CN103554305B - 一种亲和沉淀介质的合成方法及其制备依诺肝素钠的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种亲和沉淀介质的合成方法及其制备依诺肝素钠的应用，在经亲和沉淀介质纯化的肝素钠溶液中用苄索氯铵盐盐化肝素，肝素苄索氯铵盐酯化生成肝素苄基酯，在碱性条件下对肝素苄基酯进行解聚，经乙醇沉淀后得到依诺肝素钠粗品，双氧水简单的氧化脱色后即得依诺肝素钠精品。本发明以肝素钠粗品为原料并采用亲和沉淀介质纯化，有效的去除与肝素结合或非结合的杂质，并保证了肝素天然结构的完整性，增加了肝素的活性收率，为后续依诺肝素钠的制备工艺的稳定性和可控性提供依据。本发明降低了生产成本，提高了生产效率，更适于工业化生产。

Description

一种亲和沉淀介质的合成方法及其制备依诺肝素钠的应用

技术领域

本发明涉及依诺肝素钠的制备方法，更具体的说，本发明涉及一种亲和沉淀介质的制备及其在依诺肝素钠制备中的应用。

背景技术

肝素（Heparin）是一种广泛存在于人和哺乳动物组织中的具有天然抗凝血活性酸性黏多糖。肝素作为抗凝血药物已经在临床上使用了近百年，到目前为止仍是最重要的抗凝血和抗血栓药物之一，是防治深层静脉血栓形成等栓塞性疾病的首选药物。此外，肝素还具有抗病毒、抗炎、抗过敏、抗癌、降血脂等多种生物学功能。肝素在长期使用的过程中，产生了不可预见的副作用，易导致出血、血小板减少、骨质疏松等副作用。为了减少肝素的副作用，二十世纪八十年代末研发了低分子肝素。

依诺肝素钠（Enoxaparin sodium）是低分子肝素的一种，欧洲药典（EP）7.0版对依诺肝素钠定义为：它是通过对猪肠黏膜肝素的苄基酯衍生物进行碱解聚而获得的。EP7.0规定依诺肝素钠的重均分子量为3800-5000道尔顿，特征值约为4500，分子量大于8000的组分不超过18%、分子量2000～8000的组分为68%～82%、分子量小于2000的组分为12%～20%。按干燥品计算，抗Ⅹa因子效价为95-120IU/mg，抗Ⅱa因子效价为20～35IU/mg。抗Ⅹa因子效价与抗Ⅱa因子效价的比值为3.3～5.3。

依诺肝素钠主要用于抗血栓、抗凝血、预防深静脉血栓及肺栓塞、治疗不稳定心绞痛和非Q波心梗等。其主要的作用机制是通过与抗凝血酶Ⅲ结合，经依诺肝素钠结合的抗凝血酶Ⅲ结合凝血酶和FⅩa的能力增强，因依诺肝素钠分子链较短，对凝血酶的抑制作用较弱，而对抗FⅩa的作用较强，能抑制凝血酶的激活，还能抑制血小板聚集，减少暂时性血小板凝块转变成永久性血小板血纤维蛋白凝块的发生机率，改变血液的流动性，降低血液黏度，维持血液正常的流动。与其他低分子量肝素相比，依诺肝素钠具有皮下注射吸收好、半衰期长、生物利用度高、副反应少，剂量易于确定，不需要实验室监测等诸多优点，颇受临床医生和广大患者的青睐，临床应用的适应症不断扩大。目前其全球市场占有率达低分子肝素的60%以上。

目前世界上生产依诺肝素钠的工艺为肝素苄基酯的碱裂解法。美国专利US005389618A公布了依诺肝素钠的基本制备过程：肝素季铵盐的制备，肝素苄基酯的制备，对肝素苄基酯进行碱解聚等工艺步骤。CN102050888B公开了一种依诺肝素钠的制备方法，其采用亲水液相反应和疏水液相反应以及固相反应，将大分子肝素钠降解为具有特定结构的低分子肝素钠。CN100436483C公开了一种依诺肝素钠的纯化方法，其在水媒介中用长链季铵盐盐化肝素，经氯苄酯化后在碱性条件下解聚得到依诺肝素粗品，经活性炭和大孔吸附树脂脱色后得到依诺肝素成品。

然而，其一，上述专利公开的制备工艺中有机溶剂使用量大，对环境有严重的危害；其二，上述专利中几乎没有提及对原料中肝素钠的结构类似物硫酸皮肤素和多硫酸软骨素等杂质的去除方法，肝素中杂质的存在会对后续的肝素的解聚顺序等制备过程及依诺肝素钠精品的分子量分布产生直接的影响。

发明内容

本发明的目的是为了改进现有技术的不足，提供一种降低生产成本，提高产品质量，工艺稳定可控的依诺肝素钠制备方法。

本发明的目的是这样来实现的，其方法步骤为：

（1)亲和沉淀介质的合成

本亲和沉淀介质以甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯组成的pH敏感型聚合物为基质[其中基质优选Eudragit S-100（简称ES-100）或聚丙烯酸树脂Ⅲ号]，以凝血酶、抗凝血酶Ⅲ或鱼精蛋白为配基；

具体操作步骤为：称取一定量的基质，加入适量N,N-二甲基甲酰胺搅拌使其溶解,将ES-100溶液加入反应器中，底部通氮气搅拌,然后加入N,N-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑使ES-100活化3～5分钟；活化完成后加入配基偶联反应2.5～3.0小时；偶联反应完成后，用8mol/L醋酸调节反应液pH值至3.5～4.5，反应产物完全析出后抽掉反应液，沉淀用0.1mol/L，pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤3次，抽去缓冲液即得亲和沉淀介质。

（2)亲和沉淀介质纯化肝素钠粗品

将肝素钠粗品加入纯化水溶解成浓度为5%～10%的肝素钠粗品溶液，用4～8mol/L氢氧化钠调节溶液pH值至7～8.5。取肝素钠粗品溶液等体积的亲和沉淀介质，用4～8mol/L氢氧化钠调节pH值至7.6～8.4，加入与亲和沉淀介质等体积的50～150mmol/L磷酸盐缓冲液，搅拌均匀；将肝素钠粗品溶液缓缓加入到亲和沉淀介质溶液中，搅拌吸附1.5～3小时；吸附结束后调节溶液的pH值至4.5～6，使沉淀均匀析出，沉淀用亲和沉淀介质0.8～1.5倍体积的pH4.5～5.5，0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液搅拌洗涤0.5～1小时，离心分离沉淀。沉淀用亲和沉淀介质2～4倍体积的pH7.8,0.1mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液（含1.2～1.8mol/L氯化钠）搅拌洗脱2～3.5小时，洗脱液超滤浓缩至肝素钠浓度为10%～15%，得超滤浓缩液；

（3）盐化

取肝素钠粗品1～1.5重量倍的苄索氯铵，使之完全溶解于3～4重量倍的纯化水中，在搅拌的同时将苄索氯铵溶液缓缓加入到肝素钠超滤浓缩液中，再继续搅拌45～75分钟静置，真空抽滤收集复合盐沉淀，用纯化水洗涤复合盐沉淀2次，在55～65℃减压干燥30～36小时，得充分干燥的肝素苄索氯铵盐；

（4）酯化

取肝素苄索氯铵盐溶解在4～7重量倍的N,N-二甲基甲酰胺中，加入肝素苄索氯铵盐0.6～1.2重量倍的氯化苄，在30～35℃酯化20～25小时，反应结束后，加入总反应体积2倍量的饱和醋酸钠乙醇溶液，边加边搅拌，见有明显沉淀物后停止搅拌，静置6小时后离心，真空抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤2次，在 55～65℃减压干燥30～36小时，得肝素苄基酯。

（5）碱解

取肝素苄基酯用纯化水溶解成浓度为5%～7.5%的溶液，加入肝素苄基酯0.05～0.15重量倍的固体氢氧化钠，在55～65℃的恒温水浴中，搅拌反应60～100分钟。然后加入4mol/L盐酸调节溶液pH值至6.5～7.5，真空抽滤收集滤出液，加入滤出液体积2～4倍量的乙醇沉淀，沉淀静置10～12小时，真空抽滤收集沉淀，沉淀于55～65℃减压干燥30～36小时，得依诺肝素钠粗品。

（6）脱色

取依诺肝素钠粗品溶解在5～12重量倍的纯化水中，调节溶液pH值至8.5～10.5，加入溶液体积0.5%～2%的双氧水，在25～30℃条件下氧化8～10小时，调节溶液pH值至6.5～7.5，加入溶液体积1%～2%的氯化钠使之完全溶解，加入2～3倍量的乙醇沉淀10～12小时，收集沉淀用无水乙醇洗涤2次，烘干得依诺肝素钠精品。

（7）冻干

取依诺肝素钠精品加入4-6倍量的纯化水溶解，溶解液除菌过滤后冷冻干燥24小时得依诺肝素钠成品。

本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明提高了产品的质量，降低了生产成本，有效的控制了硫酸皮肤素等杂质的含量，并且产品的质量稳定可控，易于实现工业化生产。

具体实施方式

以下具体实例对本发明做进一步详细说明：

实施例1：

1.亲和沉淀介质的合成：

称取ES-100 1350g用2.7LN,N-二甲基甲酰胺搅拌使其溶解，将溶解后的ES-100溶液加入反应器中，底部通氮气搅拌，然后加入N,N-二异丙基碳二亚胺3.78g，1-羟基苯并三唑4.05g使ES-100活化3分钟,活化完成后加入鱼精蛋白100g偶联反应2.5小时。偶联反应完成后，用8mol/L醋酸调节反应液pH值至3.5，反应产物完全析出后抽掉反应液，沉淀用0.1mol/L，pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤3次，抽去缓冲液即得亲和沉淀介质。

2.亲和沉淀介质纯化肝素钠粗品：

取120g肝素钠粗品，溶解在2400mL纯化水中，用4mol/L的氢氧化钠调pH至7；取亲和沉淀介质2400mL，用4mol/L的氢氧化钠调节pH至7.6，加入50mmol/L的磷酸盐缓冲液2400mL,搅拌均匀；将肝素钠粗品溶液缓缓加入到亲和沉淀介质溶液中，搅拌吸附1.5小时；吸附结束后调节溶液的pH值至4.5，使沉淀均匀析出，沉淀用pH4.5，0.1mol/L醋酸-醋酸钠的缓冲液1920mL搅拌洗涤0.5小时，离心分离沉淀，沉淀用pH7.8,0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（含1.2 mol/L氯化钠）4800mL搅拌洗脱2小时，洗脱液超滤浓缩至1200mL,得超滤浓缩液；

3.β-消除降解工艺制备依诺肝素钠

（1）取120g的苄索氯铵，溶解于360g的纯化水中，在搅拌的同时将苄索氯铵溶液缓缓加入到肝素钠的超滤浓缩液中，再继续搅拌45分钟静置，真空抽滤收集复合盐沉淀，用纯化水洗涤复合盐沉淀2次，55℃减压干燥30小时，得充分干燥的肝素苄索氯铵盐。

（2）取肝素苄索氯铵盐溶解在4重量倍的N,N-二甲基甲酰胺中，加入肝素苄索氯铵盐0.6重量倍的氯化苄，在30℃酯化20小时，反应结束后，加入总反应体积2倍量的饱和醋酸钠乙醇溶液，边加边搅拌，见有明显沉淀物后停止搅拌，静置6小时后离心，真空抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤2次，55℃减压干燥30小时，得肝素苄基酯。

（3）取肝素苄基酯用纯化水溶解成浓度为5%的水溶液，加入肝素苄基酯0.05重量倍的固体氢氧化钠，在55℃的恒温水浴中，搅拌反应60分钟。然后加入4mol/L的盐酸调节溶液的pH值至6.5，真空抽滤收集滤出液，加入滤液体积2倍量的乙醇沉淀，沉淀静置10小时，真空抽滤收集沉淀，沉淀于55℃减压干燥30小时，得依诺肝素钠粗品。

（4）取依诺肝素钠粗品溶解于5重量倍的纯化水中，调节溶液的pH值至8.5，加入溶液体积0.5%的双氧水，在25℃条件下氧化8小时，调节溶液的pH值为6.5，加入溶液体积的1%的氯化钠使之完全溶解，加入2倍量的乙醇沉淀10小时，收集沉淀用无水乙醇洗涤2次，烘干得依诺肝素钠精品。

（5）取依诺肝素钠精品加入4倍量的纯化水溶解，溶解液除菌过滤后冷冻干燥24小时得依诺肝素钠成品。

实施例2：

1.亲和沉淀介质的合成：

称取聚丙烯酸树脂Ⅲ号1350g用13.5LN,N-二甲基甲酰胺搅拌使其溶解，将溶解后的聚丙烯酸树脂Ⅲ号溶液加入反应器中，底部通氮气搅拌，然后加入N,N-二异丙基碳二亚胺7.56g，1-羟基苯并三唑8.1g使ES-100活化5分钟,活化完成后加入凝血酶200g偶联反应3.0小时。偶联反应完成后，用8mol/L醋酸调节反应液pH值至4.5，反应产物完全析出后抽掉反应液，沉淀用0.1mol/L，pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤3次，抽去缓冲液即得亲和沉淀介质。

2.亲和沉淀介质纯化肝素钠粗品：

取120g肝素钠粗品，溶解在1200mL纯化水中，用8mol/L的氢氧化钠调节pH值至8.5；取亲和沉淀介质1200mL，用8mol/L的氢氧化钠调节pH值至8.4，加入150mmol/L的磷酸盐缓冲液1200mL,搅拌均匀；将肝素钠粗品溶液缓缓加入到亲和沉淀介质溶液中，搅拌吸附3小时；吸附结束后调节溶液的pH值至6，使沉淀均匀析出，沉淀用pH5.5，0.1mol/L醋酸-醋酸钠的缓冲液1800mL搅拌洗涤1小时，离心分离沉淀，沉淀用pH7.8,0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（含1.8 mol/L氯化钠）4800mL搅拌洗脱3.5小时，洗脱液超滤浓缩至800mL,得超滤浓缩液；

3.β-消除降解工艺制备依诺肝素钠

（1）取180g的苄索氯铵，溶解于720g的纯化水中，在搅拌的同时将苄索氯铵溶液缓缓加入到肝素钠的超滤浓缩液中，再继续搅拌75分钟静置，真空抽滤收集复合盐沉淀，用纯化水洗涤复合盐沉淀2次，65℃减压干燥36小时，得充分干燥的肝素苄索氯铵盐。

（2）取肝素苄索氯铵盐溶解在7重量倍的N,N-二甲基甲酰胺中，加入肝素苄索氯铵盐1.2重量倍的氯化苄，在35℃酯化25小时，反应结束后，加入总反应体积2倍量的饱和醋酸钠乙醇溶液，边加边搅拌，见有明显沉淀物后停止搅拌，静置6小时后离心，真空抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤2次，65℃减压干燥36小时，得肝素苄基酯。

（3）取肝素苄基酯用纯化水溶解成浓度为7.5%的水溶液，加入肝素苄基酯0.15重量倍的固体氢氧化钠，在65℃的恒温水浴中，搅拌反应100分钟。然后加入4mol/L的盐酸调节溶液的pH值至 7.5，真空抽滤收集滤出液，加入滤液体积4倍量的乙醇沉淀，沉淀静置12小时，真空抽滤收集沉淀，沉淀于65℃减压干燥36小时，得依诺肝素钠粗品。

（4）取依诺肝素钠粗品溶解于12重量倍的纯化水中，调节溶液pH值至10.5，加入溶液体积2%的双氧水，在30℃条件下氧化10小时，调节溶液pH值至7.5，加入溶液体积2%的氯化钠使之完全溶解，加入3倍量的乙醇沉淀12小时，收集沉淀用无水乙醇洗涤2次，烘干得依诺肝素钠精品。

（5）取依诺肝素钠精品加入6倍量的纯化水溶解，溶解液除菌过滤后冷冻干燥24小时得依诺肝素钠成品。

实施例3：本实施例与实施例1不同之处是肝素钠粗品为2kg,亲和沉淀介质的用量为40L，苄索氯铵2kg。

实施例4：本实施例与实施例2不同之处是肝素钠粗品为2kg,亲和沉淀介质的用量为20L，苄索氯铵3kg。

Claims (5)

1. 一种亲和沉淀介质的合成方法，其特征是包括下述步骤：

a、活化：以甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯组成的pH敏感型聚合物为基质，将基质溶于适量的N,N-二甲基甲酰胺，然后加入N,N-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑使基质活化3～5分钟；

b、偶联：活化完成后加入凝血酶、抗凝血酶Ⅲ或鱼精蛋白中的一种作为配基偶联反应2.5～3.0小时；反应完成后加8mol/L醋酸调节反应液pH值至3.5～4.5，反应产物完全析出，抽掉反应液用0.1mol/L，pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤沉淀3次，抽去缓冲液即得亲和沉淀介质；

c、以上各步反应所用的试剂用量比例为：1350g基质，100～200g配基，3.78～7.56g N,N-二异丙基碳二亚胺，4.05～8.1g1-羟基苯并三唑。

2.根据权利要求1所述的一种亲和沉淀介质的合成方法，其特征在于所述pH敏感型聚合物为Eudragit S-100或聚丙烯酸树脂Ⅲ号。

3.一种如权利要求1所述的一种亲和沉淀介质的合成方法在制备依诺肝素钠的应用，其特征在于：

（1）用权利要求1所述的一种亲和沉淀介质的合成方法合成的亲和沉淀介质纯化肝素钠粗品；

（2）将亲和沉淀介质纯化后的肝素钠溶液直接制备成肝素季铵盐，然后用β-消除降解法制备依诺肝素钠。

4.根据权利要求3所述的一种亲和沉淀介质的合成方法在制备依诺肝素钠的应用，其特征在于步骤（1）所述纯化方法为：将肝素钠粗品加入纯化水溶解成浓度为5%～10%的肝素钠粗品溶液，用氢氧化钠溶液调节溶液的pH值至7～8.5；取肝素钠粗品溶液等体积的亲和沉淀介质，用氢氧化钠溶液调节pH值至7.6～8.4，加入与亲和沉淀介质等体积的50～150mmol/L磷酸盐缓冲液，搅拌均匀；将肝素钠粗品溶液缓缓加入到亲和沉淀介质溶液中，搅拌吸附1.5～3小时；吸附结束后调节溶液的pH值至4.5～6，使沉淀均匀析出，沉淀用亲和沉淀介质0.8～1.5倍体积的pH4.5～5.5，0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液搅拌洗涤0.5～1小时，离心分离沉淀；沉淀用亲和沉淀介质2～4倍体积的pH7.8,0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液搅拌洗脱2～3.5小时，洗脱液超滤浓缩至肝素钠浓度为10%～15%，得到超滤浓缩液。

5.根据权利要求4所述的一种亲和沉淀介质的合成方法在制备依诺肝素钠的应用，其特征在于所述肝素季铵盐按下述方法制备：

取肝素钠粗品1～1.5重量倍的苄索氯铵，使之完全溶解于3～4重量倍的纯化水中，在搅拌的同时将苄索氯铵溶液缓缓加入到肝素钠超滤浓缩液中，再继续搅拌45～75分钟静置，真空抽滤收集复合盐沉淀，用纯化水洗涤2次后在55～65℃减压干燥30～36小时，得到充分干燥的肝素苄索氯铵盐。