CN1852926A - 由肝素衍生的寡糖混合物、其制备方法与含有所述混合物的药物组合物 - Google Patents

由肝素衍生的寡糖混合物、其制备方法与含有所述混合物的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及由肝素衍生的寡糖混合物，它们的平均分子量是1800－2400道尔顿，其特征在于高aXa活性与没有aIIa活性。本发明还涉及其制备方法以及含有所述混合物的药物组合物。

Description

由肝素衍生的寡糖混合物、其制备方法与含有所述混合物的药物组合物
本发明涉及由肝素衍生的平均分子量为1800-2400道尔顿的寡糖混合物，其特征在于强抗Xa(aXa)活性和无抗Iia(aIIa)活性，本发明还涉及它们的制备方法与含有它们的药物组合物。
这种肝素是一种动物源的硫酸化粘多糖混合物，主要是用于抗凝和抗血栓。
但是，这种肝素的缺陷制约了其应用。特别是由于其高抗凝活性(aIIa)可能引起出血。(血栓形成与止血作用研讨会)(Seminars in Thrombosis andHemostasis)，第5卷补编，3(1999))。
低分子量的肝素，特别是采用使肝素酯碱性去聚合所得到的和实际销售的低分子量肝素，例如依诺肝素(enoxaparine)，也具有高aIIa活性。
近来，在现有技术中曾描述一些非常低分子量的肝素。例如，在专利US 6 384 021中，这些产品的抗Xa活性是100-120UI/mg，抗IIa活性是2-8UI/mg。在国际申请WO 02/08295和WO 2004/033503中，这些产品的抗Xa活性具体是100-190UI/mg，而抗IIa活性低于5UI/mg。但是，任何这些非常低分子量肝素并不有效地具有高于190UI/mg的抗Xa活性，同时抗IIa活性为零或基本上为零(UI＝国际单位)。
抗IIa活性基本上为零(换句话说，基本上没有抗IIa活性)应该理解为活性低于0.2UI/mg。
本发明的目的是提供寡糖混合物，它们对活化因子X(因子Xa)具有非常高的选择性，同时不具有或基本上不具有抗IIa活性。
因此，本发明的目的是提供寡糖混合物，它们具有肝素组成多糖的通式结构，还具有下述特征：
-它们的平均分子量是1800-2400道尔顿，抗Xa活性是190UI/mg-450UI/mg，没有或基本上没有抗IIa活性。
-混合物的组成寡糖
-含有2-16个糖结构单元，
-在其中一个末端有4，5-不饱和糖醛酸-2-O-硫酸酯结构单元，
-并且含有呈碱金属或碱土金属盐形式的下式六糖：
在本发明描述的寡糖混合物中含有的六糖ΔIIa-IIs-Is是一种对ATIII具有强亲合性的序列，其特征在于aXa活性高于740UI/mg。
作为碱金属或碱土金属盐，优选的是钠、钾、钙和镁盐。
使用两个串联柱，例如以商品名TSK G3000XL和TSK G2000XL销售的这些柱，采用高压液相色谱法测定平均分子量。采用折射计进行检测。使用的洗脱剂是硝酸锂，流量是0.6ml/min。采用通过琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶层析法分离依诺肝素(IBF)制备得到的标准品对上述系统进行校正。根据Barrowcliffe等人，《Thromb.Res.》，12，27-36(1977-78)或D.A.Lane等人，《Thromb.Res.》，12，257-271(1977-78)描述的技术完成这种制备。使用GPC6软件(Perkin Elmer)计算结果。
根据Teien等人，《Thromb.Res.》，10，399-410(1977)描述的原理，采用生色底物酰胺水解法(méthode amydolytique)测定抗Xa活性。根据在现行欧洲药典有关低分子量肝素的专论中描述的方法进行定量，但是采用不同的复制缓冲液，即用聚乙二醇6000(PEG 6000)代替在缓冲液Tris-NaClpH7.4中的白蛋白。
相对于140-180U/mg(干计)的标准的非常低分子量肝素(HTBPM)测定抗Xa活性。相对于低分子量肝素的国际标准试样测定标准HTBPM的活性。
根据专利申请WO 02/08295，特别是WO 2004/033503所述方法制备了这个标准的HTBPM。相对于低分子量肝素的国际标准试样测定标准HTBPM的活性。
根据在现行欧洲药典有关低分子量肝素的专论中描述的方法，采用生色底物的酰胺水解法测定抗IIa活性。相对于标准的非常低分子量肝素(HTBPM)测定抗IIa活性，该肝素的测量活性是2.1UI/mg。相对于低分子量肝素的国际标准试样测定标准HTBPM的活性。
根据一个优选的方式，本发明的寡糖混合物含有20-100％六糖部分。特别是这种混合物含有30-60％六糖部分。
另外，本发明的混合物在寡糖混合物六糖部分中含有20-70％六糖ΔIIa-II s-Is。特别优选，在六糖部分中部分ΔIIa-II s-Is高达25-50％。
采用TSK G3000XL和TSK G2000XL柱的高压液相色谱法或采用六糖部分的制备分离法，测定六糖部分的百分数。
在这种情况下，使用装填聚丙烯酰胺琼脂糖类凝胶的柱对这种混合物进行了层析分离。用碳酸氢钠溶液洗脱该混合物。优选碳酸氢钠溶液的浓度是0.1-1mol/l。还更优选进行分离的浓度是1mol/l。采用紫外光谱测定法进行检测(254nm)。在分离后，六糖部分的碳酸氢钠溶液用冰醋酸中和。然后，这种溶液减压浓缩达到醋酸钠浓度高于30重量％。该六糖部分用3-5个体积的甲醇进行沉淀。使用3号烧结玻璃过滤器过滤回收六糖部分。得到的六糖混合物可以采用高效液相色谱法(HPLC)分析测定其中六糖ΔIIa-II s-Is的含量。根据本技术领域的技术人员采用的技术，采用制备性HPLC色谱法，或采用抗凝血酶III琼脂糖柱的亲合色谱法，可以分离六糖ΔIIa-II s-Is(M.Hook，I.Bjork，J.Hopwood和U.Lindahl，《F.E B.Sletters，》656(1)(1976))。
优选本发明混合物的平均分子量是1900-2200道尔顿，特别优选是1950-2150道尔顿。
根据一个优选的方式，本发明寡糖混合物的特征在于，它的抗Xa活性是190-410UI/mg，而抗IIa活性是零或基本上是零。非常特别优选抗Xa活性是200-300UI/mg。
因此，特别优选本发明的目的是具有下述特征的混合物：
-平均分子量是1950-2150道尔顿，
-抗Xa活性是190-410UI/mg，抗IIa活性是零或基本上是零，
-它们含有30-60％六糖部分，该部分含有25-55％的ΔIIa-II s-Is部分。
通过下面公开的非常独特方法得到本发明寡糖混合物的活性。本技术领域的技术人员熟知，多糖混合物的物理化学特征以及由其活性与获得的方法相关(《J.Med Chem》33(6)1639-2093(1990))。
在有机介质中使非常低分子量肝素(HTBPM)苄酯季铵盐解聚可制备本发明的寡糖混合物，这种HTBPM本身是根据专利申请WO 02/08295和WO 2004/033503所述方法制备的。一般而言，涉及使非常低分子量肝素再解聚，而它特别是在强碱存在下，优选地在二氯甲烷中以及在低于3％水的存在下使酯化肝素解聚得到的。
特别地是可根据在专利申请WO 02/08295和WO 2004/033503中描述的方法制备出在本发明中作为原料使用的HTPBM。
特别地，作为起始产品使用的HTBPM的aXa活性高于140UI/mg，aIIa活性低于5UI/mg，平均分子量是2000-3000道尔顿。相对于标准HTBPM测定aXa活性，而标准HTBPM测量活性是158UI/mg。相对于低分子量肝素标准国际试样测定标准HTBPM活性。
使用pka优选地高于20的强有机碱使根据如前面所描述方法得到的起始HTPBM再解聚(例如R.Schwesinger等人，《Angew.Chem.Int.Ed.Engl.》26，1167-1169(1987)或R.Schwesinger等人，《Angew.Chem.》105，1420(1993)定义了优选膦腈族的性质)。然后，把解聚HTBPM苄酯季铵盐转化成钠盐，皂化这些残留酯并且任选地纯化所得到的产物。下面反应流程图说明了本发明：
Figure A20048002654200111
n＝X+Y+Z(平均二糖总硫酸化率)
X＝位点硫酸化率，用H基表示补充部分
Y＝位点硫酸化率，用H基表示补充部分Z＝位点硫酸化率，用COCH3基表示补充部分
Figure A20048002654200112
因此，本发明的另一个目的是一种如前面定义的寡糖混合物的制备方法，其特征在于非常低分子量肝素的aXa活性高于140UI/mg、aIIa活性低于5UI/mg且平均分子量2000-3000道尔顿，该肝素进行下述化学反应：
a)通过苯索氯铵作用进行盐交换得到肝素苄乙铵(héparinate debenzétonium)，
b)通过苄基氯的作用使得到的肝素苄乙铵酯化，并用乙酸钠醇溶液处理得到非常低分子量的肝素苄酯钠盐，
c)得到的苄酯进行盐交换作用，得到季铵盐，优选苄乙铵盐(benzéthonium)、鲸蜡基吡啶鎓或鲸蜡基三甲基铵盐，
d)通过pka优选高于20的强有机碱的解聚作用，以得到非常低分子量的解聚肝素，
e)将非常低分子量的解聚肝素季铵盐转化成钠盐，
f)进行残留酯的皂化并任选地纯化。
在本发明中，非常特别优选在解聚步骤(步骤d)中，通过利用膦腈碱的高选择性，可以使寡糖混合物中对ATIII有亲合性的序列出乎预料之外地富集。优选强碱/酯摩尔比是0.2-5，非常特别地0.6-2。
对于最佳选择性和最大保存对ATIII有亲合性的序列，使用以HTBTM苄酯，苄乙铵盐计1摩尔当量膦腈碱进行处理时，最好在水含量低于0.3％时进行处理。
所述膦腈类碱优选地是下式的碱：
式中，R1-R7基可以相同或不同，代表含有1-6个碳原子的直链、支链或环状烷基，适当时，R3和R4可以与它们带有的基团-N-P-N-形成6元杂环。特别优选，本发明的目的是如前面定义的方法，其特征在于解聚步骤d)使用的碱是2-叔丁基亚氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氢-1，3，2-二氮杂磷杂苯(phosphorine(磷杂苯)；正式命名：2-[(1，1-二甲基乙基)亚氨基]-N，N-二乙基-1，2，2，2，3，5，6-八氢-1，3-二甲基-1，3，2-二氮杂磷杂苯-2-胺)。
在温度约15-25℃下，优选地通过过量苯索氯铵与HTBPM钠反应进行盐交换步骤a)反应。最好盐/肝素钠的摩尔比是2.5-3.5。
优选在含氯有机溶剂(例如氯仿或二氯甲烷)中，在温度25-45℃，优选30-40℃下进行步骤b)的酯化。然后，使用10重量％乙酸钠在例如甲醇的醇中溶液沉淀回收呈钠盐形式的酯。一般而言，每反应介质体积使用1-1.2体积的醇。调整苄基氯的量和反应时间使酯化率达到40-100％，优选地70-90％。优选每1重量份肝素苄乙铵盐使用0.5-1.5重量份苄基氯。还优选反应时间是10-35h。
因此，本发明方法达到的肝素苄酯季铵盐酯化率是40-100％，优选70-90％。
一般而言，在温度15-25℃下，使用一种乙酸钠醇溶液，优选使用10％(重量/体积)乙酸钠甲醇溶液处理这种反应介质，可使解聚的肝素苄酯季铵盐转化成钠盐。
添加乙酸盐的重量当量优选为随后在解聚反应中使用的肝素苄酯季铵盐的量的3倍。得到的HTBPM苄酯季铵盐优选是苄乙铵盐、鲸蜡基吡啶鎓或鲸蜡基三甲基铵盐。
在含水介质中，在温度10-25℃下，使用氯化季铵，优选使用苯索氯铵、鲸蜡基吡啶鎓或鲸蜡基三甲基铵盐进行步骤c)的盐交换反应。氯化季铵/肝素苄酯钠盐的摩尔比最好是2.5-3.5。
一般地，在含水介质中，在温度0-20℃，优选0-10℃下，使用碱金属氢氧化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂进行皂化反应。一般而言，使用1-5摩尔当量的碱金属氢氧化物。优选在1-2摩尔当量的碱金属氢氧化物存在下进行皂化反应。
任选采用任何已知的纯化解聚肝素的方法来纯化最终产物(例如根据EP 0037319B1中所述的方法)。优选在含水介质中，在温度10-50℃下，使用过氧化氢进行纯化。优选该操作在20-40℃下进行。
可以将呈钠盐形式的本发明混合物转化成其它碱金属或碱土金属盐形式。采用在专利FR 73 13 580中描述的方法，可任选地将一种盐转化成另一种盐。
本发明使得六糖ΔIIa-II s-Is大大富集。本技术领域的技术人员熟知，采用产生低分子量肝素的方法而使其肝素再解聚时，得到产物的抗Xa活性急剧下降，甚至是零。在采用能够获得依诺肝素、弗希肝素(fraxiparine)、替地肝素(fragmine)、亭扎肝素钠(innohep)(或洛集帕林(logiparin))、阿地肝素钠(normiflo)、Embollex(或Sandoparin)、Fluxum(或Minidalton)、瑞维肝素(clivarine)和Hibor的方法的情况下，如果使用它们的原方法使这些HBPM再解聚时就可以观察到这种现象。这是由于这些方法保存对位点ATIII低选择性所致。
在本发明中，如果使用来自膦腈解聚方法的HTBPM作为原料，必然发生其反现象。寡糖混合物的aXa活性增加并甚至超过用于制备HTBPM的肝素的活性。这可以是由于膦腈碱保存对ATIII具有亲合性的序列的显著选择性所致。
通过得到寡糖混合物的平均分子量也可观察到该方法的这个特征。例如，使平均分子量2400道尔顿的HTBPM解聚时，得到2000Da平均分子量的寡糖混合物。观察到，防止对ATIII有亲合性的序列(六糖和八糖)受到膦腈碱的作用，这样会使其它序列受到破坏并被除去，因此，得到了趋向于未解聚组成部分平均分子量的平均分子量的产物；即六糖ΔHa-Il s-Is(1834g/mol)。应该指出，在用膦腈碱解聚肝素步骤中，平均分子量从约15000Da到约2400Da。
另外，本发明的方法能够增加因子Xa的活性和选择性，该方法也可应用于一般低分子量肝素。例如，作为示例可以列举依诺肝素、弗希肝素、替地肝素、亭扎肝素钠(或洛集帕林)、阿地肝素钠、Embollex(或Sandoparin)、Fluxum(或Minidalton)、瑞维肝素和Hibor。还可能涉及某些具有抗Xa活性的非常低分子量肝素，例如在US 6 384 021(2000-4000Da)或WO 02/08295(1500-3000Da)中描述的这些肝素，它们的抗Xa活性低于140UI/mg(具体地100-140UI/mg)。
该方法的这个特征表现在平均分子量的寡糖混合物获得出乎意料的抗Xa活性(190UI/mg＜aXa＜450UI/mg；1800Da＜PM＜2400Da)。
根据本发明的一个具体实施方式，除去二糖和四糖部分(这些部分并不特效与ATIII结合)时，也可以增加寡糖混合物对因子Xa的选择性。在这种情况下，这种混合物用装有聚丙烯酰胺琼脂糖类凝胶或聚丙烯酰胺凝胶柱进行层析分离。这种混合物用碳酸氢钠溶液洗脱。优选碳酸氢钠溶液是一种0.1-1mol/l溶液。还更优选在浓度1mol/l进行这种分离。采用紫外光谱测定法(254nm)进行这种检测。在除去二糖和四糖部分后，用冰乙酸中和寡糖的碳酸氢钠溶液混合物。这种溶液再减压浓缩得到浓度高于20重量％的乙酸钠溶液。加入3-5个体积的甲醇沉淀这种寡糖混合物。然后采用过滤回收高亲合寡糖混合物。如果必要，可以使用适当柱脱盐进行纯化。实施例6说明了这种可选择方法，得到了非常低分子量的肝素，其抗Xa活性高于400UI/mg。
因此，本发明的另一个目的是如前面定义的制备寡糖混合物的方法，它对Xa因子具有增加的选择性，其特征在于还采用层析法除去二糖和四糖部分，特别是使用装填聚丙烯酰胺琼脂糖类凝胶柱层析法除去二糖和四糖部分。
本发明的混合物可以用作药品。
本发明的寡糖混合物可以用作抗凝血剂。特别是它们可有效用于治疗或预防静脉和动脉血栓形成、深静脉血栓形成、肺栓塞、不稳定心绞痛、心肌梗死、心肌缺血、外周动脉闭塞性疾患和心房纤颤。它们还用于预防和治疗平滑肌细胞增生、动脉粥样硬化和动脉硬化，通过调整血管发生和生长因子用于治疗和预防癌症，以及用于治疗和预防糖尿病，例如糖尿病性视网膜病和糖尿病性肾病。
本发明还涉及含有任选与一种或多种惰性赋形剂结合的式(I)混合物作为活性组分的药物组合物。
这些药物组合物例如是皮下或静脉注射液。还可以通过肺(吸入)或口服用药途径使用本发明的其它药物组合物。
剂量可以随病人的年龄、体重和身体状况而改变。对于成年人，其剂量一般是通过肌肉内或皮下途径用药，每天20-100mg。
下面实施例说明本发明而不是限制其发明。
制备1：获得非常低分子量的肝素，其起始aXa活性等于158.8IU/mg
根据专利申请WO 2004/033503使用肝素钠，同时采用如前面所述步骤a-f，可制备出实施例1作为起始产品使用的非常低分子量肝素(HTBPM)，在2-丁基亚氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氢-1，3，2-二氮杂磷杂苯存在下，在百分数低于0.6％的水存在下进行所述解聚步骤。
得到的非常低分子量肝素的特征
如此得到的解聚肝素特征如下：
平均分子量：2400道尔顿
抗Xa活性：158.8UI/mg
抗IIa活性：3.1UI/mg
抗Xa活性/抗IIa活性比：51
制备2：获得非常低分子量的肝素，其起始aXa活性等于158IU/mg
根据专利申请WO 2004/033503使用肝素钠，同时采用如前所述的步骤a-f，可制备出实施例2、3、4、5作为起始产品使用的非常低分子量肝素(HTBPM)，在2-叔丁基亚氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氢-1，3，2-二氮杂磷杂苯存在下，在百分数低于0.6％的水存在下进行该解聚步骤。
得到的非常低分子量肝素的特征
如此得到的解聚肝素特征如下：
平均分子量：2450道尔顿
抗Xa活性：158UI/mg
抗IIa活性：2.1UI/mg
抗Xa活性/抗IIa活性比：75
制备3：HTBPM，苄乙铵盐
HTBPM转变成苄乙铵盐的盐交换反应(相应于所述方法的步骤a))：
将12.53g(20.7mmol)根据制备1得到的HTBPM钠盐装入500ml锥形烧瓶A中，并且用85ml水溶解(黄色溶液)。
将31.62g(70.5mmol)苯索氯铵装入有250ml水的100ml锥形烧瓶B中(无色溶液)。
将B的内容物倒入A中，该混合物在室温下搅拌约1h。接着沉降约1h。弃去上清液，然后加入同样体积的水(250ml)。再搅拌约15min，并沉降约30min。弃去上清液，然后加入同样体积的水(250ml)。该混合物搅拌约15min，然后过滤。滤饼用水洗涤3次，每次200ml。湿的米色固体经脱水后在减压(6kPa)炉中在80℃干燥约18h。得到35.56g HTBPM苄乙铵盐。
产率达到89％。
制备4：
HTBPM转变成苄乙铵盐的盐交换反应(相应于所述方法的步骤a))：
将17.93g(30.2mmol)根据制备2得到的HTBPM钠盐装入1l锥形烧瓶A中，并且用120ml水溶解(黄色溶液)。
将45g(0.1mol)苯索氯铵装入有360ml水的500ml锥形烧瓶B中(无色溶液)。
将B的内容物倒入A中，该混合物在室温下搅拌约1h。接着沉降约1h。弃去上清液，然后加入同样体积的水(500ml)。再搅拌约15min，并沉降约30min。弃去上清液，然后再加入同样体积的水(500ml)。该混合物搅拌约15min，然后过滤。滤饼用水洗涤3次，每次200ml。湿的米色固体经脱水后在减压(6kPa)炉中在80℃干燥约48h。得到49.5g HTBPM苄乙铵盐。
产率达到87％。
实施例1：
采用本发明方法得到非常低分子量的肝素(HTBPM)，该方法包括一个77％酯化的步骤和一个在无水介质中使用由膦腈衍生的碱的解聚步骤。
HTBPM的酯化(所述方法的步骤b)：
将35.39g(18.3mmol)根据制备3得到的HTBPM苄乙铵盐(水含量0.20％)溶于183.3g无水二氯甲烷中，再装入500ml三颈瓶中。在温度30℃下添加29.5ml(25.7mmol)苄基氯。在30℃反应约23h后的酯化率是77％。在冷却到室温(22±3℃)后，将反应混合物倒入490ml 10％乙酸钠甲醇溶液中。该混合物在室温下搅拌约1h。接着沉降约1h。弃去上清液，然后加入同样体积的甲醇(250ml)。再搅拌约30min，并沉降约45min。弃去上清液，然后加入同样体积的甲醇(250ml)。接着沉降约16h。弃去上清液，然后加入同样体积的甲醇(350ml)。该混合物搅拌约5min，然后过滤其悬浮液。滤饼用水洗涤2次，每次50ml，脱水然后在减压(6kPa)与40℃下干燥约18h。得到34.48g粗制HTBPM苄酯钠盐，酯化率达到77％。
HTBPM苄酯钠盐的纯化(所述方法的步骤b))：
将34.48g粗制HTBPM苄酯钠盐溶于350ml 10％NaCl水溶液中。将这种溶液倾至1.57l甲醇中。该悬浮液搅拌约40min，接着沉降约16h。弃去上清液，然后加入同样体积的甲醇(1.5l)。再搅拌约1h，并沉降约1.5h。弃去上清液，然后加入同样体积的甲醇(1.2l)。该混合物搅拌约15min，然后过滤。滤饼用甲醇洗涤3次，每次50ml。白色的湿固体脱水然后在减压(6kPa)与40℃干燥约18h。得到6.07g HTBPM苄酯钠盐。
酯化率达到50％。
HTBPM苄酯钠盐转变成苄乙铵钠的盐交换反应(所述方法的步骤c))：
在250ml锥形烧瓶A中用40ml水溶解6g(9.14mmol)HTBPM苄酯钠盐。
同时，将13.93g(31mmol)苯索氯铵与110ml水装入250ml锥形烧瓶B中。
将B的内容物倒入A中。该悬浮液在室温(22±3℃)下搅拌约1h，接着沉降约1h。弃去上清液，然后加入同样体积的水(140ml)。再搅拌约15min，并沉降1h。弃去上清液，然后加入同样体积的水(140ml)。该混合物搅拌约15min，接着沉降约30min。弃去上清液，然后加入同样体积的水(140ml)换。搅拌约5min，然后过滤。滤饼用水洗涤3次，每次50ml，脱水后在减压(6kPa)与80℃干燥约18h。得到17.43g HTBPM苄酯苄乙铵盐。
产率达到100％。
在无水介质中HTBPM苄酯苄乙铵盐解聚：水含量检测不到＜0.01％(所述方法的步骤d))
将制备2的17.43g(9.14mmol)HTBPM装入有122ml无水二氯甲烷的250ml三颈烧瓶中。添加17.4g 4分子筛。在氩气气氛下在室温(22±3℃)搅拌约18h。
将这种溶液转移到250ml三颈烧瓶中，将该分子筛与混合物分离。添加2.64ml(9.14mmol)2-叔丁基亚氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氢-1，3，2-二氮杂磷杂苯，在氩气气氛下在22±3℃搅拌24h。
季铵盐转化成钠盐(所述方法的步骤e))
同时，在2l锥形烧瓶中制备730ml 10％乙酸钠甲醇溶液。向这个溶液中添加8.71g Hyflo supercel硅藻土。将这种反应混合物倒入所述甲醇溶液中，同时保持温度约4℃。该悬浮液在这个温度下搅拌约15min。接着在室温下沉降约45min，然后弃去上清液，然后加入同样体积的甲醇(450ml)。再搅拌约15min，并沉降45min。再弃去上清液，然后加入同样体积的甲醇(420ml)。搅拌约15min，接着用3号烧结玻璃过滤器过滤。滤饼用甲醇洗涤2次，每次70ml，脱水后在减压(6kPa)与50℃干燥约18h。得到4.35g在硅藻土(8.71g)中的粗制解聚HTBPM(钠盐)。
产率达到72.5％。
粗制解聚HTBPM(钠盐)的皂化(所述方法的步骤f1))：
4.35g(6.63mmol)在硅藻土中的粗制解聚HTBPM(钠盐)溶于46ml水中，然后用3号烧结玻璃过滤器过滤。硅藻土用2份水漂洗，每份30ml。将滤饼装入500ml锥形烧瓶中。在温度约4℃下加入823μl(9.94mmol)35％氢氧化钠溶液。在这个温度下搅拌约3h。其介质加入1NHCl溶液进行中和，然后添加11.5g NaCl和80ml甲醇。在搅拌约15min后，添加210ml甲醇。该悬浮液搅拌约1h，然后接着沉降30min。弃去上清液，加入同样量的甲醇(230ml)。搅拌约15min，再接着沉降30min。弃去上清液，加入同样量的甲醇(210ml)。搅拌约15min，然后过滤。滤饼用甲醇洗涤2次，每次9ml，脱水，然后在减压(6kPa)与50℃下干燥约18h。得到2.95g粗制解聚HTBPM(钠盐)。
产率达到73.7％。
粗制解聚HTBPM(钠盐)的纯化(所述方法的步骤f2)：
将1.5g粗制解聚HTBPM钠盐装入有16ml水的50ml三颈烧瓶中。该溶液在约10min内升温到40℃。通过加入0.1N氢氧化钠将pH调到约9.7。该溶液先用0.45μm膜过滤，然后添加84μl 30％过氧化氢水溶液。该混合物在室温下搅拌2h，同时通过加入0.1N氢氧化钠将pH保持在9.7±0.1不变。该反应混合物然后用0.1N HCl中和，再添加2g NaCl。在搅拌约10min后，用0.45μm膜过滤该溶液。在温度约4℃下倒入14ml甲醇。该溶液在室温下搅拌约15min。然后添加36ml甲醇，该悬浮液搅拌约1h。这时停止搅拌，接着沉降约30min。然后抽取其上清液弃去(40ml)。向沉降的沉淀添加40ml甲醇，搅拌约10min。使其沉淀再沉降约30min。抽取其上清液弃去(45ml)。添加45ml甲醇，然后过滤处于悬浮状的沉淀。得到的白色滤饼再用2份甲醇洗涤，每份3ml甲醇。湿的固体经脱水后在温度约50℃与减压(6kPa)下干燥。在干燥约18h后，得到1.303g纯解聚的HTBPM(钠盐)。
产率达到86.8％。
如此得到的解聚HTBPM的特征
平均分子量：1950道尔顿
多分散性指数：1.1
抗Xa活性：283U/mg
AIIa活性：未检测到(＜0.2U/mg)
实施例2：
采用本发明方法得到非常低分子量肝素(HTBPM)，该方法包括一个49％酯化的步骤和一个在无水介质中使用一种由膦腈衍生的碱的解聚步骤。
HTBPM的酯化(所述方法的步骤b)：
将13.29g(7.6mmol)根据制备4得到的HTBPM苄乙铵盐溶于70.43g无水二氯甲烷中，再加到100ml三颈烧瓶中(反应介质的水含量是0.073％)。在温度30℃下，添加12.3ml(107mmol)苄基氯。在30℃反应约7h后酯化率是49％。冷却后，将该反应混合物倒入160ml 12％乙酸钠甲醇溶液中。该混合物在室温下搅拌1h，然后使其沉降约16h。弃去上清液，然后加入相同体积甲醇(100ml)。搅拌约1h，接着沉降约1h。再弃去其上清液，加入相同体积甲醇(100ml)。搅拌约5min，然后过滤。滤饼用2×40ml甲醇洗涤，脱水，然后在减压(6kPa)与40℃炉中干燥约18h。得到3.90g粗制HTBPM苄酯钠盐，酯化率是49％。
HTBPM苄酯(49％酯化)钠盐的纯化(所述方法的步骤b)。
将3.90g粗制HTBPM苄酯钠盐溶于39ml 10％NaCl水溶液中。将该溶液倒入176ml甲醇中。该悬浮液搅拌约15min，然后接着沉降2h。过滤该混合物。滤饼在175ml甲醇中再制成悬浮液，搅拌10min。过滤，滤饼用2份甲醇洗涤，每份10ml。白色的湿固体脱水后，在减压(6kPa)与40℃炉中干燥约18h。得到2.62g HTBPM苄酯钠盐。
酯化段的总产率达到57.3％。
HTBPM苄酯转化成苄乙铵盐的盐交换反应(所述方法的步骤c))：
将2.62g(4.37mmol)HTBPM苄酯钠盐溶于20ml水中(锥形烧瓶A)。同时，将5.92g(13.2mmol)苯索氯铵与60ml水装入锥形烧瓶B中。将“B”的内容物倒入“A”中。该悬浮液在室温下搅拌约1h，然后接着沉降1h。弃去上清液，加入相同体积水(70ml)。搅拌约15min，接着沉降1h。再弃去上清液，加入相同体积水(70ml)。再搅拌约5min，过滤。滤饼用3份水洗涤，每份50ml，脱水然后在减压(6kPa)与80℃炉中干燥约18h。得到6.85gHTBPM苄酯苄乙铵盐。
产率达到99％。苄乙铵盐中的水含量是0.6％。
HTBPM苄酯苄乙铵盐的解聚作用：
将6.80g(4.3mmol)HTBPM装入有54ml无水二氯甲烷的100ml三颈烧瓶中。该混合物升温到30℃，然后搅拌直到完成溶解。估算反应混合物的水含量是约0.05％。添加1.25ml(4.3mmol)2-叔丁基亚氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氢-1，3，2-二氮杂磷杂苯，在惰性气氛下于30℃搅拌24h。
季铵盐转变成钠盐(所述方法的步骤e))
同时，在1l锥形烧瓶中制备270ml 10％乙酸钠甲醇溶液。将该反应混合物倒入所述甲醇溶液中，同时将温度保持在约4℃。该悬浮液在室温下搅拌约1h。接着沉降1h。弃去上清液，然后加入同样量的甲醇(165ml)。搅拌约1h，再接着沉降1h。再弃去其上清液，加入同样量的甲醇(170ml)。搅拌约15min并过滤。滤饼用3份甲醇洗涤，每份40ml，脱水，然后在减压(6kPa)与50℃炉中干燥约18h。得到2.29g粗制解聚HTBPM钠盐。
产率达到89％。
粗制HTBPM钠盐的皂化作用(所述方法的步骤f1))：
将2.29g(3.8mmol)粗制解聚HTBPM钠盐溶于23ml水中。用0.8μm膜过滤该溶液，然后装入100ml三颈烧瓶中。在温度约3℃下加入575μl(5.73mmol)30％氢氧化钠溶液。在这个温度下搅拌约2h。
向一半的反应混合物加入冰醋酸进行中和，然后添加367mg固体乙酸钠和13ml甲醇。该溶液搅拌约15min，然后添加65ml甲醇。得到的悬浮液搅拌约30min，然后接着沉降约16h。弃去上清液，加入同样量的甲醇(36ml)。再搅拌约30min，然后接着沉降约30min。弃去上清液，加入同样量的甲醇(16ml)。搅拌约15min并用0.22μm膜过滤。滤饼用甲醇洗涤2次，每次5ml，脱水，然后在减压(6kPa)与50℃炉中下干燥约18h。得到563mg粗制解聚HTBPM(钠盐)。
产率达到52.6％。
用AcONa沉淀粗制解聚HTBPM(钠盐)进行纯化(所述方法的步骤f2)：
将560mg粗制解聚HTBMP(钠盐)装入有5.6ml水的10ml三颈烧瓶中。褐色溶液在10min升温到40℃。通过加入0.1N氢氧化钠将pH调到9.7。该溶液用0.45μm膜过滤，添加28μl 30％过氧化氢水溶液。该混合物在室温下搅拌2h，同时通过加入0.1N氢氧化钠使pH 9.5±0.1保持不变。该反应混合物用0.1N HCl进行中和，添加620mgNaCl。搅拌10min后，该溶液用0.45μm膜过滤。在温度约4℃下倒入4.35ml甲醇中。该溶液在室温下搅拌15min。添加11.2ml甲醇。该悬浮液搅拌1h。这时停止搅拌，再接着沉降1h。然后抽取其上清液弃去(13.5ml)。向沉降的沉淀添加13.5ml甲醇，搅拌15min。该沉淀继续再沉降约30min。抽取其上清液弃去(13ml)。添加13ml甲醇，然后过滤呈悬浮状的沉淀。得到的白色滤饼然后用2份甲醇洗涤，每份5ml。湿的固体脱水后在减压(6kPa)与温度50℃下进行干燥。干燥18h后，得到376mg纯解聚HTBPM(钠盐)。产率达到67％。
如此得到的解聚HTBPM特征如下：
抗Xa活性：191UI/mg
平均分子量：2100Da
实施例3：
根据本发明方法得到非常低分子量肝素(HTBPM)，该方法包括一个73％酯化的步骤和一个在无水介质中使用由膦腈衍生的碱的解聚步骤。
HTBPM的酯化(所述方法的步骤b)：
将13.7g(7.3mmol)根据制备4得到的HTBPM苄乙铵盐溶于73.67g无水二氯甲烷中，并装入100ml三颈烧瓶中。(测定反应介质的水含量为0.23％)。在温度30℃下添加13ml(113mmol)苄基氯。在30℃反应约20h后酯化率达到73％。冷却到室温后，将该反应混合物倒入210ml 12％乙酸钠甲醇溶液中。该混合物在室温下搅拌30min，然后接着沉降约1.5h。弃去上清液，然后加入相同体积的甲醇(140ml)。搅拌15min，过滤该悬浮液。滤饼用两份甲醇洗涤，每份100ml，脱水，然后在减压(6kPa)与40℃炉中干燥约18h。得到13.3g粗制HTBPM苄酯钠盐，酯化率是73％。
HTBPM苄酯(酯化73％)钠盐的纯化(所述方法的步骤b)
将13.3g粗制HTBPM苄酯钠盐溶于133ml 10％NaCl水溶液中。将该溶液倒入600ml甲醇中。该悬浮液搅拌约15min，然后任其沉降约1h。弃去上清液，然后加入相同体积的甲醇(400ml)。搅拌约5min，然后过滤。滤饼用甲醇洗涤3次，每次100ml。湿的白色固体脱水后在减压(6kPa)与40℃炉中干燥约18h。得到2.33g HTBPM苄酯钠盐。
酯化率达到49.6％。
HTBPM苄酯苄乙铵盐的盐交换反应(所述方法的步骤c)：
在100ml锥形烧瓶“A”中使用15ml水溶解2.27g(3.53mmol)HTBPM苄酯钠盐。同时，将5.22g(11.6mmol)苯索氯铵与55ml水装入100ml锥形烧瓶“B”中。
将“B”中的内容物倒入“A”中。该悬浮液在室温下搅拌约1h，然后接着沉降约1h。弃去上清液，加入相同体积的水(50ml)。搅拌约15min，再接着沉降约1h。弃去上清液，加入相同体积的水(50ml)。再搅拌5min，然后过滤。滤饼用3份水洗涤，每份50ml，脱水后在减压(6kPa)与80℃炉中干燥约18h。得到5.67g HTBPM苄酯苄乙铵盐。
产率达到98％。所得到产物的水含量是1％。
HTBPM苄酯苄乙铵盐解聚作用(所述方法的步骤d)：
将5.45g(3.3mmol)HTBPM装入有40ml无水二氯甲烷的100ml三颈烧瓶中。估算混合物的水含量是约0.1％。将该混合物升温到30℃。添加958μl(3.3mmol)2-叔丁基亚氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氢-1，3，2-二氮杂磷杂苯，在氩气气氛下在30℃搅拌24h。
季铵盐转变成钠盐(所述方法的步骤e))：
同时，在500ml锥形烧瓶中制备200ml 10％乙酸钠甲醇溶液。将该反应混合物倒入所述甲醇溶液中，同时将温度保持在约4℃。该悬浮液在室温下搅拌约1h。接着沉降约1h。弃去上清液，然后加入相同量的甲醇(150ml)。搅拌约30min，再接着沉降约30min。再弃去其上清液，加入同样量的甲醇(150ml)。搅拌约15min，然后过滤。滤饼用甲醇洗涤3次，每次50ml，脱水后在减压(6kPa)与50℃下干燥约18h。得到1.40g粗制解聚HTBPM钠盐。产率达到65.8％。
粗制解聚HTBPM钠盐的皂化(所述方法的步骤f1)：
将1.40g(2.18mmol)粗制解聚HTBPM(钠盐)溶于14ml水中。将该溶液装入100ml三颈圆底烧瓶中。在温度约4℃，加入351μl(3.5mmol)30％氢氧化钠溶液。在这个温度下搅拌约2h。加入冰醋酸(100％)中和该溶液，然后添加7g固体乙酸钠和130ml甲醇。该悬浮液搅拌30min，然后接着沉降约1h。弃去上清液，加入同样量的甲醇(80ml)。再搅拌约30min，接着沉降约16h。弃去上清液，加入同样量的甲醇(80ml)。搅拌约15min，然后用0.45μm膜过滤。滤饼用甲醇洗涤2次，每次10ml，脱水后在减压(6kPa)与50℃下干燥约18h。得到1.15g(产率：89.4％)粗制解聚HTBPM(钠盐)。
产率达到89.4％。
粗制解聚HTBPM(钠盐)纯化(所述方法的步骤f2)：
373mg粗制解聚HTBPM(钠盐)装入有3.7ml水的10ml三颈烧瓶中。该溶液在10min升温到40℃。通过加入1N氢氧化钠将其pH调到约9.5。该溶液用0.45μm膜过滤，然后添加18μl 30％过氧化氢水溶液。该混合物在室温下搅拌约2h，同时加入0.1N氢氧化钠使pH 9.5±0.1保持不变。该反应混合物用0.1N HCl中和，然后添加430mg NaCl。搅拌约10min后，该溶液用0.45μm膜过滤。在温度约4℃倒入3ml甲醇。该溶液在室温下搅拌15min。然后添加7.7ml甲醇。该悬浮液搅拌约1h。这时停止搅拌，接着沉降约40min。然后抽取其上清液弃去(10ml)。向沉降的沉淀添加10ml甲醇，搅拌15min。使其沉淀再沉降约30min。抽取其上清液弃去(10ml)。添加10ml甲醇，用0.45μm膜过滤呈悬浮状的沉淀。得到的白色滤饼用4份甲醇洗涤，每份5ml。湿的固体在脱水后在减压(6kPa)与温度约50℃下进行干燥。在干燥约18h后，得到199mg纯解聚的HTBPM(钠盐)。产率达到54％。
如此得到的解聚HTBPM的特征如下：
平均分子量：2000道尔顿。多分散性指数：1.1
抗Xa活性：252UI/mg
实施例4：
采用本发明的方法得到HTBPM，该方法包括一个96％酯化的步骤和一个采用BEMP的解聚步骤。
HTBPM的酯化(所述方法的步骤b))
将14.45g(7.7mmol)根据制备4得到的HTBPM苄乙铵盐溶于75.79g无水二氯甲烷中，再装入250ml三颈烧瓶中。(反应介质的水含量是0.20％)。在温度30℃下添加12.4ml(108mmol)苄基氯。在温度30℃反应约26h后的酯化率是96％。冷却到室温后，将该反应混合物倒入180ml 12％乙酸钠甲醇溶液中。该混合物在室温下搅拌约30min，然后接着沉降约30min。弃去上清液，然后加入相同体积的甲醇(150ml)。搅拌约15min，然后过滤。滤饼用2份甲醇洗涤，每份100ml，脱水后在减压(6kPa)与40℃下干燥约18h。得到3.67g粗制HTBPM苄酯钠盐，酯化率96％。
HTBPM苄酯(酯化96％)钠盐的纯化(所述方法的步骤b))：
将3.67g粗制HTBPM苄酯钠盐溶于37ml 10％NaCl水溶液(3.7g NaCl在37ml水中的溶液)中。将该溶液倒入167ml甲醇中。该悬浮液搅拌约15min，然后接着沉降约1h。弃去上清液，然后加入相同体积的甲醇(38ml)。搅拌约5min并过滤。滤饼用甲醇洗涤2次，每次30ml。湿的白色固体经脱水后在减压(6kPa)与40℃下干燥约18h。得到2.76g HTBPM苄酯钠盐。
酯化率达到54.4％。
HTBPM苄酯转化成苄乙铵盐的盐交换反应(所述方法的步骤c))：
在100ml锥形烧瓶“A”中使用20ml水溶解2.83g(4.29mmol)HTBPM苄酯钠盐。同时，将6.35g(14.2mmol)苯索氯铵和50ml水装入100ml锥形烧瓶“B”中。
将“B”内容物倒入“A”中。该悬浮液在室温下搅拌约1h，然后接着沉降约1h。弃去上清液。加入相同体积的水(60ml)。搅拌约15min，再接着沉降约1h。弃去上清液，加入相同体积的水(60ml)。再搅拌约5min，然后过滤。滤饼用水洗涤4次，每次50ml，脱水后在减压(6kPa)与80℃下干燥约18h。得到7.0g HTBPM苄酯苄乙铵盐。
测得的产率是约100％。水含量是0.23％。
HTBPM苄酯苄乙铵盐的解聚(所述方法的步骤d))：
将3.67g(2.3mmol)HTBPM装入有27ml无水二氯甲烷的50ml三颈圆底烧瓶中。该混合物升温到30℃。添加676μl(2.3mmol)2-叔丁基亚氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氢-1，3，2-二氮杂磷杂苯，在30℃搅拌24h。
季铵盐转变成钠盐(所述方法的步骤e))
同时，在250ml锥形烧瓶中制备150ml 10％乙酸钠甲醇溶液。将该反应混合物倒入其甲醇溶液中，同时将温度保持在约4℃。该悬浮液在室温下搅拌约1h。接着沉降约1h。弃去上清液，然后加入同样量的甲醇(100ml)。搅拌30min，再接着沉降30min。再弃去其上清液，加入同样量的甲醇(100ml)。搅拌15min并过滤。滤饼用甲醇洗涤3次，每次40ml，脱水，在减压(6kPa)与50℃下干燥约18h。得到966mg解聚HTBPM钠盐。
产率达到64％。
HTBPM苄酯钠盐的皂化(所述方法的步骤f1)：
将942mg(1.43mmol)解聚HTBPM钠盐溶于9.5ml水中。将该溶液装入100ml三颈圆底烧瓶中。在温度约4℃下加入236μl(2.35mmol)30％氢氧化钠溶液。在这个温度下搅拌约2h。加入冰醋酸(100％)中和该溶液。然后添加4.5g固体乙酸钠和85ml甲醇。该悬浮液搅拌约30min，然后接着沉降约1h。弃去上清液，加入同样量的甲醇(40ml)。再搅拌约30min，接着沉降约16h。弃去上清液，再加入同样量的甲醇(40ml)。搅拌约30min，用0.45μm膜过滤。滤饼用甲醇洗涤2次，每次10ml，脱水后在减压(6kPa)与50℃干燥约18h。得到776mg粗制解聚HTBPM(钠盐)。
产率达到91.4％。
粗制解聚HTBPM(钠盐)纯化-所述方法的步骤f2：
将758mg粗制解聚HTBPM(钠盐)装入有7.6ml水的25ml三颈烧瓶中。该溶液在10min升温到40℃。通过加入0.1N氢氧化钠将pH调节到约9.5。该溶液用0.45μm膜过滤，然后添加38μl 30％过氧化氢水溶液。该混合物在室温下搅拌约2h，同时通过加入0.1N氢氧化钠使pH 9.5±0.1保持不变。该反应混合物用1N HCl中和，添加880mg NaCl。搅拌约10min后，该溶液用0.45μm膜过滤。在温度约4℃下倒入6.2ml甲醇。该溶液在室温下搅拌约15min。添加16ml甲醇，该悬浮液搅拌约1h。这时停止搅拌，过滤悬浮液。滤饼用2份甲醇洗涤，每份15ml。湿的固体脱水后在减压(6kPa)与温度约50℃下进行干燥。干燥约18h后，得到490mg纯解聚HTBPM(钠盐)。产率达到65％。
如此得到的解聚HTBPM特征如下：
平均分子量：2000道尔顿
多分散性指数：1.1
抗Xa活性：205UI/mg
实施例5：
采用本发明的方法得到HTBPM，该方法包括一个96％酯化的步骤和一个使用叔-丁基亚氨基-三(二甲基氨基)磷烷的解聚步骤。
HTBPM苄酯苄乙铵盐的解聚(所述方法的步骤d))：
将根据实施例4得到的3.67g(2.3mmol)HTBPM苄酯苄乙铵盐(酯化96％)，其中水含量0.23％，装入有30ml无水二氯甲烷的50ml三颈烧瓶中。该混合物升温到30℃。添加595μl(2.3mmol)叔丁基亚氨基-三(二甲基氨基)磷烷，在30℃搅拌24h。
季铵盐转变成钠盐(所述方法的步骤e))
同时，在250ml锥形烧瓶中制备160ml 10％乙酸钠甲醇溶液。将该反应混合物倒入甲醇溶液中，同时将温度保持在约4℃。该悬浮液在室温下搅拌约1h。接着沉降约1h。弃去上清液，然后加入同样量的甲醇(120ml)。搅拌约30min，再接着沉降30min。再弃去其上清液，加入同样量的甲醇(125ml)。搅拌约15min并过滤。滤饼用甲醇洗涤3次，每次40ml，脱水并在减压(6kPa)与温度50℃下干燥约18h。得到982mg粗制解聚HTBPM钠盐。产率达到65％。
粗制解聚HTBPM钠盐的皂化(所述方法的步骤f1)：
将980mg(1.49mmol)粗制解聚HTBPM钠盐溶于10ml水中。再将该溶液装入100ml三颈圆底烧瓶中。在温度约4℃下加入246μl(2.45mmol)30％氢氧化钠溶液。在这个温度下搅拌约2h。加入冰醋酸(100％)中和该溶液。然后添加4.9g固体乙酸钠和95ml甲醇。该悬浮液搅拌约30min，然后接着沉降约1h。弃去上清液，加入同样量的甲醇(60ml)。再搅拌约30min，接着沉降约16h。弃去上清液，再加入同样量的甲醇(60ml)。搅拌约30min，用0.45μm膜过滤。滤饼用甲醇洗涤2次，每次10ml，脱水后在减压(6kPa)与50℃干燥约18h。得到809mg粗制解聚HTBPM(钠盐)。
产率达到91.6％。
粗制解聚HTBPM(钠盐)的纯化-所述方法的步骤f2：
将792mg粗制解聚HTBPM(钠盐)装入有8ml水的25ml三颈烧瓶中。该溶液在10min升温到40℃。通过加入0.1N氢氧化钠将pH调节到约9.5。该溶液用0.45μm膜过滤，然后添加39.6μl 30％过氧化氢水溶液。该混合物在室温下搅拌约2h，同时加入0.1N氢氧化钠使pH 9.5±0.1保持不变。该反应混合物用1N HCl中和，添加1.04g NaCl。搅拌约10min后，该溶液用0.45μm膜过滤。在温度约4℃下倒入7.3ml甲醇。该溶液在室温下搅拌约15min。添加18.8ml甲醇，该悬浮液搅拌约1h。这时停止搅拌，再过滤。滤饼用3份甲醇洗涤，每份15ml。湿的固体脱水后在减压(6kPa)与温度约50℃下进行干燥。干燥约18h后，得到538mg纯解聚HTBPM(钠盐)。产率达到67.9％。
如此得到的解聚HTBPM特征如下：
平均分子量：2100道尔顿
多分散性指数：1.1
抗Xa活性：209UI/mg
实施例6：
采用本发明方法得到HTBPM，该方法包括采用层析的补充分离步骤，同时除去二糖和四糖部分。
将实施例1描述的寡糖混合物(286mg)溶于20ml移动相(0.2mol/l碳酸氢钠水溶液)中。
这些层析条件如下：
-移动相：0.2mol/l碳酸氢钠溶液
-固定相：Gel biogel P6
-柱：长度1m，直径5cm。
-检测波长：240nm。
收集并合并大于或等于六糖的部分。它们再用乙酸中和，然后浓缩直到得到200g/l乙酸钠溶液。在搅拌下，向得到的溶液添加5个体积甲醇。该悬浮液搅拌约18h，然后用0.45μm膜过滤。滤饼在减压(6kPa)与温度约40℃下干燥约6h。得到的产物再进行沉淀，然后溶于尽可能少量的水中，并用Sephadex G10柱脱盐。在脱盐部分浓缩后，进行冻干，得到109mg产物。产率达到38％。
如此得到的寡糖混合物特征如下：
抗Xa活性：403UI/mg
寡糖百分数如下：
  Mw(Da)   多分散性   Di％  Tetra％   Hexa％   Octa％   Deca％ ＞Deca％
  2150   1.0   0  0   53.83   32.58   10.5 3.5
本发明化合物的药理学活性：
  实施例   平均分子量   抗Xa活性UI/mg   抗IIa活性
  1   1950   283   ＜0.2
  2   2100   191   0
  3   2000   252   0
  4   2000   205   0
  5   2100   209   0
  6   2150   403   0
本发明化合物中六糖ΔIIa-II s-Is的百分数：
  实施例   六糖部分百分数   六糖部分中六糖ΔIIa-II s-Is百分数
  1   31％   46％
  2   30％   26％
  3   33％   33.5％
  4   32％   30.8％
  5   31.5％   28.7％
  6   53.8％   46％

Claims (32)

1.寡糖混合物，它们具有肝素的组成多糖的通式结构，还具有下述特征：
-平均分子量1800-2400道尔顿，
-抗Xa活性为190-450UI/mg，
-没有或基本上没有抗IIa活性，
-混合物的组成寡糖指：
-含有2-16个糖结构单元，
-在其中一个末端有4，5-不饱和糖醛酸-2-O-硫酸酯结构单元，
-以及含有呈碱金属或碱土金属盐形式的下式六糖：
Figure A2004800265420002C1
      ΔIIa                                II s                        Is
                                 。
2.根据权利要求1所述的寡糖混合物，其特征在于碱金属或碱土金属盐是钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。
3.根据权利要求1或2所述的寡糖混合物，其特征在于它含有20-100％、优选30-60％六糖部分。
4.根据权利要求3所述的寡糖混合物，其特征在于该六糖部分含有20-70％、优选25-50％如权利要求1所限定的六糖ΔIIa-II s-Is。
5.根据权利要求1-4中任一项权利要求所述的寡糖混合物，其特征在于它的平均分子量是1900-2200道尔顿、优选1950-2150道尔顿。
6.根据权利要求1-5中任一项权利要求所述的寡糖混合物，其特征在于它的抗Xa活性是190-410UI/mg、优选200-300UI/mg，同时抗IIa活性为零或基本上为零。
7.根据权利要求1-6中任一项权利要求所述的寡糖混合物，其特征在于它具有下述特征：
-平均分子量是1950-2150道尔顿，
-抗Xa活性是190-410UI/mg，且抗IIa活性为零或基本上为零，
-它们含有30-60％六糖部分，而该部分含有25-55％ΔIIa-II s-Is部分。
8.制备根据权利要求1-7中任一项权利要求所述寡糖混合物的方法，其特征在于aXa活性高于140UI/mg、aIIa活性低于5UI/mg且平均分子量为2000-3000道尔顿的非常低分子量肝素进行下述化学反应：
a)通过苄索氯铵作用进行盐交换得到肝素苄乙铵，
b)通过苄基氯的作用使得到的肝素苄乙铵酯化并处理，从而得到非常低分子量的肝素苄酯钠盐，
c)得到苄酯的进行盐交换，得到季铵盐，
d)使用pka优选高于20的强有机碱进行解聚作用，以得到解聚的非常低分子量的肝素，
e)将解聚的非常低分子量的肝素季铵盐转化成钠盐，
f)进行残留酯皂化，并任选进行纯化。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于聚合步骤d)中使用的强碱/酯摩尔比是0.2-5，优选0.6-2。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于使用膦腈衍生物作为碱进行解聚步骤d)。
11.根据权利要求8-10中任一项权利要求所述的制备方法，其特征在于以HTBTM苄酯，苄乙铵盐计，使用1摩尔当量膦腈碱操作时，以水含量小于0.3％进行解聚步骤d)。
12.根据权利要求8-11中任一项权利要求所述的制备方法，其特征在于解聚步骤d)中使用的膦腈类碱优选是下式的碱：
Figure A2004800265420004C1
式中，R1-R7基相同或不同，代表含有1-6个碳原子的直链、支链或环状烷基，或者R3和R4可以与它们带有的-N-P-N-基团构成6元杂环。
13.根据权利要求8-12中任一项权利要求所述的制备方法，其特征在于解聚步骤中使用的膦腈类碱是2-叔丁基亚氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氢-1，3，2-二氮杂磷杂苯。
14.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤b)中肝素苄酯季铵盐的酯化率是40-100％，优选是70-90％。
15.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于在温度15-25℃下，使用乙酸钠醇溶液、优选使用10％(重量/体积)乙酸钠甲醇溶液处理反应介质，将如根据权利要求8所述方法步骤b)制备的非常低分子量肝素苄酯季铵盐转化成钠盐。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于酯化步骤b)中添加的乙酸钠重量当量是解聚反应所使用肝素苄酯季铵盐质量的3倍。
17.根据权利要求8所述的制备寡糖混合物的方法，其特征在于步骤c)中得到的非常低分子量的肝素苄酯季铵盐优选是苄乙铵盐、鲸蜡基吡啶鎓或鲸蜡基三甲基铵盐。
18.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于在含水介质中，在温度0-20℃、优选0-10℃下，使用碱金属氢氧化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂进行皂化(根据步骤f)。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于使用1-5摩尔当量碱金属氢氧化物，更特别是1-2摩尔当量碱金属氢氧化物。
20.根据权利要求8-19中任一项权利要求所述制备如权利要求1-5中任一项权利要求所述寡糖混合物的方法，这些寡糖混合物对Xa因子具有增加的选择性，其特征还在于通过层析、特别是使用装填聚丙烯酰胺琼脂糖类凝胶的柱的层析来除去二糖和四糖部分。
21.根据权利要求8-20中任一项权利要求所述制备权利要求1-7中任一项权利要求所述寡糖混合物的方法，其特征在于作为起始产品使用抗Xa活性是100-140UI/mg的低分子量肝素或非常低分子量肝素(1500-3000Da)代替如权利要求8所限定的非常低分子量肝素。
22.根据权利要求8-20中任一项权利要求所述制备权利要求1-7中任一项权利要求所述寡糖混合物的方法，其特征在于作为起始产品使用抗Xa活性是100-140UI/mg的非常低分子量肝素(1500-4000Da)代替如权利要求8所限定的非常低分子量肝素。
23.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于所述低分子量肝素选自依诺肝素、弗希肝素、替地肝素、亭扎肝素钠(或洛集帕林)、阿地肝素钠、Embollex(或Sandoparin)、Fluxum(或minidalton)、瑞维肝素和Hibor。
24.采用权利要求7-23中任一项权利要求所述方法能得到的如权利要求1-7中任一项权利要求所述的寡糖混合物。
25.根据权利要求1-7中任一项权利要求所述的寡糖混合物作为药物。
26.根据权利要求1-7中任一项权利要求所述的寡糖混合物作为具有抗凝血活性的药物。
27.根据权利要求25或26所述的药物，用于治疗或预防静脉和动脉血栓形成、深静脉血栓形成、肺栓塞、不稳定心绞痛、心肌梗死、心肌缺血、外周动脉闭塞性疾患和心房纤颤、平滑肌细胞增生、动脉粥样硬化和动脉硬化，通过调整血管发生和生长因子用于治疗癌症，以及糖尿病，例如糖尿病性视网膜病和糖尿病性肾病。
28.药物组合物，该药物组合物含有至少一种如权利要求25所述的药物和一种或多种在药用惰性赋形剂或载体或添加剂。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其特征在于它们为皮下或静脉注射液。
30.根据权利要求28所述的药物组合物，其特征在于它们为通过肺途径吸入用药的制剂。
31.根据权利要求28所述的药物组合物，其特征在于它们为口服用药的制剂。
32.测定根据权利要求1-7中任一项权利要求所述寡糖混合物的抗Xa活性的方法，其特征在于采用生色底物的酰胺水解法，其中复制缓冲液是聚乙二醇6000(PEG 6000)。
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