CN115919839A - Bafilomycin D在制备抗鼻咽癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化合物应用和肿瘤治疗技术领域，具体涉及bafilomycin D在制备抗鼻咽癌活性药物上的应用，本申请人从分离自鲤链霉菌Streptomyces carpaticus T33的发酵液取得该化合物bafilomycin D，体外抗肿瘤活性评估发现，该化合物对正常人鼻咽上皮细胞NP69的细胞毒活性较低，而对鼻咽癌细胞株TW03和5‑8F有明显的细胞毒活性，可以将鼻咽癌细胞阻滞在G1期，并能诱导鼻咽癌细胞凋亡，显著的抑制了鼻咽癌细胞的体外生长、增殖能力，且相较于目前的阳性药物，效果更加显著。因此bafilomycin D具有作为抗鼻咽癌药物先导化合物的潜力，显现出了良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于化合物应用和肿瘤治疗技术领域，涉及bafilomycin D的新用途，具体涉及Bafilomycin D在制备抗鼻咽癌药物中的应用。
背景技术
鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)起源于鼻咽上皮，是我国华南地区高发的恶性肿瘤之一。目前，常见的鼻咽癌化疗药物有紫杉醇、顺铂、奈达铂、吉西他滨、多西他赛等，靶向治疗药物有贝伐珠单抗、西妥昔单抗、舒尼替尼等。上述药物对鼻咽癌细胞的控制虽然具有一定效果，但是均有不同程度的毒副作用，长期使用易产生耐药性，影响病人的治疗和康复，急需寻找毒副作用小且具有靶向性的鼻咽癌治疗新药物。
链霉菌(Streptomyces)来源的天然产物具有结构多样和活性多种的特点，一直是理想的药物来源之一，目前临床上使用的超65％的药物直接或间接来源于链霉菌所产的活性次生代谢产物，因此，从链霉菌中挖掘具有抗鼻咽癌活性的化合物具有重要意义。
巴弗洛霉素(bafilomycins)类化合物主要来源于链霉菌和北里孢菌(Kitasatospora)，具有广谱抗菌、抗肿瘤、抗病毒和抗骨质疏松等活性，然而由于该类化合物对细胞没有选择性且毒性较大，限制了其作为药物研发的应用。
发明内容
针对现有技术的中存在的问题，本发明提供了bafilomycin D的新用途，具体涉及Bafilomycin D在制备抗鼻咽癌药物中的应用。
本发明涉及的化合物bafilomycin D分离自鲤链霉菌Streptomyces carpaticusT33的发酵液，该菌已于2019年3月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019120。化合物bafilomycin D在体外对鼻咽癌细胞显现出较好的细胞毒性，能够抑制鼻咽癌细胞的体外生长和增殖能力，并且对人正常鼻咽部细胞的毒性较低，具有作为抗鼻咽癌药物先导化合物的研发前景。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了Bafilomycin D在制备抗鼻咽癌药物中的应用，所述Bafilomycin D的结构式如下所示：
进一步地，所述药物还包括以Bafilomycin D作为活性成分形成的药学上可接受的盐。
进一步地，所述药物的剂型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。
进一步地，所述药物的剂型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。
术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
术语“盐”、“可接受的盐”和“可药用的盐”是指上述化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。
本发明的有益效果为：
本发明提供了化合物bafilomycin D在抗鼻咽癌活性上的新应用，本发明提出的bafilomycin D在体外能够显著抑制鼻咽癌细胞的生长、增殖能力，将鼻咽癌细胞阻滞在G1期，并且能诱导鼻咽癌细胞凋亡，且对人正常鼻咽部细胞的毒性较低，可以用于抗鼻咽癌药物先导化合物的研发。
附图说明
图1为化合物Bafilomycin D对鼻咽正常上皮细胞NP69，鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的细胞毒活性比较。
图2为化合物Bafilomycin D和顺铂(cisplatin,DDP)对鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的生长抑制曲线。
图3为化合物Bafilomycin D对鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的周期阻滞实验结果。
图4为化合物Bafilomycin D对鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的凋亡影响结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1化合物Bafilomycin D的制备方法(也可直接市售渠道获得)：
1、化合物Bafilomycin D分离自鲤链霉菌Streptomyces carpaticus T33的发酵液，该菌已于2019年3月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019120。
2、按照燕麦粉20.0g/L，复合盐母液10mL/L，调整pH为7.2-7.4的方法配置鲤链霉菌发酵培养基，鲤链霉菌Streptomyces carpaticus T33按1％的接种量接种于发酵培养基中，在28℃、180rpm条件下培养7天。
3、从发酵液中分离纯化bafilomycin D的方法为：发酵液以8000rpm、10min离心后分离菌体和发酵上清液，发酵液使用等体积的乙酸乙酯萃取，重复三次后减压浓缩去除有机溶剂得到发酵液粗提物。该粗提物使用湿法上样到含有200目硅胶的硅胶柱(7cm×50cm)，然后分别使用体积为250mL的80：1、60：1、40：1、20：1、8：1的乙酸乙酯和甲醇溶液洗脱，收集80：1洗脱液，减压浓缩后应用装配有C18柱(2.1×100mm,1.8μm；WatersCorporation,Milford,MA)的半制备高效液相色谱(e2695,Waters Corporation)继续分离，使用乙腈和水溶液进行梯度洗脱，接收洗脱时间为16.5min的液相峰，减压浓缩后即得无色颗粒状物质bafilomycin D。
化合物确认：化合物bafilomycin D的结构分析
使用氘代氯仿溶解1mg的bafilomycin D，于800MHz核磁共振光谱仪上检测，1H-NMR谱图数据如表1所示。
表1.bafilomycin D的1H-NMR谱图数据
以下通过实验例说明化合物bafilomycin D可以发挥抗鼻咽癌活性效应。
评估方法具体如下：
1、体外抗鼻咽癌活性评估：分别取对数生长期的鼻咽正常上皮细胞NP69以及鼻咽癌肿瘤细胞株TW03和5-8F，分别用新鲜的K-SFM、DMEM完全培养基配置成5×104个/mL的细胞悬液后接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100μL，于37℃、5％ CO2培养箱中过夜培养，待细胞贴壁后，检测bafilomycin D细胞毒活性的，继续更换10μg/mL bafilomycin D的完全培养基，以相同浓度的表柔比星(Epirubicin)为阳性对照，处理24小时；检测bafilomycin D增殖抑制效果的，继续更换浓度(0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL和4μg/mL)的bafilomycin D的完全培养基，以相同浓度的DDP为阳性对照，处理24小时。随后每孔加入10μL细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit 8，CCK8)溶液，再继续反应1.5小时，使用多功能酶标仪在450nm处测量吸光值，根据吸光值计算细胞毒存活情况，通过GraphPadPrism软件，采用非线性回归计算出各化合物的IC50值。细胞活力＝(OD实验组-OD空白)/(OD对照组-OD空白)×100％。每个样品重复至少3次。
2、体外阻滞鼻咽癌细胞周期评估：取对数生长期的鼻咽癌肿瘤细胞株TW03和5-8F，以2×105/孔，接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育过夜，待细胞贴壁，更换0.5μg/mL Bafilomycin D的完全培养基处理24小时，随后用不含EDTA的胰酶消化，离心，收集细胞。用预冷的70％乙醇在4℃下固定过夜，随后用预冷的PBS洗涤，然后用细胞周期试剂盒室温避光染色30分钟。处理好的样品用流式细胞仪分析，每个样品收集10000个细胞，实验结果用Modfit软件分析。
3、体外诱导鼻咽癌细胞凋亡评估：取对数生长期的鼻咽癌肿瘤细胞株TW03和5-8F，以2×105/孔，接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育过夜，待细胞贴壁，更换0.5μg/mL Bafilomycin D的完全培养基处理24小时，随后用不含EDTA的胰酶消化，离心，收集细胞(包括培养液上清细胞)，随后用预冷的PBS洗涤，然后用细胞凋亡试剂盒室温避光染色30分钟，处理好的样品用流式细胞仪分析，每个样品收集10000个细胞，实验结果用Modfit软件分析。
4、化合物bafilomycin D对鼻咽正常上皮细胞NP69，鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的细胞毒活性比较
1)、实验方法
采用10μg/mL的bafilomycin D，以相同浓度的表柔比星为阳性对照，对鼻咽正常上皮细胞NP69，鼻咽癌细胞株TW03和5-8F处理24小时，CCK-8法检测bafilomycin D对鼻咽正常上皮细胞NP69，鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的细胞毒活性。
2、实验结果
结果如图1所示，10μg/mL的bafilomycin D和10μg/mL表柔比星处理后的细胞存活率分别为鼻咽正常上皮细胞NP69：59.51±2.99％、33.24±4.52％；鼻咽癌细胞株TW03：21.45±3.81％、33.00±1.06％，5-8F：36.89±0.90％、46.71±6.61％，细胞存活率差异有统计学意义。经10μg/mL的bafilomycin D处理后的鼻咽正常上皮细胞NP69细胞存活率高于鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的细胞存活率。
以上结果说明化合物bafilomycin D对于鼻咽癌细胞有特异性细胞毒活性。
实验例2
化合物bafilomycin D对鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的增殖抑制实验
1)、实验方法
采用5个浓度(0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL和4μg/mL)的bafilomycin D，以相同浓度的DDP为阳性对照，处理鼻咽癌细胞株TW03和5-8F 24小时，CCK-8法检测bafilomycin D对鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的抑制情况，并用GraphPad Prism 9绘制鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的生长抑制曲线。
2)、实验结果
结果如图2所示，bafilomycin D对鼻咽癌细胞株TW03和5-8F有增殖抑制作用，且呈剂量依赖性，抑制效果优于DDP，其中TW03和5-8F的24小时bafilomycin D IC50值分别为0.74±0.04μg/mL，1.48±0.08μg/mL；DDP的IC50值分别为2.72±0.45μg/mL，1.97±0.05μg/mL。
以上结果说明化合物bafilomycin D可以抑制鼻咽癌细胞增殖，抑制效果优于顺铂。
实验例3
化合物bafilomycin D阻滞鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的细胞周期实验
1)、实验方法
采用细胞周期试剂盒，通过流式细胞仪检测经0.5μg/mL的bafilomycin D处理24小时后的鼻咽癌细胞株TW03和5-8F，评价其细胞周期影响，以未处理组为对照组。
2)、实验结果
结果如图3所示，经0.5μg/mL的bafilomycin D处理24小时后，鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的G1期比例增加，G2比例下降，差异有统计学意义。
以上结果说明化合物bafilomycin D可以诱导鼻咽癌细胞G1期阻滞。
实验例4
化合物bafilomycin D诱导鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的细胞凋亡实验
1)、实验方法
采用细胞凋亡试剂盒，通过流式细胞仪检测经0.5μg/mL的bafilomycin D处理24小时后的鼻咽癌细胞株TW03和5-8F，评价其凋亡诱导效应，以未处理组为对照组。
2)、实验结果
结果如图4所示，经0.5μg/mL的bafilomycin D处理24小时后，鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的总凋亡、早期凋亡比例和晚期凋亡比例均升高，差异有统计学意义，总凋亡比例分别为12.44±1.20％和11.69±0.16％。
以上结果说明化合物bafilomycin D可以诱导鼻咽癌细胞凋亡。
综上所述，本发明提供了一种制备抗鼻咽癌活性化合物bafilomycin D的方法及其应用。通过体外抗肿瘤活性评估，证明了化合物bafilomycin D对鼻咽癌细胞具有特异性细胞毒活性，可以将鼻咽癌细胞阻滞在G1期，并能诱导鼻咽癌细胞凋亡，显著的抑制了鼻咽癌细胞的体外生长、增殖能力。因此bafilomycin D具有作为抗鼻咽癌药物先导化合物的潜力，显现出了良好的开发应用前景。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为了清楚地说明本发明技术方案的所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (3)
1.Bafilomycin D在制备抗鼻咽癌药物中的应用，其特征在于，所述Bafilomycin D的结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括以Bafilomycin D作为活性成分形成的药学上可接受的盐。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。
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