Rückstand 30Min. mit 30 ml TFA/Dichlorethan (1:1) und nach Zugabe von 3ml Wasser weitere 40 Min. bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird i.V. das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wird in 30 ml Essigester gelöst und unter intensivem Rühren mit nur soviel 1 N NaHCO3-Lösung neutralisiert, daß die wäßrige Phase einen pH-Wert von 7,5 bis 8 aufweist. Danach werden 5mMol Boc-Trp ONB in 10mi Essigester zugegeben und die Schnellsynthese bis zur Extraktion des Reagensüberschusses in Essigester ausgeführt. Durch Trocknen der Essigesterlösung über Na₂SO₄, Einengen auf etwa 10ml und Einrühren in ein Gemisch aus 200ml Ether und 100ml Petrolether erhält man den N"-Bocgeschützten Pentapeptid-4-nitrobenzylester in einer Ausbeute von 3,40g [79%; F. 108 bis 112°C; Rf 0,61 (CM17:3;„M")]. Dieser wird in 400 ml Methanol unter Zusatz von 4ml Essigsäure und etwa 10% Pd/Aktivkohleeine Stunde hydriert, dann wird der Katalysator abfiltriert, die Methanollösung bei 30⁰C auf etwa 5 ml eingeengt und der Rückstand in 150 ml Essigester aufgenommen. Die Essigesterphase wird zweimal mit 30 ml 1 N HCI gewaschen und danach mehrmals mit je 30 ml 0,5 NaHCO₃-Lösung extrahiert. Die vereinigten wäßrig-alkalischen Auszüge werden auf 0°C gekühlt, mit 150 ml Essigester überschichtet und auf pH 2 angesäuert. Nach Schütteln wird die Essigesterphase abgetrennt, die wäßrige Lösung noch zweimal mit je 50 ml Essigester extrahiert und die vereinigten organischen Auszüge mit Wasser neutral gewaschen, getrocknet und i.V. eingeengt. Der Rückstand wird in wenig Essigester aufgenommen, mit 150 ml Etherversetzt und der ausfallende Feststoff isoliert, mit Ether gewaschen und i.V. getrocknet. Ausbeute: 2,39g (83% d. Th.); F. 135°C (Z.);

N I* :-19,5⁰C(C = 1; DMF); RfO,33(CM12:4;„M") 578

Aminosäureanalyse (4N Methansulfonsäure; 110⁰C, 24h); Trp 0,84 (1); Ser 0,81 (1); Tyr 0,97 (1); GIy 1,0 (1); Leu 1,0( 1)

Beispiel 2

Boc-Trp-Ser-Tyr(Bze)-Gly-Leu-OMe

0,91 g (5mMol) H-Leu-OMe · HCI werden in 100ml Dichlorethan nach der allgemeinen Schnellsynthesevorschrift mit Boc-Gly-ONB, BocTyr(Bzl)ONB, Boc Ser ONB und Boc Trp ONB verlängert und die Abspaltung der Boc-Gruppen wird jeweils mit TFA/ Dichlorethan (1:1) vorgenommen.

Lediglich zur Ankupplung von boc-Tyr(BzI)ONB wird ein Zweiphasensystem mit Essigester anstelle von Dichlorethan gearbeitet, indem nacnderBoc-Absp~lt_ng von Dipeptid Boc-Gly-Leu · OMe TFA und Dichlorethan i.V. abdestilliert, der Rückstand in 20 ml Essigester aufgenommen, mit 1 N NaHCO₃-Lösung neutralisiert und mit 7,5 mMol Boc-Tyr(Bzl)ONBin 100 ml Essigester versetzt wird. Nach beendeter Kupplung und Extraktion wird Essigester wieder gegen Dichlorethan ausgetauscht und die folgenden Kupplungen nach dem allgemeinen Schema ausgeführt. In der letzten Stufe wird der N"-Boc-geschützte Pentapeptidmethylester aus der extrahierten und eingeengten Dichlorethanlösung durch Verreiben mit Petrolether als Feststoff erhalten.

Ausbeute: 3,07g (74% d. Th.); F. 100 bis 104⁰C;

[et] p³'⁵ : -25,2⁰C(C = 0,5; MeOH);

Aminosäureanalyse (4N Methansulfonsäure, 110⁰C, 24h) Trp 1,07 (1); Ser 0,97 (1); Tyr 0,85 (1); GIy 1,0 (1); Leu 0,95(1)

Beispiel 3

Boc-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-OH

0,302 g (1 mMol) H-Leu-ONBzl · HC! wird in 20 ml Dichlorethan nach der allgemeinen Schnellsynthesevorschrift mit Boc-D-Phe-ONB, Boc-Tyr-ONB, Boc-Ser-ONB und Boc-Trp-ONB analog zum Beispiel 1 schrittweise verlängert.

Ausbeute: 0,71Sg(TS⁰ZOd-Th.); F. 120bis123°C; R_f0,47(CM 18:2; „M")

Der N"-Boc-geschützte Pentapeptid-4-nitrobenzylesterwird in 150 ml Methanol unter Zusatz von 1,5ml Essigsäure und etwas 10% Pd/Aktivkohle eine Stunde hydriert, danach der Katalysator abfiitriert, die Methanollösung bei 30°C auf etwa 5ml eingeengt und der Rückstand in 80 ml Essigester aufgenommen. Die Essigesterphase wird 3x mit 1 N HCI extrahiert, neutral gewaschen und getrocknet sowie anschließend i.V. eingeengt. Der Rückstand wird in wenig Essigester aufgenommen, mit Ether ausgefällt, der ausfallende Feststoff isoliert, mit Ether gewaschen und i.V. getrocknet.

Ausbeute: 0,52g (85% d.Th); F. 180 °C (Z.);

la] ²L :-13,0(C = 1;DMF);R,0,44(CM12:4;„M")0,43(CMN12:4:0,5;„M") 578

Beispiel 4

Boc-Arg-(Mts)-Pro-Gly-OBzl

1,69g (5 mMol) H-GIy-OBzI · TosOH wird in 100ml Dichlorethan nach der allgemeinen Schnellsynthesevorschrift mit Boc-Pro-ONB verlängert und die anschließend N^a-Deblockierung mit TFA vorgenommen. Die Umsetzung mit Boc-Arg(Mts)-ONB erfolgt in Dichlorethan bei +4⁰C und der Reagensüberschuß an Diamin wird durch Waschen mit 1 N HCL und Wasser entfernt.

Anschließend wird das Lösungsmittel i. V. entfernt, der Rückstand in 150 ml Essigester aufgenommen und die org. Phase mit 1 N HCI, 1 N NaHCO₃ und Wasser extrahiert. Nach dem Trocknen wird die organische Phase i. V. eingeengt und der Rückstand durch Lösen in 1OmITHF, durch Zugabe von Ether/Petrolether (1:1) zweimal umgefällt. Der harzartige Rückstand wird mit Ether digeriert und danach i.V. von Lösungsmittelresten befreit.

Ausbeute: 2,28g (65% d. Th.); F. 80 bis 100⁰C (Z); R_f 083 (CM 17:3; „M") 0,91 (CMN 12:4:0,5; „M");

la] I* : -35,0 (C =1; DMF); 578

Aminosäureanalyse (6 N HCI, 11O⁰C, 24h), Arg 1,0(1); Pro 0,92(1); GIy 1,0(1)

Beispiel 5

Boc-Arg(Mts)-Pro-OBzl

1,21 g (5 mMol) H-Pro-OBzl-HCI wird in 100ml Essigester nach der allgemeinen Schnellsynthesevorschrift bei +4⁰C mit Boc-Arg(Mts)-ONB umgesetzt. Nach der Diaminbehandlung wird mit 1 N HCI, 0,3 Na₂CO₃-Lösung und Wasser extrahiert, die organische Phase getrocknet und danach i.V. eingeengt. Der Rückstand wird zweimal aus Ether/Petrolether umgefällt und der amorphe Rückstand durch Trocknen i.V. von Lösungsmittelresten befreit.

Ausbeute: 2,80g (87% d. Th.); F. 60 bis 65°C; R_f 0,84 (CM 18:2; „M") 0,72 (CMA 19:1:1 „M")

[a] ²^ : -36,0(C= 1; DMF) 578

Beispiel 6

Boc-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(Mts)-Pro-Gly-NH₂

0,54g (0,77 mMol) Boc-Arg(Mts)-Pro-Gly-OBzl werden in 10 ml 30% TFA/CH₂CI₂ gelöst und 30 Min. gerührt. Die Lösung wird i.V. eingeengt, der Rückstand in 70 ml Dichlormethan aufgenommen, je einmal mit 1 N NaHCO₃ und Wasser gewaschen und über Na₂SÜ4 getrocknet. Nach dem Einengen i.V. fällt die Aminokomponente als farbloser, glasiger Feststoff an, der in 12 ml Tetrahydrofuran gelöst wird. Dazu werden 0,508g (0,70 mMol) Boc-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-OH gegeben, die Lösung auf 0⁰C gekühlt und 0,215g (1,2 mMol) HONB und 0,206 (1 mMol) DCCI zugesetzt. Nach 2 Stunden Rühren bei 0⁰C wird das Eisbad entfernt, und der Ansatz bei Raumtemperatur 20 Stunden stehengelassen. Danach wird der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Filtrat eingeengt und die Lösung mit 150ml Essigester versetzt. Die Essigesterphase wird dreimal mit 1 N HCI, zweimal mit 1 N NaHCO₃ und einmal mit Wasser extrahiert, getrocknet und i. V. eingeengt. Der Rückstand wird in 10 ml Methanol gelöst, filtriert und die methanolische Lösung in 150ml Ether/Petrolether (2:1) eingetropft. Es entsteht ein Niederschlag von Boc-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-ArgjMtsJ-Pro-Gly-OBzl, der abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet wird [0,81 g = 88%, d. Th.; F. 135bis137°C; :;

[a] ° :-38,5°(C=1;DMF); R_f 0,55 578

(CM 17:3; „S") 0,85 (CMN 12:4:0,5; „S")]. Der Feststoff wird in 25 ml mit Ammoniak gesättigtem Methanol gelöst und 15 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach werden 5 ml Wasser zugesetzt, und nach weiteren 2 Stunden wird i.V. eingeengt. Der harzartige Rückstand wird in wenig Methanol gelöst, mit 150 ml Essigester versetzt und die Essigesterphase nacheinander zweimal mit 1 N HCI, zweimal mit 1 N NaHCO₃ und einmal mit Wasser gewaschen, schließlich getrocknet und i.V. eingeengt. Der Rückstand wird in 10 ml Methanol gelöst und unter Rühren mit 150 ml Ether versetzt. Der sich abscheidende Feststoff wird abgesaugt und getrocknet

Ausbeute: 0,61 g (81 % d. Th,); F. 169 bis 173°C;

la] „„ :-27°(C = 1; DMF); R_f0,28 578

(CM 17:3; „M"); 0,54(CMN 12:4:0,5; „M")

Aminosäureanalyse (4 N Methansulfonsäure; 110⁰C,Trp 1,05 (1), Ser 1,0 (1); Tyr 1,0 (1); GIy 2,0 (2); Leu 1,08 (1); Pro 0,99 (1); Arg

Beispiel 7

Z-pGlu-His(Boc)-OH

0,427g (1 mMol) Z-pG!u-His-OH · 1,5 H₂O(M. Fujino et al., Chem. Pharm. Bull. [Japan] 22,1857 [1974]) werden in 4ml Dioxan/ Wasser (1:1) suspendiert und unter Rühren bei Raumtemperatur mit 0,14ml (1 mMol) Triethylamin und 0,263 (1,2 mMol) Boc-pyrocarbonat versetzt. Nach wenigen Minuten entsteht eine klare Lösung, die nach 2 Stunden mit 5%iger KHSO₄-Lösung auf pH 2 angesäuert und zweimal mit Methylenchlorid extrahiert wird. Danach wird die organische Phase zweimal mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in 4ml Essigester gelöst, mit 30 ml Ether versetzt und dann durch Zugabe von Petrolether das Produkt ausgefällt.

Ausbeute: 0,345g (69% d. Th.); F. 11O⁰C (Z.);

[a] __. :+9,0"(C= 1; DMF); R_f0,26(CM4:1;„M") 578

0,78 (CMA 19:1:1;„S")

Beispiel 8

Z-pGlu-His(Z)-OH

0,427g (1 mMol) Z-p-Glu-His-OH · 1,5 H₂O werden in 4ml Dioxan/Wasser (1:1 (suspendiert und unter Rühren bei Raumtemperatur mit 0,14ml (1 mMol) Triethylamin und 0,256g (1,5 mMol) Benzyloxycarbonylchlorid versetzt. Nach wenigen Minuten entsteht eine klare Lösung, die nach 2 Stunden mit 5%iger KHSO₂-Lösung auf pH 2 angesäuert und zweimal mit Essigester extrahiert wird. Nach Waschen der organischen Phase mit Wasser wird über Na₂SO₄ getrocknet und i.V. eingeengt.

Der in wenig Essigester gelöste Rückstand wird mit Ether/Petrolether versetzt, das ausgefallene Produkt abfiltriert und i.V.

getrocknet.

Ausbeute: 0,385g (72% d. Th.); F. 135 bis 137° (Z.) R_f 0,63 (CM 16:4; „S"); 0,86 (BEW4:1:1; „S")

[et] I* :+8,5°(C=1;DMF) 578

Beispiel 9

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂

0,207g (0,17 mMol) Boc-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(Mts)-Pro-Giy-NH₂ werden in 3ml einer 3 M Methansulfonsäure/Dioxan-Lösung unter Zusatz von 0,06 ml Anisol und 0,06 g Triphenylphosphin 40 Min. bei Raumtemperatur gerührt. Nach 1 Stunde wird das Peptid mit Ether gefällt, abgesaugt, zweimal mit Ether gewaschen und i.V. über KOH getrocknet. Der Feststoff wird dann in 2 ml Dimethylformamid und 5 ml Tetrahydrofuran gelöst und die Lösung auf O⁰C gekühlt. Unter Rühren werden dazu 0,1 g (0,2 mMol) Z-pGlu-His(Boc)-OH, 0,0236 ml Triethylamin, 0,0537 g (0,3 mMol) HONB und in 3 ml Tetrahydrofuran gelöste 0,0618 g (0,3 mMol) DCCl gegeben. Nach 2 Stunden Rühren bei 0⁰C und 16 Std. bei Raumtemperatur wird durch Zugabe von Triethylamin der pH-Wert auf 6,5 gestellt und weitere 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die unlöslichen Reste werden abfiltriert und das Filtrat in Ether eingetropft, der ausfallende Feststoff mit Ether gewaschen und aus Ethanol/Ether umgefällt. Es werden 0,247g (£ 91%d.Th.; F. 165°C(Z.); R_f 0,56 (CM 4:1; „M") geschütztes Gn-RH erhalten, die in 20 ml einer jeweils 1 M an Methansulfonsäure und anThioanisol gemachten Trifluoressigsäurelösung unter Zusatz von 1,5 ml m-Kresol und 0,25g Skatol gelöst und 30 Min. bei 0°C und weitere 60 Min. bei Raumtemperatur gerührt werden. Danach wird mit 200 ml Ether gefällt, der Rückstand abzentrifugiert und zweimal mit Ether gewaschen. Anschließend wird das Peptid an Sephadex LH-20 mit Chloroform/ Methanol (2:1) als Elutionsmittel chromatografie!! und der nach dem Verdampfen der Lösungsmittel erhaltene Rückstand lyophilisiert.

Ausbeute: 0,160g (79% d. Th.); R,0,57 (BPAW 30:20:6:24; „M"), 0,29 (CMN 12:6:1; „M"), 0,57 (CMAW 60:45:6:14; „M"), 0,36 (BEW 12:3:5; „M")

Aminosäureanalyse (4 N MethansuIfonsäure; 110°C; 24h) GIu 1,11(1); His 1,05 (1);Trp0,99 (1); SerO,91 (1);Tyr0,91(1); GIy 2,14 (2); Leu 1,0 (1); Arg 0,99 (1); Pro 1,16 (1)

HPLC: Lichrosorb RP-18,10μιτι; Säule: 250 x 4,6mm;

27% Acetonitril/73% 0,66 M KH₂PO₄, pH 7,0;

Fluß: 1,1 ml/min.

Retentionszeit: 5,2min.

Gehalt: >95%

Claims (5)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung von Gn-RH und seiner Analoga gekennzeichnet dadurch, daß man aus der Gn-RH-Sequenz ein mittelständiges Fragment der allgemeinen Formel I

   Boc-Trp-SerfRiJ-TyrlR^-X-Leu-ORz (L),

   in der Boc für Tert.-Butyloxycarbonyl,

   R₁ für Wasserstoff oder eine OH-Schutzgruppe vom Benzyltyp,
   R₂ für einen Alkyl- oder Aralkylrest
   und X für GIy, D-Phe, D-AIa, D-Leu oder D-Trp stehen,

   über die Peptidschnellsynthesemethode mit Boc-Aminosäureaktivestern von N-Hydroxyverbindungen im Zweiphasensystem aus einer organischen Phase und einer wäßrigen Basenlösung ohne Isolierung von Zwischenstufen herstellt, den C-terminalen Ester verseift und das entstehende Fragment der allgemeinen Formel Il

   Boc-Trp-SerfR, )-Tyr(R, )-X-Leu-OH (II),

   in der Boc, Ri und X die oben angegebene Bedeutung besitzen, zunächst mit einem Peptidfragment der allgemeinen Formel III H-Arg(R₃)-Pro-W (III),

   in der R₃ für eine geeignet acidolytisch deblockierbare N^G-Schutzgruppe

   und W für GIy- OBzI oder -OBzI stehen, das man ebenfalls nach der Peptidschnellsynthesemethode mit Boc-Aminosäureaktivestern von N-Hydroxyverbindungen im Zweiphasensystem aus einem Halogenkohlenwasserstoff und einer wäßrigen Basenlösung ohne Isolierung von Zwischenstufen herstellt, unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid und einer N-Hydroxyverbindung zum Oktapeptid der allgemeinen Formel IV

   Boc-Trp-SerfR^-TyriFU-X-Leu-ArglFy-Pro-W (IV),

   in der Boc, R₁, R₃ und W die oben angegebene Bedeutung haben, umsetzt, dieses im Falle von W gleich GIy-OBzI mit methanolischer Ammoniaklösung und im Falle von W gleich OBzI mit methanolischer Ethylaminlösung in die C-terminalen Amide umwandelt und dann acidolytisch N-terminal die tert.-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe abspaltet, so daß ein Oktapeptid der allgemeinen Formel V

   H-Trp-SerfR-O-Tyr^l-X-Leu-ArgiRsJ-Pro-Y (V),

   in der R₁, R₃ und X die oben angegebene Bedeutung haben und Y für GIy-NH₂ oder NH-C₂H₅ steht, entsteht, das unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid und einer N-Hydroxyverbindung mit einem Dipeptid der allgemeinen Formel Vl Z-pGlu-His(R₄)-OH (Vl),

   in der Z für Benzyloxycarbonyl und R₄ für eine beliebige, mit Säuren deblockierbare N^im-Urethanschutzgruppe stehen, zum geschützten Dekapeptid der allgemeinen Formel VII

   Z-pGlu-His(R₄)-Trp-Ser(R₁)-Tyr(R₁)-X-Leu-Arg{R₃)-Pro-Y (VII),

   in der Z, R₁, R₃, R₄, X und Y die oben angegebene Bedeutung besitzen, umgesetzt wird und dann die Schutzgruppen acidolytisch abgespalten werden.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß zur Herstellung des Fragmentes I die Aminosäuren Serin und Tyrosin vorzugsweise Seitenketten-ungeschützt mit Wasserstoff für R₁ eingesetzt werden und in diesem Falle für den C-terminalen Esterschutz R₂ als 4-Nitrobenzylester gewählt werden. _t
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß zur Herstellung des Fragmentes III als Seitenkettenschutz des Arginins vorzugsweise Arylsulfonylschutzgruppen, insbesondere die Mesitylensulfonylschutzgruppe, verwendet werden.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß zur Hersteilung des Fragmentes IV als N^im-Schutzgruppe des Histidins vorzugsweise der tert.-Butyloxycarbonylrest für R₄ Verwendung findet.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1, Punkt 3 und Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß die acidolytische Schutzgruppenabspaltung von einem Fragment der allgemeinen Formel VH zum Gn-RH mit einem Gemisch aus Methansulfonsäure, Trifluoressigsäure und Thioanisol unter Zusatz von m-Kresol und Skatol vorgenommen wird.