CN115737671A - 肝素十二糖在制备细胞缺氧损伤引起疾病的治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肝素十二糖在制备细胞缺氧损伤引起疾病的治疗药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明通过缺氧模拟剂氯化钴刺激人脐静脉内皮细胞建立细胞异常缺氧损伤模型，通过Transwell侵袭和葡萄糖摄取等实验研究肝素十二糖对细胞缺氧损伤的保护作用及其机制，实验结果显示肝素十二糖抑制内皮细胞的增殖、侵袭、葡萄糖摄取及乳酸积累，并显著下调缺氧诱导因子HIF‑1A和血管内皮生长因子VEGF‑A的蛋白和mRNA的表达水平，这表明肝素十二糖通过抑制细胞异常缺氧导致的细胞侵袭及葡萄糖代谢从而发挥抗细胞缺氧损伤作用。因此，肝素十二糖能够用于制备细胞缺氧损伤引起疾病的治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肝素十二糖在制备细胞缺氧损伤引起疾病的治疗药物中的应用。
背景技术
肝素是一种糖胺聚糖类药物，其分子量范围分布从5KD-30KD，是临床上常用的抗凝药物，研究发现接受肝素和低分子量肝素治疗的癌症患者生存期得到了改善；大量临床前研究发现：肝素能够抑制动物体内的肿瘤转移，其在体内的靶器官为血管内皮。但由于肝素结构的复杂性和分子量分布的广泛性，其在临床应用中存在血小板减少、出血、和骨质疏松等副作用，使其在临床应用上受到了一些限制。
肝素十二糖(Heparin-derived oligosaccharides，HDO)是肝素由亚硝酸降解后经分离纯化而获得的平均分子量在3.2KD的十二糖聚体。中国专利ZL201010139398.9详细叙述了肝素十二糖的制备方法。
恶性肿瘤的发生与细胞的过度增殖有关，肿瘤组织缺氧是恶性肿瘤的重要生物学特征。肿瘤细胞可以通过高代谢、高氧耗或作用血管破坏氧气输送等机制来制造慢性缺氧环境。肿瘤的缺氧微环境可以稳定缺氧诱导因子(Hypoxia Inducible Factor，HIF)α亚基进入细胞核并与稳定表达的β亚基形成有活性的蛋白复合物，结合靶基因的缺氧反应元件介导下游相关靶基因的转录表达。HIF具有相当广泛的靶基因谱，通过激活下游靶基因来适应低氧环境，如诱导VEGF的表达调节血管生成来运输营养物质；通过调节葡萄糖代谢，在缺氧期间维持细胞能量产生，最终加速肿瘤的生长，提高肿瘤的侵袭，促使肿瘤发生转移。因此，抑制缺氧诱导因子及下游靶基因的表达可能是一种有潜力的抗恶性肿瘤生长转移的治疗策略。
发明内容
发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种肝素十二糖在制备细胞缺氧损伤引起疾病的治疗药物中的应用。经研究发现：肝素十二糖具有抑制内皮细胞异常缺氧导致的细胞侵袭和葡萄糖代谢的作用。
本发明研究肝素十二糖保护内皮细胞免受缺氧损伤的机制，采用不同浓度肝素十二糖作用于人脐静脉内皮细胞HUVEC，选择50μΜ缺氧模拟剂CoCl2刺激HUVEC细胞建立细胞异常缺氧损伤模型，结果发现肝素十二糖可以抑制内皮细胞的增殖、侵袭，抑制细胞葡萄糖摄取及乳酸积累，并显著下调缺氧诱导因子HIF-1A和血管内皮生长因子VEGF-A的蛋白和mRNA的表达水平，这表明肝素十二糖是通过抑制细胞异常缺氧导致的细胞侵袭及葡萄糖代谢从而发挥抗细胞异常缺氧作用的，此研究可以为治疗恶性肿瘤生长转移提供新的途径。
技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供了一种肝素十二糖在制备细胞缺氧损伤引起疾病的治疗药物中的应用。
具体地说，本发明提供了一种肝素十二糖在制备细胞缺氧损伤引起的恶性肿瘤治疗药物中的应用。
所述肝素十二糖为结构式I所示的肝素寡糖十二聚体：
所述肝素十二糖为分子量为3200D的肝素寡糖十二聚体。
所述肝素十二糖通过抑制内皮细胞侵袭及葡萄糖代谢发挥抗细胞异常缺氧的作用。
所述药物包括肝素十二糖及药学上可接受的辅料。
常用的药学上可接受的辅料包括稀释剂、表面活性剂、润滑剂、抗氧剂、粘合剂、着色剂、乳化剂等。
所述药物的剂型包括注射液或冻干针剂。
本发明的肝素十二糖为采用亚硝酸裂解肝素后经Bio-gel P6分子筛分离纯化得到分子量为3.2KD的肝素寡糖片段，可以添加药学上可接受的辅料，制备成药学上常用的剂型用于临床，如肝素寡糖注射液或肝素寡糖冻干针剂等。
可以改变本发明的药物中活性成分的实际剂量水平以获得对特定患者、组合物和施用方式而言可以有效实现所需治疗响应、对患者无毒的活性成分的量。所选择的剂量水平取决于多种因素，包括所用的具体的本发明的药物的活性、施用途径、施用时间、所用的具体组合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用的具体组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、一般健康状况和既往病史以及医学领域中公知的类似因素。
有益效果：
本发明所述肝素十二糖能作为活性成分，应用于细胞缺氧损伤引起疾病的治疗。实验结果表明，肝素十二糖可以抑制内皮细胞的增殖、侵袭，抑制细胞葡萄糖摄取及乳酸积累，并显著下调缺氧诱导因子HIF-1A和血管内皮生长因子VEGF-A的蛋白和mRNA的表达水平。因此，肝素十二糖能够用于制备细胞缺氧损伤引起疾病的治疗药物；制备细胞缺氧损伤引起的恶性肿瘤的治疗药物。
附图说明
图1为MTT实验确定肝素十二糖对HUVEC细胞增殖影响的数据统计分析结果图。
图2为Transwell侵袭实验确定肝素十二糖对HUVEC细胞侵袭影响的细胞图。
图3为Transwell侵袭实验的数据统计分析结果图。
图4为葡萄糖检测实验确定肝素十二糖对HUVEC细胞葡萄糖摄取影响的结果图。
图5为乳酸检测实验确定肝素十二糖对HUVEC细胞乳酸积累影响的结果图。
图6为Cell-based ELISA实验确定肝素十二糖对HIF-1α蛋白表达水平影响的数据统计分析图。
图7为qPCR实验确定肝素十二糖对HIF-1αmRNA水平影响的数据统计分析图。
图8为Cell-based ELISA实验确定肝素十二糖对VEGF-A蛋白表达水平影响的数据统计分析图。
图9为qPCR实验确定肝素十二糖对VEGF-AmRNA水平影响的数据统计分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
本发明的肝素十二糖为采用亚硝酸裂解肝素后经Bio-gel P6分子筛分离纯化得到分子量为3.2KD的肝素寡糖片段，其结构式如下：
实施例1MTT实验检测肝素十二糖对HUVEC细胞增殖的影响
人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞，ATCC)用含10％ FBS(Gibco公司)的DMEM(含双抗)培养基(Gibco公司，高糖DMEM培养基)在37℃、5％CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞以含0.02％(w/v)EDTA的0.25％(w/v)胰酶(Biosharp公司)消化，制备得到细胞悬液，充分混匀后以5×103个/孔加入96孔板，待细胞贴壁后，将细胞分为空白组(Control)、模型组(Model，含50μM CoCl2)及不同浓度HDO给药组(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM+50μM CoCl2)，每组设6个复孔，弃去旧培养基并加入用不含FBS的DMEM培养基配置的各组含药培养基，37℃培养24h。
每孔加入5mg/mL的MTT溶液(Sigma公司)20μL，细胞培养箱中继续孵育4h后，小心吸出培养基，每孔加入150μL DMSO于摇床振荡10min以溶解结晶，混匀后于490nm处测吸光度(Multiskan FC酶标仪，Thermo公司)。用Graph Pad Prism 5.0软件统计分析所得的数据，定量分析结果如图1。
结果显示：在加入50μM CoCl2缺氧诱导后促进了HUVEC细胞的增殖，而在0.01-1μM范围内不同剂量的肝素十二糖药物治疗可以不同程度的抑制HUVEC细胞的异常增殖，其中0.1μM肝素十二糖抑制效果最佳。
实施例2Transwell小室侵袭实验检测肝素十二糖对HUVEC细胞侵袭的影响
本实验选用8μm聚碳酸酯膜的Transwell 24孔板进行检测。
实验前一天将Transwell 24孔板和枪头放入4℃冰箱预冷。将基质胶(MatrigelBasement Membrane Matrix Phenol Red Free，Corning公司)放入4℃冰箱过夜融化备用，用预冷的无血清高糖DMEM培养液(Gibco公司)体积比1∶3稀释后，取100μL加入Transwell小室的上室内，避免产生气泡，放置于细胞培养箱中，静置1h使其凝结成胶。
设置空白组(Control)、模型组(Model，含50μM CoCl2)及不同浓度HDO给药组(0.01μM、0.1μM、1μM+50μM CoCl2)，每组细胞设3个复孔。以含0.2％(w/v)BSA(Biofroxx公司)的无FBS的DMEM培养基配置各组培养基。
将生长至90％左右且状态良好的HUVEC细胞(ATCC)常规消化后，离心，用2mL PBS清洗2遍，用各含药培养基调整细胞浓度为5×104个/mL。Transwell小室的上室加入200μL细胞悬液，下室加入500μL各组培养基(含10％FBS的DMEM培养液配制)，放入细胞培养箱继续培养24h。
取出小室，用棉签擦去小室上层未穿过膜的细胞，1mL PBS清洗上下小室2次。4％多聚甲醛固定15min，后用0.1％结晶紫染色25min，1mL PBS清洗后显微镜(AE2000倒置显微镜，麦克奥迪)下观察并拍照，结果如图2。之后每孔加入500μL 10％醋酸溶液于摇床振荡抽提结晶紫，取200μL加入到96孔板中，于600nm处测吸光度(Multiskan FC酶标仪，Thermo公司)。定量分析结果如图3。
图2和图3结果显示：与Control组相比，Model组中50μM CoCl2缺氧刺激后显著诱导HUVEC细胞向下室侵袭的增加，而在肝素十二糖药物治疗后，可以不同程度的抑制HUVEC细胞的下室的侵袭，其中0.1μM肝素十二糖抑制效果最佳。
实施例3葡萄糖测试盒检测肝素十二糖对HUVEC细胞葡萄糖摄取的影响
将生长至90％左右且状态良好的HUVEC细胞常规消化后，调整细胞密度并铺6孔板，待细胞贴壁生长至70-80％融合时，将细胞分为空白组(Control)、模型组(Model，含50μM CoCl2)及不同浓度HDO给药组(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM+50μM CoCl2)，弃去旧培养基并分别加入用不含FBS的DMEM培养基配置的各组含药培养基，给药后置于培养箱中继续培养24h。
吸取细胞培养上清液转移至EP管中，1000r/min，离心10min，取培养液上清按照葡萄糖测试盒(南京建成生物工程研究所，型号A154-1-1)说明书进行测定。
参照表1进行检测，每组均设置3个复孔。
表1检测条件
葡萄糖含量(mM)＝(A测定-A空白)/(A标准-A空白)*5.55mM
葡萄糖摄取量(mM)＝无细胞孔-样本孔
根据各组吸光度值，计算葡萄糖摄取量。分析结果如图4。
结果显示，与Control组相比，Model组中50μM CoCl2缺氧诱导后HUVEC细胞的葡萄糖摄取量明显增加，与Model组相比，肝素十二糖药物治疗后，HUVEC细胞的葡萄糖摄取量得到不同程度的抑制，其中1μM肝素十二糖抑制效果最佳。
实施例4乳酸测试盒检测肝素十二糖对HUVEC细胞乳酸积累的影响
将生长至90％左右且状态良好的HUVEC细胞常规消化后，调整细胞密度并铺6孔板，待细胞贴壁生长至70-80％融合时，将细胞分为空白组(Control)、模型组(Model，含50μM CoCl2)及不同浓度HDO给药组(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM+50μM CoCl2)，弃去旧培养基并分别加入用不含FBS的DMEM培养基配置的各组含药培养基，给药后置于培养箱中继续培养24h。
收集细胞培养上清液转移至EP管中，1000r/min，离心10min，取培养液上清按照乳酸测试盒(南京建成生物工程研究所，型号A019-2-1)说明书进行测定。
参照表2进行检测，每组均设置3个复孔。
表2检测条件
乳酸含量(mM)＝(A测定-A空白)/(A标准-A空白)*3mM
根据各组吸光度值，计算乳酸积累量。分析结果如图5。
结果显示，与Control组相比，Model组中50μM CoCl2缺氧诱导后HUVEC细胞的乳酸积累明显增加，与Model组相比，肝素十二糖药物治疗后，可以不同程度的抑制HUVEC细胞的乳酸积累，其中0.01μM肝素十二糖抑制效果最佳。
实施例5Cell-based ELISA实验检测肝素十二糖对HIF-1α和VEGF-A蛋白表达的影响
将生长至90％左右且状态良好的HUVEC细胞常规消化后，调整细胞密度并铺96孔板，待细胞贴壁生长至80％融合时，将细胞分为空白组(Control)、模型组(Model，含50μMCoCl2)及不同浓度HDO给药组(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM+50μM CoCl2)，弃去旧培养基并分别加入用不含FBS的DMEM培养基配置的各组含药培养基，每组细胞设6个复孔，给药后置于培养箱中继续培养24h。
用PBS洗涤，干燥后加4％多聚甲醛室温固定20min。按100μL/孔，加0.1％PBS-Triton X-100(PBS购自碧云天，Triton X-100购自BioFroxx公司)洗涤，5min×3次，加0.6％ H2O2-PBS-Triton X-100孵育20-30min。加0.1％ PBS-Triton X-100漂洗，5min×3次，按50μL/孔，加入10％ BSA封闭液，37℃封闭100min。封闭结束后，弃去封闭液。96孔板按50μL/孔加入5％ BSA配制的一抗(Anti-HIF-1α-Antibody/Anti-VEGF-A-Antibody，正能生物)，4℃过夜孵育。第二天弃去一抗溶液，加0.1％PBS-Triton X-100洗涤5min×3次，再按50μL/孔，加入5％ BSA配制的二抗溶液(Goat anti-Rabbit IgG HRP标记，正能生物)，37℃孵育60min。弃去二抗，加0.1％ PBS-Triton X-100洗涤5min×3次，PBS洗涤5min×3次，最后每孔加入200μL TMB显色液(Solarbio公司)于37℃避光显色30min。每孔加入50μL 1MH2SO4终止液终止反应，立刻测量450nm处吸光度(Multiskan FC酶标仪，Thermo公司)。用Graph Pad Prism 5.0软件所得的数据，定量分析结果如图6和8。
结果显示，与Control组相比，Model组细胞在50μM CoCl2缺氧诱导后HIF-1α及VEGF-A的蛋白表达水平得到显著提高，而在肝素十二糖药物治疗后，蛋白分子的表达受到抑制。其中0.1μM肝素十二糖抑制HIF-1α蛋白表达的效果最佳，而1μM肝素十二糖抑制VEGF-A蛋白表达的效果最佳。
实施例6qPCR实验检测肝素十二糖对HIF-1α和VEGF-AmRNA表达的影响
将生长至90％左右且状态良好的HUVEC细胞常规消化后，调整细胞密度并铺6孔板，待细胞贴壁生长至70-80％融合时，将细胞分为空白组(Control)、模型组(Model，含50μM CoCl2)及不同浓度HDO给药组(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM+50μM CoCl2)，弃去旧培养基并分别加入用不含FBS的DMEM培养基配置的各组含药培养基，给药后置于培养箱中继续培养24h。
弃去六孔板中培养基，用TRIzol(Solarbio公司)提取总RNA，使用Nanodrop 2000(Thermo公司)测定浓度，并计算1μg的体积。使用逆转录试剂盒(诺唯赞生物)将RNA逆转录为cDNA。用SYBR绿色荧光检测试剂盒(诺唯赞生物)进行Real-time qPCR分析。在Real-timeqPCR反应八连管中按下列组分配制PCR反应体系(冰上进行)。各个模板同时进行目的基因(HIF-1A、VEGF-A)及内参基因(ACTB)的扩增反应，设4个复孔，每个模板重复两次。每个PCR板均设定一个空白对照(去离子水)。按下列组份配制PCR反应体系：
引物购自上海生工生物，引物序列为：
| 正向引物 | 反向引物 | |
| ACTB | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
| HIF-1A | GAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCG | CCTTATCAAGATGCGAACTCACA |
| VEGF-A | CAGCTACTGCCATCCAATCGAGAC | GCATGGTGATGTTGGACTCCTCAG |
上述反应液配制在冰上进行，尽量在1小时内配制好，以防止荧光染料的衰减，短时间混合离心后，将反应管按顺序放置qPCR系统上进行PCR。设置PCR仪反应程序如下：预变性：95℃30s；循环反应：95℃10s，60℃30s，扩增40个循环；溶解曲线：95℃15s，60℃60s，95℃15s。反应结束后得出各样品的Ct值，采用2-△△Ct法计算基因表达水平。内参使用ACTB。经过Graph Pad Prism 5.0软件所得的定量分析结果，结果如图7和9所示。
结果显示，与Control组相比，Model组细胞在50μM CoCl2缺氧诱导后显著促进了HIF-1α及VEGF-A的基因转录水平，而在肝素十二糖药物治疗后，抑制了HIF-1α及VEGF-A的基因转录。其中1μM肝素十二糖抑制效果最佳。
实验结果表明，肝素十二糖可以抑制内皮细胞的增殖、侵袭，抑制细胞葡萄糖摄取及乳酸积累，并显著下调缺氧诱导因子HIF-1A和血管内皮生长因子VEGF-A的蛋白和mRNA的表达水平。因此，肝素十二糖能够用于制备细胞缺氧损伤引起疾病的治疗药物；制备细胞缺氧损伤引起的恶性肿瘤的治疗药物。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。
Claims (7)
1.肝素十二糖在制备细胞缺氧损伤引起疾病的治疗药物中的应用。
2.肝素十二糖在制备细胞缺氧损伤引起的恶性肿瘤治疗药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述肝素十二糖为结构式I所示的肝素寡糖十二聚体：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肝素十二糖为分子量为3200D的肝素寡糖十二聚体。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述肝素十二糖通过抑制内皮细胞侵袭及葡萄糖代谢发挥抗细胞异常缺氧的作用。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物包括肝素十二糖及药学上可接受的辅料。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射液或冻干针剂。
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