CN108451937B - 大果桉醛i在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大果桉醛I在制备抗肿瘤药物中的应用。发明人通过实验发明，大果桉醛I可以有效抑制结直肠癌细胞体外增殖和侵袭，能够抑制结直肠癌细胞的克隆形成能力、能够降低裸鼠皮下瘤的增长速度、对结直肠癌细胞具有一定的特异性。同时具有很好的安全性，有望作为天然抗肿瘤小分子化合物应用于对转移性结直肠癌的治疗。

Description

大果桉醛I在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及现有化合物的新应用，具体涉及大果桉醛I在制备抗肿瘤，特别是结直肠癌药物中的应用。

背景技术

结直肠癌是对人类危害很大的消化道恶性肿瘤，近年来的发病率逐年上升。结直肠癌早期症状不明显，许多患者在行根治性手术前已出现了转移，转移是影响结直肠癌患者生存及预后的重要因素，寻找结直肠癌转移相关的药物靶点，基于药物靶点筛选有效的靶向治疗药物是治疗结直肠癌的关键。现阶段对大多数肿瘤的主要治疗方式仍然是手术切除，放疗和化疗。在肿瘤的早期阶段通过手术切除无疑是最为理想的结果，但很多时候由于肿瘤发现较晚，发展快，手术切除不全等因素导致肿瘤发生了广泛转移，此时化疗为主要的治疗手段。化疗药物包括很多种类，例如烷化剂，抗代谢药，抗肿瘤类抗生素等等。由于化疗药物属于细胞毒性药物，在杀伤肿瘤细胞的同时也会杀伤正常细胞，特别是代谢旺盛的细胞，引起严重的毒副作用，因此毒副作用限制了很多化疗药的使用。对于结直肠癌来说，现阶段用于治疗转移性结直肠癌的化疗药物主要为伊立替康，近年来也出现了治疗转移性结直肠癌的新药TAS-102(Lonsurf)，它是一种抗代谢药物，能够显著延长转移性结直肠癌患者的总生存期和无病生存期，但是对血液系统具有较大毒性。因此针对转移性结直肠癌，有效的靶向治疗药物无疑是最好的选择。现阶段用于结直肠癌的靶向治疗药物主要为单克隆抗体，这些靶向治疗药物的作用靶点都位于细胞表面，例如西妥昔单抗，帕尼单抗靶向蛋白EGFR，而贝伐单抗靶向蛋白VEGF，小分子化合物类的靶向治疗药物主要为瑞格菲尼。尽管这些靶向治疗药物取得了一定的疗效，但对于结直肠癌晚期的治疗是远远不够的。由于应用于转移性结直肠癌的化疗药物毒副作用较大，而靶向治疗药物很少，容易产生耐药而且价格昂贵，因此寻找新的靶向治疗小分子化合物对转移性结直肠癌的治疗有着重要意义。针对传统药物靶点的靶向治疗药物有很多，但应用于转移性结直肠癌的却很少，而且效果非常有限。

大果桉醛I

最初是从桉树叶中分离得到的一种天然产物，属于二甲酰间苯三酚类化合物。已有研究表明，大果桉醛类物质对龋齿、牙周病的各病原菌具有非常强的抗菌活性。未有研究表明大果桉醛类物质，特别是大果桉醛I具有抗癌的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供大果桉醛I在制备抗结直肠癌药物中的应用。

发明人通过实验发明，大果桉醛I可以有效抑制结直肠癌细胞体外增殖和侵袭，能够抑制结直肠癌细胞的克隆形成能力、能够降低裸鼠皮下瘤的增长速度、对结直肠癌细胞具有一定的特异性。同时具有很好的安全性，有望作为天然抗肿瘤小分子化合物应用于对转移性结直肠癌的治疗。

本发明所采取的技术方案是：

大果桉醛I及其药学上可接受的衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

作为上述应用的进一步改进，肿瘤为结直肠癌。

作为上述应用的进一步改进，结直肠癌为转移性结直肠癌。

作为上述应用的进一步改进，大果桉醛I的起效浓度不低于80μM。

作为上述应用的进一步改进，大果桉醛I药学上可接受的衍生物为可以体内水解得到与大果桉醛I具有相同或相近药学活性的大果桉醛I衍生物。

作为上述应用的进一步改进，大果桉醛I药学上可接受的衍生物选自其药用盐、药用酯、药用醚、药用酰胺、糖基化物。

一种治疗结直肠癌的组合物，包括辅料和活性成分大果桉醛I或其药学上可接受的衍生物。

作为上述组合物的进一步改进，组合物为外用制剂。

作为上述组合物的进一步改进，外用制剂为栓剂、灌肠剂。

作为上述组合物的进一步改进，大果桉醛I药学上可接受的衍生物选自其药用盐、药用酯、药用醚、药用酰胺、糖基化物。

本发明的有益效果是：

发明人通过实验发明，大果桉醛I可以有效抑制结直肠癌细胞体外增殖和侵袭，能够抑制结直肠癌细胞的克隆形成能力、能够降低裸鼠皮下瘤的增长速度、对结直肠癌细胞具有一定的特异性。同时具有很好的安全性，有望作为天然抗肿瘤小分子化合物应用于对转移性结直肠癌的治疗。

附图说明

图1是不同浓度大果桉醛I对不同细胞株的抑制情况；

图2是时间梯度下的大果桉醛I对癌及正常肠上皮细胞的抑制情况；

图3是浓度梯度下大果桉醛I对结直肠癌细胞克隆形成能力的影响；

图4是浓度梯度下大果桉醛I对结直肠癌细胞侵袭能力的影响；

图5是大果桉醛I处理后裸鼠皮下瘤外观变化情况；

图6是不同浓度大果桉醛I处理后瘤体积和体重的变化情况。

具体实施方式

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

细胞培养

结直肠癌细胞株来源于本实验室已有的细胞株。培养细胞所用的培养基和胎牛血清购买自Gibico公司。细胞株是通过含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基进行培养，培养环境为37℃、5％的CO₂培养箱，取生长状态良好的细胞进行后续实验。

细胞增殖实验-浓度梯度

将大果桉醛I溶解于DMSO配成0.1μmol/μl的母液。待结直肠癌RKO和HCT116细胞生长至80％融合，0.25％胰蛋白酶消化，DMEM完全培养基重悬，计数，接种于96孔板中，每孔7×10³个细胞。待细胞单层贴壁后，加入大果桉醛I，使其终浓度分别为20，50，80，100，200，300μM。同时设空白孔和100％细胞培养基孔作对照，每个药物浓度设3个复孔。将培养板放回5％CO₂培养箱，24h后加入10μl的CCK8溶液，继续在培养箱中孵育2h。用全自动酶标仪在450nm测定吸光度(OD值)。根据各孔的OD值，采用以下公式计算大果桉醛I对细胞的抑制率：抑制率％＝[(对照孔吸光度-实验孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100％，细胞存活率％＝1-抑制率％。

实验结果如图1所示，加入大果桉醛I的细胞株在100μM时大部分已死亡，通过IC₅₀值的计算发现大果桉醛I对结直肠癌RKO和HCT116细胞的IC₅₀分别为76.63μM和62.33μM。并发现了大果桉醛I对结直肠癌细胞的抑制率并不是随着浓度的递增而逐渐升高，而是有一个明显的阈值，这个阈值在50μM到80μM之间或80μM到100μM之间。浓度达到阈值时，大果桉醛I对结直肠癌细胞的抑制效率突然增高。

细胞增殖实验-时间梯度

将大果桉醛I溶解于DMSO配成0.1μmol/μl的母液。待FHC、RKO、SW620、HCT116细胞生长至80％融合，0.25％胰蛋白酶消化，DMEM完全培养基重悬，计数，接种于96孔板中，每孔7×10³个细胞。待细胞单层贴壁后，加入大果桉醛I，使其终浓度为80μM，同时设空白孔和100％细胞培养基孔作对照，每个时间点设3个复孔。将培养板放回5％CO₂培养箱，分别在24h、48h、72h、96h时加入10μl CCK8溶液，在培养箱中孵育2h。用全自动酶标仪在450nm测定吸光度(OD值)。根据各孔的OD值，采用以下公式计算大果桉醛I对细胞的抑制率：抑制率％＝[(对照孔吸光度-实验孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100％，细胞存活率％＝1-抑制率％。

实验结果如图2所示，随着时间推移，三株癌细胞存活率明显下降，到第3天时已基本死亡，而正常细胞虽然略有下降，但与癌细胞相比差别很大，显微镜下观察结果也发现癌细胞在第2天和第3天时存活细胞数量明显降低，细胞变圆漂浮，而正常细胞依然贴壁生长，形态完好。说明大果桉醛I可能对结直肠癌细胞具有一定的特异性。

平板克隆形成实验-浓度梯度

将生长状态良好的SW620细胞通过胰酶消化成单细胞悬液并进行细胞计数，按每孔1000个细胞数接种于6孔板中，轻微晃动6孔板使细胞呈均匀分布，加入大果桉醛I使其终浓度为20、50、80、100μM，每个浓度梯度设置3个复孔，置于37℃、5％的CO₂培养箱中连续培养14天，待肉眼能够观察到克隆后，取出6孔板终止培养，弃去培基，使用PBS洗3次后置于室温干燥，使用甲醇固定30min，吉姆萨染色10min，流水缓慢冲洗，待完全干燥后显微镜下对细胞克隆进行计数(≥50个细胞为一个克隆)。平板克隆形成率＝克隆形成数/接种细胞数×100％，上述实验重复3次。

实验结果如图3所示，随着浓度的递增，癌细胞的克隆形成数明显减少，其中SW620在大果桉醛I 100μM浓度时已无克隆形成，HCT116在大果桉醛I 80μM浓度时已无克隆形成，这与浓度梯度下的细胞增殖实验结果一致。通过单因素方差分析比较SW620和HCT116各浓度之间的差异，结果显示具有统计学意义(P<0.001)。因此大果桉醛I能够抑制结直肠癌细胞的克隆形成能力。并且同样发现大果桉醛I对细胞的抑制能力在50μM到80μM之间或80μM到100μM之间有个明显的阈值。

细胞迁移实验-浓度梯度

常规培养SW480和DLD1细胞，实验前24h撤血清饥饿。消化细胞，用无血清的DMEM培养基重悬浮，调整细胞密度为2×10⁵个/ml。在24孔板中加入20％培养基，每孔650μl。取上述细胞悬液500μl，离心收集细胞沉淀，各孔加入终浓度分别为20，50，80，100μM，体积为200ul的大果桉醛I溶液，分别加入Transwell小室上室中，对照组加入等体积PBS，每个浓度3个复孔。将小室浸于24孔板的培养液中，37℃，5％CO₂培养箱内孵育24h，用镊子轻轻取出小室，4％多聚甲醛固定30min，取出用0.1％结晶紫染液于水平摇床上染色30min，PBS漂洗3次，用棉签擦掉膜上层未穿过的细胞，置于载玻片上，在100倍光镜下随机选取3个视野进行细胞计数并拍照。

实验结果如图4所示，随着浓度的递增，穿过滤膜的结直肠癌细胞数量明显下降，通过单因素方差分析比较SW480和DLD1各浓度之间的差异，结果显示具有统计学意义(P<0.001)。因此大果桉醛I能够抑制结直肠癌细胞的体外侵袭能力。我们同样能够发现，在到达一定浓度时，大果桉醛I对结直肠癌细胞侵袭能力的抑制率明显增高。综合CCK8增殖实验，平板克隆形成实验和Transwell侵袭实验，发现大果桉醛I对结直肠癌细胞的抑制能力具有明显的阈值，当浓度到达这个阈值时，大果桉醛I对结直肠癌细胞的抑制能力突然增加，使得结直肠癌细胞增殖和侵袭能力突然明显的受到抑制。

裸鼠皮下成瘤抑制实验

选取3-4周龄的雌性裸鼠12只，在每只裸鼠右侧腋下皮下接种5×10⁶个SW620细胞，约5天后可见部分裸鼠皮下肿瘤形成，待12只裸鼠均成瘤后，将裸鼠随机分为3组，分别为对照组、低剂量组、高剂量组，每组4只裸鼠。由于大果桉醛I是通过DMSO来溶解的，因此对照组按裸鼠体重每天给予腹腔注射20mg/kg的DMSO，低剂量组按裸鼠体重每天给予腹腔注射20mg/kg的大果桉醛I，高剂量组按裸鼠体重每天给予腹腔注射60mg/kg的大果桉醛I。由于12只裸鼠成瘤的时间顺序有先后，我们以12只裸鼠全部出现皮下瘤为起始点开始给药，以任何一只裸鼠皮下瘤长到1000mm³为终止点，共历时八天。每隔一天用游标卡尺测量瘤体大小，分别测量瘤体长(L)和宽(W)后根据公式Volume(mm³)＝LW²/2来计算肿瘤的体积，每隔一天用电子天平称量裸鼠的体重，累计测量5次。各组裸鼠肿瘤体积取均值后以第一次测量为对照组，腹腔注射后的各次测量为实验组，按照公式(实验组-对照组)/对照组×100％计算肿瘤生长率，绘制生长率曲线。

通过8天的给药发现裸鼠的生活状态未受影响，饮食活动正常。由于在给药起始点肿瘤体积的大小不同，因此终止点所检测的瘤体大小并无实际意义，但通过观察瘤体外观可以发现，高剂量组(60mg/kg大果桉醛I)的部分裸鼠肿瘤内出现了红色的斑点或条纹，可能为内出血或坏死表现，而对照组和低剂量组(20mg/kg大果桉醛I)未发现此现象(图5)。通过计算各组的瘤体增长率可以发现，高剂量组的肿瘤生长速度明显低于对照组，同时也低于低剂量组。而低剂量组的肿瘤生长速度也低于对照组(图6上)，这说明了大果桉醛I能够抑制裸鼠皮下瘤的生长，也说明了大果桉醛I对裸鼠皮下瘤的抑制能力可能呈现剂量依赖性。又通过对各组裸鼠平均体重的检测发现随着给药时间的增加裸鼠体重并没有明显变化(图6下)，这也进一步说明了天然产物大果桉醛I对裸鼠并没有明显的毒副作用。

综上，大果桉醛I对转移性结直肠癌具有明显的抑制作用，并具有一定的肿瘤特异性，可作为天然抗肿瘤小分子化合物应用于对转移性结直肠癌的治疗。

Claims (3)

1.大果桉醛I在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为结直肠癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：结直肠癌为转移性结直肠癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：大果桉醛I的起效浓度不低于80 μM。

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