JP3194953B2 - 血栓症抑制剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 関連出願 この出願は、1992年２月14日付で出願された係属中の
米国特許出願第0/836,123号「血栓症−誘発血小板凝集
の抑制剤」の部分係属出願であり、該米国特許出願の明
細書および図面もこの出願の一部を成すものである。

発明の分野 一つの観点によれば、本発明は血栓症または因子X a
の強力な抑制剤である化合物に関する。別の観点によれ
ば、本発明は新規なペプチドアルデヒド類似体、薬学的
に許容されるこれらの塩、および哺乳類の血液凝固の強
力で特異的な抑制剤としての有用な該類似体または塩を
含有する薬学的に許容される組成物に関する。さらに別
の観点によれば、本発明は、異常な血栓症によって特徴
づけられる哺乳類の疾患用治療剤としてのこれらの抑制
剤の使用方法に関する。

発明の背景 正常な止血は、クロットの形成過程（血液凝固）とク
ロットの溶解過程（線維素溶解）の間の複雑なバランス
の結果からもたらされる。血球、特異的血漿タンパク質
および血管表面の間の複雑な相互作用によって、けがや
出血がおこらない限り、血液の流動性は保持される。

血液凝固は、血漿中のセリンプロテアーゼの数種の特
異的酵素前駆体がタンパク質限定加水分解によって活性
化される一連の増幅反応の完結である［ネマーソンおよ
びノッセル、Ann.Rev.Med.、第33巻、第479頁（1982
年）参照］。この一連の反応は、初期の止血栓の安定化
に必要な不溶性フィブリンマトリックスの形成をもたら
す。活性化反応の相互作用と伝搬は、凝固の外因性およ
び内因性経路を経ておこなわれる。これらの経路は、セ
リプロテアーゼである因子X aの形成においては、高度
に相互依存的で収束的である。因子X aは、血液凝固多
段階の最後から二番目の段階であって、セリンプロテア
ーゼトロンビンの形成段階に触媒作用をもたらす。この
段階はプロトロンビナーゼ複合体のアセンブリーの次に
起こる（該アセンブリーは因子X a、非酵素的補因子V
a、および付着された活性化血小板の表面または全身を
循環する膜質微粒子の表面に集合した基質プロトロンビ
ンから成る）。

酵素前駆体である因子Ｘのその酵素的に活性な形態
（因子X a）へのタンパク分解活性は、内因性または外
因性の凝固経路のいずれかによっておこなわれる。内因
性経路は本質的なものと呼ばれるが、その理由は、凝固
に必要な全ての要因が血中に存在するからである［サイ
トウの報文「正常な止血機構」、止血障害、第27頁〜第
29頁、グラン・アンド・ストラットン社発行（ラトノフ
およびホルベス編、1984年）参照］。この経路には、酵
素前駆体セリンプロトロテアーゼ（因子IXおよびXI）お
よび非酵素的補因子（因子VIII）が含まれる、内因性経
路の開始によって、因子XIからXI aへの活性化がもたら
される。因子XI aは、因子IXから因子XI aへの活性化に
触媒作用を及ぼす。因子XI aは、適当なリン脂質表面上
の活性形態の因子VIIIと共にテナーズ（tenase）複合体
の形成をもたらす。この複合体は、酵素前駆体である因
子Ｘからセリンプロテアーゼ（因子X a）の形成に触媒
作用を及ぼし、該因子X aは次いで凝塊を形成させる。

外因性経路は非本質的なものと呼ばれるが、その理由
は、因子VIIに結合してその活性化を促進する組織因子
が血液外からもたらされるからである（サイトウの前記
文献参照）。この経路に含まれる主要な成分は酵素前駆
体セリンプロテアーゼ（因子VII）および膜結合タンパ
ク質（組織因子）である。後者は、この酵素に対して不
可欠な非酵素的補因子として作用する。この経路の開始
は、痕跡量の活性化因子VII（因子VII a）による酵素前
駆体因子VIIの活性化によってもたらされる自触媒現象
と考えられている。この場合、両方の因子は、血管の損
傷部位の膜表面上に新たに出現する組織因子と結合す
る。因子VII a/組織因子複合体は、酵素前駆体（因子
Ｘ）からのセリンプロテアーゼ（因子X a）の形成に対
して直接的に触媒作用を及ぼす。損傷組織からの出血
は、外因性経路による血液凝固を開始させる。

酵素前駆体（因子Ｘ）からその触媒的に活性な形態
（因子X a）へのタンパク分解活性は、重鎖サブユニッ
トのアミノ末端から52番目のアミノ酸活性ペプチドを遊
離させる。内因性の活性化反応は、非酵素的補因子（因
子VIII a）との高分子複合体中の因子IX aによる触媒作
用を受ける。外因性経路を経由する因子X aの形成は、
因子VII aと組織因子との触媒性複合体による触媒作用
を受ける。両方の反応は、適当なリン脂質表面上におい
て、カルシウムイオンの存在下で起こらなければならな
い。因子Ｘの内因性または外因性の活性化によって形成
される活性生成物はα−因子X aである。自触媒現象と
考えられている第二のタンパク分解開裂は、重鎖のカル
ボキシ末端から14番目のアミノ酸ペプチドの遊離を伴う
β−因子X aの形成をもたらす。いずれの形態の活性分
子も、血漿中での凝固促進能またはペプチジル色素原基
質の加水分解能の点で同等の触媒活性を有する。

トロンビンの形成は、触媒性のプロトロンビナーゼ複
合体のアセンブリーに従って因子X aの触媒作用を受け
る［マンらの報文「ビタミンＫ依存性酵素複合体の表面
依存性反応」、Blood、第76巻、第１頁〜第16頁（1990
年）参照］。この複合体は因子X a、非酵素的補因子V a
および基質プロトロンビンから成り、これらの成分は適
当なリン脂質表面上で合体する。高分子複合体が効率的
な触媒作用に必要な要件を備えることにより、自然の抗
凝固機構、例えば、ヘパリン−アンチトロンビンIIIで
媒介される阻害等から因子X aは保護される［タンテと
ローゼンベルグの報文「ヘパリン−アンチトロンビン複
合体による因子X aの中和からの保護」、J.Clin.Inves
t.、第71巻、第1383頁〜第1391頁（1983年）参照］。さ
らに、プロトロンビナーゼ複合体中の因子X aのキレー
ト化合物形成は、抗凝固効果を引き出すためにアンチト
ロンビンIIIも必要とする外因性ヘパリン治療効果によ
る阻害に対する耐性を該複合体にもたらす。

トロンビンは血栓形成の一次メディエイター（mediat
or）である。トロンビンは直接的に作用して、循環する
フィブリノゲンから不溶性フイブリンを形成させる。さ
らに、トロンビンは酵素前駆体因子XIIIを活性なトラン
スグルタミナーゼ因子XIII aに活性化し、該因子XIII a
は、増大する血栓をフィブリン線維の架橋によって共有
結合的に安定化させる作用をする［ローラントおよびコ
ニシ、Arch.Biochem.Biohys.、第105巻、第58頁（1964
年）参照］。フィブリン含有量の多い凝塊の形成と安定
化における直接的な役割のほかに、該酵素は、脈管系と
血液中の多数の細胞成分に対して大きな生体調節効果を
及ぼすことが報告されている［シューマン、Ann.NY Ac
ad.Sci,、第405巻、第349頁（1986年）参照］。

トロンビンは血小板活性の最も効果的なアゴニストで
あると考えられており、また、トロンビンは、血小板依
存性の動脈血栓形成の基本的な病態生理学的メディエイ
ターであることが証明されている［エディトら、J.Cli
n.Invest.、第84巻、第18頁（1989年）参照］。トロン
ビンで媒介される血小板活性によって、リガンドにより
誘発される血小板間凝集がもたらされる。該血小板間凝
集は主として、付着性リガンド（例えば、フィブリノゲ
ンおよびフィブロネクチン等）と血小板インテグリンレ
セプター（例えば、トロンビン活性を伴う活性な立体配
座を有する糖タンパク質等）との間の二価相互作用に起
因する［ベルントおよびフィリップス、「プレイトレッ
ツ・イン・バイオロジー・アンド・パソロジー」、第43
頁〜第74頁、エルセヴィーア／ノース・ホランド・バイ
オメディカル・プレス（ゴードン編、1981年）参照］。
トロンビンで活性化された血小板は、それぞれ非酵素的
補因子ＶおよびVIIIのトロンビン媒介活性を伴う完全な
活性血小板および血小板誘導微粒子の膜表面上における
新たなプロトロンビナーゼおよびテナーゼ（因子IX a、
因子VIII aおよび因子Ｘ）の触媒性複合体のアセンブリ
ーを介してトロンビンの製造も促進する［タンスら、Bl
ood、第77巻、第2641頁（1991年）参照］。この正フィ
ードバックプロセスによって、血栓の近接部において高
濃度のトロンビンが局部的に生成され、これによって、
血栓の増大と拡張が促進される［マンら、Blood、第76
巻、第１頁（1990年）参照］。

プロトロンビン効果とは異なり、トロンビンは止血に
対して別の観点から影響を及ぼすことが知られている。
この種の作用には、生理学的に重要な抗凝固因子として
の作用が含まれる。トロンビンの抗凝固効果は、内皮細
胞膜糖タンパク質（トロンボモジュリン）に対するトロ
ンビンの結合によって示される。この効果によりトロン
ビンの基質特異性が変化し、これによって、トロンビン
は循環性タンパク質Ｃを認識してこれをタンパク分解的
に活性化させて活性化タンパク質Ｃ（aPC）を生成する
と考えられている［ムスシら、Biochemistry、第27巻、
第769頁（1988年）参照］。aPCは、非酵素的補因子V a
およびVIII aを選択的に不活性化してそれぞれプロトロ
ンビナーゼ触媒性複合体およびテナーゼ触媒性複合体に
よるトロンビン形成の下方調節をもたらすセリンプロテ
アーゼである［エスモン、Science、第235巻、第1348頁
（1987年）参照］。トロンボモジュリンの不存在下での
トロンビンによるタンパク質Ｃの活性化は劣る。

トロンビンはまた、血管の平滑筋細胞のような間葉起
源の細胞を含む多種類の細胞に対して有効な直接的分裂
誘発因子としても知られている［ケンおよびブカナン、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第72巻、第131頁（1975年）
参照］。トロンビンと血管平滑筋との直接的相互作用に
よって血管収縮がもたらされる［バルツら、Proc.Soc.E
xpl.Biol.Med.、第180巻、第518頁（1985年）参照］。
トロンビンは、組織プラスミノゲン活性化因子を含む血
管内皮細胞からの多数の生物活性物質の放出を誘発する
直接的な分泌促進剤としても作用する［レビンら、Thro
mb,Haemost.、第56巻、第115頁（1986年）参照］。血管
細胞に及ぼすこれらの直接的な効果のほかに、該酵素
は、トロンビン誘発活性化を伴う血小板α−顆粒からの
数種の強力な成長因子（例えば、血小板−誘導成長因子
および表皮性成長因子等）の放出によって、血管平滑筋
細胞に対して強力な分裂誘発因子活性を間接的に誘発す
る［ロス、N.Engl.J.Med.第314巻、第408頁（1986年）
参照］。

多くの重要な疾患は異常な止血に関連している。冠状
動脈の血管系に関しては、確立されたアテローム性動脈
硬化性プラクの破裂に起因する異常な血栓形成は急性心
筋梗塞および不安定アンギナの主要な原因である。さら
に、血栓融解治療または経皮的な経内腔的冠状動脈形成
術（PTCA）による閉塞性の冠状動脈血栓の治療には、緊
急の消散を必要とする冒された血管の急性血栓症的再閉
鎖を伴う場合が多い。静脈血管系に関しては、四肢の下
部または腹部領域において大手術を受ける患者の多く
は、冒された四肢への血流の低減と肺塞栓症へ導く疾病
素質をもたらす静脈血管系に形成される血栓で患ってい
る。散在性の血管内凝固障害は、いずれの血管系におい
ても、敗血性ショック、特定のウイルス性感染および癌
で患っているときにみられ、また、該凝固障害は、凝固
因子の急激な消費および広範囲に及ぶ器官不全症へ導く
血管系内での生命の危険をもたらす血栓の形成によって
特徴づけられる。

動脈血管系における病原性血栓症は、今日の医学の分
野においては、臨床上重大な関心事となっている。西欧
諸国における主要な死因の一つである急性心筋梗塞の主
要な原因は病原性血栓症である。周期的に起こる動脈血
栓症は、血栓融解剤およびPTCAによってそれぞれ治療さ
れる閉塞冠状動脈の酵素的および外科的再疎通化によっ
てもたらされる不全症の主要な原因の一つである［「ト
ロンボシス・イン・カージオバスキュラー・ディスオー
ダー」（フルターおよびフェアストレーテ編、サウンダ
ース社（W.B.Saunders Co.）発行:1991年）の第327頁
に記載のロスの報文および第389頁に記載のガリフとウ
ィラーソンの報文参照］。静脈血管系における血栓症の
場合とは異なり、動脈血栓症は、血液凝固多段によって
形成されるフィブリンと細胞成分、特に血小板との複雑
な相互作用であって、高い確率で動脈血栓に導く相互作
用の結果をもたらされる。急性の動脈血栓症または再血
栓症の有効な治療法または予防法は現在のところ知られ
ていない。何故ならば、生体内投与される臨床的な抗凝
固剤として最も広く使用されているヘパリンはこの症状
に対して一般的に有効であることは証明されていないか
らである［プリンスおよびヒルシュ、J.Am.Coll.Cardio
l.、第67巻、第3A頁（1991年）参照］。

PTCAの後で一般的に発生する予測できずに周期的に起
こる血栓症的再閉塞のほかに、この手術を受けた患者の
30〜40％において、再疎通化血管に顕著な再発狭窄症が
みられる［カリフら、J.Am.Coll.Cardiol.、第17巻、第
28頁（1991年）参照］。これらの患者には、新たに生じ
た狭窄症を治療するためにPTCAを繰り返すか、または冠
状静脈バイパスを設ける手術が必要となる。物理的な力
によって損傷を受けた血管の狭窄症は血栓症的突起によ
るものではなく、周囲の平滑筋細胞における過剰増殖性
応答の結果であり、該平滑筋細胞は経時的に、筋肉マス
の増加による冒された血管の内腔径の減少をもたらす
（カリフらの上記文献参照）。動脈血栓症に関しては、
物理的な再疎通化に伴う血管の再発狭窄症を予防するの
に有効な薬理学的処置は現在のところ知られていない。

安全で有効な治療用抗凝固剤の必要性は、一つの観点
においては、セリンプロテアーゼトロンビンが形成され
る血液凝固多段の最後から２番目の段階における因子X
aの触媒としての役割に注目している。

トロンビンに対する最も好ましい天然の基質は、P3認
識サブサイトにおける非荷電アミノ酸を含むとされてい
る。例えば、以下に示すように、トロンビンに対して生
理学的に基本的な基質であるフィブリノゲンのＡα鎖上
のトロンビン開裂サイトにはグリシン残基が含まれる
が、Ｂβ鎖上の開裂サイトにはセリン残基が含まれるこ
とが知られている： P4 P3 P2 P1 P1′ Gly−Gly−Val−Arg/Gly フィブリノゲンＡα鎖 Phe−Ser−Ala−Arg/Gly フィブリノゲンＢβ鎖 トロンビンの活性サイトに結合してフィブリノゲンの
フィブリンへの変換と細胞の活性化を阻害する非荷電残
基をP3位に有するペプチジル誘導体が知られている。さ
らに、P1アミノ酸と結合したアルデヒド官能基、クロロ
メチルケトン官能基またはホウ酸官能基を有するペプチ
ジル誘導体も知られている。基質様ペプチジル誘導体、
例えば、Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−アルギニナ
ル（Ｄ−Phe−Pro−Arg−al）、Ｄ−フェニルアラニル
−プロリル−アルギニン−クロロメチルケトン（Ｐ−PA
CK）およびアセチル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル
−ボーロアルギン（Ac−（Ｄ−Phe）−Pro−boroArg）
がトロンビンの活性サイトに直接結合することによって
該酵素を阻害することが知られている。例えば以下の文
献参照： バジャスツ、Symposia Biologica Hungarica、第25
巻、第277頁（1984年）；バジャスツら、J.Med.Chem.、
第33巻、第1729頁（1990年）；バジャスツら、Int.J.Pe
ptide Protein Res.、第12巻、第217頁（1970年）；
ケットナーおよびショー、Methods Enzymol.、第80
巻、第826頁（1987年）；ケットナーら、EP293,881号明
細書（1988年、12月７日発行）；ケットナーら、J.Bio
l.Chem.、第265巻、第18209頁（1990年）。これらの分
子が、血小板を多く含む動脈血栓症の予防において、有
効な抗凝固剤であることが知られている［ケリーら、Th
romb.Haemostas.、第65巻、第736頁および第257頁（199
1年）参照］。

トロンビンの活性サイトのインヒビターであるが、P3
認識サブサイトに非荷電アミノ酸を有するペルチジル化
合物とは構造が異なるペプチジル化合物が知られてい
る。アルガトロバン（2R,4R−４−メチル−１−［Ｎ−
２−（３−メチル−1,2,3,4−テトラヒドロ−８−キノ
リンスルホニル）−Ｌ−アルギニナル］−２−ピペルジ
ンカルボン酸とも呼ばれる）もトロンビンの活性サイト
に直接結合するので、該酵素の非ペプチジルインヒビタ
ーとしては最も効果的で選択性のある化合物であるとさ
れている［オカモトら、Biochem.Biophys.Res.Commu
n.、第101巻、第440頁（1981年）参照］。アルガトロバ
ンは、急性動脈血栓症のいくつかの実験的モデルにおい
ては、抗血栓症剤として有効であるとされている［ジャ
ングら、Circulation、第81巻、第219頁（1990年）およ
びCirc.Res.、第67巻、第1552頁（1990年）参照］。

トロンビンのインヒビターであって、該酵素の活性サ
イトと他のサイトに結合すると考えられているペプチジ
ル化合物が知られている。ヒルジンとその種々のペプチ
ジル誘導体は、トロンビンの活性サイトとエキソサイト
またはエキソサイトのみに結合することによって、フィ
ブリノゲンからフィブリンへの変換および血小板の活性
化を阻害すると言われている［マークワルト、Thromb.H
aemostas.、第66巻、第141頁（1991年）参照］。ヒルジ
ンは、最初はヒルの唾液腺抽出物から単離された65アミ
ノ酸ポリペプチドであって、既知のトロンビンインヒビ
ターのうちで最も効能の高いものの一つであると言われ
ている［マーキおよびワリス、Thromb.Haemostas.、第6
4巻、第344頁（1990年）参照］。この化合物は、相互に
異なって離れたアニオン結合性エキソサイトと触媒活性
サイトの両方へ結合することによって、トロンビンを阻
害すると言われている（ライデルの前記文献参照）。ヒ
ルンジンは生体内で有効な抗血栓症剤であるとされてい
る［マークワルトら、Pharmazie、第43巻、第202頁（19
88年）およびケリーら、Blood、第77巻、第１頁（1990
年）参照］。抗血栓症的効果のほかに、ヒルジンは、ア
テローム性動脈硬化症を患うウサギの大腿動脈に物理的
な損傷を与えたときにもたらされる平滑筋の増殖とこれ
に関連する再発狭窄症を有効に阻害すると言われている
［サレムボックら、Circulation、第84巻、第232頁（19
91年）参照］。

ヒルゲンは、ヒルジンのアニオン性カルボキシ末端か
ら誘導されるペプチドであると言われている。ヒルゲン
は、トロンビンの結合性エキソサイトのみに結合するこ
とによって、フィブリンの形成を阻害するが、該酵素の
非ブロック化活性サイトに接近する小さな合成基質の触
媒的代謝回転は阻害しないと言われている［マラガノア
ら、J.Biol.Chem.、第264巻、第8692頁（1989年）およ
びナスキら、J.Biol.Chem.、第265巻、第13484頁（1990
年）参照］。Ｘ線結晶学的分析によれば、ヒルゲンによ
って表現されるヒルジンの領域は、トロンビンのエキソ
サイトに直接的に結合すると言われている［スクルジプ
クザーク−ジャンクンら、Thromb.Haemostas.、第65
巻、アブストラクト507、第830頁（1991年）参照］。さ
らに、ヒルゲンの結合によって、特定の小さな合成基質
のトロンビンによる触媒的代謝回転が促進されることも
報告されており、このことは、酵素活性サイトにおける
立体配座の変化がエキソサイトの占有を伴うことを示す
［リウの前記文献参照］。ヒルゲンは、トロンビンによ
って仲介される血小板の凝集をブロックすると言われて
いる［ヤクボウスキおよびマラガノア、Blood、第75
巻、第399頁（1990年）参照］。

ヒルログ（hirulog）は、トロンビンに対して好まし
い基質認識サイトに基づくペプチド（Ｄ−フェニルアラ
ニル−プロリル−アルギニン）にグリシン−スペイサー
領域を介して結合されたヒルゲン様配列を含む合成キメ
ラ分子であるとされている。ヒルゲン様配列は、このペ
プチドのＣ−末端を介して該ペプチドに結合すると言わ
れている［マラガノンら、Biochemistry、第29巻、第70
95頁（1990年）参照］。ヒルログは、フィブリンの多い
血栓症および血小板の多い血栓症のいずれの予防におい
ても有効な抗血栓症剤となり得ると言われている［マラ
ガノンら、Thromb.Haemostas.、第65巻、アブストラク
ト17の第651頁（1991年）参照］。

発明の概要 一つの観点によれば、本発明は抗血栓症剤として有効
な化合物に関する。即ち本発明は、次式： AcR−A₁−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−al （式中、AcRは疎水性アシル基を示し、A₁はグルタミン
酸（Glu）もしくはアスパラギン酸（Asp）またはGluも
しくはAspの等価物を示す） で表わされ、トロンビンおよび／または因子X aに対し
て約200nMもしくはそれ以下のIC₅₀を有し、また、プラ
スミンに対して、トロンビンもしくは因子X aに対する
比較的小さなIC₅₀よりも大きなIC₅₀を有する化合物に関
する。これらの化合物は血栓症の抑制剤として有用であ
る。

好ましい観点によれば、本発明による化合物には、次
式で表わされる化合物および薬学的に許容される該化合
物の塩類が含まれる： 式中、R₁は炭素原子数約５〜約10のアルキル基、炭素
原子数約６〜約12のアリールによって置換された炭素原
子数約１〜約３のアルキル基、または炭素原子数約５〜
約８の環状アルキルによって置換された炭素原子数約１
〜約３のアルキル基を示し、ｍは１または２を示し、 R₂は−CO₂R′、 を示し（Ｒ′は水素原子、炭素原子数約１〜約４の低級
アルキル基または炭素原子数約６〜約14のアラルキル基
を示す）、R₃は−（CH₂）_３−NH−Ｃ（＝NH）−NH₂を示
す。

ペプチジルアルギニンアルデヒドは水溶液中では、次
式で示すように、４種の平衡構造（A:アルギニンアルデ
ヒド、B:水和アルデヒド、ＣおよびD:アミノシクロー
ル）で存在することが知られている［バジャスツら、J.
Med.Chem.、第33巻、第1729頁（1990年）参照］。

Ｒは本発明に含まれる所定の化合物の残余の部分を示
す。本発明によるペプチドアルデヒドには、これらの定
義内における全ての平衡形態のものも包含される。

別の観点によれば、薬学的に有効量の上記化合物およ
び薬学的に許容されるキャリヤーを含有する薬剤組成物
が本発明には含まれる。さらに別の観点によれば、哺乳
類における血液凝固プロセスを伴う障害によって特徴づ
けられる疾患を予防または治療するために上記化合物お
よび薬剤組成物の使用方法が本発明には含まれる。

定義 本発明によってここで使用する下記の用語は、特に言
及しない限り、次の様に定義される。

「アルキル」…直鎖、分枝鎖および環状鎖を含む飽和
脂肪族基、 「アリール」…共役π電子系を有する少なくとも１個
の環を有する芳香族基であって、随意に置換されていて
もよい炭素環式アリール基、ヘテロ環式アリール基およ
びビアリール基が含まれる。

「アラルキル」…アリール基によって置換されたアル
キル基。適当なアラルキル基には、随意に置換されてい
てもよいベンジル基およびピコリル基等が含まれる。

「メチレン」…−CH₂−。

「アルキレン」…２価の直鎖状または分枝鎖状の飽和
脂肪族残基。

さらに、以下の略語は次の意義を有する。

「Ala（Tzl）_２…（Ｒ）−３−テトラゾリル−２−ア
ミノプロピオン酸。

「Arg−al」…Ｌ−アルギニナル。

「Asp」…Ｌ−アルパラギン酸。

「Asp（OCH₃）」…Ｌ−アスパラギン酸β−メチルエ
ステル。

「Bn」…ベンジル。

「Boc」…ｔ−ブトキシカルボニル。

「BocPro−OH」…Ｎ−Boc−Ｌ−プロリン。

「Bom」…ベンジルオキシメチル。

「BOP」…ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−ト
リス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム−ヘキサフル
オロホスフェート。

「ブライン（Brine）」…塩化ナトリウムの飽和水溶
液。

「Cbz」…ベンジルオキシカルボニル。

「CDI」…カルボニルジイミダゾール。

「ChxAc」…１−シクロヘキシルアセチル。

「ChxPA」…３−シクロヘキシルプロパノイル。

「DCM」…ジクロロメタン。

「DIEA」…ジイソプロピルエチルアミン。

「DMF」…N,N−ジメチルホルムアミド。

「EtOAc」…酢酸エチル。

「Fm」…９−フルオレンメチル。

「HCA」…３−フェニルプロパノイル。

「IPA」…イソプロパノール。

「αMeHCA」…２−メチル−３−フェニルプロパノイ
ル。

「MeOH」…メタノール。

「4MeV」…４−メチルペンタイノル。

「NaOAc」…酢酸ナトリウム。

「NMM」…４−メチルモルホリン。

「Oct」…オクタノイル。

「Ph」…フェニル基。

「Pro」…Ｌ−プロリン。

「2PrPent」…２−プロピルペントイル。

「TEA」…トリエチルアミン。

「TFA」…トリフルオロ酢酸。

「THF」…テトラビトロフラン。

図面の簡単な説明 図１は、本発明による１種または２種以上の化合物を
調製するのに使用した固相試薬の製造法を示す反応スキ
ームである。図１において、Bnはベンジルを示し、ｔ−
Buはｔ−ブチルを示し、Bocはｔ−ブトキシカルボニル
を示す。

図２は、本発明による１種または２種以上の化合物の
調製に用いた化合物の合成法を示す反応キームである。
図２において、「ｉ」は「pTsOH/FmOH、トルエン／還
流」を示し、「ii」は「Boc−Asp−β−ベンジルエステ
ル/BOP/NMM/DMF」を示し、「iii」は「トリエチルアミ
ン／還流」を示す。

図３は、本発明による化合物の液相法による合成例を
示す反応スキームである。図３において、「ｉ」は「CD
I/t−ブチルカルバゼート」を示し、「ii」は「TFA/DC
M」を示し、「iii」は「（１）/NaOAc」を示し、「iv」
は「遊離酸（例えば図２の（23））としての保護ペプチ
ド（または類似体）/BOP/NMM/DMF」を示し、「ｖ」は
「H₂/Pd」を示し、「vi」は「H₃O⁺」を示し、「vii」は
「トリメチル酢酸/DCC/1−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル/DMF」を示す。あるいは、図３において、「ｖ」が
「HF/アニソール」を示し、「vi」が「ホルムアルデヒ
ド/H₃O⁺」を示してもよい。

好ましい態様の詳細な説明 好ましい化合物 好ましい観点によれば、本発明は次式： AcR−A₁−Ｌ−Pro−Arg−al （式中、AcRは疎水性アシル基を示し、A₁はグルタミン
酸（Glu）もしくはアスパラギン酸（Asp）またはGluも
しくはAspの等価物を示す）で表わされ、トロンビンお
よび／または因子X aに対して約200nMもしくはそれ以下
のIC₅₀を有し、また、プラスミンに対して、トロンビン
もしくは因子X aに対する比較的小さなIC₅₀よりも大き
なIC₅₀を有する化合物に関する。

「透過物」は、アミノ酸の一般式A₁または疎水性アシ
ル基の変形物であって、所定のアミノ酸または疎水性ア
シル基の使用と比べて、当該化合物の阻害能に有害な影
響をほとんど及ぼさない変形物を含むことを意味する。
一般に、適当な疎水性アシル基は、アシル（カルボニ
ル）炭素原子のほかに、少なくとも約５個の炭素原子を
有し、また、有効な阻害能を発揮するのに十分な疎水性
を有する。GluまたはAspはカルボキシル化された非環式
アミノ酸およびその等価物である。このような等価物に
は、グルタミン酸のγ−Ｒ′エステル、アスパラギン酸
のβ−Ｒ′エステルまたはGluもしくはAspのカルボン酸
基の代わりにテトラゾールが置換されたＲ′−置換テト
ラゾールが含まれる。この場合、Ｒ′は水素原子、炭素
原子数１〜６の低級アルキル基または炭素原子数約６〜
約15のアラルキル基を示す。

本発明の一つの観点によれば、特定のペプチドアルデ
ヒドのＮ−アシル誘導体が提供される。この種の化合物
は次式（Ｉ）で表わされる： 式（Ｉ）で表わされる好ましい化合物には、R₃が−
（CH₂）_３−NH−Ｃ（＝NH）−NH₂である化合物、即ち、
P1がＬ−アルギニナルである化合物が含まれる。また、
別の好ましい化合物にはP2残基がＬ−プロリンである化
合物が含まれる。さらにまた、別の好ましい化合物に
は、ｍが１または２であり、 R₃が−CO₂R′、 （Ｒ′は水素原子、炭素原子数約１〜約６の低級アルキ
ル基または炭素原子数約４〜約14のアラルキル基を示
す）を示す化合物が含まれる。特に好ましい化合物は、
Ｒ′が水素原子またはメチル基を示す化合物である。

本発明による好ましい化合物にはP4基がＮ−アシル基
である化合物が含まれる。好ましいP4残基には、R₁が炭
素原子数約５〜約10のアルキル基、炭素原子数約６〜約
12のアリール基によって置換された炭素原子数約１〜約
３のアルキル基、または炭素原子数約５〜８の環状アル
キル基によって置換された炭素原子数約１〜約３のアル
キル基を示す化合物である。特に好ましい化合物には、
アリール基がフェニル基である化合物または環状アルキ
ル基がシクロヘキサンである化合物が含まれる。式
（Ｉ）で表わされる好ましい化合物には下記の化合物が
含まれる： 特に好ましい化合物には下記の化合物が含まれる： 式（Ｉ）で表わされる好ましい化合物には、薬学的に
許容されるこれらの塩も含まれる。「薬学的に許容され
る塩」には、式（Ｉ）で表わされる化合物と有機酸もし
くは無機酸との組合せから誘導される化合物の塩も含ま
れる。これらの塩類は、遊離の塩基および塩のいずれの
形態も有用である。実際上、塩形態の使用は塩基形態の
使用と同等であり、両方の形態の化合物は本発明に包含
される。

好ましい化合物の調製 本発明によるペプチドアルデヒドは固相法または液相
法のいずれによって合成してもよい。特定の条件下で
は、本明細書に記載の液相法が好ましい。

いずれの方法において使用する出発原料は化学薬品メ
ーカー、例えば、アルドリッチ（Aldrich）社、シグマ
（Sigma）社およびノバ・バイオケミカルズ（Nova Bio
chemicals）社等からの市販品として容易に入手し得
る。

これらの化合物の合成工程において、これらの方法に
おいて用いるアミノ酸誘導体の官能基は保護基によって
保護し、カップリング反応中における交差反応を防止す
る。適当な保護基の例とこれらの用法は次の文献に記載
されており、該記載内容も本明細書の一部を成すもので
ある： 「ザ・ペプタイズ：アナリシス、シンセシス、バイオ
ロジー」、アカデミックプレス、第３巻（グロスおよび
マイエンホーファー編、1981年）および第９巻（ウデン
フリエンドおよびマイエンホーファー編、1987年）。

本発明によるペプチドアルデヒド誘導体は後述の文献
に記載の方法によって合成してもよく、あるいは、ウェ
ッブによる1991年12月13日付の米国特許出願第07/807,4
74号明細書に記載された固相合成試薬と合成法によるア
ミノ酸誘導体の逐次的化学結合法によって合成してもよ
い（該明細書の当該開示内容も本明細書の一部を成すも
のである）。

図１に、固相合成法によってアミノ酸誘導体が結合さ
れる固相試薬の合成法を示す。以下の実施例８に示すよ
うに、本発明による化合物の中間体を、ホルムアルデヒ
ド（TFA溶媒）を用いる処理によって固相から脱離させ
た後、活性炭に担持したPd触媒上での水素化による脱保
護によって、本発明による化合物を調製することができ
る。あるいは、実施例14と15に示すように、本発明によ
る化合物は、HF/アニソールを用いる処理によって、脱
保護セミカルバゾンの形態で固相から脱離させ、次い
で、該セミカルバゾンを希塩酸中でホルムアルデヒドを
用いて処理することによって本発明による化合物に変換
させる。

本発明によるペプチドアルデヒドは溶液相法によって
合成してもよい。好ましい方法の概要を図２および図３
に示す。図２は、本発明による化合物の合成に用いる化
合物の合成プロセスを示す。図３は、本発明による化合
物を溶液相で合成するための好ましいプロセスを示す。
ペプチドアルデヒドを溶液合成する別の方法は、例え
ば、次の文献に記載されている： マッコネルらの前記文献、第87頁および該文献の引用
文献、 バジャスツら、J.Med.Chem.、第33巻、第1729頁（199
0年）、 カワムラら、Chem.Pharm.Bull.、第17巻、第1902頁
（1969年）、および ソメノら、Chem.Pharm.Bull.、第34巻、第1748頁（19
86年）。

有用性および製剤 本発明による化合物は、トロンビンまたは因子X aを
阻害するが、プラスミンは実質的に阻害しないことによ
って特徴づけられる。

本発明による化合物を緩衝液中に溶解させることによ
って、アッセイ濃度が０〜100μＭの溶液を調製する。
トロンビン、因子X aおよびプラスミンに対するアッセ
イにおいては、発色性の合成基質を、被験化合物と問題
となる酵素を含有する溶液に添加し、該酵素の残余の触
媒活性を分光光度法によって測定する。化合物のIC₅₀は
基質の代謝回転から決定される。IC₅₀は、基質の代謝回
転の50％を阻害する被験化合物の濃度である。本発明に
よる化合物は、トロンビンまたは因子X aのアッセイに
おいては、好ましくは約200nMのIC₅₀を有するが、プラ
スミンのアッセイにおいては、トロンビンと因子X aに
対する比較的小さなIC₅₀よりも小さくないIC₅₀を有する
のが好ましい。好ましい化合物は、トロンビンもしくは
因子X aのアッセイまたは両方のアッセイにおいて、約1
00nMもしくはそれ以下のIC₅₀を示す。

本発明には、異常な血栓症によって特徴づけられる哺
乳類に治療上有効量の本発明による化合物または薬剤組
成物を投与することを含む、該哺乳類の予防または治療
方法が含まれる。

投与に必要な該組成物の治療上有効な量は、投与経
路、被処置哺乳類の種類、および問題となる特定の哺乳
類の身体的特徴等によって左右される。これらの要因お
よび投与量を決定する該要因との関係は、医学の分野に
おける当業者にとっては周知である。

異常な血栓症によって特徴づけられる症状には、動脈
管系および静脈管系のものが含まれる。

冠状動脈管系に関しては、異常な血栓形成は、急性心
筋梗塞および不安定アンギナの主要な原因である確立さ
れたアテローム性動脈硬化性プラグの破裂、並びに血栓
融解療法またはPTCAの結果もたらされる閉塞性の環状血
栓形成によって特徴づけられる。

静脈管系に関しては、異常な血栓形成は、四肢の下部
または腹部領域において大手術を受ける患者であって、
冒された四肢への血流の低減と肺塞栓症へ導く疾病素質
をもたらす静脈血管系に形成される血栓で患っている患
者においてみられる症状によって特徴づけられる。異常
な血栓形成はまた、敗血症ショック、特定のウイルス性
感染および癌で患っているときにいずれの血管系におい
てもみられる散在性の血管内凝固障害、並びに凝固因子
の急激な消費および広範囲に及ぶ器官不全症へ導く微細
血管系内での生命の危険をもたらす血栓形成がみられる
症状によって特徴づけられる。

本発明による薬剤組成物は、経口投与用には錠剤、カ
プセル剤またはエリキシル剤として、直腸内投与用には
坐薬として、注射投与用には無菌溶液または懸濁液とし
て製材化して使用してもよい。投与量および投与方法は
最適な効能が得られるように適合させてもよいが、体
重、ダイエット、同時投薬および医学の分野における当
業者が認識している他の因子によって左右される。

本発明によって選択開示された化合物は、トロンビン
および因子X aからのトロンビンの発生のインヒビター
として有効であると共に、異常な血栓症によって特徴づ
けられる症状の予防または治療にも有効である。

本発明には、薬学的に許容されるキャリヤーまたは希
釈剤に本発明にる化合物を治療上有効な量配合した貯蔵
用または投与用組成物が含まれる。治療用に許容される
キャリヤーまたは希釈剤は薬学の分野においては周知で
あり、例えば、「レミングトンズ・ファーマシューティ
カル・サイエンシズ」（マック・パブリッシング社発
行、；ジェンナロ編、1985年）に記載されている。防腐
剤、安定剤、染料および香味剤を該薬剤組成物に配合し
てもよい。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、
およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを防腐剤とし
て添加してもよく、さらに、抗酸化剤および沈澱防止剤
を配合してもよい（上記文献、第1449頁参照）。

本発明方法を実施するに際しては、上記の化合物また
は組成物を単独で使用してもよく、また、併用してもよ
く、さらに、他の治療剤または診断剤と併用してもよ
い。これらの化合物は生体内（通常は哺乳類の体内）、
好ましくはヒトの体内で使用してもよく、あるいは生体
外で使用してもよい。これらの化合物を生体内使用する
場合には、該化合物または組成物を種々の方法、例え
ば、非経口投与法、静脈内投与法、皮下投与法、筋肉内
投与法、結腸内投与法、直腸内投与法、鼻腔内投与法ま
たは腹腔内投与報等によって、種々の投与形態で投与す
ればよい。当業者には明らかなように、有効な生体内投
与量および特定の投与形式は処置される哺乳類の年令、
体重および種、使用する化合物の種類および該化合物を
使用する特定の用途等によって左右される。有効投与
量、即ち、所望の効能を得るのに必要な投与量の決定法
は当業者の技術的範囲内の事項である。典型的には、化
合物の投与量は、比較的低い量から始め、所望の効能が
得られるまで増量して決定される。

本発明による化合物の投与量は、所望の効能や治療的
な指示に応じて広範囲に変化させることができる。典型
的には、投与量は約0.01〜100mg/kg（体重）、好ましく
は約0.01〜10mg/kg（体重）である。好ましい投与は一
日ずつの投与量を非経口投与、例えば静脈内投与する方
法である。

注射形態の製剤は常套の形態、例えば、液状溶液また
は懸濁液、注射前に溶液または懸濁液にするのに適した
固体状形態、またはエマルション形態に調製することが
できる。適当なエキシピエントとしては、水、塩類液、
デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチ
ン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウムおよびシステ
インハイドロクロリド等が例示される。さらに、所望に
より、注射可能な薬剤組成物は少量の非毒性の補助物
質、例えば、湿潤剤およびpH緩衝剤等を含有していても
よい。また、所望により、吸収促進剤、例えば、リポソ
ーム等を使用してもよい。

本発明を理解するのを補助するために、以下の実施例
において一連の実験の結果を説明する。本発明に関する
以下の実施例は本発明の範囲を特に限定するものではな
く、当業者が理解し得る範囲内において、現在知られて
おり、また今後開発される本発明の種々の変形態様も、
本明細書に開示されて以下の請求の範囲に記載されてい
る本発明に包含されるものである。

本発明を以下の実施例においてさらに説明する。実施
例１〜７の概要を図１に示す。

実施例１ α−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−N^g−ニトロアルギニ
ナルの製造 A.方法１ α−ｔ−ブトキシカルボニル−N^g−ニトロアルギニナ
ル（１）の合成のための以下の方法は、Boc−アミノ酸
アルデヒドの一般的製造法の例である。パテル等、Bioc
him.Biophys.Acta.、第748巻、第321頁〜第330頁（1983
年）参照。Boc−N^g−ニトロ−アルギニン12.7（40ミリ
モル）およびカルボニルジイミダゾール（CDI）7.0g（4
3ミリモル）を、室温で乾燥テトラヒドロフラン（THF）
200mLに加え、30分間撹拌した、反応混合物を−78℃に
冷却し、LiAlH₄の1M−THF溶液35mLを30分間かけて滴下
した。反応は−78℃において撹拌下で更に１時間行っ
た。次に、アセトン18mLを加え、混合物を素早く1NのHC
l400mLに加えた。この混合物を酢酸エチル100mLで２回
抽出した。酢酸エチル抽出物を混合し、次いで水100m
L、飽和NaHCO₃溶液100mLおよび飽和NaCl溶液100mLを用
いる洗浄処理に２回付した。得られた溶液をMgSO₄を使
用して乾燥させ、泡状物に濃縮した。α−ｔ−ブトキシ
カルボニル−N^g−ニトロアルギニナルの粗製物6.36g（2
1ミリモル；収率52％）を得た。

B.方法２ 化合物（１）は、フェーレンツおよびカストロの方法
［Shnthesis、第676頁（1983年）参照］の修正法によっ
て合成した。

Ｎ−メチルペリジン11.4mLを、約０℃に冷却したジク
ロロメタン75mL中にN,O−ジメチルヒドロキシルアミン
8.42g（94ミリモル）を加えた懸濁液に撹拌下でゆっく
りと加えた。溶液を20分間撹拌して、遊離のヒドロキシ
ルアミンを生成させ、次の工程において使用のために冷
却保存した。

別のフラスコ中において、Boc−N^g−ニトロアルギニ
ン30.0g（94ミリモル）をテトラヒドロフラン約1400mL
中に加熱溶解させ、該溶液を窒素雰囲気下で０℃まで冷
却した。Ｎ−メチルピペリジン11.4mLおよびイソブチル
クロロホルメート12.14mL（94ミリモル）を加え、混合
物を10分間撹拌した。先に製造したヒドロキシルアミン
を一時に加え、反応混合物を室温まで暖めた後、一夜撹
拌した。

生じた沈澱を濾取し、ついでテトラヒドロフラン200m
Lで洗浄した。濾液を真空下で約150mLまで濃縮後、酢酸
エチル200mLを加え、続いて氷で溶液を冷却した。冷却
した酢酸エチル相を、0.2Nの塩酸を75mLずつ用いて２回
洗浄し、次に0.5N水酸化ナトリウム溶液を75mLずつ用い
て２回洗浄した後、ブライン75mLで１回洗浄し、次いで
無水硫酸マグネシウムを用いて有機相を乾燥した。真空
下で濃縮することによって、固体状のBoc−N^g−ニトロ
アルギニン−Ｎ−メチル−Ｏ−メチルカルボキサミド2
2.7g（収率70％）を得た。ジクロロメタンとメタノール
の9:1混合液を用いるシリカゲル上での薄層クロマトグ
ラフィー分析は１つの斑点を示した。

フラスコを窒素雰囲気下で、−50℃まで冷却し、次い
で1N水素化アルミニウムリチウムのテトラヒドロフラン
溶液70mL（70ミリモル）および乾燥テトラヒドロフラン
500mLを入れた。乾燥テトラヒドロフラン中にBoc−N^g−
ニトロアルギニン−Ｎ−メチル−Ｏ−メチルカルボキサ
ミド66ミリモルを含む溶液50mLをゆっくり加えた。この
場合、反応混合物の温度は−50℃に維持した。冷却剤の
除去により０℃まで反応混合物を暖めた後、これを−30
℃まで再冷却し、この温度で2N硫酸水素カリウム溶液10
0mL（0.2モル）を約10〜15分間撹拌しながら加えた。反
応混合物を次いで室温で２時間撹拌した。沈澱を濾取
後、濾液を真空下で100mLまで濃縮した。濃縮物を酢酸
エチル800mL中に注ぎ、これを1N塩酸を50mLずつ用いて
２回洗浄し、次に飽和炭酸水素ナトリウム溶液を50mLず
つ用いて２回洗浄した後、ブライン50mLで１回洗浄し
た。一緒にした水性抽出物を酢酸エチルを100mLずつ用
いて３回抽出した。酢酸エチルの全洗浄液を一緒にし、
これを無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥した。混合物
を真空下で濃縮することによって、化合物（１）を18.5
g（収率:95％）得た。

実施例２ トランス−４−（アミノメチル）−シクロヘキサンカル
ボン酸ベンジルエステル−パラ−トルエンスルホネート
塩の製造 トランス−４−（アミノメチル）−シクロヘキサンカ
ルボン酸50g（0.318モル）、ｐ−トルエンスルホン酸6
1.7g（0.324モル）、ベンジルアルコール250mL（2.4モ
ル）およびトルエン250mLを混合し、撹拌した。混合物
を24時間還流し、遊離水をディーン−スターク装置を用
いて共沸除去した。透明な溶液を５時間還流後に得た。
該溶液を室温まで冷却し、生成物を結晶化した。混合物
を真空濾過処理に付した後、エーテルで洗浄し、次いで
真空乾燥器中で乾燥させることによって標記化合物を12
8.12g（収率96％）得た。

¹H−NMR（CD₃OD）δ:1.05（m,2H）、1.43（m,2H）、
1.59（m,1H）、1.85（m,2H）、2.03（m,2H）、2.33（m,
1H）、2.35（s,3H）、2.75（d,2H）、5.09（s,2H）、7.
23（d,2H）、7.32（m,5H）、7.69（d,2H）。

融点:154〜156℃。

グリーンスタインおよびヴィニッツの報文［ケミスト
リー・オブ・ジ・アミノ・アシッズ、第２巻、第942頁
（1986年）］参照。

実施例３ １−ｔ−ブトキシカルボニル−セミカルバジディル−ト
ランス−４−メチルシクロヘキサンカルボン酸ベンジル
エステルの製造 カルボニルジイミダゾール（CDI）3.24g（0.02モル）
を窒素雰囲気下で室温においてジメチルホルムアミド
（DMF）45mLに溶解させた。DMF45mLにｔ−ブチルカルバ
ゼード2.48g（0.02モル）を加えた溶液を滴下した。固
体状ベンジルエステル（２）8.38g（0.02モル）を加
え、次いでトリエチルアミン（TEA）3.06mLを30分間か
けて滴下した。反応は窒素雰囲気下で室温において、撹
拌下で１時間行った。水（100mL）を加え、混合物を酢
酸エチル50mLで３回抽出した。酢酸エチル層を合わせ
て、これを1N HCl、H₂O、NaHCO₃溶液およびNaCl溶液を
順次75mLずつ用いる抽出処理に２回付し、次いでMgSO₄
を用いて乾燥させた。混合物を濾過し、濾液を濃縮し
て、油状物を得た。該油状物は、酢酸エチル／ヘキサン
混合溶媒を用いる再結晶により精製した（融点:106〜10
8℃）。該油状物は次の工程において直接使用してもよ
い。

¹H−NMR（CDCl₃）δ:0.94（m,2H）、1.42（m,2H）、
1.45（s,9H）、1.81（m,2H）、2.02（m,2H）、2.27（m,
1H）、3.17（t,2H）、5.09（s,2H）、5.51（t,1H）、6.
46（s,2H）、7.34（m,4H）。

実施例４ １−（ｔ−ブトキシカルボニル）−３−セミカルバジデ
ィル−トランス−４−メチル−シクロヘキサンカルボン
酸の製造 上記の実施例３で得られた粗製Boc−ベンジルエステ
ル（３）に、メタノール（MeOH）250mLおよび活性炭に
パラジウムを10％担持させた触媒500mgを加えた。水素
圧5psigの条件下において、ヒドロゲネーターを用いて
１時間振盪後、混合物を微細ガラス濾過器を通してセラ
イトで濾過した。濾液を濃縮し泡状物とし、これにメチ
レンクロリドを加え、沈澱を形成させた。混合物を５℃
で65時間保管した。結晶化した試料をエーテルで濾過
し、標記化合物を粗生成物として4.0g（12.7ミリモル；
化合物（２）からの全収率62％）得た。

¹H−NMR（CD₃OD）δ:0.96（m,2H）、1.42（m,2H）、
1.46（s,9H）、1.82（m,2H）、1.97（m,2H）、2.18（m,
1H）、3.0（t,2H）。

融点:185〜189℃。

実施例５ セミカルバジディル−トランス−４−メチルシクロヘキ
サンカルボン酸トリフルオロアセテート塩の製造 化合物（４）315mg（１ミリモル）を、０℃でトリフ
ルオロ酢酸（TFA）10mLに加え、得られた溶液を30分間
撹拌した、その後、溶液をエーテル75mLに滴下した。生
成した沈澱物を混合物から濾別し、エーテルで洗浄する
ことによって標記化合物を組成物として254mg（0.77ミ
リモル）得た（収率:77％）。

¹H−NMR（CD₃OD）δ:1.0（m,2H）、1.38（m,2H）、1.
43（m,1H）、1.84（m,2H）、2.01（m,2H）、2.22（m,1
H）、3.04（d,2H）。

融点:154〜156℃。

実施例６ ａ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−N^g−ニトロアルギニ
ナル−セミカルバゾニル−トランス−４−メチルシクロ
ヘキサンカルボン酸の製造 水45mLを含むエタノール135mL中に化合物（５）13.7g
（41.6ミリモル）および粗製化合物（１）18.0g（約59
ミリモル）含む溶液を、NaOAc9.41g（69ミリモル）で処
理し、１時間還流した。この溶液を冷却した後、0.1NHC
l中へ注ぎ、酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機
相をブラインを用いて順次洗浄した後、MgSO₄で乾燥
し、次いで濃縮した。この濁った混合物を５℃で一夜放
置して、生成物を沈澱させ、該生成物を濾過により分離
した後、真空下で乾燥することによって標記化合物を9.
9g得た（（５）に基づく収率:47％）。

¹H−NMR（CD₃OD）δ:1.0（m,2H）、1.43（s,9H）、1.
45−2.20（m,13H）、3.09（d,2H）、3.30（m,2H）、4.1
8（bs,1H）、7.10（d,1H）。

融点:162〜163℃。

実施例７ セムカルバゾン固相の合成 固相試薬（７）を、反応容器中にメチル−ベンズヒド
ラルアミン（MBHA）樹脂0.8g（0.5ミリモル、0.62g/モ
ル）を入れ、ジクロロメタン（DCM）で１回、ジメチル
ホルムアミド（DMF）で３回、10％ジイソプロピルエチ
ルアミン（DIEA）/DMFで２回、およびDMFで４回洗浄す
ることにより製造した（これらの洗浄処理は、いずれも
洗浄液10mLを用いて撹拌下で１〜２分間行う）。DMF5m
L、４−メチルモルフォリン（102μｌ）１ミリモル、ベ
ンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ジメチ
ルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
（BOP試薬）（443mg）１ミリモル、および化合物（６）
（500mg）１ミリモルを加え、回転輪を用いて16時間混
合し、次いでDMFで３回、10％DIEA/DMFで２回およびDMF
で３回洗浄した。得られた樹脂は、DCM、メタノール、
およびエーテルを用いて順次洗浄した。

得られた樹脂（７）は、ニンヒドリンにより98〜99％
のカップリング収率を示した。

この樹脂のＮ−末端は、以下の実施例に示すように、
常套のペプチドシンセサイザーを用い、標準的なｔ−Bo
c法の手順に従って、アミノ酸またはアミノ酸類似物に
よって延長した。ペプチド類似体の合成は、アプライド
・バイオシステムズ社製430A型ペプチドシンセサイザー
を使用し、該430A型のユーザーマニュアルに記載のｔ−
Bocの化学的条件下において行った。得られた保護ペプ
チドアルデヒドはホルムアルデヒドを用いてキャリィヤ
ーから切断することができ、また水素/Pdを用いて脱保
護することができる。ニトロ基は、アルデヒドの還元を
伴うことなくグアニジン基から除去し得る。

実施例８ Ｎ−（４−メチルペンタノイル）−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルの調製 アプライド・バイオシステムズ社製430A型ペプチドシ
ンセサイザーを使用してペプチドアルデヒド（８）を合
成した。使用したBocの化学的条件は該装置のユーザー
マニュアルに記載の条件に従った。

Boc保護基を50％トリフルオロ酢酸（ジクロロメタン
溶媒）を用いる処理により除去することによって樹脂
（７）0.500gを使用のために調製した。洗浄し、10％ジ
イソプロピルエチルアミン（ジクロロメタン溶媒）を用
いて処理することによって酸性度を中和した後、以下の
手順に従って、市販のBoc−保護アミノ酸をキャリヤー
試薬（およびアミノ酸キャリヤー延長鎖）にカップリン
グさせた。

Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンをジシクロヘキシルカルボジ
イミドと１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ジメチル
ホルムアミド溶媒）を用いて樹脂に結合させ、次いで50
％トリフルオロ酢酸（ジクロロメタン溶媒）を用いて処
理することによってBoc保護基を除去し、洗浄後、10％
ジイソプロピルエチルアミン（ジクロロメタン溶媒）を
用いて酸性度を中和した。同様にして、Ｎ−Boc−Ｌ−
アスパラギン酸−β−ベンジルエステルをカップリング
させ、脱保護処理を行った。４−メチル吉草酸を、ジシ
クロヘキシルカルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾト
リアゾール（ジメチルホルムアミド溶媒）を用いて、固
相上のペプチドにカップリングさせた。

テトラヒドロフラン5mL、酢酸1mL、ホルムアルデヒド
1mLおよび1NのHCl0.100mLから成る混合物を用いて、撹
拌下で１時間処理することによってペプチドアルデヒド
を固相から離脱させた。この混合物を濾過処理に付した
後、樹脂をテトラヒドロフラン10mLを用いて洗浄した。
全濾液を水100mLを用いて希釈した後、酢酸エチルを用
いて抽出した。酢酸エチル相をNaCl飽和水溶液を用いて
洗浄し、硫酸マグネシウムを用いて乾燥した後、真空下
で濃縮した。

ペプチドアルデヒドのベンジル保護基とニトロ保護基
を脱離させるために、濃縮したペプチドアルデヒドを水
10％含有メタノール10mL、1N HCl0.300mLおよび活性炭
担持パラジウム触媒0.200gから成る混合物に加えた後、
水素（5psi）を用いて45分間処理した。この混合物をセ
ライト（Celite）を有する微細なガラスフィルターを用
いる濾過処理に付し、濾液を水10％含有メタノールを用
いて洗浄した後、濃縮することによって粗製ペプチドア
ルデヒドを得た。

得られたペプチドアルデヒドを逆相HPLC（粒径10ミク
ロンで、孔径300オングストロームのＣ−18カラム）を
用いて精製した。この場合、トリフルオロ酢酸を0.1％
ずつ含む水とアセトニトリルを用いる傾斜溶離を行った
（アセトニトリル:5〜40％）。カラム留分を分析用HPLC
を用いて分析し、純粋な生成物を含有する留分を捕集
し、凍結乾燥して生成物（８）を得た。ファブ（FAB）
質量分析による生成物の分子量は468.2a.m.u.であった
（計算分子量:468.3a.m.u.）。

実施例９ Ｎ−オクタニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−プロリル−Ｌ
−アルギニナルの調製 ペプチドアルデヒド（９）を、実施例８に記載の手順
に準拠して合成し、精製した。

Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた
後、Ｎ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベンジルエス
テルを結合させた。50％トリフルオロ酢酸（ジクロロメ
タン溶媒）を用いる処理によってｔ−Boc保護基を脱離
させ、次いで、酸性度を洗浄によって中和した後、４−
メチル吉草酸の代わりにオクタン酸を固相上のペプチド
にカップリングさせた。さらに、脱保護して精製するこ
とによって標記化合物を得た。ファブ質量分析による生
成物の分子量は496.3a.m.u.であった（計算分子量:496.
3a.m.u.）。

実施例10 Ｎ−（３−フェニルプロパニル）−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルの調製 ペプチドアルデヒド（10）を、実施例８に記載の手順
に準拠して合成し、精製した。

Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた
後、Ｎ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベンジルエス
テルを結合させた。50％トリフルオロ酢酸（ジクロロメ
タン溶媒）を用いる処理によってｔ−Boc保護基を脱離
させ、次いで、酸性度を洗浄によった中和した後、４−
メチル吉草酸の代わりに３−フェニルプロピオン酸を固
相上のペプチドにカップリングさせた。さらに、脱保護
して精製することによって標記化合物を得た。ファブ質
量分析による生成物の分子量は502.2a.m.u.であった
（計算分子量:502.3a.m.u.）。

実施例11 Ｎ−（＋／−）−２−メチル−３−フェニルプロパノイ
ル）−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニ
ナルの調製 ペプチドアルデヒド（11）を、実施例８に記載の手順
に準拠して合成し、精製した。

Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた
後、Ｎ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベンジルエス
テルを結合させた。50％トリフルオロ酢酸（ジクロロメ
タン溶媒）を用いる処理によってｔ−Boc保護基を脱離
させ、次いで、酸性度を洗浄によって中和した後、４−
メチル吉草酸の代わりに、（＋／−）−２−メチル−３
−フェニルプロピオン酸を固相上のペプチドにカップリ
ングさせた。さらに、脱保護して精製することによって
標記化合物を得た。ファブ質量分析による生成物の分子
量は516.3a.m.u.であった（計算分子量:516.3a.m.
u.）。

実施例12 Ｎ−（１−シクロヘキシルアセチル）−Ｌ−アスパルチ
ル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルの調製 ペプチドアルデヒド（12）を、実施例８に記載の手順
に準拠して合成し、精製した。

Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた
後、Ｎ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベンジルエス
テルを結合させた。50％トリフルオロ酢酸（ジクロロメ
タン溶媒）を用いる処理によってｔ−Boc保護基を脱離
させ、次いで、酸性度を洗浄によって中和した後、４−
メチル吉草酸の代わりに、シクロヘキサン酢酸を固相上
のペプチドにカップリングさせた。さらに、脱保護して
精製することによって標記化合物を得た。ファブ質量分
析法による生成物の分子量は494.5a.m.u.であった（計
算分子量:494.6a.m.u.）。

実施例13 Ｎ−（３−フェニルプロピオニル）−Ｌ−グルタミル−
Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルの調製 ペプチドアルデヒド（13）を、実施例８に記載の手順
に準拠して合成し、精製した。

Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた
後、Ｎ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベンジルエス
テルの代わりにＮ−Boc−Ｌ−グルタミン酸−β−ベン
ジルエステルを結合させた。50％トリフルオロ酢酸（ジ
クロロメタン溶媒）を用いる処理によってｔ−Boc保護
基を脱離させ、次いで、酸性度を洗浄によって中和した
後、４−メチル吉草酸の代わりに、３−フェニルプロピ
オン酸を固相上のペプチドにカップリングさせた。さら
に、脱保護して精製することによって標記化合物を得
た。ファブ質量分析法による生成物の分子量は516.2a.
m.u.であった（計算分子量:516.3a.m.u.）。

本発明による化合物の中間体を固相から脱離させる別
の方法は実施例14および15において説明する。

実施例14 Ｎ−（３−シクロヘキサンプロピオニル）−Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナル−セミカルバ
ゾニル−トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカ
ルボキサミドの調製 実施例８に記載の手順に準拠して、化合物（14）を樹
脂（７）上で合成した。

Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた
後、Ｎ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベンジルエス
テルを結合させた。50％トリフルオロ酢酸（ジクロロメ
タン溶媒）を用いる処理によってｔ−Boc保護基を脱離
させ、次いで、酸性度を洗浄によって中和した後、４−
メチル吉草酸の代わりに３−シクロヘキサンプロピオン
酸を固相上のペプチドにカップリングさせた。

MBHA（メチルベンズヒドリルアミン）樹脂に保持され
たペプチド300mgを秤量してテフロン製円筒状反応容器
に入れ、アニソール300μＬを添加した後、反応フラッ
シュをねじ山を介してHF装置に取り付けた。無水HFを−
20℃で容器内に凝縮させた。反応混合物を−20℃で0.5
時間磁気的に撹拌させ、０℃まで昇温させた後、さらに
１時間撹拌を続行した。HFを窒素気流で除去した後、粗
製生成物を0.1N炭酸水素アンモニウム溶液50mLを用いて
樹脂から抽出した。この水性抽出物をジエチルエーテル
を用いて洗浄し（３×25ml）、凍結させ、次いで、凍結
乾燥させることによって、粗製生成物を白色泡状物とし
て得た。このセミカルバゾンを逆相HPLC（粒径10ミクロ
ンで孔径300オングストロームのＣ−18カラムを使用）
を用いて精製した。この場合、水（15mM炭酸水素アンモ
ニウム含有水;pH7.1）−アセトニトリルを用いる傾斜溶
離を行った（アセトニトリルの濃度は45分間で15％から
40％に変化させた）。カラム留分を分析用HPLCを用いて
分析し、生成物含有フラクション（保持時間:18分間）
を捕集し、凍結させ、次いで凍結乾燥させることによっ
て白色粉末を60mg（0.085ミリモル）得た。

実施例15 Ｎ−（３−シクロヘキサンプロピオニル）−Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナル セミカルバゾン（14）60mg（0.085ミリモル）を、TFA
水溶液（pHを１に緩衝化した水溶液）14.1mLと37％ホル
ムアルデヒド（8.5ミリモル、100当量）636μＬとの混
合物を用いて処理した。この処理混合物を23℃で0.5時
間撹拌した後、0.2μｍフィルターを用いて濾過した
後、逆相HPLC（粒径が10ミクロンで孔径が300オングス
トロームのＣ−18カラムを使用）を用いて精製した。こ
の場合、水（0.1％トリフルオロ酢酸含有）−アセトニ
トリルを用いる傾斜溶離を行った（アセトニトリルの濃
度は45分間で10％から30％に変化させた。カラム留分を
分析用HPLCを用いて分析し、生成物含有留分（保持時
間:17分間）を捕集し、凍結乾燥後、標記化合物を20mg
（0.039ミリモル）得た。該生成物のマススペクトル分
析において、Ｍ＋１のピークは509.2a.m.u.に現れた。

実施例16 Ｎ−（２−プロピルペンタノイル）−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルの調製 ペプチドアルデヒド（16）を、実施例14および15に記
載の手順に準拠して合成し、樹脂から脱離させ、脱保護
し、精製した。

Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた
後、Ｎ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベンジルエス
テルを結合させた。50％トリフルオロ酢酸（ジクロロメ
タン溶媒）を用いる処理によってｔ−Boc保護基を脱離
させた後、酸性度を洗浄により中和させ、次いで、４−
メチル吉草酸の代わりに２−プロピルペンタン酸を固相
上のペプチドにカップリングさせた。さらに、脱保護し
て精製することによって標記化合物を得た。ファブ質量
分析法による生成物の分子量は496.2a.m.u.であった
（計算分子量:496.3a.m.u.）。

本発明による特定の化合物の液相合成法は実施例17〜
46において説明する。

実施例17 １−ｔ−ブトキシカルボニル−セミカルバジディル−４
−ジフェニルメタンの調製 ジメチルホルムアミド（DMF）255mL中にカルボジニル
イミダゾール（CDI）16.2g（0.10モル）加えた溶液を室
温で調製し、窒素雰囲気下で撹拌した。DMF255mL中にｔ
−ブチルカルバゼート13.2g（0.100モル）加えた溶液を
30分間かけて滴下した。次いで、DMF100mLにジフェニル
メチルアミン18.3g（0.10モル）加えた溶液を30分間か
けて滴下した。反応は窒素雰囲気下、室温において、撹
拌下で１時間行った。この反応混合物に水10mLを添加
し、これを真空下で約150mLまで濃縮した。この濃縮溶
液を水500mL中に注ぎ、酢酸エチル400mLを用いて抽出し
た。酢酸エチル相を各々75mLの1N HCl、H₂O、NaHCO₃飽
和水溶液およびブラインを順次用いる抽出処理に２回付
した後、MgSO₄を用いて乾燥させた。この混合物を濾過
処理に付し、濾液を濃縮して白色泡状物を29.5g得た
（収率85％）。この生成物は酢酸エチル／ヘキサン混合
溶媒を用いる再結晶によって精製可能であったが、この
状態でも次の反応工程で直接使用するのに十分な純度で
あった［mp:142〜143℃;C₁₉H₂₃N₃O₃に対する元素分析に
計算値:C66.84、H6.79、N12.32（実測値:C66.46、H6.7
5、N12.90）］。

実施例18 セミカルバジディル−４−ジフェニルメタントリフルオ
ロアセテート塩の調製 化合物（17）3.43g（10ミリモル）をジクロロメタン1
2.5mLに加えた溶液をトリフルオロ酢酸（TFA）12.5mLを
用いて０℃で処理し、この温度において30分間撹拌した
後、この溶液をエーテル75mL中に滴下した。沈澱物を形
成させ、混合物を濾過処理に付した後、エーテルを用い
て洗浄することによって粗製生成物（mp:182〜184℃）
を2.7g得た。

実施例19 α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−N^g−ニトロ−ア
ルギニナル−セミカルバニル−４−Ｎ−ジフェニルメタ
ンの調製 化合物（18）2.65g（7.8ミリモル）および化合物
（１）（α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−N^g−ニ
トロアルギニナル）2.36を水6mL含有エタノール20mLに
加えた溶液を酢酸ナトリウム1.2g（8.8ミリモル）を用
いて処理し、１時間還流を行った。この溶液を冷却した
後、水中に注ぎ、次いで、酢酸エチルを用いて３回抽出
した。一緒にした有機相を水、0.1N HClおよびブライ
ンを用いて順次洗浄した後、MgSO₄を用いて乾燥し、次
いで、濃縮した。白色固体状残渣をアセトニトリル／エ
ーテル混合溶媒から再結晶させることによって標記化合
物（mp:78〜79℃）3.2g得た（化合物（18）に基づく収
率:78％）。

実施例20 N^g−ニトロ−アルギニナル−セミカルバゾニル−４−Ｎ
−ジフェニルメタントリフルオロアセテート塩の調製 化合物（19）0.53g（1.0ミリモル）をジクロロメタン
5mLに加えた溶液をトリフルオロ酢酸（TFA）5mLを用い
て０℃で処理し、この温度で30分間撹拌した後、この撹
拌溶液をエーテル40mL中に滴下した。沈澱物を生成さ
せ、この混合物を濾過処理に付し、エーテルを用いて洗
浄することによって、純粋な白色固体（mp:159〜160
℃）を0.51g得た（収率:97％）。

実施例21 Ｌ−プロリン−９−フルオレンメチルエステルｐ−トル
エンスルホン酸塩の調製 Ｌ−プロリン15.99g（139.0ミリモル）、９−フルオ
レンメタノール30.0g（152.9ミリモル）およびｐ−トル
エンスルホン酸をトルエン600mLに加えた溶液を還流さ
せ、水をディーン−スターク（Dean−Stark）トラップ
を用いて除去した。26時間後、反応生成物を濃縮するこ
とによって油状物を64g得た（粗収率:99％）。該油状物
は次の反応工程においてそのまま使用した。

実施例22 α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパルチ
ル−β−ベンジルエステル−Ｌ−プロリン−９−フルオ
レンメチルエステルの調製 Ｌ−プロリン−９−フルオレンメチルエステルｐ−ト
ルエンスルホン酸塩（21）15.44g（33.2ミリモル）、α
−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギン
酸−β−（ベンジルエステル）9.35g（41.9ミリモル）
およびベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−
（ジメチルアミノ）−ホスホニウム−ヘキサフルオロホ
スフェート（BOP試薬）18.6g（42.0ミリモル）をDMF100
mLに加えた溶液を氷浴中で撹拌し、この撹拌溶液を１−
ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物0.45g（3.34ミリ
モル）およびジイソプロピルエチルアミン19.0mL（198
ミリモル）を用いて処理した後、反応を撹拌下におい
て、０〜５℃で1.5時間行った。次いで、反応混合物を
酢酸エチル600mL中に注いだ後、クエン酸の飽和水溶
液、水、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液およびブライ
ンを用いて順次洗浄した。有機相をMgSO₄を用いて乾燥
した後、真空下で濃縮することによって油状物を18g得
た（粗収率:91％）。該油状物はそのまま次の反応工程
で使用した。

実施例23 α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパルチ
ル−β−（ベンジルエステル）−Ｌ−プロリンの調製 上記の粗製油状物α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニ
ル）−Ｌ−アスパルチル−β−（ベンジルエステル）Ｌ
−プロリン−９−フルオレンメチルエステル（22）17.5
g（29.2ミリモル）をトリエチルアミン250mL中に懸濁さ
せ、還流を１時間行った後、この反応混合物を油状物ま
で濃縮し、これを酢酸エチル600mLに溶解させた。酢酸
エチル相をクエン酸水溶液とブラインを用いてそれぞれ
１回ずつ洗浄し、MgSO₄を用いて乾燥させた後、濃縮し
て得られた油状物をカラムクロマトグラフィー（シリカ
ゲル、10〜20％THF/DCM）によって精製することによっ
て標記化合物を7.5g得た［化合物（21）からの全収率38
％］。

実施例24 α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパルチ
ル−β−（ベンジルエステル−Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−
ニトロアルギニナル−セミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフ
ェニルメタンの調製 α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパル
チル−β−（ベンジルエステル）−ｌ−プロリン（23）
11.29g（26.9ミリモル）をDMF60mLに溶解させた溶液を
Ｎ−メチルモルホリン（NMM）11.9mL（108ミリモル）、
BOP11.9g（27ミリモル）および化合物（20）14.64g（28
ミリモル）を用いて処理した後、撹拌下で２時間反応を
行った。反応混合物を酢酸エチル700mL中に注ぎ、1Nク
エン酸水溶液、NaHCO₃飽和水溶液、水およびブラインを
用いて順次洗浄した後、濃縮することによって泡状物を
得た。該泡状物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲ
ル、６〜20％IPA/DCM）によって精製することによって
標記化合物を12.5g得た［化合物（23）からの全収率:38
％］。

実施例25 Ｌ−アスパルチル−β−（ベンジルエステル）−Ｌ−プ
ロリル−Ｌ−N^g−ニトロ−アルギニナル−エミカルバゾ
ニル−４−Ｎ−ジフェニルメタンの調製 ０℃に冷却した50％トリフルオロ酢酸溶液（ジクロロ
メタン溶媒）にα−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−
Ｌ−アスパルチル−β−（ベンジルエステル）−Ｌ−プ
ロリル−Ｌ−^ｇ−ニトロ−アルギニナル−セミカルバゾ
ニル−４−Ｎ−ジフェニルメタン（24）を添加し、この
温度で1.5時間撹拌した後、エーテル1000mL中に注いで
沈澱物を生成させた。該沈澱物を濾別し、エーテルで洗
浄することによって標記化合物（25）を得た。

実施例26 ３−フェニル（プロピオニル）−Ｌ−アスパルチル−β
−（ベンジルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−ニト
ロ−アルギニナル−セミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフェ
ニルメタンの調製 Ｌ−アスパルチル−β−（ベンジルエステル）−Ｌ−
プロリル−Ｌ−Ｎ−^ｇ−ニトロ−アルギニナル−エミカ
ルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタン（25）0.91g
（1.08ミリモル）をTFH20mLに加えた溶液を乾燥ピリジ
ン0.16mLおよび３−フェニルプロパノイルクロリド0.29
7mL（2.2ミリモル）を用いて処理した後、湿気を遮断し
た雰囲気下で１時間撹拌した。この反応混合物を水中に
注いた後、酢酸エチルを用いて抽出した。抽出物を1M
HCl水溶液、水、NaHCO₃飽和水溶液およびNaCl飽和水溶
液を用いて順次洗浄した後、MgSO₄を用いて乾燥し、次
いで減圧下で濃縮し、該濃縮物をフラッシュクロマトグ
ラフィー（イソプロパノールの10％ジクロロメタン溶
液）によって精製することにより３−フェニル（プロピ
オニル）−Ｌ−アスパルチル−β−（ベンジルエステ
ル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−ニトロ−アルギニナル−
セミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタンを0.7g得
た。

実施例27 Ｎ−（３−フェニルプロパノイル）−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−プロリル−アルギニナルの別の調製法 実施例26の化合物（26）を、アニゾール0.70mLと共に
テフロン製のHF容器へ移し、乾燥窒素気流下で−78℃ま
で冷却した。無水HF（約10mL）を該容器内に凝縮させ、
反応は、撹拌下で系の温度を−20℃まで昇温させた後、
この温度に30分間保持することによって行った。反応物
の温度を０℃まで昇温させ、HFを乾燥窒素気流下で蒸発
させた後、0.1M NH₄HCO₃水溶液50mLを添加して得られ
た溶液をジエチルエーテルを用いて３回抽出した。３−
フェニル（プロピオニル）−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−プ
ロリル−Ｌ−アルギニナル−セミカルバゾンを含有する
水性層を氷酢酸4.9mL、1M HCl水溶液5.6mLおよび47％
ホルムアルデヒド水溶液2.7mLを用いて処理し、この粗
製反応混合物を300mm×50mmの混合型カラム［オールテ
ク社（Allteck）製、カタログ＃Ｃ−6000B］にかけ、50
mMリン酸塩緩衝液を用いて溶離させた。標記化合物を含
有する留分を一緒にした後、蒸発処理に付して得られた
ペプチドアルデヒドを逆相HPLC（粒径10ミクロンで孔径
300オングストロームのＣ−18カラム）を用いる脱塩処
理に付した。この場合、トリフルオロ酢酸を各々0.1％
含有する水とアセトニトリルを用いる傾斜溶離を行った
（アセトニトリルの濃度は５〜40％に変化させた）。カ
ラム留分を分析用HPLCを用いて分析し、純粋な生成物を
含有する留分を捕集し、これを凍結乾燥することによっ
て標記化合物を得た。ファブ質量分析による生成物の分
子量は502a.m.u.であった（計算分子量:502a.m.u.）。

実施例28 α−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−メチルエステルの
調製 乾燥無水メタノール（100mL）を、窒素雰囲気下、氷
浴中で撹拌しながら、金属ナトリウム0.26g（10.8ミリ
モル）を用いて処理した。金属ナトリウムが溶解した
後、α−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベンジルエス
テル3.2g（10.0ミリモル）を無水メタノール20mLに加え
た溶液を添加し、この溶液を撹拌処理に付した後、TLC
によるエステル交換反応に付した。約20時間後、氷酢酸
1mLを添加し、反応物を濃縮した。この残渣を0.5M HCl
水溶液中に注ぎ、酢酸エチルを用いて抽出した。酢酸エ
チル相を水およびブラインを用いて順次洗浄し、MgSO₄
を用いて乾燥した後、濃縮させて得られた生成物（約3
g）を次の反応工程において使用した。

実施例29 α−Boc−Ｌ−アスパルチル−β−（メチルエステル）
−Ｌ−プロリンベンジルエステルの調製 化合物（28」（α−Boc−Ｌ−アスパルチル−β−
（メチルエステル））8.9g（36ミリモル）、BOP15.9g
（36ミリモル）およびＬ−プロリンベンジルエステル8.
7g（36ミリモル）をDMF90mLに加えた溶液をNMM19.7mLを
用いて処理した。この処理溶液を３時間撹拌し、1M HC
l水溶液中に注いだ後、酢酸エチルを用いて抽出した。
有機相を1M HCl水溶液、1M NaOH水溶液、水およびブ
ラインを用いて順次洗浄し、Na₂SO₄を用いて乾燥した
後、濃縮することによって粗製生成物を16.8g得た。該
生成物の¹H−NMR（CDCl₃）のデータは次の通りである：
δ1.42（s,9H）、2.0（m,3H）、2.2（m,1H）、2.65（m,
2H）、3.67（s,3H）、3.76（m,2H）、4.57（m,1H）、4.
86（m,1H）、5.15（dd,2H）、5.40（d,1H）、7.35（m,5
H）。

実施例30 Ｎ−（３−フェニルプロパノイル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリンベンジルエス
テルの調製 化合物（29）8.4g（19.3ミリモル）を75％TFA/CH₂Cl₂
100mLに加えた溶液を氷浴中で1.5時間撹拌した後、濃縮
して油状物を得た。この油状残渣をトルエンに溶解さ
せ、これを濃縮して過剰のTFAを除去した。該濃縮物をT
HF75mLに溶解させ、これに３−フェニルプロパノイル酸
クロリド21.6ミリモルを添加した後、NaHCO₃飽和水溶液
100mLを添加した。この混合物を70分間激しく撹拌した
後、酢酸エチルとNaHCO₃飽和水溶液との混合物中に注
ぎ、得られた混合物を振盪させ、有機相を水およびブラ
インを用いて洗浄し、次いでMgSO₄を用いて乾燥した
後、濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（０
〜２％CH₃OH/CH₂Cl₂）によって精製した。TLC（シリ
カ）によるRfは0.5であった（２％MeOH/CH₂Cl₂）。

実施例31 Ｎ−（３−フェニルプロパノイル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリンの調製 化合物（30）2.8g（6.0ミリモル）をメタノール125mL
に加えた溶液に活性炭担持10％パラジウム触媒280mgを
加え、これを振盪下において、水素ガス（15psig）を用
いて1.5時間処理した後、懸濁液を濾過処理に付し、濃
縮することによって標記化合物を得た。該化合物の¹H−
NMR（CDCl₃）のデータは次の通りである：δ2.1（m,3
H）、2.2（m,1H）、2.53（t.3H）、2.91（t.3H）、2.6
−2.9（m,2H）、3.65（s,3H）、3.7（m,2H）、4.38（d
d,1H）、4.86（m,1H）、5.05（m,2H）、7.23（m,5H）、
8.37（d,1H）。

実施例32 Ｎ−（３−フェニルプロパノイル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリル−N^g−ニトロ
−Ｌ−アルギニナルセミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフェ
ニルメタンの調製 化合物（31）1.7g（4.5ミリモル）、BOP2.0g（4.5ミ
リモル）および化合物（20）2.3g（4.5ミリモル）をDMF
13mLに加えた溶液をNMM2.3mLを用いて処理した溶液を３
時間撹拌し、次いで水中に注いだ後、酢酸エチルを用い
て抽出した。有機相を1M HCl水溶液、1M NaOH水溶液
および水を用いて順次洗浄し、MgSO₄を用いて乾燥した
後、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー
（０〜10％CH₃OH/CH₂Cl₂）によって精製して得られた標
記化合物は、メタノール10％溶液（ジクロロメタン溶
媒）を用いるシリカゲル上でのTLCにおいて、Rf＝0.37
の単一スポットを与えた。

実施例33 Ｎ−（３−フェニルプロパノイル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギ
ニナル−の調製 実施例32で得られた化合物（32）全量をアニソール0.
70mLと共にテフロン製HF容器内に移し、これを乾燥窒素
気流中、−78℃まで冷却し、次いで無水HF（約10mL）を
該容器内に凝縮させた。反応系の温度を０℃まで高めた
後、乾燥窒素気流下でHFを蒸発させた。次いで、0.1M
NH₄HCO₃水溶液50mLを添加し、得られた溶液をジエチル
エーテルを用いて３回抽出した。３−フェニル（プロピ
オニル）−Ｌ−アスパルチル−β−（メチルエステル）
−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナル−セミカルバゾンを
含有する水性相を氷酢酸4.9mL、1M HCl水溶液5.6mLお
よび47％ホルムアルデヒド水溶液2.7mLを用いて処理し
た溶液を１時間撹拌することによってセミカルバゾンを
加水分解させ。得られたペプチドアルデヒドを逆相HPLC
（粒径10ミクロンで孔径300オングストロームのＣ−18
カラム）を用いて精製した。この場合、トリフルオロ酢
酸を各々0.1％含有する水とアセトニトリルを用いる傾
斜溶離を行った（アセトニトリルの濃度は５％〜40％に
変化させた）。カラム留分を分析用HPLCを用いて分析
し、純粋な生成物を含有する留分を捕集し、凍結乾燥す
ることによって標記化合物を得た。ファブ質量分析によ
る該化合物の分子量は516a.m.u.であった（計算分子量:
516a.m.u.）。

実施例34 Ｎ−（２−ロピルペンタノイル）−Ｌ−アスパルチル−
β（メチルエステル）−Ｌ−プロリンベンジルエステル
の調製 化合物（30）8.4g（19.3ミリモル）を75％TFA/CH₂Cl₂
100mLに加えた溶液を氷浴中で1.5時間撹拌した後、濃縮
して油状物とした。この油状物をトルエンに溶解させ、
次いで該溶液を濃縮処理に付すことによって過剰のTFA
を除去した。得られた濃縮物を、２−プロピルペンタン
酸2.44mL（15.6ミリモル）、BOP（6.91g）およびNMM（7
8ミリモル）をTMF35mL中に加えた混合物中に添加し、こ
れを1.2時間撹拌した後、実施例33と同様の処理を行っ
た。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（10〜50％
酢酸エチル／ヘキサン）によって精製することによっ
て、標記化合物を油状物（40％酢酸エチル／ヘキサンを
用いるTLCにおけるRf＝0.3）を2.0g得た。

実施例35 Ｎ−（２−プロピルペンタノイル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリンの調製 化合物（34）2.0g（4.34ミリモル）をメタノール90mL
に加えた溶液を、活性炭にPdを10％担持させた触媒を用
いて処理し、これを水素ガス（15psig）で1.5時間処理
した。反応生成物を濾過処理に付した後、濃縮すること
によって標記化合物（mp157〜159℃）を得た。

実施例36 Ｎ−（３−フェニルプロパノイル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリル−N^g−ニトロ
−Ｌ−アルギニナルセミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフェ
ニルメタンの調製 化合物（34）1.67g（4.5ミリモル）、BOP2.0g（4.5ミ
リモル）および化合物（20）2.3g（4.5ミリモル）をDMF
13mLに加えた溶液をNMM2.3mLを用いて処理した。この溶
液を２時間撹拌し、次いで水中に注いだ後、酢酸エチル
を用いて抽出した。有機相を1M HCl、1M NaOH溶液お
よび水を用いて順次洗浄し、MgSO₄を用いて乾燥し、濃
縮後、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（０〜８％
CH₃OH/CH₂Cl₂）により精製することによって標記化合物
を1.2g得た。該化合物は、ジクロロメタン中にメタノー
ルを10％含有する溶媒を用いるシリカゲル上でのTLCに
おいて、Rf＝0.54の単一スポットを示した。

実施例37 Ｎ−（３−フェニルプロパノイル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギ
ニナルの調製 実施例36で調製した化合物（36）を脱保護処理に付し
た後、実施例33に記載のようにして精製することによっ
て標記化合物を得た。該化合物のファブ質量分析による
分子量は510.3a.m.u.であった（計算分子量:510.3a.m.
u.）。

実施例38 Ｎ−Boc−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルの調製 ペプチドアルデヒドは当該分野では既知化合物である
［バジャスツら、Folia Haematol.Leipzig、第109巻、
第16頁（1982年）；バジャスツ、Symposia Biologica
Hungarica、第25巻、第277頁（1984年）；バジャスツ
ら、J.Med.Chem.、第33巻、第1729頁（1990年）］。こ
の化合物は、実施例ＡおよびＢのアッセイにおけるコン
トロールとして使用するために、次の方法によって調製
した。

ペプチドアルデヒド（38）を実施例８に記載の手順に
準拠し合成し精製した。Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを樹脂
（７）に結合させた後、Ｎ−Boc−Ｄ−フェニルアラニ
ンを結合させた。最後のカップリング後の50％トリフル
オロ酢酸を用いる処理は省略した。さらに、脱保護し、
精製することによって標記化合物を得た。該化合物のフ
ァブ質量分析による分子量は502a.m.u.であった（計算
分子量:502a.m.u.）。

実施例39 ３−シアノ−２−（1,1−ジメチルエトキシ）メタンア
ミドプロピオン酸の調製 Boc−Ｌ−アスパラギン20.0g（86ミリモル;1当量）を
乾燥ピリジン120mLに溶解させ、次いでジシクロヘキシ
ルカルボジイミド20.0g（97ミリモル;1.3当量）を乾燥
ピリジン60mLに溶解させた溶液を30分間かけて滴下し
た。反応は、23℃において撹拌下で３時間おこない、反
応混合物はナイロン製フィルター（２μｍ）を用いる濾
過処理に付し、濾液を回転減圧蒸発器を用いて濃縮し、
該濃縮液に水100mLを加えた。この溶液のpHを、40％NaO
H水溶液を用いて10に調節した後、さらにナイロン製フ
ィルター（２μｍ）を用いる濾過処理をおこなった。濾
液をDowex50×８−400イオン交換樹脂床（120mL）を通
過させ、該樹脂を、カラム体積の４倍量の混合溶媒（メ
タノール：水＝1:1）を用いて洗浄した。濾液を真空下
で濃縮することによって、標記化合物を白色固体として
17.5g得た（収率:95％）。生成物の¹H−NMR（CD₃OD）は
次の通りである:4.40p.p.m.（m,1H）2.95p.p.m.（m,2
H）;1.40p.p.m.（s,9H）． 実施例40 ３−テトラゾリル−２−（1,1−ジメチルエトキシ）メ
タンアミドプロピオン酸の調製 ３−シアノ−２−（1,1−ジメチルエトキシ）メタン
アミド−プロピオン酸（39）17.5g（82ミリモル;1当
量）をTHF125mLに溶解させ、次いで、トリブチル錫アジ
ド40.5g（129ミリモル;1.5当量）を添加した。反応混合
物を３日間還流させた後、揮発分を回転減圧蒸発器を用
いて除去した。残渣を0.5MNaOH水溶液300mL中に溶解さ
せ、この水溶液を酢酸エチルを用いて洗浄した（４×10
0mL）。水性層をDowex50×８−400イオン交換樹脂床（1
25mL）を通過させ、該樹脂をカラム体積の４倍量の混合
溶媒（メタノール：水＝1:1）を用いて洗浄した。揮発
分を回転減圧蒸発器を用いて除去することによって標記
化合物を白色固体として17.9g得た（収率:85％）。生成
物の¹H−NMR（CD₃OD）のデータは次の通りである:4.55
p.p.m.（m,1H）;3.40p.p.m.（m,2H）;1.40p.p.m.（s,9
H）。この化合物は固相ペプチド合成法に使用するのに
適している。

実施例41 ３−（Ｎ−２−メチル）テトラゾリル−２−（1,1−ジ
メチルエトキシ）メタンアミドプロピオン酸メチルエス
テルおよび３−（Ｎ−３−メチル）テトラゾリル−２−
（1,1−ジメチルエトキシ）メタン−アミドプロピオン
酸メチルエステルの調製 ３−テトラゾリル−２−（1,1−ジメチルエトキシ）
メタン−アミドプロピオン酸（40）1.5g（5.8ミリモル;
1.0当量）を乾燥DMF13mLに溶解させ、次いで、炭酸セシ
ウム3.9g（12.0ミリモル;2.1当量）を添加した後、ヨウ
化メチル930μｌ（14.5ミリモル;2.5当量）をシリンジ
を用いて添加した。この反応混合物を23℃で３時間撹拌
し、次いで0.5M HCl50mL中に注いだ後、酢酸エチルを
用いて抽出した（３×50mL）。一緒にした有機相を0.5M
HCl、NaHCO₃の飽和水溶液50mLおよびブライン50mLを
用いて順次洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた
後、有機相をデカントさせ、揮発分を回転減圧蒸発器を
用いて除去することによって標記化合物の混合物を黄色
油状物として得た。該異性体はシリカ上でのクロマトグ
ラフィー（50％EtOAc/ヘキサン）によって分離させた。
一方の異性体が最初に溶出した（Rf＝0.3）。他方の異
性体のRfは0.15である。純粋な生成物を含有する留分を
一緒にし、揮発分を回転蒸発器によって除去することに
よって、純粋な各標記化合物を0.60g得た。¹H−NMR（CD
Cl₃）のデータは以下の通りである： （二番目に溶出した異性体） 5.8p.p.m.（d,1H）;4.75p.p.m.（m,1H）;4.05p.p.m.
（s.3H）;3.75p.p.m.（s,3H）;3.4p.p.m.（m,2H）;1.5
p.p.m.（s,9H）． （最初に溶出した異性体） 5.75p.p.m.（d,1H）;4.75p.p.m.（m,1H）;4.30p.p.m.
（s.3H）;3.75p.p.m.（s,3H）;3.65p.p.m.（m,2H）;1.7
p.p.m.（s,9H）． 実施例42 ３−（Ｎ−２−メチル）テトラゾリル−２−（1,1−ジ
メチルエトキシ）メタンアミドプロピオン酸または３−
（Ｎ−３−メチル）テトラゾリル−２−（1,1−ジメチ
ルエトキシ）メタンアミドプロピオン酸の調製 ３−（Ｎ−２−メチル）テトラゾリル−２−（1,1−
ジメチルエトキシ）−メタンアミドプロピオン酸メチル
エステルまたは３−（Ｎ−３−メチル）テトラゾリル−
２−（1,1−ジメチルエトキシ）−メタンアミドプロピ
オン酸メチルエステル0.5g（1.75ミリモル;1.0当量）を
メタノール12mLに溶解させ、次いで1.0M LiOH水溶液2.
3mL（1.3当量）を添加し、23℃で撹拌を２時間おこなっ
たところ、出発物質はTLC分析（シリカゲル上での1:1Et
OAc/ヘキサン）によって確認できなかった。反応混合物
をDowex50×８−400イオン交換樹脂床（10mL）を通過さ
せ、該樹脂を、カラム体積の４倍量の溶媒（メタノー
ル：水＝1:1）を用いて洗浄した。溶媒を減圧下で除去
させることによって標記化合物を得た。

実施例43 ３−テトラゾリル−２−（1,1−ジメチルエトキシ）メ
タンアミドプロピオン酸メチルエステルの調製 ３−テトラゾリル−２−（1,1−ジメチルエトキシ）
−メタンアミドプロピオン酸（40）1.66g（6.5ミリモ
ル;1当量）を乾燥THF26mLに溶解させ、次いで、カルボ
ニルジイミダゾール3.14g（19.4ミリモル;3当量）を添
加し、さらに、イミダゾール88mg（1.3ミリモル;0.2当
量）を添加し、反応混合物を23℃で3.5時間撹拌した。
さらにメタノール20mLを加えた混合物を0.5時間撹拌し
た。揮発分を回転減圧蒸発器を用いて除去した後、粗製
生成物を酢酸エチル100mLに加えた。有機相を0.5M HCl
を用いて洗浄し（２×25mL）、硫酸ナトリウムを用いて
乾燥させ、デシカント（dessicant）からのデカンテー
ションの後、有機相を真空下で濃縮させ、生成物をシリ
カ上でのクロマトグラフィー（２〜10％MeOH/CH₂Cl₂、
１％酢酸）によって精製することによって標記化合物を
720mg得た。該化合物の¹H−NMR（CDCl₃）のデータは次
の通りである:5.8ppm（d,1H）,4.75ppm（s,1H）,3.8ppm
（s,3H）,3.55ppm（m,2H）,1.4ppm（s,9H）． 実施例44 ３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−
２−（1,1−ジメチルエトキシ）メタンアミドプロピオ
ン酸メチルエステルおよび３−（Ｎ−３−ベンジルオキ
シメチル）テトラゾリル−２−（1,1−ジエチルエトキ
シ）メタンアミドプロピオン酸メチルエステルの調製 ３−テトラゾル−２−（1,1−ジメチルエトキシ）−
メタンアミドプロピオン酸メチルエステル（43）1.28g
（4.7ミリモル;1当量）を乾燥TFH9.5mLに加え、次い
で、ベンジルオキシメチルクロリド0.65mL（5.6ミリモ
ル;1.2当量）をシリンジを用いて添加した後、ジイソプ
ロピルエチルアミン1.05mL（6.1ミリモル;1.3当量）を
添加した。この反応混合物を23℃で１時間撹拌した後、
酢酸エチル100mLを用いて希釈した。有機相を0.5N HCl
（２×50mL）、NaHCO₃飽和水溶液（50mL）およびブライ
ン（50mL）を用いて順次洗浄した後、硫酸ナトリウムを
用いて乾燥させた。有機相をデカントし、減圧下で濃縮
した。濃縮物をクロマトグラフィー（1:1 EtOAc/ヘキサ
ン；シリカ）によって処理することによって標記化合物
を得た（Rf＝0.4の留分:1.05g、Rf＝0.25の留分:0.67
g）。いずれの異性体も以後の反応で使用することがで
きる。

実施例45 ３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−
２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン酸メチ
ルエステルまたは３−（Ｎ−３−ベンジルオキシメチ
ル）テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミ
ド）プロピオン酸メチルエステルの調製 ４−メチル吉草酸2.0gをオキサリルクロリド10mLに加
え、この混合物を23℃において、窒素雰囲気で一夜撹拌
した後、乾燥トルエン100mLを添加し、揮発分を減圧下
で除去することによって酸クロリドを得た。該酸クロリ
ドは以下のようにして使用した。

３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル
−２−（1,1−ジメチルエトキシ）メタンアミド−プロ
ピオン酸メチルエステルまたは３−（Ｎ−３−ベンジル
オキシメチル）テトラゾリル−２−（1,1−ジメチルエ
トキシ）メタンアミド−プロピオン酸メチルエステル
（44）1.0g（2.5ミリモル;1当量）を−５℃でトリフル
オロ酢酸10mLに加え、この溶液を0.5時間撹拌した後、
減圧下で濃縮した。粗製トリフルオロ酢酸塩をトルエン
と混合し、再度濃縮することによって残余のトリフルオ
ロ酢酸を除去した。粗製トリフルオロ酢酸塩を乾燥THF5
mLに加え、次いで、前述のようにして調製した４−メチ
ルバレロイルクロリド0.52g（3.8ミリモル;1.5当量）を
加えた後、トリエチルアミン1.07mLを添加した。この反
応混合物を23℃で２時間撹拌した後、酢酸エチル50mLで
希釈した。有機相を0.5M HCl（２×25mL）、NaHCO₃飽和
水溶液（25mL）およびブライン（25mL）を用いて順次洗
浄した後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。デカンテ
ーション後、有機相を減圧下で濃縮し、次いで、クロマ
トグラフィー（1:1 EtOAc/ヘキサン；シリカ）により精
製することによって標記化合物を得た。

実施例46 ３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−
２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン酸また
は３−（Ｎ−３−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル
−２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン酸の
調製 ３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル
−２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン酸メ
チルエステルまたは３−（Ｎ−３−ベンジルオキシメチ
ル）テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミ
ド）プロピオン酸メチルエステル（45）の0.15Mメタノ
ール溶液に1.5当量の1M LiOH水溶液を添加した。反応混
合物を出発物質がTLCによって検出されなくなるまで撹
拌し（約３時間）、次いで、Dowex 50X8−400イオン交
換樹脂を通過させ、該樹脂をカラム体積の４倍量の溶媒
（1:1 メタノール／水）を用いて洗浄し、濾液を減圧下
で濃縮することによって対応する標記化合物を得た。

実施例47 Boc−Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−ニトロ−アルギニナル−
セミカルバゾニルボニル−４−Ｎ−ジフェニルメタンの
調製 N^g−ニトロ−アルギナル−セミカルバゾニル−４−Ｎ
−ジフェニルメタントリフルオロ酢酸塩（20）5.0（9.6
ミリモル;1当量）、Ｎ−ｔ−ブトキシカル−Ｌ−プロリ
ン2.15g（11.5ミリモル;1.2当量）、BOP試薬5.53g（12.
5ミリモル;1.3当量）およびＮ−ヒドロキシベンズトリ
アゾールモノハイドレート0.15g（0.96ミリモル;0.1当
量）を乾燥DMF38mLに加え、次いで、Ｎ−メチルモルホ
リン6.3mL（57.6ミリモル;6当量）をシリンジを用いて
添加した。反応混合物を３時間撹拌した後、酢酸エチル
300mLで希釈した。有機相を4M HCl（30mL）、1M NaOH水
溶液（２×30mL）およびブライン（30mL）を用いて順次
洗浄した後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。有機相
をデカントした後、減圧下で濃縮することによって粗製
生成物を得た。該生成物はクロマトグラフィー（1:10 M
eOH/メチレンクロリド；シリカ）によって精製した。

実施例48 ３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−
２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオノイル−
Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−ニトロ−アルギニナル−セミカ
ルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタンまたは３−（Ｎ
−３−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−２−（４
−メチルバレロイルアミド）プロピオノイル−Ｌ−プロ
リル−Ｌ−N^g−ニトロ−アルギニナル−セミカルバゾニ
ル−４−Ｎ−ジフェニルメタンの調製 Boc−Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−ニトロ−アルギニナル
−セミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタン（47）
2.5ミリモル（１当量）を−５℃でトリフルオロ酢酸10m
Lに加え、この溶液を0.5時間撹拌した後、減圧下で濃縮
した。粗製トリフルオロ酢酸塩をトルエンと混合し、再
濃縮によって残余のトリフルオロ酢酸を除去した。３−
（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−２−
（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン酸または３
−（Ｎ−３−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−２
−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン酸（46）
３ミリモル（1.2当量）、BOP試薬3.25ミリモル（1.3当
量）およびＮ−ヒドロキシベンズトリアゾールモノハイ
ドレート0.25ミリモル（0.1当量）を乾燥DMF10mLに加
え、次いで、Ｎ−メチルモルホリン15ミリモル（６当
量）をシリンジを用いて添加した。反応混合物を３時間
撹拌した後、酢酸エチル100mLで希釈した。有機相をデ
カントした後、減圧下で濃縮することによって粗製生成
物を得た。該生成物をクロマトグラフィー（1:10 MeOH/
メチレンクロリド；シリカ）により精製することによっ
て対応する標記化合物を得た。

実施例49 ３−テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミ
ド）プロピオノイル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナル
の調製 上記の実施例で得られた全生成物（48）をアニソール
0.70mLと共にテフロン製HF容器内に入れ、乾燥窒素気流
下で−78℃まで冷却し、無水HF（約10mL）を該容器内で
凝縮させ、反応混合物を撹拌した後、−20℃まで昇温さ
せ、この温度に30分間保持した。反応混合物を０℃まで
昇温させ、乾燥窒素気流下でHFを蒸発させた後、0.1M N
H₄HCO₃水溶液50mLを加え、得られた溶液をジエチルエー
テルを用いて３回抽出した。２−（４−メチルバレロイ
ルアミド）プロピオノイル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギ
ニナルセミカルバゾンを含有する水性相を氷酢酸4.9m
L、1M HCl水溶液5.6mLおよび47％ホルムアルデヒド水溶
液2.7mLを用いて処理した。この溶液を１時間撹拌する
ことによってセミカルバゾンを加水分解させた。得られ
たペプチドアルデヒドを、粒径が10ミクロンで孔径が30
0オングストロームのＣ−18カラムを用いる逆相HPLCを
用いて精製した。この場合、トリフルオロ酢酸をそれぞ
れ0.1含有する水とアセトニトリルを用いる傾斜溶離を
行った（アセトニトリルの濃度は５〜40％の間で変化さ
せた）。カラム留分を分析用HPLCによって分析し、純粋
な生成物を含有する留分を捕集し、凍結乾燥することに
よって標記化合物を得た。

該化合物は実施例50〜56に記載の方法によって合成し
てもよい。

実施例50 １−アミド−３−ベンジルオキシメタンアミド−1,4−
ブタンジオイック酸メチルエステルの調製 Cbz−Ｌ−アスパラギン15.0g（56.4ミリモル;1当量）
を乾燥メチレンクロリド100mLに溶解させた溶液にオキ
サリルクロリド50mL（573ミリモル;10当量）を10分間か
けて滴下した。反応を23℃において撹拌下で４時間行っ
た後、揮発分を回転減圧蒸発器を用いて除去し、次い
で、メタノール100mLを加え、この混合物を23℃におい
て0.5時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗
製生成物をフラッシュクロマトグラフィー（０〜５％メ
タノール／メチレンクロリド）によって精製することに
よって標記化合物を12.45g得た。該化合物の¹H−NMR（C
ClD₃）のデータは次の通りである:7.4p.p.m.（m,5H）、
6.1p.p.m.（d,1H）、5.8p.p.m.（d,2H）、5.1p.p.m.
（s,2H）、4.6p.p.m.（m,1H）、3.75p.p.m.（s,3H）、
2.85p.p.m.（m,2H）。

実施例51 ３−シアノ−２−ベンジルオキシメタンアミドプロピオ
ン酸メチルエステルの調製 Cbz−Ｌ−アスパラギンメチルエステル（50）5.0g（1
7.9ミリモル;1当量）を乾燥ピリジン10mLに溶解させた
溶液にベンゼンスルホニルクロリドをシリンジを用いて
添加した。反応を50℃において撹拌下で３時間行った
後、1M HCl50mLを加え、水溶液を酢酸エチルを用いて抽
出した（２×100mL）。有機相を一緒にし、1M HCl50m
L、NaHCO₃飽和水溶液50mLおよびブラインを用いて順次
洗浄した後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。デカン
テーション後、有機相を減圧下で濃縮した。粗製生成物
をフラッシュクロマトグラフィー（10％ EtOAc/メチレ
ンクロリド;Rf＝0.45）により精製することによって標
記化合物を4.1g得た。該化合物の¹H−NMR（CDCl₃）のデ
ータは次の通りである:7.4p.p.m.（m,5H）、5.7p.p.m.
（m,1H）、5.1p.p.m.（s,2H）、4.6p.p.m.（m,1H）、3.
8p.p.m.（s,3H）、3.0p.p.m.（m,2H）。

実施例52 ３−テトラゾリル−２−ベンジルオキシメタンアミドプ
ロピオン酸メチルエステルの調製 ３−シアノ−２−ベンジルオキシメタンアミドプロピ
オン酸メチルエステル（51）2.5g（9.45ミリモル;1当
量）を乾燥THF10mLに溶解させた溶液にトリ−ｎ−ブチ
ル錫アジド3.0g（9.54ミリモル;1当量）を添加した。反
応を72時間還流させことによって行った後、減圧下で濃
縮した。1M NaOH水溶液50mLを添加した後、酢酸エチル
を用いる抽出処理（３×50mL）を行った。水溶液のpHを
4M HClを用いて１にした後、酢酸エチルを用いて抽出し
た（４×60mL）。硫酸ナトリウムを用いて乾燥した後、
有機相をデカントし、減圧下で濃縮することによって標
記化合物を2.5g得た。該化合物の¹H−NMR（CDCl₃）のデ
ータは次の通りである:7.3p.p.m.（m,5H）、6.1p.p.m.
（m,1H）、5.1p.p.m.（s,2H）、4.8p.p.m.（m,1H）、3.
8p.p.m.（s,3H）、3.5p.p.m.（m,2H）。

実施例53 ３−テトラゾリル−２−アミノプロピオン酸メチルエス
テルヒドロクロリドの調製 ３−テトラゾリル−２−ベンジルオキシメタンアミド
プロピオン酸メチルエステル（52）0.53g（1.74ミリモ
ル;1当量）をメタノール30mLに溶解させた溶液に濃塩酸
1mLを添加した。反応容器内に窒素ガスを流し、活性炭
にPdを10％担持させた触媒80mgを添加した後、40psiの
条件下で水素化を２時間行った。触媒を濾去した後、減
圧下で濃縮することによって標記化合物を354mg得た。
該化合物の¹H−NMR（CD₃OD）のデータは次の通りであ
る:4.7p.p.m.（m,1H）、3.8p.p.m.（s,3H）、3.6p.p.m.
（m,2H）。

実施例54 ３−テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミ
ド）プロピンオン酸メチルエステルの調製 ３−テトラゾリル−２−アミノプロピオン酸メチルエ
ステルヒドロクロリド（53）353mg（1.74ミリモル;1当
量）、４−メチル吉草酸262μＬ（2.09ミリモル;1.2当
量）、BOP試薬1.0g（2.26当量）およびＮ−ヒドロキシ
ベンズトリアゾールモノヒドレート27mg（0.174ミリモ
ル;0.1当量）を乾燥DMF5mLに加え、次いで、Ｎ−メチル
モルホリン960μＬ（8.7ミリモル;5当量）をシリンジを
用いて添加した。反応混合物を23℃で18時間撹拌した
後、酢酸エチル100mLを用いて希釈した。有機相をクエ
ン酸20％水溶液（10mL）およびブライン（10mL）を用い
て洗浄した後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。デカ
ンテーション後、有機相を減圧下で濃縮し、粗製生成物
をシリカ上でのクロマトグラフィー［MeOH/メチレンク
ロリド（２〜10％、１％酢酸）］により精製することに
よって標記化合物を230mg得た（Rf＝0.30;10％MeOH/メ
チレンクロリド、１％酢酸）。該化合物の¹H−NMR（CDC
l₃）のデータは次の通りである:7.0p.p.m.（d,1H）、5.
05p.p.m.（m,1H）、3.8p.p.m.（s,3H）、3.6p.p.m.（m,
2H）、1.5p.p.m.（m,3H）、0.8p.p.m.（d,6H）。

実施例55 ３−テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミ
ド）プロピオン酸の調製 ３−テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミ
ド）プロピオン酸メチルエステル（54）51mg（0.19ミリ
モル;1当量）および水酸化リチウム16mg（0.38ミリモ
ル;2当量）を水1.5mLに加え、撹拌を２時間行った後、1
M HClを35μＬ添加し、この溶液を減圧下で濃縮するこ
とによって標記化合物を得た（以下の反応においては、
この化合物はそのまま使用した）。該化合物の¹H−NMR
（CD₃OD）のデータは次の通りである:4.6p.p.m.（m,1
H）、3.4p.p.m.（m,1H）、3.2p.p.m.（m,1H）、2.15
（m,2H）、1.4p.p.m.（m,3H）、0.8p.p.m.（d,6H）。

実施例56 ３−（Ｎ−３−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−
２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオノイル−
Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−ニトロ−アルギニナル−セミカ
ルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタンの調製 Boc−Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−ニトロ−アルギニナル
−セミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタン（19）
120mg（0.28ミリモル;1当量）を−５℃でトリフルオロ
酢酸5mLに加え、これを0.5時間撹拌した後、減圧下で濃
縮した。粗製トリフルオロ酢酸塩をトルエンと混合し、
再濃縮により残余のトリフルオロ酢酸を除去した。３−
テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミド）プ
ロピオン酸（55）48mg（0.23ミリモル;1.2当量）、１−
（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジ
イミドヒドロクロリド48mg（0.25ミリモル;1.3当量）お
よび４−ジメチルアミノピリジン2mg（0.02ミリモル;0.
1当量）を乾燥DMF3mLに加え、次いで、ジイソプロピル
エチルアミン100μＬ（0.57ミリモル;3当量）をシリン
ジを用いて添加した。反応混合物を23℃で18時間撹拌し
た後、クエン酸20％溶液10mL中に加えた。この水性液を
酢酸エチルを用いて抽出し（６×15mL）、一緒にした有
機相を硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。デカンテー
ション後、有機相を減圧下で濃縮し、粗製生成物を2mm
の分取TLCシリカゲルプレート上でのクロマトグラフィ
ー（10％MeOH/メチレンクロリド、１％酢酸）によって
処理した。Rfが0.25のバンドを10％メタノール／酢酸エ
チルに溶解させた後、濾過し、揮発分を減圧下で除去す
ることによって、標記化合物を30mg得た。該化合物の¹H
−NMR（CD₃OD）のデータは次の通りである:7.3p.p.m.
（m,10H）、7.1p.p.m.（d,1H）、6.1p.p.m.（s,1H）、
4.7p.p.m.（m,1H）、4.5p.p.m.（m,1H）、4.3p.p.m.
（m,1H）、3.6p.p.m.（m,1H）、3.2p.p.m.（m,2H）、2.
8p.p.m.（m,1H）、2.1p.p.m.（m,3H）、1.2−1.9p.p.m.
（m,13H）。

実施例57 ３−テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミ
ド）プロピオノイル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナル
の調製 実施例56において得られた全化合物（58）をアニソー
ル0.70mLと共に、テフロン製HF容器内に入れ、乾燥窒素
気流下で−78℃まで冷却した後、無水HF（約10mL）を該
容器内で凝縮させた。反応混合物を撹拌し、次いで、−
20℃まで昇温させ、この温度で30分間保った後、０℃ま
で昇温させ、乾燥窒素気流下でHFを蒸発させた。HFを蒸
発させた後、0.1M NH₄HCO₃水溶液50mLを添加し、得られ
た溶液をジエチルエーテルを用いて３回抽出した。２−
（バレロイルアミド）プロピオノイル−Ｌ−プロリル−
Ｌ−アルギニナル−セミカルバゾンを含有する水性相を
氷酢酸4.9mL、1M HCl水溶液5.6mLおよびホルムアルデヒ
ド47％水溶液2.7mLを用いて処理した後、１時間撹拌し
てセミカルバゾンを加水分解させた。得られたペプチド
アルデヒドを、粒径が10ミクロンで孔径が300オングス
トロームのＣ−18カラムを用いる逆相HPLCを用いて精製
した。この場合、トリフルオロ酢酸をそれぞれ0.1％含
有する水とアセトニトリルを用いる傾斜溶離を行った
（アセトニトリルの濃度は５〜40％の間で変化させ
た）。分析用HPLCを用いてカラム留分を分析し、純粋な
生成物を含有する留分を捕集し、凍結乾燥することによ
って標記化合物を得た。ファブ質量分析による該化合物
の分子量は492a.m.u.であった（計算分子量:492a.m.
u.）。

実施例Ａ 選択された純粋な凝結酵素の生体外での障害 トロンビン、因子X aおよびプラスミンの触媒活性に
対するインヒビターとしての本発明化合物の障害能は、
精製したヒト酵素の酵素活性の50％を阻害する濃度（IC
₅₀）を決定することによって評価した。

全てのアッセイにおいては、緩衝液としてHBSA（HEPE
S 10mM、pH7.5、塩化ナトリウム150mM、牛血清アルブミ
ン）を使用した。IC₅₀を決定するアッセイは、適当なウ
ェルを有するコーニング社製のマイクロタイタープレー
トにおいて、HBSA50μＬ、HBSAで希釈した広範囲にわた
る特定濃度の被験化合物溶液［非阻害速度Voを測定する
場合にはHBSAのみ］50μＬおよびHBSAで希釈した酵素50
μＬを混合することによって行った。周囲温度において
インキュベーションを30分間行った後、以下に記載する
特定濃度の基質50μＬをウェル内に加え、最終的な全体
積を200μＬとした。発色性基質の加水分解の初期速度
は、405nmにおける吸光度の変化を、カイネティック・
マイクロプレート・リーダー「テルモ・マックス（Ther
mo Max）（登録商標）」を用いて５分間（この間、添
加した基質の５％以下の酵素が消費された）測定するこ
とによって決定した。加水分解の初期速度を50％低下さ
せる添加インヒビターの濃度をIC₅₀として定義した。

トロンビンアッセイ トロンビンの触媒活性は、発色性基質ペファクロム
（Pefachrome）ｔ−PA［CH₃SO₂−Ｄ−ヘキサヒドロチロ
シン−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリ；
ペンタファーム社（Pentapharm Ltd.）製］を用いて測
定した。この基質はアッセイに先立って、脱イオン水と
混ぜた後、HBSAを用いて、最終的な濃度が300μＭ（約1
0倍のKm）になるように希釈した。精製したヒトのα−
トロンビンとしては、エンザイム・リサーチ・ラボラト
リーズ社（Enzyme Research Laboratories,Inc.）製
のものを使用した。この酵素は、アッセイに先立ってHB
SAを用いて、最終濃度が0.25nMになるように希釈した。

因子X aアッセイ 因子X a触媒活性は、カビ・ジアグノスチカ社（Kabi
Diagnostica）製の基質「S2765」（Ｎ−α−ベンジル
オキシカルボニル−Ｄ−アルギニニル−Ｌ−グリシル−
Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリドジヒドロクロリ
ド）を用いて測定した。この基質はアッセイに先立っ
て、脱イオン水と混ぜた後、HBSAを用いて、最終濃度が
250μＭ（約５倍のKm）になるように希釈した。ヒトの
因子X aは、エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ社
製の精製したヒトの因子Ｘからボックらの方法によって
調製した［ボックら、Archives of Biochem.Bioph
s.、第273巻、第375頁（1989年）参照］。この酵素はア
ッセイに先立って、HBSAを用いて、最終濃度が0.5nMに
なるように希釈した。

プラスミンアッセイ プラスミンの触媒活性は、カビ・ジアグノスチカ社製
の発色性基質「Ｓ−2251」（Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル
−Ｌ−リジン−ｐ−ニトロアニリドジヒドロクロリド）
を用いて測定した。この基質はアッセイに先立って、脱
イオン水と混ぜた後、HBSAを用いて、最終濃度が200μ
Ｍ（約５倍のKm）になるように希釈した。精製したヒト
のプラスミンとしては、エンザイム・リサーチ・ラボラ
トリーズ社製のものを用いた。この酵素は、アッセイに
先立って、HBSAを用いて、最終濃度が1.0nMになるよう
に希釈した。

以下の表１に、選択された被験化合物と対照化合物
［Boc−（Ｄ−Pho）−Pro−Arg−al］のIC₅₀の測定値を
示す。

表１から明らかなように、これらのインヒビターは、
血液の凝固過程に関係する選択酵素のインヒビターとし
て有用である。

血栓症の実験的モデル 実施例10記載の化合物（HCA−Asp−Pro−Arg−al）の
抗血栓症特性は、急性動脈血栓症を誘発された以下の確
立された実験的モデル（FeCl₃で誘発された血小板依存
性の動脈血栓症のラット）を用いて評価した。

このモデルは、血小板依存性の動脈血栓症によって十
分に特徴づけられたモデルであって、有効な抗血栓症化
合物、例えば、直接型トロンビンインヒビターの評価に
おいて利用されている［クルツら、Thromb.Res.、第60
巻、第269頁〜第280頁（1990年）参照］。臓器を対外に
露出させたシャントモデルとは異なり、このモデルにお
いて発生する血栓はヘパリンの影響を比較的受けない。
このことは、このモデルが、気球による血管形成または
酵素による血栓崩壊の後に新たに再疎通化された冠状血
管において臨床上みられるタイプの血栓症を示すことを
意味する。このモデルの場合、濾紙に吸収させた調製直
後のFeCl₃溶液を用いて処理したラットの頚動脈のセグ
メントには、血小板に富む閉塞性血栓が形成される。Fe
Cl₃は処理された頚動脈のセグメント内へ拡張して脱内
皮化を引き起こすことによって血栓を形成させるものと
考えられている。FeCl₃の投与後に発生する閉塞性血栓
形成に対する被験化合物の効果は、超音波によるフロー
トメトリー（flowtometry）によってモニターし、該効
果を主要な評価尺度として用いた。フロートメトリー
は、凝塊形成を熱的に検知する方法の修正法である［ク
ルツら、Thromb.Res.、第60巻、第269頁〜第280頁（199
0年）参照］。

雄のラット［ハーラン・スプラグ・ドーリー・ラット
（Harlan Sprague Dawley rat）］を使用の少なくと
も72時間前から順応させ、手術の12時間前から水以外は
接種させないようにした。このようにして準備したラッ
トに「ネムブタール（Nembutal）」を用いて麻酔をかけ
た。この場合、血圧および麻酔薬と麻痺の伝搬をモニタ
ーするためのカテーテルを埋め込んだ。左側の頚動脈を
次のようにして取り出した。即ち、頚部の正中線に沿っ
て切開した後、鈍的剥離させ、次いで、常套法によって
頚動脈鞘から血管のセグメント（2cm）を取り出した。
絹の縫合糸を単離した血管の基部と末梢の端部の下に挿
入することによって、血管の基部端の周囲に超音波流プ
ローブ［「トランソニック（Transonic）］を導入する
ための間隔を形成させた。該プローブは固定アームを用
いて固定させた。

手術後、食塩水を注入した対照群と実施例10で調製し
た化合物で処理した被験群において、ラットは無作為に
選んだが、各群の単位投与あたり少なくとも６匹のラッ
トを用いた。超音波流プローブを導入し、凝塊形成刺激
剤を投与する前30分間被検体を安定化させた後、被験化
合物を投与した。調製直後のFeCl₃の35％水溶液10mLを
吸収させた直径3mmの濾紙（ワットマン＃３）を、超音
波流プローブに接する単離した頚動脈末梢セグメントに
付着させた（ｔ＝０）。血圧、血流、心臓の鼓動速度お
よび呼吸を60分間にわたってモニターした。

血液の流れの停止によって定義される閉塞の発生を主
要な評価尺度として記録した。観察を60分間行った後、
超音波流プローブを抜去し、間隙を過剰の流体で満たし
た。末梢および基部の縫合糸を縛び、動脈クランプをセ
グメントの末梢と基部の先端部に載置した。単離したセ
グメントを切り出し、濾紙上で吸液乾燥させた後、秤量
した。凝塊を除去した後、セグメントを再び秤量し、そ
の差から凝塊の全重量を求めた。使用したラットは安楽
死させた。

上記の生体内モデルに抗血栓症剤としての実施例10の
化合物の効能は、以下の表２に示すように、閉塞の発生
の抑制と凝塊の大きさの低減によって裏づけられる。

以上の生体内での試験データは、実施例10の化合物
が、２つの十分に確立された実験的な血栓症モデルにお
いて抗血栓症的効能を示すことを証明するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピアソン、ダニエル・アンドルー アメリカ合衆国92075カリフォルニア、 ソラナ・ビーチ、ティー―14、サウス・ ナード669番 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 5/06 - 5/097 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次式で表わされる化合物または薬学的に許
   容される該化合物の塩： 式中、R₁は炭素原子数５〜10のアルキル基、炭素原子数
   ６〜12のアリールによって置換された炭素原子数１〜３
   のアルキル基、または炭素原子数５〜８の環状アルキル
   によって置換された炭素原子数１〜３の アルキル基を示し、ｍは１または２を示し、R₂は−CO
   ₂R′、 を示し（Ｒ′は水素原子、炭素原子数１〜４の低級アル
   キル基または炭素原子数６〜14のアラルキル基を示
   す）、R₃は−（CH₂）_３−NH−Ｃ（＝NH）−NH₂を示す。
2. 【請求項２】R₁が炭素原子数５〜８のアルキル基、また
   はフェニルまたはシクロヘキサンによって置換された炭
   素原子数１もしくは２のアルキル基である請求項２記載
   の化合物。
3. 【請求項３】R₁が３−メチルブチル、４−ヘプチル、２
   −シクロヘキシルエチルおよび２−フェニルエチルから
   成る群から選択される請求項２記載の化合物。
4. 【請求項４】R₂が−CO₂Hである請求項３記載の化合物。
5. 【請求項５】R₂が−CO₂CH₃、−CO₂CH₂CH₃または−CO₂CH
   ₂CH₂CH₃である請求項３記載の化合物。
6. 【請求項６】R₂が−CO₂CH₃である請求項５記載の化合
   物。
7. 【請求項７】R₂が （式中、Ｒ′は水素原子またはメチル基を示す）である
   請求項３記載の化合物。
8. 【請求項８】Ｒ′が水素原子である請求項７記載の化合
   物。
9. 【請求項９】Ｒ′がメチル基である請求項７記載の化合
   物。
10. 【請求項１０】下記の化合物群から選択される化合物：
11. 【請求項１１】次式： AcR−A₁−Ｌ−Pro−Arg−al （式中、AcRは疎水性アシル基を示し、A₁はグルタミン
    酸（Gla）もしくはアスパラギン酸（Asp）またはGluも
    しくはAspの等価基を示す） で表わされ、トロンビンおよび／または因子X aに対し
    て約200nMもしくはそれ以下のIC₅₀を有し、また、プラ
    スミンに対して、トロンビンもしくは因子X aに対する
    比較的小さなIC₅₀よりも大きなIC₅₀を有する化合物。
12. 【請求項１２】治療上許容されるキャリヤーおよび治療
    上有効量の請求項１〜11いずれかに記載の化合物を含有
    する、異常な血栓症によって特徴づけられる哺乳類の症
    状の予防用または治療用薬剤組成物。
13. 【請求項１３】異常な血栓症によって特徴づけられる症
    状の予防用または治療用薬剤を製造するために請求項１
    〜11いずれかに記載の化合物を使用する方法。