MXPA04012714A

MXPA04012714A - Derivados epimerizados del polisacarido k5 con un grado muy alto de sulfatacion.

Info

Publication number: MXPA04012714A
Application number: MXPA04012714A
Authority: MX
Inventors: Zoppeti Giorgio
Original assignee: Glycores 2000 Srl
Priority date: 2002-06-18
Filing date: 2003-06-17
Publication date: 2005-08-15
Also published as: MXPA04012721A; BR0312182A; EP1513880A1; NO20050247L; JP2005536577A; BR0312179A; WO2003106504A1; WO2003106505A1; DE60334617D1; MXPA04012805A; US7838644B2; CA2489862A1; US20060014718A1; WO2003106505A9; JP2005533878A; US20050245736A1; NZ537215A; NO20050244L; AU2003240191A1; BR0312197A

Abstract

Se describe un metodo novedoso para al sulfatacion en exceso de epiK5-N-sulfato para obtener un epiK5-amina-O-sulfato en exceso con un grado muy alto de sulfatacion, el cual, mediante una N-sulfatacion posterior, proporciona los derivados de epiK5-N, O-sulfato en exceso novedosos con un grado de sulfatacion de al menos 4, basicamente libres de la actividad sobre los parametros de coagulacion y la utilidad den el campo cosmetico o farmaceutico. Tambien se describen epiK5-N-sulfatos novedosos de bajo peso molecular utiles como intermediarios en la preparacion de los derivados de LMW-epiK5-N, o-sulfato en exceso correspondientes.

Description

DERIVADOS EPIMERIZADOS DEL POLISACÁRIDO K5 CON UN GRADO MUY ALTO DE SULFATACIÓN CAMPO DE IA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con derivados novedosos del polisacárido K5 con un grado muy alto de sulfatación, un proceso para su preparación, con los intermediarios novedosos bastante O-sulfatados útiles en su síntesis y con las composiciones farmacéuticas que contienen los derivados del polisacárido K5 como ingredientes activos básicamente libres de una actividad sobre la coagulación. En particular, la invención se refiere a un proceso para la preparación de epiK5-N, 0-sulfatos en exceso iniciando con un polisacárido K5, N-desacetilado previamente, N-sulfato y C5-epimerizado al menos al 20%, a través de una O-sulfatación en exceso en condiciones adecuadas y la posterior N-sulfatación, con los epiK5-N,0-sulfatos en exceso de actividad anti-angiogenética y antiviral y con los intermediarios novedosos de bajo peso molecular de los epi-K5-N-sulfatos .

ANTECEDENTES DE IA INVENCIÓN Los glucosaminoglicanos tales como por ejemplo heparina, sulfato de heparan, sulfato de dermatan, sulfato de condroitina y ácido hialurónico son biopolímeros que se extraen industrialmente de diversos animales. En particular, la heparina, principalmente obtenida por la extracción de la membrana mucosa intestinal de cerdos o del pulmón bovino, es un copolimero polidisperso con una distribución de peso molecular entre aproximadamente 3,000 hasta aproximadamente 30,000 D que consiste de una mezcla de cadenas que consiste básicamente en un ácido urónico (ácido glucurónico o ácido idurónico) y de un aminoazúcar (glucosamina) enlazados por los enlaces oc-1—»4 o ß-l—»4. En la heparina, la unidad urónica se puede O-sulfatar en la posición 2 y la unidad de glucosamina se N-acetila o N-sulfata, 6-O-sulfata, y 3-0-sulfata, en aproximadamente el 0.5% de las unidades de glucosamina presentes. Las propiedades y biosintesis natural de la heparina en mamíferos se ha descrito por Lindahl et al., 1986 en Lañe, D. andLindahl, ü. (Editores) "Heparin. Chemical and Biological Properties Clinical Applications", Edward Arnold, Londres, Páginas 159-190, por Lindahl, U, Feingold D. S. and Rodén L, 1986 TIBS, 11, 221-225 y por Conrad H. E. "Heparin Binding Proteins", Capítulo 2: Structure of Heparinoids. Academic Press, 1998. La biosintesis de heparina se presenta al iniciar con su precursor N-acetil-heparosan que consiste de una mezcla de cadenas que consiste de la unidad de disacárido repetitiva glucuronil-p-l~»4-N-acetilglucosamina . El precursor experimenta modificaciones enzimáticas que hidrolizan parcialmente en grupo N-acetilo sustituyéndolo con un grupo SO3, epimerizan el carboxilo en la posición 5 de una porción de las unidades glucurónicas convirtiéndolas en unidades idurónicas e introduciendo grupos O-sulfato para obtener un producto que, una vez extraído industrialmente, tiene aproximadamente el doble de grupos sulfato en lo que se refiere a los carboxilo por unidad de disacárido. Estas modificaciones enzimáticas conducen a, junto con, la formación de la región de pentasacáridos de un enlace con antitrombina III (ATIII) , denominada polisacárido activo, que es la estructura necesaria para el enlace de alta afinidad de la heparina con la ATIII y fundamental para la actividad anticoagulante y antitrombótica de la heparina misma. Este pentasacárido, presente sólo en algunas de las cadenas que forman la heparina, contiene una unidad de glucosamina sulfatada en la posición 3 y un ácido glucurónico separado entre ácidos idurónicos que contienen disacáridos . En la naturaleza, la formación del pentasacárido activo se hace posible mediante la reacción de epimerización del carboxilo de una porción de las unidades glucuronicas en unidades idurónicas portadas por la glucuronil-C5 epimeraza (C5-epimerización) y mediante una sulfatación adecuada que también conduce a la introducción de un grupo sulfato sobre el hidroxilo en la posición 3 de la glucosamina. Más particularmente, en la naturaleza la formación del pentasacárido activo se realiza por el hecho de que la C5-epimerización se presenta por grupos, es decir, sobre las porciones de cadenas, y extensivamente lo cual da por resultado en un producto que contiene más unidades idurónicas que glucuronicas. La heparina comercial, de hecho, contiene aproximadamente 70% de unidades idurónicas y 30% de unidades glucuronicas. Junto con las principales actividades anticoagulantes y antitrombóticas, la heparina también ejerce actividades antilipaémicas, antiproliferativas, antivirales, antitumurosas y antimetastáticas, aunque su uso como un fármaco se obstaculiza por los efectos secundarios debidos a la acción anticoagulante que puede provocar hemorragia.

TÉCNICA ANTERIOR Se sabe que el polisacárido K5 capsular aislado de Escherichia coli, descrito por Vann W. F. et al., en European Journal of Biochemistry, 1981, 116, 359-364 ("Vann 1981") , consiste de una mezcla de cadenas que consiste de la unidad de disacáridos repetitiva glucuronil-ß-?—»4-N-acetil glucosamina y por lo tanto muestra la misma secuencia repetitiva (A) del precursor N-acetil-heparosan de la heparina. El polisacárido K5 capsular, denominado en lo sucesivo como "polisacárido K5" o de manera más simple "K5", se modificó químicamente por Lormeau et al. según se describe en la US 5,550,116 y por Casu et al. según se describe en Carbohydrate Research, 1994, 263, 271-284. Los K5-0-sulfatos que tienen actividades antitumorosas, antimetastáticas, antivirales, y en particular anti-VIH se describen en la EP 333243 y en la O 98/34958. El K5 también se modificó química y enzimáticamente para obtener productos que tuvieron el mismo tipo de actividad biológica in vitro sobre la coagulación como el de la heparina extraída de órganos animales (heparina extractiva) . El logro de los productos que tienen una actividad sobre la coagulación del mismo tipo como el de la heparina extractivo se presenta por los procesos que imitan ese comportamiento en la naturaleza y prevén el paso clave total de la C5-epimerización con D-glucuronil C5 epimeraza. Los procesos descritos en IT 1230785, WO 92/17507, WO 96/14425 y WO 97/43317 utilizan K5 como el material de partida. El K5 que se origina de la fermentación se somete a N-desacetilación seguida por N-sulfatación y sobre el K5-N-sulfato asi obtenido se realiza la C5-epimerización con C5-epimeraza en solución, obtenida ya sea mediante cromatografía de un solución de enzimas microsomales de mastocitoma de ratón (IT 1230 785) o de hígado bovino (WO 92/17507, WO 96/14425 y WO 97/43317) . La D-glucuronil C5 epimeraza proveniente de hígado bovino se purificó por Campbell, P. et al . en J. Biol. Chem., 1994, 269/43, 26953-26958 ("Campbell 1994") quienes también suministraron esta composición en aminoácidos y describen su uso en solución para la transformación de un K5-N-sulfato en el producto epimerizado al 30% correspondiente, demostrando la formación de ácido idurónico mediante el método de HPLC seguido por una despolimerización nitrosa total a disacárido. El documento WO 98/48006 describe la secuencia de ADN que codifica para la D-glucuronil C5 epimeraza y una D-glucuronil C5 epimeraza recombinante, obtenida de un vector de expresión recombinante que contiene el ADN, después purificado por Campbell et al., como se muestra por Jin-Ping L. et al. en J. Biol Chem. 2001, 276, 20069-20077 ("Jin-Ping 2001") . La secuencia de C5-epimeraza completa se describió por Crawford B. E. et al. en J. Biol. Chem., 2001, 276(24), 21538-21543 (Crawford 2001) . El documento O 01/72848 describe un método para la preparación de los derivados de N-sulfato N-desacetilados del polisacárido K5, epimerizado al menos al 40% de ácido idurónico en lo que respecta al total de los ácidos urónicos, que tienen un peso molecular de 2,000 hasta 30,000, que contiene de 25 hasta 50% de cadenas de alta afinidad para ATIII y que tiene una actividad anticoagulante y antitrombótica expresada como la proporción HCII/antiXa de 1.5 hasta 4. El documento describe la sulfatación en exceso de un K5-N-sulfato, epimerizado al 40-60% y muestra que el producto obtenido, cuyo 13C-RMN se ilustra, tiene un contenido del grupo sulfato por unidad de disacárido de 2-3.5. Repitiendo la sulfatación en exceso mencionada anteriormente en las condiciones descritas y examinando la 13C-RMN se determinó que el producto obtenido realmente es una amina libre cuyo contenido de 6-O-sulfato es del 80-95%, que el del 3-0- d sulfato sobre el aminoazúcar es del 30%, pero cuyo grado de sulfatación es de 3.2. También se ha observado que en las condiciones de sulfatación en exceso descritas en la WO 01/72848 no se obtuvo un grado de sulfatación superior a 3.2. El documento US 2002/0062019 describe un proceso para la preparación de los epiK5-N, O-sulfatos , activos en el control de la coagulación que tienen un grado de sulfatación de 2.3 hasta 2.9 y un peso molecular de 2,000 hasta 30,000, o de 4,000 hasta 8,000, o de 18,000 hasta 30,000. El proceso mencionado anteriormente incluye los pasos: (p-a) . Una N-desacetilación del polisacárido K5 y una N-sulfatación de la K5-amina resultante, (p-b) una epimerización del 5-N-sulfato, (p-c) una O-sulfatación en exceso del epiK5-N-sulfato, (p-d) una O-desulfatación parcial, (p-e) una 6-0-sulfatación selectiva, (p-f) una N-sulfatación del producto asi obtenido, cualquier producto obtenido al término de cualquiera de los pasos (p-b) -(p-f) capaz de ser sometido a despolimerización. El documento describe un epiK5-N, O-sulfato que tiene un peso molecular de 7,400, obtenido mediante los pasos mencionados anteriormente (p-a) -(p-f) siguió por una despolimerización nitrosa al término del paso (p-f) , con un grado de sulfatación de 2.3 hasta 2.9. El mismo documento también describe una entidad de K5 con un peso molecular de aproximadamente 5, 000 que también se puede someter a los pasos (p-a) - (p-f) - Con el fin de estandarizar la terminología y hacer que el texto sea más comprensible, en la descripción de la presente se utilizarán términos o expresiones convencionales. En singular o plural. En particular: por "K5" o "polisacárido K5" se debe entender el polisacárido capsular proveniente de Escherichia coli obtenido mediante fermentación, es decir, una mezcla de cadenas que consiste de unidades de disacárido (A) que contienen opcionalmente un doble enlace en el extremo no reductor según se mostró anteriormente, en cualquier caso preparado y purificado de acuerdo con los métodos descritos en la literatura, en particular de acuerdo con Vann 1981, de acuerdo con Manzoni M. et al., Journal of Bioactive Compatible Polymers, 1996, 11, 301-311 (^Manzoni 1996") o de acuerdo con el método descrito en la WO 01/72848 y en la WO 02/068447; es evidente para alguien con experiencia en la técnica que lo que se muestra en lo sucesivo se puede aplicar a cualquier N-acetilheparosan; por "C5-epimeraza" se debe entender la D-glucuronil C-5-epimeraza, extractiva o recombinante, en cualquier caso preparada, aislada y purificada, en particular como se describe en Campbell 1994, en WO 98/48006, en Jin-Ping L. et al. en J. Biol Chem. 2001, 276, 20069-20077 (Jin-Ping 2001") o en Cra ford 2001; por K5-amina se debe entender un 5 N-desacetilado al menos al 95%, pero en el cual los grupos N-acetilo no se puedan detectar con un aparato de NMR normal; por "K5-N-sulfato" se debe entender un K5 N-desacetilado y N-sulfato al menos al 95%, normalmente 100% ya que los grupos N-acetilo están sin detectar con un aparato NMR normal, según se describirá en lo sucesivo; - por "epiK5" se debe entender el K5 y sus derivados en los cuales el 20-60% de las unidades glucorónicas está C5-epimerizado a unidades iduronicas; - por "epiK5-N-sulfato" se debe entender K5-N-sulfato en el cual el 20-60% de las unidades glucurónicas está C5-epimerizado a unidades iduronicas; por "epiK5-amina-0-sulfato en exceso" se debe entender una epiK5-amina O-sulfato con un grado de sulfatación de al menos 3.4; - por "epiK5-N, O-sulfato en exceso" se debe entender un epiK5-amina-0-sulf tado completamente N-sulfatado con un grado de sulfatación de al menos 4; además : los términos y expresiones convencionales en la presente definidos anteriormente se refieren a un K5 como se aisló después de la fermentación, en general con una distribución de peso molecular entre aproximadamente 1,500 hasta 50,000 con un peso molecular medio de 10,000-25,000, ventajosamente de 15,000-25,000; los términos y expresiones convencionales de la presente definidos anteriormente, cuando van precedidos por el acrónimo "LMW" (bajo peso molecular), por ejemplo LMW-K5-N-sulfato, LMW-epiK5-N-sulf to indican productos con bajo peso molecular, obtenidos mediante la fraccionación o mediante la despolimerización del K5-N-sulfato y que consisten o se derivan de K5-N-sulfatos que tienen un peso molecular medio entre aproximadamente 1,500 hasta 12,000 calculado en un producto N-sulfatado al 100%; los términos y expresiones convencionales según se definieron anteriormente en la presente, cuando van seguidos por "-derivado" indican como un todo tanto los derivados provenientes del K5 natural como aquellos de bajo peso molecular; por el término "aproximadamente" haciendo referencia al peso molecular, se debe entender el peso molecular medido mediante viscosimetria ± el peso teórico de una unidad de disacárido, incluyendo el peso del sodio, calculado como 461 en el caso de un derivado de epiK5-N-sulfato y 806 en el caso de un derivado de epiK5-N-0-sulfato en exceso con un grado de sulfatación de 4.26; - por la expresión "especie preponderante", se debe entender el compuesto que, en la mezcla que constituye el LMW-epiK5-N-sulfato, el LMW-epiK5-amina-sulfato en exceso o el LMW-epiK5-N, O-sulfato en exceso, es el tipo más representado, determinado por el pico de la curva del peso molecular medido mediante HPLC; a menos que se establezca específicamente de otra manera, por "grado de sulfatación" se debe entender la proporción SO3-/COO"", que se puede expresar como el número de grupos sulfato por unidad de disacárido, medido con el método conductométrico descrito por Casu B. et al. en Carbohydrate Research, 1975, 39, 168-176 (Casu 1975), el mismo utilizado en la WO 01/72848; por "condiciones de O-sulfatación en exceso" se debe entender una O-sulfatación extrema realizada, por ejemplo, de acuerdo con el método C descrito por B. Casu et al. en Carbohydrate Research, 1994, 263, 271-284 (Casu 1994); por el término "alquilo" se debe entender un alquilo lineal o ramificado, mientras que "tetrabutilamonio" denota el grupo tetra-n-butilamonio .

SOMRRIO DE IA INVENCIÓN Actualmente se ha encontrado sorprendentemente que, a diferencia de lo que presenta con los procesos descritos en IT 1230785, O 92/17507, O 96/14425, O 97/43317, WO01/72848 y la US 2002/0062019, iniciando con un epiK5-N-sulfato es posible obtener un epiK5-amina-0-sulfato en exceso con un grado mayor de sulfatación que con cada epiK5-amina-0-sulfato descrito en la literatura, por ejemplo en la WO 01/72848, al preparar la sal con una base orgánica terciaria o cuaternaria del epiK5-N-sulfato teniendo cuidado en dejar que la mezcla de reacción repose durante un periodo de tiempo de 30-60 minutos manteniendo el pH a aproximadamente 7 con la misma base orgánica y luego tratando la sal obtenida con un reactivo de 0-sulfatación en las condiciones de O-sulfatación en exceso. Sometiendo los epiK5-amina-0-sulfatos en exceso asi obtenidos a N-sulfatación, se obtienen epiK5-N,0-sulfatos en exceso novedosos que, a diferencia de los productos descritos en IT 1230785, WO 92/17507, WO 96/14425, WO 97/43317, WO 01/72848 y la US 2002/0062019, están libres de actividad sobre la coagulación y son útiles para la preparación de medicinas, en particular composiciones farmacéuticas de actividad antiangiogenética y antiviral o de composiciones cosméticas. Mediante la despolimerización con ácido nitroso de los LMW-epiK5-N, O-sulfatos en exceso se obtienen los epiK5-N, O-sulfatos en exceso novedosos, libre de actividad sobre la coagulación, y con actividad antiangiogenética y antiviral.

Para preparar los derivados de ?,?-sulf to N-desacetilados del polisacárido K5, el ácido idurónico epimerizado al menos al 40% en lo que se refiere al total de los ácidos urónicos y que tenga un bajo peso molecular de acuerdo con el método descrito en la WO 01/72848, se determinó que la despolimerización del producto de alto peso molecular obtenido al final del paso de N-sulfatación del proceso puede proporcionar resultados variables debido a que en general produce algunos productos despolimerizados que muestran mucha menor actividad, que los productos de alto peso molecular de los cuales provienen, en todos los parámetros de coagulación. Se asume que esto se lleva a cabo debido a que la degradación con ácido nitroso se ve influenciada por la presencia de los grupos sulfatos. En particular los sulfatos en la posición 3 de la glucosamina dan por resultado en productos heterogéneos, según se describe por Nagasawa et al. en Thrombosis Research, 1992, 65, 463-467 (Nagasawa 1992) . Actualmente se ha encontrado que al someter un epiK5-N-sulfato a despolimerización nitrosa en la cual el contenido de ácido idurónico en lo que respecta al total de ácidos idurónicos es del 20-60%, ventajosamente del 40-60%, de preferencia aproximadamente 50%, se obtienen los LMW-epiK5-N-sulfatos que constituyen los intermediarios eficaces novedosos para la preparación de los LMW-epiK5-N, O-sulfatos en exceso que tienen un alto grado de actividad sobre diferentes parámetros biológicos, con o sin actividad sobre los parámetros de coagulación. En particular, se ha encontrado que es posible despolimerizar un epiK5-N-sulfato para obtener los LMW-epiK5-N-sulfatos novedosos de peso molecular medio entre aproximadamente 2,000 hasta 4,000, más particularmente los MW-epiK5-N-sulfatos específicos que consisten de mezclas en las cuales el compuesto predominante es un decasacárido o un dodecasacárido o un tetradecasacárido . También estos LM -epiK5-N-sulfatos, que no se pueden obtener de otra manera, tienen interesantes propiedades biológicas y son intermediarios útiles para la preparación de LMW-epiK5-N, O-sulfatado en exceso de actividad antiviral y/o antiangiogenética y sorprendentemente libres de actividad sobre la coagulación. Al someter un LMW-epiK5-N-sulfato al método de salificación mencionado anteriormente con una base orgánica terciaria o cuaternaria, teniendo cuidado de dejar que la mezcla de reacción repose durante un período de tiempo de 30-60 minutos manteniendo el pH a aproximadamente 7 con la misma base orgánica y luego tratar la sal obtenida con un reactivo de O-sulfatación en las condiciones de O-sulfatación en exceso, se obtienen los LMW-epiK5-amina-0-sulfatos en exceso novedosos. Al someter el LMW-epiK5-amina-0-sulfato en exceso a N-sulfatación, se obtienen derivados N-sulfatados y 0-sulfatados en exceso novedosos (LMW-epiK5-N, O-sulfatado en exceso) sorprendentemente libres de actividad sobre la coagulación . y de actividad antiviral y/o antiangiogenética, útiles para la preparación de composiciones farmacéuticas o cosméticas. Estos LMW-epiK5-N-sulfatos se obtienen iniciando con un K5-N-sulfato con una reacción de epimerización con una C5-epimeraza recombinante aislada y purificada, inmovilizada en un soporte sólido, a una temperatura de aproximadamente 30 °C y a un pH de aproximadamente 7 durante 12-24 horas en presencia de un catión bivalente seleccionado entre calcio, magnesio, bario y manganeso y una posterior reacción de despolimerización nitrosa del producto epimerizado asi obtenido, o viceversa. Sorprendentemente, a partir de las observaciones hechas sobre el curso de la reacción de epimerización en las condiciones mencionadas anteriormente, es posible asumir que, contrario a lo que ocurre en la naturaleza en la biosintesis de la heparina, normalmente y no la C5-epimerización del tipo "grupos" del substrato se presenta cada 2 unidades de ácido glucurónico que conduce a los derivados de epi-K5-N-sulfato caracterizados por una unidad de tetrasacárido repetitiva que consiste de dos unidades glucosaminas separadas por una unidad glucurónica y seguida por una unidad idurónica o viceversa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De esta forma, de acuerdo con uno de sus aspectos, la presente invención proporciona un proceso para la preparación de derivados de epiK5-N, O-sulfato en exceso, caracterizado porque: (a) un derivado de K5-N-sulfato, en forma ácida, se trata con una base orgánica terciaria o cuaternaria, dejando que la mezcla de reacción repose durante un periodo de tiempo de 30-60 minutos, manteniendo el pH de la solución a un valor de 7 mediante la adición de la misma base orgánica terciaria o cuaternaria, y su sal se aisla con la base orgánica; (b) la sal de la base orgánica del derivado de epiK5-N-sulfato se trata con un reactivo de O-sulfatación en las condiciones de la O-sulfatación en exceso; (c) el derivado de epi-K5-amina-0-sulfato en exceso obtenido asi se trata con un reactivo de N-sulfatación y el derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso se aisla. En general, el derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso se aisla en la forma de sal de sodio y opcionalmente la sal de sodio se transforma en otra sal química o farmacéuticamente aceptable. En este contexto, el término "químicamente aceptable" se refiere a un catión que se puede utilizar en síntesis química, tal como por ejemplo, el ión de sodio, amonio (C1-C4) tetraalquilamonio o para la purificación del producto, mientas que "farmacéuticamente aceptable" se explica por sí mismo. Los cationes ventajosos son aquellos derivados de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio, (C1-C4) tetraalquilamonio, aluminio y zinc. Los cationes preferidos son los iones de sodio, calcio y tetrabutilamonio . De acuerdo con una forma ventajosa del procedimiento, el paso (a) se lleva a cabo al hacer pasar una solución de la sal de sodio del derivado de epiK5-N-sulfato, es decir, del polisacárido K5, N-desacetilado previamente, N-sulfatado, normalmente al 100%, y C5-epimerizado al 20-60% y opcionalmente despolimerizado con ácido nitroso, que tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 1,000 hasta 25,000, ventajosamente entre aproximadamente 1,500 hasta 25,000, a través de una resina de intercambio iónico ácida, por ejemplo del tipo IR-120 H+, recolectando el eluato incluyendo también el agua residual de la resina y neutralizando el eluato con la base orgánica terciaria o cuaternaria, de preferencia con una solución acuosa de hidróxido de tetrabutilamonio . La solución se deja reposar durante 1 hora, manteniendo su pH a 7 mediante la adición de la misma base y la sal así obtenida se aisla por liofilización. En el paso (b) , la O-sulfatación en exceso se presenta al utilizar un exceso del agente de O-sulfatación y trabajando a una temperatura de 20 hasta 70 °C durante un período de tiempo de hasta 24 horas en un solvente polar aprótico. Ventajosamente, la sal con una base orgánica terciaria o cuaternaria del derivado de epiK5-N-sulfato-derivativo, es decir, del polisacárido K5, N-desacetilado previamente, N-sulfatado de preferencia al 100%, y C5-epimerizado al 2-60% y opcionalmente despolimerizado con ácido nitroso, que tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 1,000 hasta 25,000, ventajosamente entre aproximadamente 1,500 hasta 25,000 como se aisló en el paso (a) , se disuelve en dimetilformamida y se trata con 2-10 moles de un reactivo de O-sulfatación por cada hidroxilo libre a una temperatura de 40-60 °C durante 10-20 horas. Como un reactivo de O-sulfatación se utiliza ventajosamente el aducto de piridina.S03 en una cantidad de 2.5-5 moles, de preferencia 2.5-4 moles por hidroxilo libre por disacárido y la reacción se lleva a cabo ventajosamente a 50-60 °C, de preferencia a 55 °C, durante la noche. El producto obtenido al término de la reacción se aisla mediante la adición de 0.1-1 volumen de agua y neutralización, de preferencia con hidróxido de sodio, precipitación con una solución saturada con cloruro de sodio en acetona, filtración y posible ultrafiltración. El producto asi obtenido en general es la sal de sodio de un derivado de epiK5-amina-0-sulfato en exceso que tiene un contenido de ácido idurónico de 20-60% del total de ácidos urónicos, que tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 3,500 hasta 40,000, ventajosamente entre aproximadamente 4,500 hasta 40,000 y un grado de sulfatación de al menos 3.4, ventajosamente de al menos 3.5, más ventajosamente de 3.55 hasta 4, de preferencia 3.55 hasta 3.8. La sal de sodio asi obtenida se puede convertir en otra sal. ? manera de ejemplo, se puede realizar un intercambio con el ión de calcio trabajando con membranas de ultrafiltración . En el paso (c), el derivado de epiK5-amina-0-sulfatado en exceso con un grado muy alto de sulfatación se N-sulfata utilizando los métodos de N-sulfatación conocidos en la literatura. En la práctica, la N-sulfatación se realiza mediante el tratamiento de una solución acuosa que contiene el derivado de epiK5-amina-0-sulfatado en exceso que se origina del (b) con carbonato de sodio y un agente de N-sulfatación, por ejemplo, un aducto de (Cl-C4 ) trialquilamina . SO3 o piridina . SO3, manteniendo la mezcla a 30-50 °C durante 8-24 horas y aislando el derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso, por ejemplo mediante diafiltración. Opcionalmente el paso de N-sulfatación se repite hasta obtener una substitución mayor al 95%, de preferencia completa. Los derivados de epiK5-N, O-sulfato en exceso novedosos asi obtenidos en general están en su forma de sal de sodio. La sal de sodio se puede convertir en otra sal química o farmacéuticamente aceptable. Las sales particularmente ventajosas son aquellas de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, de amonio, (C1-C4) tetraalquilamonio, aluminio y zinc. Se prefieren las sales de sodio, calcio y tetrabutilamonio . Los epiK5-N-sulfatos de partida sometidos al paso (a) del proceso de la presente invención se derivan de un polisacárido K5, N-desacetilado previamente, N-sulfatado virtualmente al 100%, y C5-epimerizado al 20-60%, venta osamente 40-60%, y opcionalmente despolimerizado con ácido nitroso, que tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 1,000 hasta 25,000, ventajosamente entre aproximadamente 1,500 hasta 25,000. De preferencia, el. material de partida es un epi-K5-N-sulfato que tiene un peso molecular medio entre 10,000 y 25,000 o un LMW-epiK5-N-sulfato que tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 1,000 hasta 12,000, venta osamente entre aproximadamente 1,000 hasta aproximadamente 10,000, de preferencia entre aproximadamente 1,500 hasta 8,000. Los epiK5-N-sulfatos , preparados mediante la C5-epimerización de los K5-N-sulfatos, son bien conocidos en la literatura y se describen ampliamente por ejemplo en la WO 92/17507, WO 01/72848, WO 98/14425, WO 97/43317 o la ÜS 2002/0062019. Su preparación mediante C5-epimerización de la unidad glucurónica del K5-N-sulfato con una D-glucuronil C5-epimeraza se describe en los documentos citados anteriormente en la presente. Un LMW-epiK5-N-sulfato que tiene un contenido de unidades idurónicas de aproximadamente 20%, obtenido mediante N-desacetilación, N-sulfatación y C5-epimerización de una entidad de K5 que tiene un peso molecular medio de 5,000 se describe en la WO 92/17507. Sin embargo, este LMW- 5-N-sulfato contiene una cantidad considerable de grupos acetilo. Un epiK5-N-sulfato con un contenido de ácido idurónico de 40-60%, particularmente ventajoso como un material de partida, es aquel obtenido por la epimerización de un K5-N-sulfato virtualmente libre de grupos acetilo, a su vez preparado de K5 particularmente puro, en particular que no contenga sustancias lipofílicas, descrito en la WO 02/068477. De acuerdo con una forma preferida del procedimiento, mediante epimerización se utiliza un K5-N-sulfato obtenido de un K5 libre de sustancias lipofílicas similar al descrito en la WO 02/068477 y la C5-epimerización se realiza con una D-glucuronil C5-epimeraza que se aisla, se purifica e inmoviliza en un soporte sólido, a un pH de aproximadamente 7, a una temperatura de aproximadamente 30 °C y durante un periodo de tiempo de 12-24 horas en presencia de al menos un ión bivalente seleccionado entre calcio, magnesio, bario y manganeso. Los LMW-epiK5- -sulfates que tienen un alto contenido de unidades idurónicas, en particular 40-60%, de preferencia 50-55%, son productos particularmente ventajosos, novedosos, como materiales de partida en la preparación de los derivados de LMW-epiK5-N, O-sulfato en exceso . Los LMW-epiK5-N-sulfatos como se mostraron anteriormente se preparan mediante un proceso caracterizado porque un K5-N-sulfato se somete, en cualquier un orden, (i) a C5-epimerización con una D-glucoronil C5-epimeraza que se aisla, se purifica y en solución o se inmoviliza en un soporte sólido, a un pH de aproximadamente 7, a una temperatura de aproximadamente 30 °c y durante un periodo de tiempo de 12-24 horas en presencia de al menos un ión bivalente seleccionado entre calcio, magnesio, bario y manganeso; y (ii) a una despolimerización nitrosa seguida opcionalmente por reducción, normalmente con borohidruro de sodio. La expresión "en cualquier orden" muestra que el proceso se puede llevar a cabo indistintamente tanto en la dirección (i)-(ii), es decir, en la secuencia mostrada anteriormente, así como también en dirección inversa, es decir, también en la dirección (ii)-(i), sometiendo el K5-N-sulfato en primer lugar a la reacción de despolimerización nitrosa, opcionalmente seguida por reducción con borohidruro de sodio, y después esto a C5-epimerización en las condiciones mencionadas anteriormente. El orden preferido es en la dirección (i)-»(ii). La secuencia (ii)-(i) de preferencia se utiliza iniciando con LMW-K5-N-sulfatos que tienen un peso molecular medio mayor a 4,000, de preferencia iniciando con aproximadamente 6,000. Por ejemplo, se puede determinar la cantidad del nitrito de sodio que, iniciando con 1 g del epiK5-N-sulfato, permite la obtención de un LMW-epiK5-N-sulfato con un peso molecular mayor a 4,000, en particular de al menos 6,000, con el fin de obtener intermediarios útiles para la preparación de los LM epi 5-N, O-sulfatos en exceso. De hecho, en este caso, en el paso (ii) se obtiene el porcentaje de epimerización óptima . De acuerdo con un aspecto preferido de la invención, la C5-epimeraza se inmoviliza en un soporte sólido inerte. La C5-epimeraza, de preferencia recombinante, se aisla y purifica por ejemplo de acuerdo con Campbell 1994, WO 98/48006, Jin-Ping 2001 o Cra ford 2001, se inmoviliza en un soporte inerte en presencia del sustrato, es decir, en presencia del derivado de K5-N-sulfato-de partida o en presencia del LMW-K5-N-sulfato, ventajosamente que tiene un peso molecular medio mayor a 4,000, de preferencia de al menos 6,000. La inmovilización se realiza de acuerdo con los métodos convencionales, por ejemplo como se describe en la WO 01/72848. La reacción de C5-pimerización se lleva a cabo al hacer recircular 20-1,000 mi de una solución HEPES 25 mm a un pH de aproximadamente 7 que contiene 0.001-10 g del sustrato (K5-N-sulfato o LMW-K5-N-sulfato, de preferencia con un peso molecular mayor a 4,000, en particular de al menos 6,000) y un catión seleccionado entre calcio, magnesio, bario y manganeso a una concentración entre 10 y 60 mm a través de una columna que contiene de 1.2 x 107 hasta 3 x 1011 cpm de la enzima inmovilizada, manteniendo el pH a aproximadamente 7 aproximadamente 30 °C, a un flujo de 30-220 m/hora durante un periodo de tiempo de 12-24 horas, ventajosamente 15-24 horas . De preferencia, la solución se hace recircular a un flujo de aproximadamente 200 mi/hora durante la noche (15-20 horas) . El producto obtenido se purifica y se separa de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, mediante ultrafiltración y precipitación con etanol. El producto asi obtenido es ya sea uno que consiste del epiK5-N-sulfato (y en tal caso se disuelve en agua y se somete a despolimerización) o un LMW-epiK5-N-sulfato (en tal caso constituye el producto final) . El porcentaje de epimerización, en la práctica la cantidad de unidades idurónicas en lo que respecta a las glucurónicas, se calcula utilizando 1H-RMN de acuerdo con el método descrito en la WO 96/4425. La reacción de despolimerización nitrosa se lleva a cabo de acuerdo con métodos conocidos mediante la despolimerización de heparina, por ejemplo, de acuerdo con el método descrito en la EP 37319, en la WO 82/03627 o de acuerdo con el método de despolimerización de un 5-N-sulfato descrito en la EP 544592, pero iniciando con un K5-N-sulfato o un epiK5-N-sulfato que contiene de 0 hasta no más del 10%, de preferencia no más del 5%, de grupos acetilo. De preferencia, la despolimerización, realizada con nitrito de sodio y ácido clorhídrico en un epiK5-N-sulfato virtualmente libre de grupos acetilo, se sigue por la reducción in situ con borohidruro de sodio. En la práctica, una solución acuosa fría de epiK5-N-sulfato se lleva a pH ácido (aproximadamente 2) con ácido clorhídrico y, todavía fría, se trata con nitrito de sodio manteniendo la temperatura 4°C) y el pH (aproximadamente 2) constante y, al término de la despolimerización (aproximadamente 15-30 minutos) la solución se neutraliza con hidróxido de sodio y se trata, todavía aproximadamente 4°C, con una solución acuosa de borohidruro de sodio. Al término de la reducción (aproximadamente 4 horas) el exceso que borohidruro de sodio se destruye con ácido clorhídrico, la solución se neutraliza con hidróxido de sodio y el producto despolimerizado (y reducido) se aisla de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo mediante precipitación directa con etanol o acetona. El producto obtenido al término de la despolimerización puede ser ya sea un LMW-epiK5-N-sulfato (en tal caso constituye el producto final) o un LMW-K5-N-sulfato (y en este caso se somete directamente a la C5-epimerización como se mostró en la presente anteriormente, después del aislamiento o también en solución sin haberse aislado anteriormente) , en particular cuando tiene un peso molecular medio mayor a 4,000, de preferencia de al menos 6,000, o se utiliza para preparar L W-K5-N, O-sulfatado en exceso con actividad antiangiogenética y antiviral. Al controlar aproximadamente la reacción de polimerización, en particular utilizando diferentes cantidades de nitrito de sodio/ácido clorhídrico, se obtienen los LMW-epiK5-N-sulfatos o LMW-K5-N-sulfatos que tienen un peso molecular medio en el intervalo total entre aproximadamente 1,500 hasta 12,000, ventajosamente entre aproximadamente 1,500 hasta 10,000, de preferencia entre aproximadamente 1,500 hasta 7,500, calculado en el espectro 13C-RMN a través de la integración de la señal atribuida al C2 de 2,5-anhidromanitol con el carbono anomérico de la glucosamina dentro de la cadena de polisacárido . De acuerdo con una forma general del procedimiento, iniciando por ejemplo, con 1 g del epiK5-N-sulfato, el producto de partida se disuelve en 100-200 mi de agua desionizada y se termostatiza a 4°C. Luego se agrega una cantidad de nitrito de sodio para obtener el peso molecular medio deseado, por ejemplo entre aproximadamente 2,000 hasta 4,000. Por lo tanto, iniciando con un epiK5-N-sulfato que tiene un peso molecular de 20,000 medido con el método HPLC equipado con una columna BioRad BioSil 250 y utilizando un estándar de heparina de peso molecular conocido, requerirá la adición de 330 hasta 480 mg de nitrito de sodio disuelto en una solución acuosa al 0.2%. La solución que contiene el epiK5-N-sulfato y el nitrito de sodio, mantenida a 4°C, se lleva a pH 2 a través de la adición de HC1 0.1 N enfriado a 4°C. Se deja reaccionar bajo agitación lenta durante 20-40 minutos, luego se neutraliza con NaOH 0.1 N. El producto obtenido se lleva a temperatura ambiente y se trata con un agente reductor tal como por ejemplo borohidruro de sodio (250-500 mg disuelto en 50-100 mi de agua) y se deja reaccionar durante 4-8 horas. El exceso de borohidruro de sodio se elimina llevando el pH a 5-5.5 con HC1 0.1 N y se deja reposar durante aproximadamente 2-4 horas adicionales. Al finalizar se neutraliza con NaOH 0.1 N y el producto se recupera mediante precipitación con acetona o etanol después de haber concentrado el producto mediante evaporación a presión reducida. Similármente, se puede determinar la cantidad de nitrito de sodio la cual, iniciando con 1 g de K5-N-sulfato o epiK5-N-sulfato, permite la obtención de un LM -K5-N-sulfato o un LMW-epi 5-N-sulfato con un peso molecular medio entre aproximadamente 4,000 hasta 12,000, ventajosamente entre aproximadamente 4,000 hasta 7,500, en particular de 6,000-7,500. El LMW-epiK5-N-sulfato asi obtenido, con un contenido de ácido idurónico de 20 hasta 60%, venta osamente de 40 hasta 60%, de preferencia de 50-55% y virtualmente libre de N¾ y grupos N-acetilo, que tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 1,500 hasta 12,000, ventajosamente entre aproximadamente 1,500 hasta 10,000, de preferencia entre aproximadamente 1,500 hasta 7,500 y sus sales química o farmacéuticamente aceptables constituye los productos novedosos útiles como materiales de partida particularmente interesantes en la preparación de los LMW-epiK5-N, O-sulfatos en exceso, aunque también por sí mismos útiles como ingredientes activos de las composiciones farmacéuticas o cosméticas y constituyen un aspecto adicional de la presente invención. Venta osamente, los materiales de partida en la preparación de los derivados de epi 5-N, O-sulfato en exceso de la presente invención son derivados de epi 5-N-sulfato que consisten de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula I: en la cual las unidades urónicas son 20-60% que consisten de ácido idurónico, n es un número entero de 2 hasta 100, ventajosamente de 3 hasta 100 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable. Más ventajosamente, los derivados de epiK5-N-sulfato de partida consisten de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula I en la cual las unidades urónicas son del 40-60% que consisten de ácido idurónico, n es un número entero de 2 hasta 100, venta osamente de 3 hasta 100 y el catión correspondiente es químicamente aceptable. Los materiales de partida preferidos son los LMW-epiK5-N-sulfatos como se mostró anteriormente, que consisten de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula I en la cual las unidades urónicas son del 20-60% comprendidas ventajosamente del 40-60%, de preferencia 50-55%, de ácido idurónico, n es un número entero de 2 hasta 20, ventajosamente de 3 hasta 15 y el catión correspondiente es químicamente aceptable. En la práctica, los LMW-epiK5-N-sulfatos preferidos constan de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula I' : en la cual las unidades urónicas están comprendidas del 20-60%, ventajosamente 40-60%, de preferencia 50-55% de ácido idurónico, q es un número entero de 2 hasta 20, ventajosamente de 3 hasta 15, y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable . En este contexto, el término "químicamente" se refiere a un catión que se puede utilizar en síntesis química, tal como por ejemplo, los iones de sodio, amonio, (C1-C4 ) tetraalquilamonio, o para la purificación del producto . Los cationes ventajosos son aquellos derivados de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio, (C1-C4 ) tetraalquilamonio, aluminio y zinc. Los cationes preferidos son iones de sodio, calcio y tetrabutilamonio . Son particularmente interesantes los LMW-epiK5- N-sulfatos que consisten de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula I' en la presente anteriormente, obtenida por despolimerización nitrosa de los epiK5-N-sulfatos correspondientes mostrados anteriormente y la posible reducción posterior por ejemplo con borohidruro de sodio. Entre éstos, se prefieren los L W-epiK5-N-sulfatos que consisten de una mezcla de cadenas en la cual la especie preponderante tiene la fórmula I'a: en la cual las unidades urónicas son del 60-40% que consisten de ácido glucurónico y 40% hasta 60% de ácido idurónico, p es un número entero de 4 hasta 8. El peso molecular medio de estos productos está entre aproximadamente 2000 hasta 4000 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable. El origen de estos epiK5-N-sulfatos a partir de un paso de despolimerización nitrosa implica, en la reducción final de la mayoría de las cadenas en la mezcla de cadenas, la presencia de una unidad de 2,5-anhidromanosa o, en el caso de la reducción con por ejemplo, borohidruro de sodio, de 2 , 5-anhidromanitol de la estructura (a) : en la cual X representa un grupo formilo o un grupo hidroximetilo . Por lo tanto, la reducción final de la mayoría (60-70% de las cadenas) se representa realmente por la estructura (b) : en la cual X es como se definió anteriormente. La presencia de la estructura (a) no tiene ninguna influencia sobre las características químicas de los epiK5-N-sulfatos y sus derivados ya que cualesquiera sulfataciones podrían conducir a una posible introducción de uno o dos grupos sulfato que sin embargo no podrían mover significativamente el grado de sulfatación de los derivados O-sulfatados . Sin embargo, se prefiere que la despolimerización nitrosa esté seguida por la reducción por ejemplo con borohidruro de sodio ya que, de acuerdo con el proceso de la presente invención, los L W-epiK5-N-sulfatos se someten a reacciones de sulfatación y acilación cuya influencia, del radical de 2,5-an idromanosa de la estructura (a) , se desconoce el grupo formilo en el cual X representa el formilo. Además, la presencia de la estructura (a) no influye sobre la actividad biológica de los productos, según se demostró por 0stergaard P. B. et al. en Thrombosis Research, 1987, 45, 739-749 (0stergaard 1987) para las heparinas de bajo peso molecular. Los LMW-epi 5-N-sulfatos particularmente ventajosos de acuerdo con la presente invención consisten de mezclas de cadenas en las cuales la especie preponderante es un compuesto de la fórmula I'b: en la cual X es formilo o, de preferencia, hidroximetilo, m es 4, 5 ó 6, el catión correspondiente es un ión química o farmacéuticamente aceptable y las unidades glucurónicas e idurónicas están presentes alternativamente, iniciando con una unidad glucurónica o idurónica. En tal caso, la proporción glucurónica/idurónica es de 45/55 hasta 55/45, es decir, aproximadamente 50/50. El uso de la C5-epimeraza, de preferencia recombinante, de preferencia inmovilizada en un soporte sólido en las condiciones mostradas anteriormente por lo tanto no permite la epi erización "por grupos" de los derivados de K5-N-sulfato en los derivados de epiK5-N-sulfato como se presentan en la naturaleza, pero del tipo ordinario . De esta forma, de acuerdo con otro de sus aspectos, la presente invención proporciona el uso de la C5-epimeraza aislada y purificada, para la conversión de un derivado de K5-N-sulfato en un derivado epiK5-N-sulfato correspondiente caracterizado por una unidad de tetrasacárido repetitiva que consiste de dos unidades de glucosamina separadas por una unidad glucurónica y seguida por una unidad idurónica o separada por una unidad idurónica y seguida por una unidad glucurónica. La epimerización - se presenta óptimamente y se lleva a cabo sobre un derivado de K5-N-sulfato que tiene un peso molecular medio mayor a 4,000, de preferencia de 6,000 hasta 7,500. De acuerdo con la presente invención, los derivados de epi 5-N-sulfato de partida, de preferencia N-sulfatados al 100% (en particular los derivados de epiK5-N-sulfato que consisten de mezclas de cadenas en las cuales al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula I o í' o en las cuales la especie preponderante tiene la fórmula I'a o I'b donde X es hidroximetilo) , se someten a los pasos (a) y (b) mencionados anteriormente, al término de lo cual se aislan los derivados de epiK5-amina-0-sulfato en exceso novedosos, correspondientes, en los cuales la amina no se sustituye, normalmente en forma de sal de sodio, que se puede transformar en otra sal química o farmacéuticamente aceptable. Las sales particularmente ventajosas son aquellas de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio, (Ca-C4) tetraalquilamonio, aluminio y zinc y, entre estas, se prefieren las sales de sodio, calcio y tetrabultilamonio . De esta forma, de acuerdo con otro de sus aspectos, la presente invención se refiere a derivados de epiK5-amina-0-sulfato en exceso novedosos y sus sales quimica o farmacéuticamente aceptables, que se pueden obtener mediante un proceso caracterizado porque: (a) un derivado de epiK5-N-sulfato, en forma ácida, se trata con una base orgánica terciaria o cuaternaria, dejando que la mezcla de reacción repose durante un periodo de 30-60 minutos, manteniendo el pH de la solución a un valor de 7 mediante la adición de la base orgánica terciaria o cuaternaria y su sal se aisla con la base orgánica; (b) la sal de la base orgánica del derivado de epiK5-N-sulfato se trata con un reactivo de O-sulfatación en las condiciones de la O-sulfatación en exceso y el derivado de epiK5-amina-0-sulfato en exceso se aisla. Utilizando, como los materiales de partida ventajosos del paso (a) , los derivados de epiK5-N-sulfato que consisten de una mezcla de cadena en la cual al menos el 90% de las cadenas tiene la fórmula I mencionada anteriormente, en la cual las unidades urónicas son el 20-60% que consisten de ácido idurónico, n es un número entero de 3 hasta 100 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable, al finalizar el paso (b) se obtiene un derivado de epiK5-amina-0-sulfato en exceso que consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula II: en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, n es un número entero de 2 hasta 100, de preferencia de 3 hasta 100, R, R' y R" son hidrógeno o S03-, para un grado de sulfatación de al menos 3.4, ventajosamente de al menos 3.5, de manera más ventajosa de 3.55 hasta 4, de preferencia de 3.55 hasta 3.8 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable. Estos derivados de epiK5-amina-0-sulfato en exceso con un grado muy alto de sulfatación son productos novedosos útiles como intermediarios en la preparación de sus derivados de N-sulfato o N- (C2-C ) acilado básicamente libres de la actividad sobre los parámetros de coagulación, pero que tienen otras propiedades farmacológicas interesantes. Los derivados de epiK5-amina-0-sulfato en exceso ventajosos con un grado muy alto de sulfatación consisten de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula II en la cual las unidades urónicas son del 40-60% que consisten de ácido idurónico, n es un número entero de 2 hasta 100, de preferencia de 3 hasta 100, con un peso molecular medio entre aproximadamente 2,000 hasta 40,000, ventajosamente entre 4,500 hasta 40,000, R es al menos 40%, de preferencia 50-80% de SO3-, R' y R" son ambos SO3- o uno es hidrógeno y el otro es 5-10% de SO3- en ácido glucuronico monosulfatado y 10-15% de SO3- en ácido idurónico monosulfatado, el grado de sulfatación es mayor a 3.4, ventajosamente de al menos 3.5, más ventajosamente de 3.55 hasta 4, de preferencia de 3.55 hasta 3.8, y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable. Los derivados de epiK5~amina-0-sulfato en exceso preferidos con un grado muy alto de sulfatación son L W-epiK5-amina-0-sulfatos en exceso que consisten de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula II en la cual las unidades urónicas están comprendidas del 40-60%, de preferencia 50-55%, de ácido idurónico, R es al menos 40%, ventajosamente 50-80%, de preferencia aproximadamente 65% de S03-, R' y R" son ambos S03- o uno es hidrógeno y el otro es 5-10% de SO3- en ácido glucurónico y 10-15% de SO3- en ácido idurónico, n es un número entero de 2 hasta 20, ventajosamente de 3 hasta 15, con un peso molecular medio entre aproximadamente 4,000 hasta 8,000 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable. En la práctica, los LMW-epiK5-amina-0-sulfatos en exceso preferidos consisten de una mezcla de cadena en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula II' : en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, q es un número entero de 2 hasta 20, ventajosamente de 3 hasta 15, R, R' y R" son hidrógeno o SO3-, para un grado de sulfatación de al menos 3.4, ventajosamente de al menos 3.5, más ventajosamente de 3.55 hasta 4, de preferencia de 3.55 hasta 3.8, y el catión correspondiente es un ión química o farmacéuticamente aceptable. Entre estos LMW-epiK5-amina-0-sulfatos en exceso se prefieren aquellos que consisten de una mezcla de cadenas en la cual la especie preponderante tiene la fórmula II' a: en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, p es un número entero de 4 hasta 8, R, R' y R" son como se definieron anteriormente, el grado de sulfatación es de al menos 3.4, ventajosamente de al menos 3.5, más ventajosamente de 3.55 hasta 4, de preferencia de 3.55 hasta 3.8 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable. El origen de los LMW-epiK5-amina~0-sulfatos en exceso novedosos a partir de los LMW-epiK5-sulfatos obtenidos mediante la despolimerización nitrosa y la posterior reducción con, por ejemplo, borohidruro de sodio, implica, en la reducción final de la mayoría de las cadenas en la mezcla de cadenas, la presencia de una unidad de 2 , 5-anhidromanitol sulfato de la estructura en la cual R" representa hidrógeno o S03-. De esta forma, la reducción final de la mayoría de las cadenas en la mezcla de cadenas se representa por la estructura (b' ) : en la cual la unidad urónica puede ser glucurónica o idurónica. Entre los LMW-epiK5-amina-0-sulfatos en exceso novedosos mencionados anteriormente, se prefieren aquellos que consisten de mezclas en los cuales la especie preponderante es un compuesto de la fórmula II' b: en la cual las unidades urónicas son del 40-60% que consisten de ácido idurónico, m es 4, 5 ó 6, R, R' y R" son hidrógeno o S03-, X" es OH u OS03-, para un grado de sulfatación de al menos 3.4, ventajosamente de al menos 3.5, más ventajosamente de 3.55 hasta 4, de preferencia de 3.55 hasta 3.8, las unidades idurónicas están presentes alternativamente, iniciando con una unidad glucurónica o idurónica, y el catión correspondiente es un ión química o farmacéuticamente aceptable. Todos estos derivados de epiK5-amina-0-sulfatados en exceso con un grado muy alto de sulfatación son productos novedosos que son intermediarios útiles para la preparación de los derivados de epiK5-amina-0-sulfatados en exceso N-sustituidos y por lo tanto constituyen un aspecto adicional de la presente invención. En particular, de acuerdo con otro de sus aspectos, la invención se relaciona con el uso de los derivados de epiK5-amina-0-sulfatados en exceso mencionados anteriormente con un grado muy altos de sulfatación para la preparación de los derivados de epiK5-amina-O-sulfatados en exceso N-sustituidos, novedosos, en particular N-sulfatados o N-acilados. Al término del paso (c) del proceso de la presente invención, que consiste de una N-sulfatación de los derivados de epiK5-amina-0-sulfato en exceso obtenidos al final del paso (b) (en particular los derivados de epiK5-amina-0-sulfatos en exceso que consisten de mezclas de cadenas en las cuales al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula II o II' o en las cuales la especie preponderante tiene la fórmula II' a o II' b) se obtienen los derivados de epiK5-N, O-sulfato en exceso cuyo contenido de ácido idurónico es del 20-60% del total de los ácidos urónicos y cuyo grado de sulfatación es al menos 4, de preferencia de 4 hasta 4.6. De esta forma, de acuerdo con otro de sus aspectos, la presente invención proporciona derivados N-desacetilados novedosos del polisacárido K5, O-sulfatados y N-sulfatados , C5-epimerizado a ácido idurónico en al menos 20% del total de las unidades urónicas, que tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 2,000 hasta 45,000, un grado de sulfatación de al menos 4, los derivados están básicamente inactivo en los parámetros de coagulación. Similarmente a lo establecido anteriormente, los derivados novedosos se denotan, como un todo, mediante el término general "derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso", independientemente de su peso molecular. En particular, el peso molecular medio está entre aproximadamente 2,000 hasta 45,000 ya que los derivados se originan ya sea de un epi-K5-N-sulfato obtenido por N-desacetilación y N-sulfatación del K5 por fermentación o por la despolimerización nitrosa del último . Al controlar la despolimerización nitrosa es posible obtener derivados de bajo peso molecular en virtualmente todos los intervalos mencionados anteriormente . Sin embargo, para el uso de los derivados de la presente invención como productos farmacéuticos o cosméticos es ventajoso preparar derivados de bajo peso molecular, con un peso molecular medio entre aproximadamente 2,000 hasta 16,000, ventajosamente entre aproximadamente 3,500 hasta 13,000 con una distribución de peso molecular entre aproximadamente 1,000 hasta 15,000, de preferencia entre aproximadamente 4,500 hasta 9,000, con una distribución de peso molecular entre aproximadamente 2,000 hasta 10,000, o de derivados de alto peso molecular, que se originan del K5 ultrafraccionado, con un peso molecular medio entre aproximadamente 20,000 hasta 45,000, con una distribución de peso molecular entre aproximadamente 2,000 hasta 70,000. En los derivados de epiK5-N, O-sulfato en exceso de la presente invención el derivado de sulfatación es muy alto, de preferencia de 4 hasta 4.6, el nitrógeno de la glucosamina está sulfatado virtualmente al 100%. Además, los derivados de epiK5-N, O-sulfato en exceso están 6-0-sulfatados al 100% y 3-O-sulfatados al 50-80% en sus unidades de glucosamina, 3-O-monosulfatados al 5-10% en unidades glucurónicas, O-monosulfatados al 10-15% en unidades idurónicas y 2.3-di-O-sulfatados en las unidades urónicas restantes, considerando que el grado de sulfatación es al menos 4. Los derivados de epiK5-N, O-sulfato en exceso ventajosos de acuerdo con la presente invención se obtienen a través de los derivados de epiK5-amina-0-sulfato en exceso a su vez preparados a partir de los derivados de epiK5-N-sulfato que consisten de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tiene la fórmula I mencionada anteriormente, en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, n es un número entero de 2 hasta 100, ventajosamente de 3 hasta 100 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable. En tal caso, los derivados de epiK5-N, O-sulfato en exceso novedosos consisten de mezclas de cadenas en las cuales al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III: en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, n es un número entero de 2 hasta 100, de preferencia de 3 hasta 100, R, Rr y R" son hidrógeno o SO3-, Z es SO3-, el grado de sulfatación es al menos 4, de preferencia de 4 hasta 4.6 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable. Los cationes son ventajosamente aquellos de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio, (Ci~ C4) tetraalquilamonio, aluminio y zinc y, entre estos, de preferencia las sales de sodio, calcio y tetrabutilamonio . Entre los derivados de epiK5~amina-N, O-sulfato en exceso mencionados anteriormente, aquellos que consisten de mezclas de cadenas en las cuales al menos el 90% de las cadenas tiene la fórmula III mencionada anteriormente en la cual R es SO3- en 50%-80%, de preferencia en aproximadamente 65% de las cadenas y el grado de sulfatación es al menos 4, ventajosamente es de 4 hasta 4.6, de preferencia de 4 hasta 4.3. Los derivados de epi 5-N, O-sulfato en exceso ventajosos con un grado muy alto de sulfatación consisten de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III, en la cual Z es SO3-, las unidades urónicas son del 40-60% que consisten de ácido idurónico, n es un número entero de 2 hasta 100, de preferencia de 3 hasta 100, con un peso molecular medio entre aproximadamente 2,000 hasta 45,000, ventajosamente entre aproximadamente 4,500 hasta 45,000, R es al menos 40%, de preferencia 50-80% de S03-, R' y R" son ambos S03-o uno es hidrógeno y el otro es 5-10% de S03- en ácido glucurónico monosulfatado y 10-15% de S03- en ácido idurónico monosulfatado, el grado de sulfatación es al menos 4, de 4 hasta 4.6 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable. Los derivados de epiK5-amina-0-sulfatado en exceso N-sustituidos son LMW-epi 5-amina-0-sulfatados en exceso que consisten de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III en la cual las unidades urónicas son del 40-60% comprendidas, de preferencia del 50-55% de ácido idurónico, R es al menos 40%, ventajosamente 50-80%, de preferencia aproximadamente 65% de SO3-, R' y R" son ambos S03- o uno es hidrógeno y el otro es 5-10% de S03- en ácido glucurónico y 10-15% de SO3-en ácido idurónico, Z es SO3- al 100% o (C2-C4) acilo, n es un número entero de 2 hasta 20, de preferencia de 3 hasta 15, con un peso molecular medio entre aproximadamente 4,000 hasta 8,500 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable. En la práctica, los derivados de epiK5-N,0-sulfatos preferidos con un grado muy alto de sulfatación consisten de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III' : en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, q es un número entero de 2 hasta 20, ventajosamente de 3 hasta 15, R, R' y R" representan hidrógeno o un grupo S03-, Z es SO3-, para un grado de sulfatación de al menos 4, de preferencia de 4 hasta 4.6 y el catión correspondiente es un ión química o farmacéuticamente aceptable. Son particularmente interesantes las mezclas de la fórmula III' en la cual las unidades urónicas son del 40-60% comprendidas, de preferencia del 50-55%, de ácido idurónico, R es al menos 40%, ventajosamente 50-80%, de preferencia aproximadamente SO3- al 65%, R' y R" son ambos SO3- o uno es hidrógeno y el otro es SO3- al 5-10% en ácido glucurónico y SO3- al 10-15% en ácido idurónico, n es un número entero de 2 hasta 20, ventajosamente de 3 hasta 15, con un peso molecular medio entre aproximadamente 2,000 hasta 16,000, ventajosamente entre aproximadamente 3,500 hasta 13,000, de preferencia entre aproximadamente 4,500 hasta 9,000 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable. Entre estos LM -epiK5-N, O-sulfatos en exceso, son ventajosos aquellos que consisten de una mezcla de cadenas en la cual la especie preponderante tiene la fórmula III' a: en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, p es un número entero de 4 hasta 8, Z es S03-, Rr R' y R" son hidrógeno o S03-, para un grado de sulfatación de al menos 4, de preferencia de 4 hasta 4.6 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable. El origen de los LM -epiK5-N, O-sulfatos en exceso novedosos a partir de los LMW-epiK5-sulfatos obtenidos mediante la despolimerización nitrosa y la posterior reducción con, por ejemplo, borohidruro de sodio implica, en la reducción final de la mayoría de las cadenas de la mezcla de cadenas, la presencia de una unidad 2, 5-anhidromanitol sulfatada de la estructura (a') como se mostró anteriormente en la cual R" representa hidrógeno o SO3-. De esta forma, la reducción final de la mayoría de las cadenas en la mezcla de cadenas se representa por la estructura (b") : en la cual Z representa S03- y la unidad urónica puede ser glucuronica o idurónica. Entre los LM -epiK5-N, O-sulfatos en exceso novedosos, mencionados anteriormente, se prefieren aquellos que consisten de mezclas en las cuales la especie preponderante es un compuesto de la fórmula III' b: en la cual R, R' y R" son hidrógeno o S03-, Z es S03-, X" es OH o OSO3-, m es 4,5 ó 6, para un grado de sulfatación de al menos 4, de preferencia de 4 hasta 4.6, las unidades urónicas están presentes alternativamente, iniciando con una unidad glucurónica o idurónica, y el catión correspondiente es un ión química o farmacéuticamente aceptable. Los cationes son venta osamente aquellos de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio, (C1-C4) tetraalquilamonio, aluminio y zinc y, entre estos, de preferencia los preferencia los iones de sodio, calcio y tetrabutilamonio . Si se utiliza un epi 5 como un derivado de epiK5 de partida del proceso de la presente invención, es decir, un polisacárido K5, N-desacetilado previamente, N-sulfatado normalmente al 100%, y C5-epimerizado al 20-60% y no despolimerizado, al finalizar el paso (c) se aisla un epiK5-N, O-sulfato en exceso que se puede someter a despolimerización nitrosa y una posible reducción posterior con, por ejemplo, borohidruro de sodio para obtener el LMW-epiK5-N, O-sulfato en exceso correspondiente que tenga el mismo grado de sulfatación. En particular, se obtienen los LMW-epiK5-N, O-sulfatos en exceso que consisten de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III' o III' a en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, q, R, R' , R" y Z tienen el significado definido anteriormente, para un grado de sulfatación de al menos 4, de preferencia de 4 hasta 4.6 y el catión correspondiente es un ión química o farmacéuticamente aceptable. En tal caso, el origen de estos LMW-epiK5-N, 0-sulfatos en exceso a partir de una reacción de despolimerización y una posible reducción posterior con, por ejemplo, borohidruro de sodio implica, en la reducción final de la mayoría de las cadenas en la mezcla de cadenas, la presencia de una unidad de 2 , 5-anhidromanano de la estructura (a") : en la cual X es formilo o hidroximetilo y R" representa hidrógeno o S03-. Los derivados de epiK5-N, O-sulf to en exceso novedosos, especialmente en su forma salina, son productos bastante aniónicos capaces de capturar los radicales libres y se pueden utilizar en la industria de los cosméticos como adyuvantes contra la pérdida del cabello o para preparar cremas "anti-envejecimiento" y, en la industria farmacéutica, como productos para el tratamiento de dermatitis. Además, los derivados de epiK5-N, O-sulfato en exceso de la presente invención, en particular los LMW-epiK5-N, O-sulfatos en exceso poseen actividad anti-angiogenética y antiviral y por lo tanto constituyen los ingredientes activos para la preparación de medicinas. De esta forma, de acuerdo con un de sus aspectos adicionales, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen, como uno de sus ingredientes activos, una cantidad farmacológicmaente activa de un derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso como se mostró anteriormente o de una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en mezcla con un excipiente farmacéutico . En las composiciones farmacéuticas de la presente invención para administración oral, subcutánea, intravenosa, transdérmica o tópica, los ingredientes activos de preferencia se administran en la forma de unidades de dosificación, en mezcla con los excipientes o vehículos farmacéuticos clásicos. La posología puede variar ampliamente dependiendo de la edad, peso y la condición de salud del paciente. Esta posologia incluye la administración de una dosis de 1 mg hasta 1000, venta osamente de 10 mg hasta 750 mg, de preferencia 250 hasta 500 de una a tres veces al dia mediante administración intravenosa, subcutánea, oral, transdérmica o tópica. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se formulan con los excipientes clásico adecuados para diferentes formas de administración. Son particularmente ventajosas las formulaciones en la forma de cremas, ungüentos, linimentos, geles, espumas, bálsamos, óvulos vaginales, supositorios, soluciones o suspensiones adecuados para administración local. Ventajosamente, las composiciones de la presente invención incluyen, como uno de sus ingredientes activos, un derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso que se puede obtener iniciando con un derivado de epiK5 de acuerdo con los pasos (a), (b) y (c) del ' proceso descrito anteriormente, o iniciando con un epiK5 no despolimerizados, de acuerdo con los pasos (a) , (b) y (c) del proceso descrito anteriormente, con una posible despolimerización nitrosa posterior después del paso (c), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en mezcla con un excipiente farmacéutico. Ventajosamente, el derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III o III' o en la cual la especie preponderante es un compuesto de la fórmula III' a o III' b. El ingrediente activo preferido es un LMW-epiK5-?,?-sulfato en exceso que tiene un grado de sulfatación de al menos 4, de preferencia de 4 hasta 4.6, ventajosamente que tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 3,500 hasta 11,000, más venta osamente entre aproximadamente 3,500 hasta 5,200 y básicamente libre de grupos N-acetilo. Por último, de acuerdo con otro de sus aspectos, la presente invención proporciona una composición cosmética que incluye una cantidad eficaz de un derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en mezcla con un excipiente cosmético . Una sal seleccionada del grupo que consiste de sales de sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio y zinc de los derivados de epiK5-N, O-sulfato en exceso, en particular aquellos que, consisten de mezclas de cadenas en las cuales al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III o III' o en las cuales la especie preponderante tienen la fórmula III' a o III' b, constituye un ingrediente activo eficaz de las composiciones farmacéuticas o cosméticas de la presente invención. Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitarla.

PREPARACIÓN I Preparación del polisacárido K5 a partí Escherichia coli Se llevó a cabo una primera fermentación matraz Erlenmeyer utilizando el siguiente medio : Harina de soya desgrasada 2 g/i K2HP04 9.7 g/i KH2P04 2 g/l MgCl2 0.11 g/i Citrato de sodio 0.5 g/l Sulfato de amonio 1 g/i Glucosa 2 g/l Agua de manantial 1000 mi pH = 7.3 El medio se esterilizó a 120 °C durante 20 minutos. La glucosa se preparó por separado en forma de solución que se esterilizó a 120 °C durante 30 minutos y se agregó estéril al medio. El matraz Erlenmeyer se inoculó con una suspensión de células de E. coli Bi 8337/41 (O10:K5:H4) que se originan de un tubo mantenido en agar de soya Triptica, y se incuban a 30 °C durante 24 horas bajo agitación controlada (160 rpm, impulso de 6 cm) . El desarrollo bacteriano se midió mediante el conteo de las células utilizando el microscopio. En una operación posterior, un termentador Chemap-Braun de 14 1 que contenía el mismo medio como el anterior, se inoculó al 0.1% con el cultivo del matraz Erlenmeyer como en lo anterior y la fermentación se realizó mediante la aeración de 1 vvm, (vvm = volumen de aire por volumen de líquido por minuto) agitación de 400 rpm y temperatura de 3 °C durante 18 horas. Durante la fermentación se midieron el pH, el oxígeno, el residuo de glucosa, el polisacárido K5 producido y el desarrollo bacteriano. Al término de la fermentación la temperatura se llevó a 80°C durante 10 minutos. Las células se separaron del medio a través de centrifugación a 10, 000 rpm y el sobrenadante se ultrafiltró utilizando un módulo SS 316 (MST) ajustado con una membrana PES a un corte nominal de 800 y 10,000 D para reducir el volumen a 1/5. El polisacárido K5 luego se precipitó mediante la adición de 4 volúmenes de acetona a 4°C y se dejó sedimentar durante la noche a 4°C. Por último, se recuperó mediante centrifugación a 10,000 rpm durante 20 minutos o filtración. La desproteinización del sólido obtenido se llevó a cabo utilizando una proteasa tipo II proveniente del Aspergillus orizae en un amortiguador de NaCl 0.1 M y EDTA 0.15 M a pH 8 que contenía SDS (dodecil sulfato de sodio al 0.5%) (10 mg/1 del filtrado) a 37 °C durante 90 minutos. La solución obtenida se ultrafiltró en el modelo SS 316 con membrana a un corte nominal de 10, 000 D con 2 extracciones con NaCl 1 M y lavado con agua hasta la desaparición de la absorbancia en el 'ultrafiltrado . El polisacárido K5 luego se precipitó con acetona y se obtuvo un rendimiento de 850 mg por litro del termentador . La pureza del polisacárido obtenido se midió a través de la determinación de los ácidos urónicos (método de carbazol) , 13 N R protónica y de carbono, UV y contenido de proteina. La pureza es mayor al 80%. El polisacárido obtenido se compuso de dos entidades de diferente peso molecular, respectivamente 30,000 y 5,000 D a medida que emerge de la determinación mediante HPLC utilizando una columna Pharmacia 75 HR y una entidad individual con un tiempo de retención de aproximadamente 9 minutos utilizando dos columnas en serie de Bio-sil SEC 250 (Bio Rad) y Na2S04 como la fase móvil a temperatura ambiente y un flujo de 0.5 mi/minuto. La medición se realizó contra una curva estándar obtenida con entidades de heparina de peso molecular conocido. El espectro de 1H-RMN del K5 purificado de esta forma obtenido mostró diferentes señales que se pueden atribuir a los metilos de las sustancias lipofilícas.

PREPARACIÓN II Purificación del K5 En 100 mi de una solución acuosa saturada de cloruro de sodio y termostatizada a 4°C se disolvió 1 g del K5 obtenido al final de la PREPARACIÓN I y a la solución asi obtenida se agregaron 3 volúmenes de isopropanol frió. La concentración salina de la solución se llevó a 3 M mediante la adición de la cantidad calculada de una solución saturada de cloruro de sodio y la solución , obtenida se dejó en un entorno frió (aproximadamente 4°C) durante la noche. El precipitado que se formó se separó mediante centrifugación a 10,000 rpm durante 20 minutos y la pureza del producto se verificó mediante diálisis durante la noche y una examinación posterior del espectro 1H-RMN, a partir del cual las señales en la región bajo 1.5 ppm deben estar ausentes. Opcionalmente, se repitió la operación de disolución en agua saturada con NaCl y precipitación con isopropanol. El precipitado se disolvió en agua y se ultrafiltró en una membrana Miniplaca Millipore que corte 10,000 D hasta la desaparición de las sales. De esta forma, se obtuvo un 5 que tenia una pureza de al menos 99% de cuyo espectro 1H-RMN no hubo trazas de impurezas lipofilicas resultantes en la región bajo 1.5 ppm.

PREPARACIÓN III Preparación de un K5-N-sulfato (i) N-Desacetilación Diez gramos del polisacárido K5 puro preparado como se describe en la PREPARACIÓN II se disolvieron en 1000 mi de hidróxido de sodio 2 N y la solución asi preparada se dejó a 60 °C durante 24 horas. La solución se llevó a temperatura ambiente luego a pH neutro (pH7) con ácido clorhídrico 6N. (11) N-sulf tación A la solución que contenia el K5 desacetilado, mantenida a 40 °C, se agregaron 16 g de carbonato sodio y después de esto y en 4 horas, 16 g de la piridina . S03- . Al finalizar la reacción, después de 24 horas, la solución se llevó a temperatura ambiente, luego a pH 6.5-7 con una solución al 5% de ácido clorhídrico. El producto se purificó de las sales mediante diafiltración utilizando una membrana enrollada helicoidalmente 1,000 D (cartucho Millipore a escala preparativa) . El proceso se terminó cuando la conductibilidad del permeado fue menor a 1000 ]iS, de preferencia menos a 100 µ? . La ultradiálisis se redujo hasta que se obtuvo una concentración al 10% del polisacárido utilizando el mismo sistema de diálisis en concentración. La solución concentrada se secó mediante liofilización. En el análisis de espectro 13C-RMN no aparecieron residuos de N-acetilo o NH2.

PREPARACIÓN IV LMN-K5-N-sulfato El producto obtenido según se describe en el Ejemplo 1, pasos (i) y (ii) , de la WO 02/068477 se despolimerizó mediante el método de degradación con ácido nitroso y una reducción posterior del aldehido que se forma. Se continúa disolviendo 1 g del K5-N~sulfato en 200 mi de agua destilada y agregándole 480 mg del nitrito de sodio disuelto en 240 mi de agua destilada. La solución luego se llevó a 4°C y el pH a 2 con HCl 0.1 N y mantenida durante 30 minutos. Al término de la reacción la solución se llevó a pH 7 con NaOH 0.1 M y luego a temperatura ambiente. La solución luego se agregó con 450 mg de NaBH4 y se dejó reaccionar durante 4 horas. El exceso de NaBH4 se eliminó con pH pasos 5-6 de la HCl. El producto, se neutralizó con NaOH 0.1 M, se recuperó mediante precipitación con 3 volúmenes de acetona a 4°C, la filtración con un embudo de filtrado y se secó a 40°C en un horno al vacio. Se obtuvo 900 mg de LM - 5-N-sulfato con un peso molecular medio de aproximadamente 2,000, consistiendo de una mezcla de cadenas mientras que la especie preponderante es un compuesto de la fórmula I'b en la cual m es 4 y las unidades urónicas son aquellas de ácido glucurónico.

EJEMPLO 1 LMN-epiK5-N-sulfato. Secuencia (i) Epimerización para epiK5-N-sulfato Se obtuvieron diez gramos de K5-N-sulfato como se describió en el Ejemplo 1, pasos (i) y (ii) , de la WO 02/068477, de cuyo espectro 1H-RMN no aparecieron señales que se relacionen con grupos acetilo o N¾, se disolvieron en 600 mi de amortiguador HEPES 22 mm a pH 7 , conteniendo CaCl2 a una concentración de 50 mm y la solución asi obtenida se hizo recircular a través de una columna de 50 mi rellena con resina Sepharose 4B que contenia 5 g de la C5-epimeraza recombinante (WO 96/14425) inmovilizada como se describe en el Ejemplo 1 de la WO 01/72848. La reacción se llevó a cabo a 30 Dc a un pH 7 con un flujo de 200 ml/h durante 24 horas. El producto obtenido se purificó mediante ultrafiltración y precipitación con etanol. De esta forma, se obtuvo un epiK5-N-sulfato cuyo contenido de ácido urónico es del 54%. (ii) Despolimerización del epiKS-N-sulfato. A una solución de 1 g del producto asi obtenido, en 25 mi de agua destilada, se agregaron 230 mg de nitrito de sodio disuelto en 115 mi de agua destilada. La solución luego se llevó a 40 °C y el pH a 2 con HC1 0.1 N y se mantuvo durante 30 minutos. Al término de la reacción la solución se llevó a temperatura ambiente y el pH a 7 con NaOH 0.1 M. La solución luego se agregó con 450 mg de NaBHí y se dejó reaccionar durante 4 horas. El producto se recuperó mediante precipitación con 3 volúmenes de acetona a 4°C, filtración con un embudo de filtrado y secó a 40 °C en un horno al vacio. Se obtuvieron 900 mg del LMW-epiK5-N-sulfato con un contenido de ácido idurónico del 54% y una distribución de peso molecular de 1,000 hasta 4,000, medida con el método HPLC.

EJEMPLO 2 MW-epiK5-N-sulfato. Secuencia (ii) —> (i) (ii) Despolimerizacion del K5~N-sulfato 2 g del K5-N-sulfato, obtenido según se describe en el Ejemplo 1, pasos (i) y (ii) , de la WO 02/068477, se despolimerizaron según se describió en la PREPRACIÓN I, utilizando 100 mg de nitrito de sodio y 300 mg de borohidruro de sodio. Se obtuvieron 1.8 g del LMW-K5-N-sulf to con un peso molecular medio de 5,000. (i) Epimexlzación del LMW-K5-N-sulfato 1 g de N-sulfato del LM -K5 sulfato obtenido en el (ii) en la presente anterior se trató como se describió en el paso (i) del Ejemplo 1. Se obtuvo un producto epimerizado con una proporción de ácido idurónico/ácido glucurónico de 44/56 contra una proporción de 0/100 del producto de partida, con una distribución de peso molecular de 2,000 hasta 10,000 y con un peso molecular medio de 5, 000 D. El rendimiento, calculado al medir el contenido de ácidos urónicos contra un estándar con el método de carbazol (Bitter and Muir, Anal. Biochem. 1971, 39, 88-92) es del 90%.

EJEMPLO 3 LMN-epiK5-N-sulfato. Secuencia (i)?(ii) (i) Epimerización del K5-sulfa.to Una cantidad de 2 g del K5 N-sulfato, obtenido según se describió en el Ejemplo 1, pasos (i) y (ii) , de la O 02/068477, se disolvieron en 120 mi de amortiguador HEPES 25 mm, pH 7, que contenia CaCl2 50 mM. La solución obtenida se hizo recircular a través de una columna de 50 mi rellena con la resina que contenia la enzima inmovilizada obtenida según se describe en la WO 96/14425. Esta operación se llevó a cabo a 30°C con un flujo de 200 ml/h durante 24 horas. El producto obtenido se purificó a través de ultrafiltración en una membrana de 1000 D y se hizo pasar sobre una columna de intercambio iónico IR 120H+, neutralizando el eluato con NaOH 1 N. La muestra se recuperó mediante precipitación con etanol o acetona. Se obtuvo un producto epimerizado con una proporción de ácido idurónico/ácido glucurónico de 55/45 contra una proporción de 0/100 del producto de partida. El porcentaje de epimerización se calculó con """H-RMN de acuerdo con el método descrito en la WO 96/14425. El rendimiento, calculado al medir el contenido de ácidos urónicos contra un estándar con el método de carbazol (Bitter and Muir Anal. Biochem. 39, 88-92-1971) es del 90%. (ii) Despolimerización del epi-K5-N~sulfato Un gramo del producto obtenido en el paso (a) se despolimerizó mediante el método de degradación con ácido nitroso y la posterior reducción del aldehido que se forma. En particular se continúa disolviendo el producto en 25 mi de agua destilada y agregándolo con 230 mg de nitrito de sodio disuelto en 115 mi de agua destilada. La solución luego se llevó a 4°C y el pH a 2 con HCl 0.1 N y se mantuvo durante 30 minutos. Al término de la reacción la solución se llevó a temperatura ambiente y el pH a 7 con NaOH 0.1 M. La solución luego se agregó con 450 mg de aBH4 y se dejó reaccionar durante 4 horas. El producto se recuperó mediante precipitación con 3 volúmenes de acetona a 4°C, filtración con un embudo de filtrado y se secó a 40 °C en un horno del vacio. Se obtuvieron 900 mg del LMW-epiKS-N-sulfato con una distribución de peso molecular medida con el método de HPLC que varia de 1,000 hasta 4,000 y con un contenido de unidades glucurónicas del 45% y un contenido de unidades idurónicas del 55%.

EJEMPLO 4 EpiK5-N,0-sulfato en exceso (a) Sal tetrabutilamónica del epiK5-N-sulfato Una solución en 40 mi de agua de 400 mg del epiK5-N-sulfato, como se obtuvo al término del paso (i) del Ejemplo 1, se termostatizó a 4°C, luego se hizo pasar sobre una resina de intercambio iónico IR 120+ preacondicionada con agua a 4°C. El eluato obtenido, que consistió de 100 mi de una solución a pH 1.94, se neutralizó con una solución al 15% de hidróxido de tetrabutilamonio y se dejó a temperatura ambiente durante una hora, manteniendo el pH a 7 mediante la adición de hidróxido de tetrabutilamonio al 15% y por último se liofilizó. De esta forma se obtuvieron 805 mg la sal tetrabutilamónica del epiK5-N-sulfato . (b) Epi-KS-amina-O-sulfato en exceso Una solución que contenia 805 mg de la sal asi obtenida en 30 mi de dimetilformamida se ajustó a 55 °C y se trató con 30 mi de la dimetilformamida que contenia 2.26 g del aducto de piridina. SO3. La reacción a 55 °C se continuó durante la noche luego se agregaron a la mezcla 60 mi de agua. Después de la neutralización con NaOH 1 N, el producto se precipitó con 3 volúmenes de acetona saturada con NaCl y se ajustó a 4°C durante la noche. El precipitado se recuperó mediante filtración en guch G4 y luego se ultrafiltró con el sistema TFF Mxllxpore 1000 D y se secó a presión reducida. Se obtuvieron 550 mg del epi-K5-amina-0-sulfatado en exceso que tenga un contenido de ácido idurónico del 54%, de glucosamina-6-O-sulfato del 100%, de glucosamina 3-O-sulfato del 60%, de ácido glucurónico monosulfatado de 10%, de ácido idurónico monosulfatado de 15%, el resto de unidades urónicas se disulfataron, con un grado de sulfatación de 3.55 medido con el método conductométrico de acuerdo con Casu et al. 1975. (c) EpiK5-amina-0-sulfatado en exceso-N-sulfato A una solución de 250 mg del epi-K5-amina-0-sulfatado en exceso obtenido en el paso (b) en 15 mi de agua se agregaron 400 mg de carbonato sodio, luego a la mezcla asi obtenida se agregaron 400 mg del aducto de piridina.S03 en forma sólida un poco a la vez en 4 horas. La mezcla de reacción se mantuvo a 55 °C durante la noche, luego se detuvo llevando el pH a 7 con HC1 0.1 N. Después de la ultrafiltración en una membrana 1000 D se agregaron 3 volúmenes de acetona saturada con cloruro de sodio y el precipitado se recuperó mediante centrifugación a 5000 rpm durante 5r . De esta forma, se obtuvieron 244 mg del epiK5-N, O-sulfato en exceso cuyo grado de sulfatación, medido con el método conductométrico de acuerdo con Casu et al. 1975, es de 4.25. Mediante el análisis el espectro 1H—R N resulta que el epiK5-N, O-sulfato en exceso asi obtenido tuvo un contenido de ácido idurónico del 54%, 6-O-sulfato del 100%, N-sulfato del 100%, glucosamina 3-0-sulfato del 60%, ácido glucurónico monosulfatado del 10%, ácido idurónico monosulfatado del 15%, el resto de las unidades urónicas se disulfataron. A partir del espectro -""H-RMN, se calcula por lo tanto un grado de sulfatación de 4.35 que, considerando los márgenes de error de los métodos, corresponde al grado de sulfatación de epiK5~ amina-O-sulfatado en exceso obtenido al final del paso (b) , N-sulfatado al 100%. Por lo tanto se asume que, más allá de un cierto porcentaje de grupos sulfato, la fuerte naturaleza aniónica del producto puede conducir a una subestimación del grado de sulfatación determinado con el método conductométrico.

Claims

NOVEDAD DE IA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un proceso para la preparación de un derivado de epi 5-N, O-sulfato en exceso, caracterizado porque : (a) un derivado de K5-N-sulfato, que tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 1,500 hasta 25,000 en forma ácida, se trata con una base orgánica terciaria o cuaternaria, dejando que la mezcla de reacción repose durante un periodo de tiempo de 30-60 minutos, a un pH de aproximadamente 7 y su sal se aisla con la base orgánica; (b) la sal de la base orgánica del derivado de epiK5-N-sulfato se trata con un reactivo de O-sulfatación en las condiciones de la O-sulfatación en exceso; (c) una sal de la base orgánica terciaria o cuaternaria del derivado de epi-K5-amina-0-sulfato en exceso asi obtenida se trata con un reactivo de N-sulfatación y el derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso asi obtenido se aisla.
2. El proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque el derivado de epi 5-N, O-sulfato en exceso se aisla en la forma de sal de sodio y se transforma opcionalmente en otra sal química o farmacéuticamente aceptable.
3. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque, en el paso (a) se utiliza hidróxido de tetrabutilamonio como una base orgánica .
4. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizado porque, en el paso (b) la O-sulfatación en exceso se lleva a cabo en dimetilformamida utilizando 2-4 moles el reactivo de O-sulfatación por OH disponible por disacárido a una temperatura de 40-60 °C durante 15-20 horas.
5. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, caracterizado porque se utiliza un derivado de epiK5-N-suifato como material de partida que tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 1,000 hasta 25,000.
6. El proceso según la reivindicación 5, caracterizado porque el derivado de epiK5-N-sulfato de partida es C5-epimerizada al 40-60%.
7. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, caracterizado porque el derivado de epiK5-N-sulfato de partida tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 1,500 hasta 25,000.
8. El proceso según la reivindicación 7, caracterizado porque el derivado de epiK5-N-sulfato tiene un peso molecular medio entre 10,000 y 25,000.
9. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, caracterizado porque el material de partida tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 1,000 hasta 12,000.
10. El proceso según la reivindicación 9, caracterizado porque el material de partida tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 1,500 hasta 8,000.
11. El proceso según la reivindicación 5, caracterizado porque el derivado de epiK5-N-sulfato se utiliza como material de partida que consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula I: en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, n es un número entero de 2 hasta 100 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable.
12. El proceso según la reivindicación 11, caracterizado porque el material de partida consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula I, en la cual las unidades urónicas son del 40-60% que consisten de ácido idurónico.
13. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, caracterizado porque, en la fórmula I, n representa un número entero de 3 hasta 100.
14. El proceso según la reivindicación 5, caracterizado porque el material de partida consiste en una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula I' en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, q es un número entero de 2 hasta 20 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable. 15. El proceso según la reivindicación 14, caracterizado porque el material de partida consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula , en la cual n es un número entero de 3 hasta
15.
16. El proceso según la reivindicación 5, caracterizado porque el material de partida consiste de una mezcla de cadenas en la cual la especie preponderante tiene la fórmula I'a: en la cual las unidades urónicas son del 60-40% que consisten de ácido glucurónico y 40% hasta 60% de ácido idurónico, p es un número entero de 4 hasta.8 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable .
17. El proceso según la reivindicación 16, caracterizado porque el peso molecular medio del material de partida está entre aproximadamente 2000 hasta 4000.
18. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 16 y 17, caracterizado porque el material de partida consiste de una mezcla de cadenas en la cual la especie preponderante tiene la fórmula I'b: en la cual X es hidroximetilo, m es 4, 5 6 6, y las unidades glucurónicas e idurónicas estén presentes alternativamente, iniciando con una unidad glucurónica o idurónica.
19. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones de 5 a 18, caracterizado porque el material de partida proviene de una N-desacetilación y de una N-sulfatación de un K5 que está básicamente libre de sustancias de lipofilicas.
20. Un derivado de epiK5-N, 0-sulfato en exceso que se puede obtener según el proceso de las reivindicaciones 1 a 19.
21. Un derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso que tiene un contenido de ácido idurónico del 20-60%, un peso molecular medio entre aproximadamente 2,000 hasta 45,000 y un grado de sulfatación de al menos 4, o uno de sus sales química o farmacéuticamente aceptables, el derivado está básicamente inactivo en los parámetros de coagulación.
22. Un derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso según la reivindicación 21, cuyo peso molecular medio está entre aproximadamente 15,000 hasta 45,000.
23. ün derivado de epi 5-N, O-sulfato en exceso según la reivindicación 21, cuyo peso molecular medio está entre aproximadamente 4,500 hasta 8,500.
24. El derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque el grado de sulfatación es de 4 hasta 4.6.
25. El derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, caracterizado porque es 6-O-sulfatado al 100% y 3-0-sulfatado al 50-80% en sus unidades de glucosamina, 0-monosulfatado al 5-10% en las unidades glucurónicas, 3-0-monosulfatado al 10-15% en las unidades idurónicas y 2.3-di-O-sulfatado en las unidades urónicas restantes.
26. El derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III: en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, R, R' y R", representan hidrógeno o S03-, R es S03- en al menos 40% de la mezcla de cadenas, Z es un grupo SO3-, n es un número entero de 2 hasta 100, el grado de sulfatación es al menos 4 y el catión correspondiente es quimica o farmacéuticamente aceptable .
27. El derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso según la reivindicación 26, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III en la cual las unidades urónicas son del 40-60% de ácido idurónico.
28. El derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones 26 y 27, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III en la cual n es un número entero de 3 hasta 100.
29. El derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, caracterizado porque es un LMW-epiK5-N, O-sulfato en exceso que consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III' : en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, q es un número entero de 2 hasta 20, R, R' y R" representan hidrógeno o un grupo SO3-, Z es SO3-, para un grado de sulfatación de al menos 4, de 4 hasta 4.6 y el catión correspondiente es un ión química o farmacéuticamente aceptable.
30. El LMW-epiK5- , O-sulfato en exceso según la reivindicación 29, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III' en la cual q es un número entero de 3 hasta 15.
31. El LMW-epiK5-N, O-sulfato en exceso según la reivindicación 30, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III' en la cual las unidades urónicas son del 40-60% que consisten de ácido idurónico.
32. El LMW-epi 5-N, O-sulf to en exceso según la reivindicación 31, caracterizada porque su contenido de ácido idurónico es del 50-55%.
33. El LMW-epiK5-N, O-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones de 29 a 32, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III' en la cual R es al menos 40% de S03-, R' y R" son ambos S03- o uno es hidrógeno y el otro es S03- al 5-10% en ácido glucurónico y S03- al 10-15% en ácido idurónico.
34. El LMW-epiK5-N, O-sulfato en exceso según la reivindicación 33, caracterizado porque tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 2,000 hasta 16,000.
35. El LMW-epiK5-N, O-sulfato en exceso según la reivindicación 34, caracterizado, porque tiene un peso molecular entre aproximadamente 4,500 hasta 9,000.
36. El LMW-epiK5-N, O-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones de 33 a 35, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula III' en la cual R es S03- al 50-80%.
37. El LMW-epiK5-N, O-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones de 32 a 36, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual la especie preponderante tiene la fórmula III' a: en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, p es un número entero de 4 hasta 8, Z es S03-, R, R' y R" son hidrógeno o S03-, para un grado de sulfatación de 4 hasta 4.6 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable.
38. El LMW-epiK5-N, O-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones de 33 a 37, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual la especie preponderante tiene la fórmula III' b: en la cual R, R' y R" son hidrógeno o SÜ3-, Z es S03-, X" es OH u OS03-, m es 4,5 ó 6, para un grado de sulfatación de 4 hasta 4.6, las unidades glucurónicas e idurónicas están presentes alternativamente, iniciando con una unidad glucurónica o idurónica, y el catión correspondiente es un ión química o farmacéuticamente aceptable .
39. El derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones de 20 a 38, caracterizado porque la sal o catión química o farmacéuticamente aceptable es la sal o catión de un metal alcalino, metal alcalinotérreo, amonio, (Ci~ C ) etraalquilamonio, aluminio y zinc.
40. El derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso según la reivindicación 39, caracterizado porque la sal o catión química o farmacéuticamente aceptable es la sal o catión de sodio, calcio o tetrabutilamonio .
41. Un derivado de epiK5-amina-0-sulfato en exceso, una de sus sales química o farmacéuticamente aceptables, que se puede obtener según los pasos (a) y (b) de la reivindicación 1, aislado en la forma de sal de sodio y, opcionalmente, transformado en otra sal química o farmacéuticamente aceptable.
42. Un derivado de epiK5-amina-0-sulfato en exceso cuyo contenido de ácido idurónico es del 20-60% del total de los ácidos urónicos, que tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 2,000 hasta 40,000 y un grado de sulfatación de al menos 3.4, o una de sus sales química o farmacéuticamente aceptables .
43. El derivado de epiK5-amina-0-sulfato en exceso según la reivindicación 42, caracterizado porque el derivado de epiK5-amina-0-sulfato en exceso consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula II: en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, n es un número entero de 2 hasta 100, R, R' y R" son hidrógeno o S03-, el grado de sulfatación es al menos 3.4 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable.
44. El derivado de epiK5-amina-0-sulfato en exceso según la reivindicación 43, caracterizado porque, en la fórmula II, n representa un número entero de 3 hasta 100.
45. El derivado de epiK5-amina-0-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula II en la cual las unidades urónicas son del 40-60% que consisten de ácido idurónico, con un peso molecular medio entre aproximadamente 2,000 hasta 40,000, R es al menos 40%, SO3-, Rr y R" son ambos SO3- o uno es hidrógeno y el otro es SO3- al 5-10% en ácido glucurónico monosulfatado y SO3- al 10-15% en ácido idurónico monosulfatado .
46. El derivado de epiK5-amina-0-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones de 42 a 45 , caracterizado porque es un LMW-epiK5-amina-0-sulfato en exceso que consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula II en la cual las unidades urónicas son del 40-60% que consisten de ácido idurónico, R es al menos 40%, SO3-, R' y R" son ambos SO3- o uno es hidrógeno y el otro es SO3- al 5-10% en ácido glucurónico y SO3- al 10-15% en ácido idurónico, n es un número entero de 3 hasta 15, con un peso molecular medio entre aproximadamente 4,000 hasta 8,000 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable.
47. El derivado de epiK5-amina-0-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones de 42 a 46, caracterizado porque es un LMWepi 5-amina-0-sulfato en exceso que consiste de una mezcla de cadenas en la cual la especie preponderante tiene la fórmula II' a: en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, p es un número entero de 4 hasta 8, R, R' y R" son hidrógeno o SO3-, el grado de sulfatación es al menos 3.4.
48. El LM epiK5-amina-0-sulfato en exceso según la reivindicación 47, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual la especie preponderante es un compuesto de la fórmula II' b: en la cual las unidades urónicas son del 40-60% que consisten de ácido idurónico, m es 4, 5 ó 6, R, R' y R" son hidrógeno o SO3-, X" es OH u OS03-, para un grado de sulfatación de al menos 3.4, las unidades idurónicas están presentes alternativamente, iniciando con una unidad glucurónica o idurónica.
49. ün LMW-epiK5-N-sulfato virtualmente libre de N¾ y grupos N-acetilo, que tiene un contenido de ácido idurónico de 20 hasta 60% y un peso molecular medio entre aproximadamente 1,500 hasta 12,000, o una de sus sales química o farmacéuticamente aceptables.
50. El LMW-epi 5-N-sulfato según la reivindicación 49, caracterizado porque el contenido de ácido idurónico es de 40 hasta 60% y el peso molecular medio es entre aproximadamente 1,500 hasta 10,000.
51. El LMW-epiK5-N-sulfato según la reivindicación 49, caracterizado porque el contenido de ácido idurónico es del 50-55% y el peso molecular medio es entre aproximadamente 1,500 hasta 7,500.
52. El LMW-epiK5-N-sulfato según cualquiera de las reivindicaciones de 49 a 51, obtenido mediante un proceso caracterizado porque un 5-N-sulfato se somete, en cualquier orden; (i) a C5-epimerización con una D-glucuronil C5-epimeraza aislada, purificada y en solución o inmovilizada en un soporte sólido, a un pH de aproximadamente 7, a una temperatura de aproximadamente 30 °C y durante un periodo de tiempo de 12-24 horas en presencia de al menos un ión bivalente seleccionado entre calcio, magnesio, bario y manganeso; y (ii) a despolimerización nitrosa opcionalmente seguida por reducción.
53. El LMW-epiK5-N-sulfato según la reivindicación 52, caracterizado porque, en el paso (ii) , la despolimerización se sigue por la reducción con borohidruro de sodio.
54. El LMW-epi 5-N-sulfato según la reivindicación 53, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula I ' : en la cual las unidades urónicas son del 20-60% que consisten de ácido idurónico, q es un número entero de 2 hasta 20 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable.
55. El LMW-epiK5-N-sulfato según la reivindicación 54, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula I ' , en la cual las unidades urónicas son del 40-60% de ácido idurónico.
56. El LMW-epi 5-N-sulfato según cualquiera de las reivindicaciones 54 y 55, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual al menos el 90% de las cadenas tienen la fórmula I' en la cual n es un número entero de 3 hasta 15.
57. El LM -epiK5-N-sulfato según cualquiera de las reivindicaciones 54 y 55, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual la especie preponderante tiene la fórmula I'a: en la cual las unidades urónicas son del 60-40% que consisten de ácido glucurónico y 40% hasta 60% de ácido idurónico, p es un número entero de 4 hasta 8 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable .
58. El LMW-epiK5-N-sulfato según cualquiera de las reivindicaciones 55 a 57, caracterizado porque consiste de una mezcla de cadenas en la cual la especie preponderante tiene la fórmula I'b: en la cual X es hidroximetilo, m es 4, 5 ó 6, el catión correspondiente es un ión química o farmacéuticamente aceptable y las unidades glucurónicas e idurónicas están presentes alternativamente, iniciando con una unidad glucurónica o idurónica.
59. El LMW-epiK5-N-sulfato según cualquiera de las reivindicaciones de 49 a 58, caracterizado porque la sal o catión se selecciona entre aquellos de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio, (C1-C4) tetraalquilamonio, aluminio y zinc.
60. El LMW-epiK5-N-sulfato según la reivindicación 59, caracterizado porque la sal o catión se selecciona entre aquellos de sodio, calcio y tetrabutilamonio .
61. El proceso para la preparación de un LM -epiK5-N-sulfato, caracterizado porque un K5-N-sulfato se somete, en cualquier orden; (i) a C5-epimerización con una D-glucuronil C5-epimeraza aislada, purificada y en solución o inmovilizada en un soporte sólido, a un pH de aproximadamente 7, a una temperatura de aproximadamente 30 °C y durante un periodo de tiempo de 12-24 horas en presencia de al menos un ión bivalente seleccionado entre calcio, magnesio, bario y manganeso; y (ii) a despolimerización nitrosa seguida opcionalmente por reducción.
62. El proceso según la reivindicación 61, caracterizado porque se lleva a cabo en el orden (i)-(ii).
63. El proceso según la reivindicación 61, caracterizado porque que se lleva a cabo en el orden (ii) -(i) .
64. El proceso según la reivindicación 63, caracterizado porque el producto obtenido al término de la despolimerización es un LMW-K5-N-sulfato que se somete directamente a C5-epimerización.
65. El proceso según la reivindicación 64, caracterizado porque el LMW-K5-N-sulfato tiene un peso molecular medio mayor a 4,000.
66. Una composición farmacéutica que incluye, como uno de sus ingredientes activos, una cantidad farmacológicamente activa de un derivado de epiK5-N,0-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 40 en mezcla con un excipiente farmacéutico.
67. Una composición cosmética que incluye una cantidad eficaz de un derivado de epiK5-N, O-sulfato en exceso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 40, en mezcla con un excipiente cosmético.
68. El uso de la C5-epimeraza aislada y purificada para la conversión de un derivado de K5-N-sulfato en un derivado de epiK5-N-sulfato correspondiente caracterizado por una unidad de tetrasacárido repetitiva que consiste de dos unidades de glucosamina separadas por una unidad glucurónica y seguida por una unidad de idurónica o separada por una unidad idurónica y seguida por una unidad glucurónica.
69. El uso según la reivindicación 68, caracterizado porque el derivado de K5-N-sulfato tiene un peso molecular medio mayor a 4,000.
70. Use según la reivindicación 69, caracterizado porgue el peso molecular medio es de 6,000 hasta 7,500.