CN116350639A

CN116350639A - 沙蟾蜍精在制备抗耐药性骨肉瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN116350639A
Application number: CN202310519889.3A
Authority: CN
Inventors: 贾强; 黄利华; 江津津; 陈烽华
Original assignee: Guangzhou City Polytechnic
Current assignee: Guangzhou City Polytechnic
Priority date: 2023-05-10
Filing date: 2023-05-10
Publication date: 2023-06-30

Abstract

本发明提供了沙蟾蜍精在制备抗耐药性骨肉瘤药物中的应用，属于医药领域。本发明提供了沙蟾蜍精在制备抗耐药性骨肉瘤药物中的应用，所述耐药性骨肉瘤的细胞系包括U2OS/MTX300。沙蟾蜍精对耐药性骨肿瘤细胞具有显著的抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。较低浓度的沙蟾蜍精(5μmol/L)可以起到高浓度薯蓣皂苷元(100μmol/L)对U2OS的抑制效果。作为天然植物提取药物，沙蟾蜍精将在抗肿瘤的药物治疗领域具有广阔的应用前景。

Description

沙蟾蜍精在制备抗耐药性骨肉瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及沙蟾蜍精在制备抗耐药性骨肉瘤药物中的应用。

背景技术

原发性骨肉瘤是常见的恶性骨肿瘤，发病年龄主要在青少年时期。因其起病隐匿，进展迅速，发现时已多属中晚期。故而手术治疗效果差，放化疗又都有明显不良反应，导致骨肉瘤患者生存质量差，生存期短。目前亟需有效、安全的抗肿瘤药物用于骨肉瘤的治疗。

正常生理条件下，细胞的增殖受到严格的调控，且细胞可以通过程序性死亡的方式进行代谢，也即发生细胞凋亡。然而，当癌基因激活、抑癌基因失活、修复相关基因的功能缺失、凋亡机制丢失、端粒酶过度表达、信号转导调控机制紊乱等相关分子事件发生时，细胞过度增殖，并伴随着凋亡异常，导致恶性肿瘤的发生。抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡是实现肿瘤治疗最理想的方式。

近年来，以中医药为主的综合治疗手段，可以有效控制骨肉瘤患者病情发展、改善生活质量、延长生存期，并且天然的抗肿瘤药物效果显著且几乎无不良反应。

在骨肿瘤细胞中存在着对抗肿瘤药物具有耐药性的肿瘤细胞系，这大大减小了传统药物的治疗效果，而薯蓣皂苷元也没有体现出对这类细胞显著性的抑制作用。

目前，沙蟾蜍精对耐药性骨肉瘤细胞的研究未见报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了沙蟾蜍精在制备抗耐药性骨肉瘤药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了沙蟾蜍精在制备抗耐药性骨肉瘤药物中的应用，所述耐药性骨肉瘤的细胞系包括U2OS/MTX300。

优选的，所述耐药性中的药包括甲氨蝶呤、阿霉素和顺铂中的一种或几种。

优选的，所述药物还包括医学上可接受的辅料。

优选的，所述药物的剂型包括胶囊剂、片剂、粉剂、酒剂、混悬剂、乳剂、糖浆、气雾剂或注射剂。

本发明对骨肉瘤细胞系U2OS、HOS、MNNGHOS、143B、ZOS、ZOSM、MG63、SJSA1、G292进行常规培养，对具有甲氨喋呤(MTX)耐药性的U2OS/MTX300细胞系用含有300μg/L MTX的培养基进行持续培养，采用MTT检测不同浓度沙蟾蜍精对骨肉瘤细胞U2OS、U2OS/MTX300、HOS、MNNGHOS、143B、ZOS、ZOSM、MG63、SJSA1、G292活力的影响；通过克隆形成试验检测沙蟾蜍精处理后U2OS、U2OS/MTX300、ZOS、143B细胞增殖能力的影响；通过倒置显微镜观察Hoechst染色检测沙蟾蜍精处理后U2OS、143B细胞的凋亡情况；通过流式细胞仪检测检测沙蟾蜍精处理后U2OS、U2OS/MTX300、ZOS、143B细胞的凋亡情况。通过westernblot技术检测沙蟾蜍精处理后细胞凋亡相关指标的变化；通过裸鼠动物实验检测沙蟾蜍精在动物体内对骨肉瘤的治疗作用。实验结果发现：沙蟾蜍精能够抑制U2OS/MTX300增殖并诱导其凋亡，对其他骨肉瘤细胞系也具有很好的抑制增殖和诱导凋亡的效果。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)沙蟾蜍精对耐药性骨肿瘤细胞具有显著的抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。

(2)较低浓度的沙蟾蜍精(5μmol/L)可以起到高浓度薯蓣皂苷元(100μmol/L)对U2OS的抑制效果。

(3)作为天然植物提取药物，沙蟾蜍精将在抗肿瘤的药物治疗领域具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为不同浓度沙蟾蜍精对骨肉瘤细胞活力的影响图；

图2为沙蟾蜍精对骨肉瘤细胞增殖能力的影响图；

图3为沙蟾蜍精作用于骨肉瘤细胞后Hoechst染色图；

图4为沙蟾蜍精作用于骨肉瘤细胞后流式细胞术检测图；

图5为westernblot检测沙蟾蜍精处理后细胞凋亡相关指标的变化；

图6为沙蟾蜍精在动物体内对骨肉瘤的治疗作用结果；其中，A-肿瘤体积变化曲线，B-肿瘤大小实测图，C-小鼠体重变化曲线，D-肿瘤质量变化曲线。

具体实施方式

本发明提供了沙蟾蜍精在制备抗耐药性骨肉瘤药物中的应用，所述耐药性骨肉瘤的细胞系包括U2OS/MTX300。在本发明中，所述耐药性中的药优选包括甲氨蝶呤、阿霉素和顺铂中的一种或几种。在本发明中，所述药物还优选包括医学上可接受的辅料。在本发明中，所述药物的剂型优选包括胶囊剂、片剂、粉剂、酒剂、混悬剂、乳剂、糖浆、气雾剂或注射剂。

在本发明中，所述沙蟾蜍精的结构式如下：

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

沙蟾蜍精在抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导骨肉瘤细胞凋亡中的应用

本发明所用到的人骨肉瘤U2OS、HOS、MNNGHOS、143B、MG63、SJSA1、G292细胞系购自中国科学院上海细胞库；U2OS/MTX300细胞系购自意大利RIZZOLI骨软肿瘤研究中心；ZOS、ZOSM来源于中山大学附属第一医院骨肿瘤科构建的人骨肉瘤原代细胞系；沙蟾蜍精购自广州安邦生物科技有限公司，Hoechst 33258购自美国Thermo公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清均购自Invitrogen公司；MTT试剂盒购自Sigma公司。裸鼠购自南京大学-南京生物医药研究院。

实验方法：

1.细胞培养和药物配制

U2OS、HOS、MNNGHOS、143B、ZOS、ZOSM、MG63、SJSA1、G292细胞培养液为含10％胎牛血清、100mg/L链霉素和100mg/L青霉素的高糖完全培养液；对U2OS/MTX300的MTX耐药细胞系用含300μg/L MTX、10％胎牛血清、100mg/L链霉素和100mg/L青霉素的高糖完全培养液进行持续培养。培养箱环境为37℃、5％CO₂、饱和湿度。

沙蟾蜍精先用DMSO完全溶解，使用完全培养基稀释。动物实验采用沙蟾蜍精悬液，配制浓度为60mg/kg。

2.沙蟾蜍精对细胞增殖能力的影响

用不同浓度沙蟾蜍精(0～20μmol/L)分别处理骨肉瘤细胞72h后，多功能酶标仪450nm波长下读取吸光度(A)值(OD)，并计算出细胞增殖抑制率[抑制率(％)＝(1－加药孔平均A值/对照孔平均A值)×100％]和IC50值。结果如图1所示，经测定，细胞增殖出现抑制效应且呈剂量时间依赖性，沙蟾蜍精作用骨肉瘤细胞72h的IC50值为0.6551～2.5800μmol/L(具体如表1所示)，有抑制活性。

表1 IC50值结果

细胞系	IC50(μM)
		U2OS	2.1710
U2OS/MTX300	2.4570
		HOS	0.7005
MNNGHOS	0.8308
		143B	0.7606
MG63	1.6370
		ZOS	1.6300
ZOSM	2.5800
		SJSA1	0.6551
G292	0.7478

另外，将骨肉瘤细胞U2OS、U2OS/MTX300、ZOS、143B均匀铺在六孔板中，1000个细胞/孔，用2.5μmol/L沙蟾蜍精处理细胞48h后在培养箱持续培养8～10天后(对照组加PBS处理；下同)，用PBS洗涤两次后加甲醇固定30min，加入1％结晶紫染色30min，洗净结晶紫后拍照。结果如图2所示，药物处理组的骨肉瘤细胞克隆数大幅减少，证明沙蟾蜍精对这些细胞的增殖具有抑制作用。

3.沙蟾蜍精对骨肉瘤细胞凋亡的作用

取对数生长期的U2OS、143B细胞，分别加入终浓度为0、2.5μmol/L的沙蟾蜍精培养24h后，用PBS洗涤两次后加4％的多聚甲醛固定，加入Hoechst 33258染液，37℃闭光孵育45min，荧光显微镜下观察细胞核的变化并拍照。

形态学观察结果如图3所示，沙蟾蜍精作用后的细胞呈明显凋亡状态，细胞核固缩、变亮，核小体碎片增加，显著地诱导了骨肉瘤细胞凋亡。

另外，将骨肉瘤细胞U2OS、U2OS/MTX300、ZOS、143B，分别加入终浓度为0、2.5μmol/L的沙蟾蜍精培养48h后，用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行检测。结果如图4所示，沙蟾蜍精可诱导骨肉瘤细胞发生明显的凋亡。

进一步，用不同浓度沙蟾蜍精处理U2OS、143B细胞48小时后，用RIPA细胞裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，通过westernblot技术检测细胞凋亡相关指标。结果如图5所示，沙蟾蜍精处理后凋亡指标cleavedPARP随着药物浓度的升高而上升，抗凋亡指标Bcl2、Bcl-xL随着药物浓度的升高而降低，提示沙蟾蜍精可诱导肿瘤细胞发生凋亡。

4.沙蟾蜍精在动物体内对骨肉瘤的治疗作用

将骨肉瘤细胞143B接种于4周龄的雌性裸鼠皮下，1周后将裸鼠随机分组，分为对照组、沙蟾蜍精组、ADM组。对照组进行蒸馏水灌胃，每天1次；沙蟾蜍精组进行沙蟾蜍精悬液灌胃，浓度为60mg/kg，每天1次；ADM组进行ADM腹腔注射，浓度为6mg/kg，每周1次。每4天测量动物体重及肿瘤体积。

实验结果如图6所示，从肿瘤的体积和重量变化、以及从小鼠体重的变化上看，沙蟾蜍精悬液在动物体内对骨肉瘤有治疗作用，且效果比ADM更明显，未观察到沙蟾蜍精在动物体内有明显的毒副作用。

以上实验结果证明，沙蟾蜍精能够抑制耐药性骨肉瘤细胞增殖和诱导其凋亡，适合于作为抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡的药物。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.沙蟾蜍精在制备抗耐药性骨肉瘤药物中的应用，所述耐药性骨肉瘤的细胞系包括U2OS/MTX300。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述耐药性中的药包括甲氨蝶呤、阿霉素和顺铂中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括医学上可接受的辅料。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括胶囊剂、片剂、粉剂、酒剂、混悬剂、乳剂、糖浆、气雾剂或注射剂。