CN102558392A - 一种高抗FXa、低抗FIIa低分子肝素钠的制备方法 - Google Patents
一种高抗FXa、低抗FIIa低分子肝素钠的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种高抗FXa、低抗FIIa低分子肝素钠的制备方法，将普通肝素在有机溶剂中进行β-消除降解，减少了磺酸基从肝素上脱落，从而提供一种降解条件温和、产物抗凝活性高的低分子肝素钠的制备方法。同时，按照本方法制备的低分子肝素钠的抗FXa效价在120～160IU/mg、抗FIIa效价在10～30IU/mg，平均分子量在3500-5000Da。
Description
技术领域
本发明涉及一种低分子肝素钠(Low Molecular WeightHeparin，LMWH)的制备方法，具体涉及一种高抗FXa、低抗FIIa低分子肝素钠的生产工艺。
背景技术
肝素是一种从动物肠黏膜、肺等器官中提取出来的黏多糖，其在医学上用来预防和治疗手术引起的血栓塞、静脉栓塞等栓塞性疾病，具有广泛的用途。低分子肝素是从普通肝素降解而来的，其平均分子量小于8000Da，分子量小于8000Da的组分含量不得低于60％，按干燥品计算，抗Xa效价≥70IU/mg，抗Xa/抗IIa≥1.5。
低分子肝素具有生物利用率高、血浆半衰期长等优点，特别是其引起的出血副作用大幅降低，因而大量的从普通肝素到低分子肝素的降解方法被不断发现。目前采用的降解方法主要有亚硝酸降解、β-消除降解法、过氧化物降解法以及肝素酶降解。在美国专利US5389618A中记述的肝素降解方法就是利用在水溶液中用碱进行β-消除，从而得到平均分子量在3500～5500Da，抗FXa在50～120IU/mg的低分子肝素，由于降解是在水溶液中进行，在降解过程中使用的碱可能使较多的磺酸基从肝素上脱落，从而造成产物的抗凝活性降低。
发明内容
本发明的目的是提供一种在有机溶剂中对普通肝素进行β-消除降解的方法，以解决在水溶液进行降解时产物抗凝活性降低的技术问题，从而提供一种降解条件温和、产物抗凝活性高的低分子肝素钠的制备方法。
本发明所采用的技术方案如下：
一种高抗FXa、低抗FIIa低分子肝素钠的制备方法，包括如下步骤：
(1)、取精品肝素配成10％的水溶液，室温下边搅拌边加入季铵盐如苄索氯铵，1～2小时后停止搅拌，沉降、倾倒、洗涤沉淀物，最后过滤、干燥，得到白色肝素季铵盐固体；
(2)、将(1)中的肝素季铵盐固体溶解于有机溶剂中配成5～10％的溶液，再加入0.05～0.2摩尔浓度的碱如苄基三甲基氢氧化铵、DBU(二氮杂二环)、甲醇钠、氢氧化钠，在温度为0～50℃(优选10～40°)下反应4～24小时(优选8～12小时)进行β-消除降解；
(3)、将(2)反应结束后的降解物，在室温下加入两倍体积的10％的醋酸钠的甲醇溶液，搅拌1～2小时后，在0～4℃下沉降、过滤、甲醇洗涤，在25～35℃下真空干燥，得到低分子肝素钠的粗品；
(4)、上述(3)中的低分子肝素钠粗品配成10％的溶液，加1M氢氧化钠溶液，调pH值为9～10，加入30％的过氧化氢搅拌6小时后，滴加1M的盐酸至中性，然后加入5～10％的氯化钠，再用2.5～3倍的甲醇沉淀低分子肝素钠；过滤，用甲醇洗涤后干燥制得低分子肝素钠的精品；
(5)、将上述(4)的精品低分子肝素钠溶解于去离子水配成10％的溶液，用0.2微米的膜过滤后，冷冻干燥，最终得到低分子肝素钠，其抗FXa效价在120～160IU/mg，抗FIIa效价在10～30IU/mg，平均分子量在3500-5000Da，大于8000Da的片段不大于10％，小于2500Da的片段不大于30％，2500Da到8000Da的片段在65～80％。
作为本发明的一种改进，上述低分子肝素钠制备方法中步骤(2)所述有机溶剂可为二氯甲烷或二甲基甲酰胺。
本发明的有益效果在于：将普通肝素在有机溶剂中进行β-消除降解，减少了磺酸基从肝素上脱落，从而提供一种降解条件温和、产物抗凝活性高的低分子肝素钠的制备方法。另外，按照本方法制备的低分子肝素钠的抗FXa效价在120～160IU/mg、抗FIIa效价在10～30IU/mg，平均分子量在3500-5000Da。
具体实施方式
实施例1
取1公斤的精品肝素钠溶解于7升水，然后在快速搅拌下加入50％(W/V)的氯苄索铵的水溶液4.5升，反应2小时后，加入10升水，静止沉降，倾倒去上部清夜，再加水洗涤，然后过滤，水洗涤，干燥，约得到2.7公斤的肝素季铵盐。
取上述反应得到的肝素季铵盐10克溶解于30毫升的二氯甲烷中，室温下加入5毫升的DBU，反应12小时后，加入60毫升的10％醋酸钠甲醇溶液，搅拌1小时后，冷藏(0～4℃)下沉降、过滤、甲醇洗涤、干燥，得到粗品低分子肝素钠。
将得到的粗品低分子肝素钠溶于50毫升水，加1M的氢氧化钠调pH到9.5，加入30％的过氧化氢至浓度为0.5％，室温下搅拌6小时后，用1M的盐酸调溶液到中性，加入氯化钠，使得氯化钠的浓度为8％，用150毫升的甲醇沉淀。过滤，甲醇洗涤，45℃下真空干燥。
干燥后的低分子肝素钠溶于50毫升去离子水，用0.2微米的膜过滤，冷冻干燥，最终得到2.6克精品低分子肝素钠。
上述低分子肝素钠的平均分子量为3750Da，分子量大于8000Da的为2％，分子量小于2500Da的为27％，2500～8000Da的为71％。抗FXa值为142IU/mg，抗FIIa值为13IU/mg。
实施例2
重复实施例1，不同点为：肝素季铵盐溶解于30毫升的二甲基甲酰胺(DMF)中，在45℃下加入2克的甲醇钠，搅拌8小时后冷却至室温，再加入10％的醋酸钠甲醇溶液。
本实施例最终得到2.5克精品低分子肝素钠，其平均分子量为4700Da，分子量大于8000Da的为4.5％，分子量小于2500Da的为18％，2500-8000Da的为77.5％；抗FXa值为151IU/mg，抗FIIa值为27IU/mg。
Claims (5)
1.一种高抗FXa、低抗FIIa低分子肝素钠的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)、取精品肝素的水溶液，加入季铵盐，得到白色肝素季铵盐固体；
(2)、上述(1)中的肝素季铵盐固体溶解于有机溶剂中，在有机碱或无机碱作用下进行β-消除降解；
(3)、上述(2)中的降解物在醋酸钠作用下转化为钠盐，得到低分子肝素钠的粗品；
(4)、上述(3)中低分子肝素钠粗品通过氧化脱色精制、微膜过滤除菌、冷冻干燥得到低分子肝素钠。
2.按照权利要求1所述高抗FXa、低抗FIIa低分子肝素钠的制备方法，其特征在于：制备步骤(1)中所述季铵盐为苄索氯铵。
3.按照权利要求1所述高抗FXa、低抗FIIa低分子肝素钠的制备方法，其特征在于：制备步骤(2)中所述有机溶剂为二氯甲烷或二甲基甲酰胺。
4.按照权利要求1所述高抗FXa、低抗FIIa低分子肝素钠的制备方法，其特征在于：制备步骤(2)中所述有机碱为苄基三甲基氢氧化铵、DBU或甲醇钠，所述无机碱为氢氧化钠。
5.按照权利要求1所述高抗FXa、低抗FIIa低分子肝素钠的制备方法，其特征在于：按照本制备方法制得的低分子肝素钠为抗FXa效价在120～160IU/mg，抗FIIa效价在10～30IU/mg，平均分子量在3500-5000Da，大于8000Da的片段不大于10％，小于2500Da的片段不大于30％，2500Da到8000Da的片段在65～80％。
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