CN114796503B - Kdm6a抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂联合在制备抗肿瘤的药物中的用途 - Google Patents
Kdm6a抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂联合在制备抗肿瘤的药物中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种KDM6A抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂联合在制备抗肿瘤的药物中的用途，并公开了一种抗肿瘤的联用药物组合物，该联用药物组合物由KDM6A抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂组成，通过联用显著抑制肿瘤的发生、增殖或生长，促进肿瘤细胞的铁死亡，且无明显不良反应。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别涉及KDM6A抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂联合在制备抗肿瘤的药物中的用途。
背景技术
肝癌是中国发病率排第4位、死亡率排2位的恶性肿瘤，肝癌的整体中位生存期为2年左右，患者五年生存率只有10％。肝癌的治疗难度高，一方面来源于致病因素复杂且多为多病因混合致病，导致发病机制错综复杂；另一方面是因肝脏自身发病隐匿的特点和患者个体间异质性，往往发现时大多已丧失了根治性手术机会，选择接受以非手术局部治疗和系统治疗为主的治疗。总体而言，肝癌恶性程度高，术后发率较高，多数病人术后生存不理想。
目前肝癌靶向治疗主要采用抑制血管生长的多靶点酪氨酸激酶抑制剂，其中包括索拉非尼、仑伐替尼、瑞戈非尼及多纳非尼等。其中，索拉非尼是自美国食品药品监督管理局(FDA)批准后近15年间唯一被证实可延长肝癌患者总生存时间的靶向药物，随后上市的靶向药物如仑伐替尼、瑞戈非尼等也并没有带来显著的生存期改善获益。多纳非尼是在索拉非尼分子结构上进行调整后形成的一种多激酶抑制剂，类似于索拉非尼的一种新型化合物，但在药效学性能和药代动力学方面均有所提升和优化。多纳非尼是12年来晚期肝癌治疗领域第一个在大型III期临床试验中生存期优于索拉非尼的分子靶向药物；ZGDH3研究显示，与索拉非尼相比，多纳非尼可改善晚期肝癌患者的生存期(延长2月余)，而且安全性及耐受性好。索拉非尼组≥3级药物不良事件的发生率可达50％，而多纳非尼组为38％，严重影响肝癌病人的生活质量。虽然目前单用酪氨酸激酶抑制剂(包括索拉非尼、仑伐替尼、瑞戈非尼及多纳非尼等)可一定程度上延长晚期肝癌患者的生存期，但疗效仍有限。
已有大量研究证实联合方案优于单方案疗效，可显著增加肝癌患者的临床获益，靶向治疗联合免疫治疗用于晚期或不可切除肝癌的治疗可获得30％左右的客观缓解率，病人中位生存期也提高到20个月左右。比如阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗(”A+T”组合)是抗血管生成药物联合程序性死亡配体1(PDL1)治疗肝癌的组合典范，是第一个超越索拉非尼疗效的联合方案，目前已被FDA批准用于晚期肝癌一线治疗。可见，因此，亟需探索能增强肝癌靶向药物治疗疗效同时减轻不良反应的方案，进而提高肝癌患者的生存期。
目前已有研究团队通过CRISPR筛选，发现皮生长因子受体(EGFR)的抑制在肝癌中与仑伐替尼是合成致死的；体外细胞实验和动物模型实验均表明，EGFR抑制剂和仑伐替尼联合用药，表现出有效的抗肿瘤作用。更重要的是，临床试验中，EGFR抑制剂和仑伐替尼联合用药，让原本对仑伐替尼无反应的晚期肝细胞癌患者产生了有意义的临床反应。另外，研究表明磷酸丝氨酰tRNA激酶(PSTK)，一种必不可少的RNA依赖性激酶，是肝癌细胞对靶向治疗产生抗性的关键介质。PSTK能够通过维持谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)活性和促进谷胱甘肽(GSH)代谢和叶酸生物合成来防止铁死亡诱导。因此，靶向PSTK可能代表一种通过诱导铁死亡来克服HCC化疗耐药性的可行方法。
虽然目前已有多种联合方案用于肝癌的治疗，但目前可利用的治疗方案对于绝大多数晚期肝癌患者仍不适用，反应率较低，而且副作用相对较大，严重影响人类生命健康。因此，亟需探索能增强肝癌靶向药物治疗疗效同时减轻不良反应的方案，进而提高肝癌患者的生存期。
发明内容
有鉴于此，本发明有必要提供一种KDM6A抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂联合在制备抗肿瘤的药物中的用途，从而显著抑制肿瘤的发生、增殖或生长，显著促进肝癌细胞的铁死亡，且无明显不良反应。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种KDM6A抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂联合在制备抗肿瘤的药物中的用途。
进一步方案，所述KDM6A抑制剂为GSK-J4。
进一步方案，所述酪氨酸激酶抑制剂选自多纳非尼、索拉非尼、瑞戈非尼、仑伐替尼或卡博替尼。
进一步方案，所述肿瘤为肝癌。
进一步方案，所述KDM6A抑制剂的剂量选自5-50mg/kg，给药频次为每天一次；
所述酪氨酸激酶抑制剂的剂量范围选自5-50mg/kg，给药频次为每天一次。
本发明进一步提供了一种抗肿瘤的联用药物组合物，包括KDM6A抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。
进一步方案，所述KDM6A抑制剂为GSK-J4。
进一步方案，所述酪氨酸激酶抑制剂选自多纳非尼、索拉非尼、瑞戈非尼、仑伐替尼或卡博替尼。
进一步方案，所述联用药物组合物中，所述KDM6A抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂的摩尔比为(0.1-2)：1。
进一步方案，所述肿瘤为肝癌。
本发明具有以下有益效果：
本发明基于CRISPR/Cas9高通量技术测序筛选及药物筛选，筛选出可增敏酪氨酸激酶抑制剂疗效的潜在靶基因KDM6A，同时筛选出KDM6A抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂可协同致死肿瘤细胞。低剂量的KDM6A抑制剂和低剂量的酪氨酸激酶抑制剂在体外可明显导致肿瘤细胞死亡，当添加铁死亡抑制剂可明显逆转这一现象，并通过体外实验验证两者联合可促进肿瘤细胞铁死亡。通过体内实验发现，KDM6A抑制剂联合酪氨酸激酶抑制剂可显著抑制肿瘤的发生发展，且无明显不良反应。
经相关试验测定验证了本发明提供的KDM6A抑制剂联合酪氨酸激酶抑制剂的方案能够明显抑制肿瘤细胞的生长，具有较佳的抗肿瘤功效；且本发明提供的两药联合中，使用量少，并能降低副作用，其联合使用的药效大于单独药效，对肿瘤的发生、发展具有明显的抑制效果。
附图说明
图1为实施例1中通过药物文库筛选药物流程示意及结果图；
图2为实施例1中CCK8方法和细胞克隆实验对单药组及联用组对三种不同肝癌细胞生长影响结果示意图；
图3为实施例2中CRISPR敲除文库与多纳非尼联合筛选协同导致肝癌细胞死亡靶基因的流程示意图；
图4为图3中的测序结果分析；
图5为实施例2中通过CRISPR敲除文库筛选靶基因WB验证结果；
图6为实施例3中CCK8方法检测单药组及联用组对肝癌细胞HepG2及Hep3B的抑制作用结果；
图7为实施例3中不同酪氨酸激酶抑制剂与GSK-J4联用组和单药组对不同肝癌细胞的抑制作用结果；
图8-图12为实施例4中验证GSK-J4和多纳非尼联用致死肝癌细胞的作用可被铁死亡抑制剂(ferrostatin-1)逆转结果示意图；
图13为实施例5中体内裸鼠皮下瘤模型的流程及结果示意图；
图14为实施例6中体内免疫正常小鼠皮下瘤模型的流程及结果示意图；
图15为实施例7中体内免疫正常小鼠原位肝癌诱导模型的流程及结果示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面参考附图描述的实施例是示例性的，仅仅是用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
术语解释
本文所述的“肿瘤”为具有酪氨酸激酶抑制剂耐药性的肿瘤。较佳的，所述肿瘤包括血癌、肝癌、肺癌或肾癌，更佳的，所述肿瘤为肝癌。
本文中所述的“联用”或“联合用药”等指的是两种或两种以上活性物质可以各自作为单一制剂同时地、或各自作为单一制剂以任何顺序依次地施用于受试者。
本文所述的“KDM6A抑制剂”指的是以KDM6A为靶点，能够下调KDM6A活性的物质，或者能够下调KDM6A的表达水平、稳定性或减少其有效作用时间的物质。
试剂准备
多纳非尼Donafenib，购自苏州泽璟生物制药股份有限公司；GSK-J4(购自MCE，货号 HY-15648B)；索拉非尼Sorafenib(购自MCE，货号Bay 43-9006)；瑞戈非尼Regorafenib(购自MCE，货号BAY 73-4506)；仑伐替尼Lenvatinib(购自MCE，货号E7080)；卡博替尼Cabozantinib，购自(购自MCE，货号XL184)。
将多纳非尼、GSK-J4以DMSO作为溶剂，根据需要分别配置成不同浓度待用，其中多纳非尼分别为2.5mM及5Mm，GSK-J4分别为4mM、2mM、1mM和0.5Mm。
材料准备：
人源肝癌细胞Huh7、PLC/PRF/5、HCCLM3、HepG2及Hep3B及小鼠肝癌细胞Hep1-6购自中科院上海细胞库。
实施例1药物筛选
1、文库设计
如图1a中所示的，综合麻省理工学院MIT的CTD2 PRISM数据库以及Sanger研究所的GDSC数据药库共设计了针对不同信号通路的657种小分子药物文库，由MCE公司合成，最初浓度为10mM。
2、检测不同浓度多纳非尼对不同肝癌细胞增殖影响
采用CCK8方法进行检测，具体步骤为：将处于指数级增长期的肝癌细胞Huh7(人源，上皮样贴壁生长)、肝癌细胞PLC/PRF/5细胞(人源，上皮样贴壁生长)和肝癌细胞HCCLM3(人源，上皮样贴壁生长)，分别用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，并接种到96孔培养板中；在培养箱(恒温37℃，5％CO2)中培养24h，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的多纳非尼，分别作用48h后终止培养；每孔加入10μl CCK8(5mg/mL)，37℃避光孵育2h，在酶标仪490nm波长下测定细胞光密度值，并按照下式计算细胞生存率：
结果如图1b中所示的，筛选出针对不同肝癌细胞的IC20多纳非尼浓度，如表1中所示的：
表1不同肝癌细胞的IC20多纳非尼浓度筛选结果
| 肝癌细胞 | IC20多纳非尼浓度 |
| HCCLM3细胞 | 5μM/L |
| PLC/PRF/5细胞 | 2.5μM/L |
| Huh7细胞 | 2.5μM/L |
3、药物文库与多纳非尼联合筛选协同导致肝癌细胞死亡的药物
具体流程如图1c所示的，将处于指数级增长期的Huh7细胞、PLC/PRF/5细胞和HCCLM3 细胞，用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，接种到96孔培养板中。在培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，分别加入药物文库或多纳非尼联合药物文库，分别作用48h后终止培养；每孔加入10μl CCK8(5mg/mL)，37℃避光孵育2h，在酶标仪490nm波长下测定细胞光密度值，然后进行数据分析。图1d-图1f示出了药物文库联合多纳非你协同致死肝癌细胞的药物筛选结果，显示GSK-J4对不同肝癌细胞均具有明显的作用。此外，对三种不同肝癌细胞的筛选结构取交集，如图1g所示的，显示对三种肝癌细胞均有作用的仅为GSK-J4。其中，GSK-J4的作用位点如图1h所示的，GSK-J4是一种有效的H3K27me3/me2去甲基化酶UTX/KDM6A 和JMJD3/KDM6B双抑制剂，IC50分别为6.6μM和8.6μM。
4、检测不同浓度GSK-J4对三种不同肝癌细胞的抑制作用
采用CCK8方法(同多纳非尼检测)进行检测，结果如图1i中所示的，筛选出针对不同肝癌细胞的GKS-J4浓度，如表2中所示的：
图2不同肝癌细胞的IC20 GSK-J4浓度筛选结果
| 肝癌细胞 | IC20GSK-J4浓度 |
| HCCLM3细胞 | 2μM/L |
| PLC/PRF/5细胞 | 0.5μM/L |
| Huh7细胞 | 0.5μM/L |
5、检测多纳非尼、GSK-J4及联合组对三种不同肝癌细胞生长的影响
(1)采用CCK8方法(同多纳非尼检测)分别检测多纳非尼、GSK-J4及联合组对肝癌三种细胞系细胞的抑制作用，结果见图2。
(2)采用细胞克隆实验检测多纳非尼、GSK-J4及联合组对不同肝癌细胞生长的影响。具体步骤为：将处于指数级增长期的Huh7、PLC/PRF/5和HCCLM3，用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，取1000细胞接种到6孔培养板中。在培养箱中培养48h后，分别加入不同浓度多纳非尼、GSK-J4及联合用药，分别作用10天后终止培养，弃掉上清培养液，用PBS 冲洗一次，加入0.25％结晶紫溶液，静置15min后用流水冲洗，待干拍照，然后进行克隆计数分析。结果见图2。
图2中，图2a为PLC/PRF/5细胞CCK8及细胞克隆实验结果，图2b为Huh7细胞CCK8 及细胞克隆实验结果，图2c为HCCLM3细胞细胞CCK8及细胞克隆实验结果。
最终筛选的药物浓度为：Huh7及PLC/PRF/5细胞为多纳2.5μMol/L，GSK-J4为0.5μMol/L： HCCLM3细胞为：多纳非尼5μMol/L及GSK-J4 1μMol/L，如表3所示的：
表3联合用药浓度
| 肝癌细胞 | 多纳非尼浓度 | GSK-J4浓度 |
| HCCLM3细胞 | 5μM/L | 1μM/L |
| PLC/PRF/5细胞 | 2.5μM/L | 0.5μM/L |
| Huh7细胞 | 2.5μM/L | 0.5μM/L |
通过上述文库联合多纳非尼协同致死不同肝癌细胞的药物筛选结果中，表明GSK-J4均有明显增敏作用。与单药相比，低浓度的GSK-J4联合多纳非尼可明显抑制肝癌细胞增殖。
实施例2靶基因筛选
1、如图3a所示的，综合设计包含1950个基因的可靶标的CRISPR敲除文库。
进一步的，图3b示出了CRISPR敲除文库与多纳非尼联合筛选协同导致肝癌细胞死亡流程示意图，具体的说，在Huh7肝癌细胞中感染课题组构建的“扩展性”药物靶标文库病毒(针对1980个基因敲除共含9900个sgRNA序列)；随后经puro筛选稳定感染细胞株后分为两组，分别使用低浓度的多纳非尼(2.5μM)及DMSO处理48h；最后提取细胞基因组进行高通量测序分析筛选可促进多纳非尼协同致死肝癌细胞的相关基因。
分析结果如图4中所示，对测序结果前10名(基因敲除后可促进肝癌细胞死亡的基因) 进行分析，具体包括MAPK1、KDM6A、MAP2K1、ARAF、BRAF、CDK4、THBS1、KDM6B、 PBRM1、BCL2L1。图4进一步示出了前3位MAPK1、KDM6A、MAP2K1基因敲除后在多纳非尼药物作用下的致死效果。
2、克隆实验
将处于指数级增长期的HCCLM3sgAAVS1(con)、sgKDM6A-2及sgKDM6A-3(KDM6A 敲除)细胞，用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，取1000细胞接种到6孔培养板中。在培养箱中培养48h后，分别培养10天后终止培养，弃掉上清培养液，用PBS冲洗一次，加入0.25％结晶紫溶液，静置15min后用流水冲洗，待干拍照，然后进行克隆计数分析。结果见图5。
结果如图5中所示的，经WB验证通过Crispr/Cas9技术已敲除KDM6A，克隆结果表明与单独使用多纳非尼相比，敲除KDM6A联合多纳非尼可更明显的抑制肝癌细胞增殖。
通过上述试验验证了敲除KDM6A联合多纳非尼能够更明显的抑制肝癌细胞的增殖，说明以KDM6A为靶点的，任何可降低KDM6A的活性、降低KDM6A或其编码基因的稳定性、下调KDM6A的表达、减少KDM6A有效作用时间、或抑制KDM6A基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明作为对于抑制KDM6A有用的物质，均能够起到增敏酪氨酸激酶抑制剂的抗肿瘤作用。故可以理解的是，本文中所述的KDMA6A抑制剂可以是针对 KDM6A的拮抗剂或抑制剂，敲除或沉默KDM6A或KDM4B的试剂等，具体可提及的实例包括但不限于GSK-J4、GSK-J1或GSK-J2；优选为GSK-J4。
实施例3
1、采用同实施例1中相同的CCK8方法检测GSK-J4和多纳非尼联用组对肝癌细胞HepG2 及Hep3B的抑制作用，其中，DMSO 1μl/mL，多纳非尼单药(浓度2.5μM)；GSK-J4单药(浓度0.5μM)；联用组(多纳非尼2.5μM+GSK-J4 0.5μM)。
结果如图6中所示的，可以看出，低浓度的多纳非尼及GSK-J4联合较单药能更明显的促进肝癌细胞(HepG2及Hep3B)死亡。
2、采用同实施例1相同的CCK8方法检测单药组和联用组GSK-J4与其他酪氨酸激酶抑制剂(索拉非尼、瑞戈非尼、仑伐替尼和卡博替尼)对不同肝癌细胞的抑制作用，其中，采用的各浓度如表4-表7中所示的：
表4索拉非尼、GSK-J4单药及联用组浓度(μM)
| 肝癌细胞 | 索拉非尼单药 | GSK-J4单药 | 联用组 |
| HCCLM3细胞 | 2.5 | 4 | S2.5+G4 |
| PLC/PRF/5细胞 | 2.5 | 0.5 | S2.5+G0.5 |
| Huh7细胞 | 2.5 | 0.5 | S2.5+G0.5 |
表5瑞戈非尼、GSK-J4单药及联用组浓度(μM)
| 肝癌细胞 | 瑞戈非尼单药 | GSK-J4单药 | 联用组 |
| HCCLM3细胞 | 2.5 | 4 | R2.5+G4 |
| PLC/PRF/5细胞 | 2.5 | 0.5 | R2.5+G0.5 |
| Huh7细胞 | 2.5 | 0.5 | R2.5+G0.5 |
表6仑伐替尼、GSK-J4单药及联用组浓度(μM)
| 肝癌细胞 | 仑伐替尼单药 | GSK-J4单药 | 联用组 |
| HCCLM3细胞 | 5 | 4 | L5+G4 |
| PLC/PRF/5细胞 | 2.5 | 0.5 | L2.5+G0.5 |
| Huh7细胞 | 5 | 0.5 | L5+G0.5 |
表7卡博替尼、GSK-J4单药及联用组浓度(μM)
| 肝癌细胞 | 卡博替尼单药 | GSK-J4单药 | 联用组 |
| HCCLM3细胞 | 5 | 4 | C5+G4 |
| PLC/PRF/5细胞 | 5 | 0.5 | C5+G0.5 |
| Huh7细胞 | 2.5 | 0.5 | C2.5+G0.5 |
检测结果如图7中所示的，通过CCK8方法表明：与单药相比，GSK-J4联合其他肝癌靶向药物(索拉非尼、瑞戈非尼、仑伐替尼或卡博替尼)均能明显抑制肝癌细胞生长。
实施例4
1、将处于指数级增长期的Huh7、PLC/PRF/5和HCCLM3，用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，取50000细胞接种到12孔培养板中过夜，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度多纳非尼、GSK-J4及联合用药(Huh7及PLC/PRF/5细胞为多纳2.5μM/L，GSK-J4为0.5μM/L；Hcclm3细胞为：多纳非尼5μM/L及GSK-J44μM/L)，12h后分别加入铁死亡抑制剂(ferrostatin-1， 1μM)、凋亡(Z-VAD-FMK，10μM)、坏死(Necrosulfonamide，0.5μM)或自噬抑制剂(3-MA，3mM)，作用24h后，采用同实施例1中所述的CCK8方法检测细胞活性。
结果如图8中所示的，结果表明GSK-J4联合多纳非尼致死肝癌细胞的作用可被铁死亡抑制剂(ferrostatin-1)逆转，而凋亡、坏死或自噬抑制剂均无明显作用。
2、将处于指数级增长期的Huh7、PLC/PRF/5和HCCLM3，用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，取50000细胞接种到12孔培养板中过夜，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度多纳非尼、GSK-J4及联合用药，12h后另一个联合用药组分别加入铁死亡抑制剂(ferrostatin-1, 1μM)，作用24h后，加入碘化丙啶染色液(对死亡细胞可进行染色)，20min后收集上清细胞，并同时用胰酶收集贴壁细胞，用PBS重悬上述细胞进行上机检测。
结果如图9中所示的，流式分析PI染色结果进一步表明GSK-J4联合多纳非尼致死肝癌细胞的作用可被铁死亡抑制剂(ferrostatin-1)逆转。
3、脂质过氧化检测：采用脂质氧化(MDA)检测试剂盒(碧云天，S0131S)进行，将处于指数级增长期的Huh7、PLC/PRF/5和HCCLM3，用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，取150000细胞接种到6孔培养板中过夜，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度多纳非尼、GSK-J4及联合用药，12h后另一个联合用药组分别加入铁死亡抑制剂(ferrostatin-1，1μM)，作用24h 后，加入脂质过氧化传感器(组分A)，最终浓度为10μM，37℃下孵育30min。除去培养基，用PBS洗涤细胞三次。读取不同波长的荧光；其中一个激发/发射波长为581/591nm (Texas/>滤芯组)用于还原染料，另一个在488/510nm激发/发射(传统的FITC滤光片组) 用于氧化染料。发射荧光强度在590nm和510nm的比值即为脂质过氧化的相对值。
结果如图10所示的，流式分析GSK-J4联合多纳非尼可促进肝癌细胞脂质过氧化，当用铁死亡抑制剂后可逆转这一效果。
4、将胰酶消化未处理，多纳非尼、GSK-J4及联合用药组分别处理的Huh7肝癌细胞，离心弃上清，利用丙二醛进行固定，再进行电镜切片准备，在电镜下观察不同处理组线粒体形态。
结果如图11所示的，电镜结果显示GSK-J4联合多纳非尼可引起肝癌细胞线粒体皱缩，膜密度增加，符合铁死亡表现。
5、C11 BODIPY 581/591本质上是一种亲脂染料，能积累在膜内。一旦染料的多不饱和丁二烯部分被氧化，加大发射波长从590nm迁移到510nm，探针仍维持亲脂性，从而反映膜的脂质过氧化水平。将Huh7细胞计数种在共聚焦小皿上(10000细胞)，分别给予DMSO、多纳非尼(2.5μM)、GSK-J4(0.5μM)及联合用药(多纳非尼2.5μM及GSK-J40.5μM)、联合用药(多纳非尼2.5μM及GSK-J40.5μM)及ferrostatin-1，细胞用C11 BODIPY 581/591(2μM inHEPES-buffered HBSS)孵育20min，之后共聚焦成像，用488nm和565nm激光器激发，检测505-550nm和＞580nm下的荧光。
结果如图12所示的，利用C11 BODIPY 581/591探针染色提示GSK-J4联合多纳非尼可促进脂质过氧化，符合铁死亡特征，当利用当用铁死亡抑制剂后可逆转这一效果。
通过以上实验验证了多纳非尼联合GSK-J4可促进肝癌细胞铁死亡，且使用铁死亡抑制剂后可逆转多纳非尼联合GSK-J4引起的细胞死亡。
实施例5体内裸鼠皮下瘤模型
裸鼠(购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，动物实验经中国科学技术大学实验动物管理委员会审核并通过，遵循动物实验操作规范及伦理要求，实验动物在无病原体的SPF 环境下进行饲养及实验操作。)
可参阅图13a，将HCCLM3肝癌细胞种于10cm的培养皿中，待细胞融合度达到70-85％后消化细胞、离心，用PBS洗涤1-2次后用PBS重悬计数，最后需达到2×106个细胞/150μl，用1ml细针注射器分别将150μl肝癌细胞注射至BALB/c裸鼠右侧背部皮下。7d后分别给予羧甲基纤维素溶液(CMC，对照溶剂)、多纳非尼(10mg/kg，CMC配置)、GSK-J4(10mg/kg， CMC配置)、联用组(多纳非尼10mg/kg+GSK-J410mg/kg，CMC配置)药物进行灌胃治疗，每周进行6次灌胃治疗，每3天监测肿瘤体积，2周后处死裸鼠，解剖并完整取出肿瘤后进行拍照，同时称量裸鼠体重、肿瘤质量及体积。
结果如图13中所示的，其中，连续肿瘤体积测量曲线(图13b)表明多纳非尼联合GSK-J4 相较于单药能够更显著的抑制肝癌肿瘤的生长。单药及联用组用药后肝癌皮下肿瘤的大体照片以及肿瘤质量和体积图(图13c-图13f)，表明联用组能够更显著的抑制肝癌肿瘤的生长，肿瘤体积与质量均有显著的下降。此外，根据裸鼠体重曲线(图13g)可以看出，单药组及联用组的裸鼠体重均未见明显变化。
综合上述结果可以看出，与单药相比，多纳非尼与GSK-J4联用能够更有效的抑制裸鼠肝癌肿瘤生长(免疫缺陷)，且无明显不良反应。
实施例6体内免疫正常小鼠皮下瘤模型
C57BL/6小鼠(购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，动物实验经中国科学技术大学实验动物管理委员会审核并通过，遵循动物实验操作规范及伦理要求，实验动物在无病原体的SPF环境下进行饲养及实验操作。)
采用同实施例1中相同的CCK8方法检测单药(多纳非尼2.5μM、GSK-J40.5μM)及联用组(多纳非尼2.5μM及GSK-J40.5μM)对Hep1-6小鼠肝癌细胞影响，CCK8提示GSK-J4 联合多纳非尼较单药可有效的抑制hep1-6小鼠肝癌细胞的生长(图14b)。
可参阅图14a，将Hep1-6小鼠肝癌细胞种于10cm的培养皿中，待细胞融合度达到70-85％后消化细胞、离心，用PBS洗涤1-2次后用PBS重悬计数，最后需达到2×106个细胞/150μl，用1ml细针注射器分别将150μl肝癌细胞注射至C57BL/6右侧腋窝。7d后分别给予对照溶剂、多纳非尼(10mg/kg)、GSK-J4(10mg/kg)、联用组(多纳非尼10mg/kg+GSK-J410mg/kg)药物进行灌胃治疗，每周进行6次灌胃治疗，每3天监测肿瘤体积，2周后处死小鼠，解剖并完整取出肿瘤后进行拍照，同时称量小鼠体重、肿瘤质量及体积。
结果如图14所示的，其中，连续肿瘤体积测量曲线(图14c)表明联用组较单药能更显著的抑制小鼠肝癌肿瘤的生长过程。单药及联合用药后肝癌皮下瘤肿瘤的大体照片(图14d) 以及肿瘤体积与质量变化曲线(图14e、图14f)表明，联用组能够明显抑制肝癌肿瘤生长，肿瘤质量和体积均有显著下降。小鼠体重曲线(图14g)表明，单药及联合用药组的小鼠体重未见明显变化。
综合上述结果可以看出，与单药相比，多纳非尼与GSK-J4联用更有效的抑制肝癌肿瘤生长(免疫功能正常)，且无明显不良反应。
实施例7体内免疫正常小鼠原位肝癌诱导模型
可参阅图15a和图15b，将c-myc(20μg)、sg P53(20μg)及SB13质粒(5μg)通过尾静脉高压注射诱导肝癌原位自发肿瘤的形成(C57BL/6免疫正常小鼠，约2-3周可形成肿瘤)，在尾静脉注射后7d开始给予对照溶剂、多纳非尼(10mg/kg)、GSK-J4(10mg/kg)、联用组(多纳非尼10mg/kg+GSK-J410mg/kg)药物进行灌胃治疗，每周进行6次灌胃治疗，尾静脉注射35d后处死小鼠，解剖并完整取出肝脏后进行拍照，同时称量小鼠体重、肿瘤质量及体积。
结果如图15中所示的。通过图15c-图15d可以看出联用组能够明显抑制肝癌肿瘤的形成，肝脏肿瘤质量明显降低。此外，图15e中WesternBlot实验结果验证肝癌诱导肿瘤中myc和 p53的表达情况，符合肝癌诱导模型的体系。图15f小鼠体重曲线可以看出，单药及联合用药组的小鼠体重未见明显变化。
综合上述结果可以看出，与单药相比，多纳非尼与GSK-J4联用更有效的抑制小鼠原位肝癌诱导肿瘤生长(免疫功能正常)，且无明显不良反应。
实施例8
本实施例中将GSK-J4的剂量设为5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg、50mg/kg，将多纳非尼的剂量设为5mg/kg、15mg/kg、25mg/kg、50mg/kg，分别进行联用组合药物同实施例5-8的试验，经验证与单药相比，多纳非尼与GSK-J4联用能够明显抑制肝癌的发生和发展，且无明显不良反应。
实施例9
本实施例分别采用不同的KDM6A抑制剂，具体为GSK-J1、GSK-J2，将其分别与多纳非尼、索拉非尼、瑞戈非尼、仑伐替尼、卡博替尼进行不同的组合，采用同实施例5-8相同的试验，经验证，两药联用能够明显抑制肝癌的发生和发展，且无明显不良反应，说明以KDM6A为靶点的抑制剂，均能够增敏酪氨酸激酶抑制剂的抗肿瘤作用。这里由于篇幅有限，不再具体阐述。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.KDM6A抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂联合在制备抗肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述KDM6A抑制剂为GSK-J4，所述酪氨酸激酶抑制剂选自多纳非尼、索拉非尼、瑞戈非尼、仑伐替尼或卡博替尼；所述肿瘤为肝癌。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述KDM6A抑制剂的剂量选自5-50mg/kg，给药频次为每天一次；
所述酪氨酸激酶抑制剂的剂量范围选自5-50mg/kg，给药频次为每天一次。
3.一种抗肿瘤的联用药物组合物，其特征在于，包括KDM6A抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂，其中，所述KDM6A抑制剂为GSK-J4，所述酪氨酸激酶抑制剂选自多纳非尼、索拉非尼、瑞戈非尼、仑伐替尼或卡博替尼；所述肿瘤为肝癌。
4.如权利要求3所述的联用药物组合物，其特征在于，所述联用药物组合物中，所述KDM6A抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂的摩尔比为（0.1-2）：1。
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| CN109498629A (zh) * | 2018-09-28 | 2019-03-22 | 康贝迪生物科技(苏州)有限公司 | 一种小分子抑制剂用于结直肠癌化疗敏感性的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| A comprehensive study of epigenetic alterations in hepatocellular carcinoma identifies potential therapeutic targets;Juan Bayo等;《Journal of Hepatology》;第71卷;第78-90页 * |
| Donafenib Versus Sorafenib in First-Line Treatment of Unresectable or Metastatic Hepatocellular Carcinoma: A Randomized, Open-Label, Parallel-Controlled Phase II-III Trial;Shukui Qin等;《Journal of Clinical Oncology》;第39卷(第27期);第3002-3015页 * |
| GSK-J4 通过抑制STAT3 磷酸化对HepG2 肝癌细胞凋亡和侵袭的影响;陈青松等;《第三军医大学学报》;第40卷(第9期);第739-745页 * |
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