CN111096988B - 阿魏挥发油的gc-ms指纹图谱的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供阿魏挥发油在制备抗肿瘤血管生成、抗肿瘤细胞增殖或抗肿瘤细胞侵袭迁移的药物中的应用。本发明还提供阿魏挥发油的GC‑MC指纹图谱的构建方法。本发明经实验研究发现：阿魏挥发油能有效抑制血管生成，抑制内皮细胞的成管能力；能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭；具有良好的抗肿瘤细胞转移能力，在多种阿魏挥发油的实验中，准噶尔阿魏挥发油的效果最佳。

Description

阿魏挥发油的GC-MS指纹图谱的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及阿魏挥发油的GC-MS指纹图谱的构建方法及其应用，尤其是在制备抗肿瘤血管生成、抗肿瘤细胞增殖或抗肿瘤细胞侵袭迁移的药物中的应用。

背景技术

准噶尔阿魏(Ferula songoriea Pall)为伞形科阿魏属植物，药用部位是根和油胶树脂。在哈萨克斯坦等民间用来治疗头痛、感冒、胃病等疾病，广泛分布于新疆阿勒泰、塔城等地。

《中国药典》(2015版)中收录的药用阿魏为伞形科植物新疆阿魏(Ferulasinkiangensis K.M.Shen)或阜康阿魏(Ferula fukanensis K.M.Shen)的树脂，味苦、辛，温，归脾胃经。具有消食，化癥，散痞，杀虫之功效。目前仅产于新疆。阿魏维吾尔族称为“英”，哈萨克族叫“萨斯克”。新疆地区的少数民族居民(维、蒙、哈萨克)在长期的生产和生活实践中，对阿魏的应用积累了丰富的经验。新疆民间常用于治疗腹部肿块、慢性肠胃炎、虫积、肉积、慢性支气管炎及风湿性关节炎等。阿魏的研究国内外有大量的报道，近年来由于发现其具有植物雌激素和抗癌活性而倍受人们关注。但是药典品种的2种阿魏均已濒临灭绝，资源匮乏。

新疆维吾尔和哈萨克民族用臭阿魏(如新疆阿魏和阜康阿魏)类的根或油胶树脂治疗某些癌症，如食道癌、胃癌、子宫癌等，具有十分独特的疗效。在国外的研究中，意大利学者Poli F.，Saleem M.，RYU，伊朗学者M Iranshahi，A Sahebkar，韩国学者Kim KH等均发现阿魏属植物具有植物雌激素和抗癌活性；国内杨俊荣也有类似报道。但是查阅文献发现，关于准噶尔阿魏的化学成分与药理作用研究较少。

血管生成是恶性肿瘤发生和发展的关键因素，促进了包括胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌等诸多肿瘤疾病的进展。肿瘤血管生成被认为是一个多步骤且复杂的过程，其中肿瘤微环境中的肿瘤细胞及其他细胞直接或间接参与发挥作用。血管内皮细胞在肿瘤血管生成中的作用及相关机制多年来一直被广泛研究。抑制血管内皮细胞的生物学功能，其中包括抑制其迁移、成管能力，是抗肿瘤血管生成，抑制肿瘤生长的重要靶标。

肿瘤血管生成是肿瘤发生发展的关键，在肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。肿瘤细胞生长的营养和氧供给是通过有效的血管网来传输的。新血管网由内皮细胞建立，即从已存在的血管形成新血管，过程复杂，其中内皮细胞的迁移及管形成是关键步骤。内皮细胞还可以通过分泌生长因子和细胞外基质蛋白酶促进肿瘤侵袭与远处转移。因此，抑制血管内皮细胞的生物学功能是抗肿瘤血管生成，抑制肿瘤发生发展的关键。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了阿魏挥发油的GC-MS指纹图谱的构建方法及其在制备抗肿瘤血管生成、抗肿瘤细胞增殖或抗肿瘤细胞侵袭迁移的药物中的应用。本发明对准噶尔阿魏挥发油进行GC-MS指纹图谱与抗肿瘤作用研究，希望通过探索准噶尔阿魏挥发油中化学成分及种类与抗肿瘤实验，为准噶尔阿魏的研究和开发提供一定的科学依据。

本申请发明人前期研究中发现准噶尔阿魏有一定的抗肿瘤、抗炎活性，对其进行分离得到挥发油、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水等5个极性部位，结果表明其低极性部位(挥发油、二氯甲烷、乙酸乙酯)具有较强的抗肿瘤活性，具备进一步研究的价值，而高极性部位(正丁醇、水)抗肿瘤活性较低，故进一步对阿魏挥发油进行了研究。

本发明提供阿魏挥发油在制备抗肿瘤血管生成的药物中的应用。

本发明提供阿魏挥发油在制备抗胃癌的药物中的应用。

本发明提供阿魏挥发油在制备抗肿瘤转移和/或抗肿瘤腹水的药物中的应用。

作为优选，所述肿瘤转移为胃癌转移；优选为胃癌肝转移。

作为优选，所述阿魏挥发油是将阿魏的根粉碎后，加入水，回流提取得到的油状液体。

作为优选，所述阿魏为新疆阿魏、阜康阿魏、多伞阿魏或准噶尔阿魏。

新疆阿魏和阜康阿魏都是臭阿魏，且化学成分药理作用比较相近。

作为优选，所述阿魏为新疆阿魏和准噶尔阿魏。

作为优选，所述阿魏为准噶尔阿魏。

作为优选，所述阿魏挥发油的给药量为1.5g生药/kg。

本发明提供阿魏挥发油的GC-MS指纹图谱的构建方法，将阿魏挥发油进行GC-MS分析；

其中，气相色谱分析条件为：色谱柱HP-5MS毛细管柱，其规格为30m×0.25mm×0.25μm；进样量0.05μL；分流比60∶1；升温程序起始温度为60℃，保持2min；以4℃/min的速率程序升温至80℃，保持5min，以2℃/min升温至180℃，保持5min；以10℃/min升温至200℃，保持2min；载气为氦气，总流速为1mL/min，柱流速为1mL/min；

质谱条件为：电离方式EI；电离能量70eV；离子源发生器温度230℃；接口温度为240℃；溶剂延迟时间为3min；信号采集时间为65min；质量扫描范围33～550amu。

本发明经实验研究发现：阿魏挥发油能有效抑制血管生成，抑制内皮细胞的成管能力；能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭；具有良好的抗肿瘤细胞转移能力，在多种阿魏挥发油的实验中，准噶尔阿魏挥发油的效果最佳。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为准噶尔阿魏挥发油GC-MS指纹图谱。

图2为3种阿魏对斑马鱼节间血管生成的影响。

图3为3种阿魏对SGC 7901移植瘤斑马鱼肠下静脉血管新生的影响。

图4为3种阿魏对人胃癌SGC 7901细胞迁移的影响。

图5为3种阿魏干预人胃癌SGC 7901细胞迁移的抑制作用。

图6为3种阿魏干预人胃癌SGC 7901细胞侵袭的抑制作用。

图7为3种阿魏对SGC 7901异位移植瘤裸鼠的作用。

图8为3种阿魏对SGC7901胃癌原位种植裸鼠肿瘤的病理结果(HE，×200)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

一、实验材料

1.1细胞株：人胃癌SGC-7901、人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)，购自上海中国科学研究院细胞研究所，实验使用3-5代细胞。

1.2药材：由新疆医科大学附属中医医院主任中药师鉴定为新疆阿魏(Ferulasinkiangensis)、多伞阿魏(Ferula ferulaeoides)、准噶尔阿魏(Ferula songoriea)。

1.3试剂：内皮细胞ECM-2培养基(美国Scien Cell公司)；胎牛血清(FBS)(美国Hyclone公司，批号F160123)；磷酸盐缓冲溶液(PBS)(美国Hyclone公司，批号AC10257442)；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司，批号AD16192263)；二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司，批号67685TT)；青霉素/链霉素溶液(美国Hyclone公司，批号J170016)；MTT(美国Sigma公司，批号EZ2811D347)；带基质胶Transwell小室(America millipore，Lot：2500655)；不带基质胶Transwell小室(America Corning，Lot：4167004)。

1.4主要仪器：回流提取装置；酶标仪(美国Thermo公司)；安捷伦5977A MSD-7890B气质联用仪(美国安捷伦公司)；超声波清洗机(昆山仪器公司)；L204电子称量天平；超净工作台(中国上海，ZHJH-C1112B)；CO₂细胞培养箱(America，Thermo)；荧光倒置研究级显微镜(America，IX71-12FL/PH)；移液器(德国Eppendorf公司)。微量注射仪ZGENEBIO PCO-1500(力钧生物科技有限公司)；SZX16体式荧光显微镜、IX51倒置显微镜、激光扫描共聚焦显微镜FV-1000(Olympus)；ZSA302体视显微镜(重庆光学仪器公司)；HPG-280BX光照培养箱(哈尔滨东联电子科技公司)；斑马鱼养殖饲养设备(北京爱生科技公司)。

二、方法

(一)3种阿魏挥发油的提取及准噶尔阿魏挥发油的GC-MS分析

取新疆阿魏、多伞阿魏、准噶尔阿魏根，切碎成小块，至烧瓶中，加10倍重量水，连接挥发油测定器与回流冷凝管，置电热套中缓缓加热至沸，并保持微沸5h，至测定器中油量不再增加，停止加热，放置片刻，得到挥发油，经无水硫酸钠干燥后得到具有特殊气味的油状液体，封装于安瓿中供分析用。

准噶尔阿魏挥发油的气相色谱分析：色谱柱HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样量0.05μL；分流比60∶1；升温程序起始温度为60℃，保持2min；以4℃/min的速率程序升温至80℃，保持5min，以2℃/min升温至180℃，保持5min；以10℃/min升温至200℃，保持2min；载气为氦气(99.999％)，总流速为1mL/min，柱流速为1mL/min。

质谱条件：电离方式EI；电离能量70eV；离子源发生器温度230℃；接口温度为240℃；溶剂延迟时间为3min；信号采集时间为65min；质量扫描范围33～550amu。

(二)3种阿魏抑制血管新生实验

1. 3种阿魏对斑马鱼节间血管生成的影响

选用成年血管标记绿色荧光转基因斑马鱼品系，在受精卵发育至24h时，使用1g·L^-1Pronase E溶液脱去卵膜。在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，移入24孔板中，每孔6-8枚。用二甲基亚砜(DMSO)将3种阿魏挥发油配制成1g·L^-1母液，取一定体积至24孔中，使药液的终浓度为9.375mg·L^-1；对照组为含0.1％DMSO培养水，加药后置于光照培养箱28℃14h。荧光显微镜下观察并计算斑马鱼节间血管数(ISV)，拍照，计算抑制率。

抑制率/％＝(正常对照组节间血管数-给药组节间血管数)/正常对照组节间血管数×100％。

2. 3种阿魏对SGC 7901移植瘤斑马鱼肠下静脉血管新生的影响

选用成年野生型斑马鱼品系，新生斑马鱼胚胎用蒸馏水清洗2次，随后用含有亚甲基蓝培养水灭菌处理，加入终浓度0.03％二苯硫脲(PTU)孵育48h(除斑点)，斑马鱼胚胎加入适量1％三卡因轻度麻醉，放置在体式显微镜下，用微量注射仪将CM-Dil染色后的人胃癌细胞SGC-7901注射于胚胎卵黄下，约0.1μL(约200个癌细胞)，微量注射条件：压力0.12psi，注射时间：0.08s，注射后斑马鱼按照每组12条分组，随机分5组：正常对照组、模型对照组、新疆阿魏组、多伞阿魏组、准噶尔阿魏组；正常对照组仅做穿刺注射处理，不注射细胞；用二甲基亚砜(DMSO)将3种阿魏挥发油配制成1g·L^-1母液，取一定体积至24孔中，使药液的终浓度为9.375mg·L^-1；正常对照组、模型对照组均加含0.1％DMSO培养水至24孔中。加完药物放入28.5℃的饲养箱中，培养48h后，将麻醉后的胚胎放置于共聚焦镜下，波长为480nm，分别拍摄整体与肠下静脉，沿X、Y行2个方向的逐层扫描拍照，并用FV-10软件分析肠下静脉OD，观察3种阿魏挥发油对斑马鱼肠下静脉血管(SIVs)的影响。

3. 3种阿魏对人脐静脉内皮细胞管腔形成能力的影响

4℃提前将基质胶融化，96孔板预冷，每孔铺基质胶50μL，37℃孵育1h待胶凝固。取对数生长期的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞，10％血清的新鲜培养基重悬，调整密度为1×10⁵个/mL，每孔100μL，用二甲基亚砜(DMSO)将3种阿魏挥发油配制成1g·L^-1母液，取一定体积至24孔中，使药液的终浓度为9.375mg·L^-1；设对照孔和给药孔，给药孔加入3种阿魏挥发油药液，对照组为含0.1％DMSO培养水，药物作用8h后进行拍照。通过小管的长度和每单位面积的分支点的数量，评估药物对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)成管能力的影响。

(三)3种阿魏对人胃癌SGC-7901细胞增殖、划痕、迁移、侵袭的影响

1. 3种阿魏挥发油对人胃癌SGC-7901细胞增殖影响

取处于对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞，加入1mLPBS轻轻摇晃清洗细胞培养瓶，后吸去全部液体，再加入1mL(具体加入量根据细胞特性)胰蛋白酶消化液进行消化(待有细胞明显脱落后)，再加入1mL 10％FBS完全培养液终止消化，移液枪吹打瓶底，打匀细胞悬液，移入15mL离心管中，1000rpm离心3min，弃去上清液，加入2mL 10％FBS完全培养液，打匀。计数板计数，调整细胞混悬液浓度为2×10⁵个/mL。于96孔板中每孔加入细胞混悬液100μL，37℃、CO₂细胞培养箱中培养。24h后取3种阿魏挥发油，细胞培养液分别稀释成300mg·L^-1、150mg·L^-1、75mg·L^-1、37.5mg·L^-1、18.75mg·L^-1、9.375mg·L^-16个浓度。加入上述CO₂细胞培养箱中培养。24h后显微镜记录各组细胞的生长状态，将MTT检测试剂与DMSO按顺序加入，用酶标仪(490nm)检测吸光度，并计算3种阿魏挥发油对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制率及IC₅₀。

抑制率(％)＝(模型组OD-给药组OD)/(模型组OD-空白组OD)×100％

2.细胞划痕实验

收集指数生长期的人胃癌SGC 7901细胞，调整细胞混悬液浓度为1×10⁵个/mL。每孔2mL接种于6孔细胞培养板中，在CO₂细胞培养箱培养至铺满六孔板底层约80％时，在培养板中呈横线形轻轻划痕，每孔3条。轻轻呈十字形摇晃，弃去培养板中的上清液及划下的细胞。将3种阿魏挥发油稀释至9.375mg·L^-1，阳性对照药顺铂稀释至同样浓度，分别作用于6孔板中的细胞，每孔加2mL，于此同时，空白对照组中加细胞培养液，并拍照，CO₂细胞培养箱中培养24、48h时分别再次拍照，采用显微镜微距记录软件，记录划痕距离。计算SGC 7901肿瘤细胞的迁移率。

3.Transwell小室迁移实验

取指数生长期的人胃癌SGC 7901细胞，调整细胞混悬液浓度为1×10⁵个/mL。每孔2mL接种于6孔细胞培养板中，在CO₂细胞培养箱培养24h。将受试药物稀释至9.375mg·L^-1，顺铂对照药组浓度同上。移液管吸取6孔板中原有培养液，将含药细胞培养液分置于6孔板中，每孔2mL。于此同时，空白对照组加细胞培养液，常规培养。将Transwell小室从冰箱中取出常温放置1h后进行活化，小室浸泡于不含血清的DMEM细胞培养基，于CO₂细胞培养箱中孵育30min后取出小室。3种阿魏挥发油干预人胃癌SGC 7901细胞48h后将6孔板中上清液弃去，常规收集各组药物干预的细胞，细胞计数板计数，以无血清的细胞培养基调整人胃癌细胞浓度为3×10⁵个/mL的混悬液，分组加至小室上层(不含基质胶)，每孔200μL，小心在小室下层加入含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液，检查小室中无气泡，于细胞培养箱中常规培养。48h后弃去Transwell小室上、下层液体，并加入预先配制、4℃预冷的多聚甲醛(4％)在Transwell小室下层中固定细胞30min，取出小室，磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗2次，以Transwell试剂盒中配带的染色剂染色30min取出小室，PBS清洗小室多次，用细棉签仔细拭去小室上层未穿膜的细胞，并避免损伤小室的微孔膜，并再次清洗小室确保小室上层细胞全部除去，以防干扰细胞计数。小室晾干后，每个小室在显微镜下选取多个视野，调整焦距为200目拍照，统计每个分组人胃癌SGC7901细胞的穿膜细胞数，计算各组肿瘤细胞的迁移抑制率。

4.Transwell小室检测3种阿魏对细胞侵袭能力的作用

将处于对数生长期的人胃癌SGC 7901肿瘤细胞常规消化、1000r·min^-1，离心5min，细胞计数板计数，调整细胞浓度至1×10⁵cell·mL^-1，取6孔板每孔加2mL，放于CO₂培养箱中培养，隔天换液。将3种阿魏挥发油以DMSO助溶后用培养液逐级稀释至9.375mg·L^-1，阳性药顺铂用10％胎牛血清培养液稀释至相同浓度，分别给药，每孔2mL，并设空白对照组，药物作用48h后，将6孔板中上清液弃去，常规消化、离心，以无血清培养基稀释，细胞计数板计数制成1×10⁶cells·mL^-1的细胞混悬液，加至Transwell小室上层(含基质胶)，每孔200μL。小室下层加600μL完全培养液，将小室轻轻上提，检查小室与下层液接触面是否有气泡产生，排出气泡，常规培养48h。培养终止后，弃去Transwell小室上下层液，PBS清洗小室2次，4％多聚甲醛固定细胞30min后，取出小室PBS清洗两次，加染色液染色，30min后取出小室用流动的去离子水清洗后，用棉签拭去小室上层细胞，显微镜下观察小室上层细胞是否全部拭去，小室晾干后进行拍照。显微镜每孔选取5个视野200倍拍照后计算穿过基质胶的细胞，计算细胞侵袭抑制率。

(四)3种阿魏抑制SGC7901胃癌皮下移植瘤作用的研究

1.建立胃癌SGC 7901皮下移植瘤裸鼠模型及分组给药

将体质量为18～22g的BALB/c裸鼠、雌雄各半，随机分为正常组、模型组、顺铂对照组、3种阿魏组，每组10只。收集生长状态良好的SGC 7901胃癌细胞，1000r/min离心3min，弃去上清液，加生理盐水稀释洗涤2次并以生理盐水稀释，将细胞悬液以生理盐水调为1×10⁷个/mL，无菌接种于裸鼠左前肢腋下，每只裸鼠接种0.2mL，次日根据裸鼠体重灌胃给药，给药前12h禁食不禁水。3种阿魏挥发油组剂量均为1.5g生药/kg。顺铂给药剂量为5mg/kg，每隔3d给药1次。正常组和模型组分别灌胃给予等体积0.2mL/10g相应溶媒，连续灌胃给药2w，记录肿瘤生长情况。从第7d开始量取异位移植瘤裸鼠肿瘤的长、宽、厚并记录数据，计算瘤体体积。肿瘤体积＝π×a×b×c/6(a：瘤长，b：瘤宽，c：瘤厚)。

2. 3种阿魏对SGC 7901异位移植瘤裸鼠肿瘤体积、抑瘤率的测定

胃癌SGC 7901异位移植瘤小鼠给药2w后，于末次给药1h时记录各组小鼠体质量。迅速摘取各组小鼠腋窝下的肿瘤瘤体，用滤纸吸干脏器组织上的血液、水分，分别称取、记录质量，计算裸鼠抑瘤率，并进行统计分析。

(五)3种阿魏抑制SGC7901胃癌原位种植模型及肝转移的研究

1.建立胃癌SGC7901胃癌裸鼠原位种植模型

取传代后14d左右的荷瘤鼠，常规消毒，无菌操作，从腋部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，切开选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，切成1mm×1mm×1mm小块，浸泡于RPMI-1640培养液中，置于冰袋上，备用。

BALB/c裸鼠的体质量为18～22g、雌雄各半，随机分为正常组、模型组、顺铂对照组、3种阿魏组，每组8只。实验动物术前禁食，水合氯醛50mg/kg腹腔麻醉，皮肤消毒，左侧旁正中切口进腹，在胃窦小弯近胃角处用无菌缝合针头划破胃壁浆肌层，植入1块瘤组织块于凹内，并在瘤块表面滴上1滴OB生物胶，凝固后回纳入腹腔，缝合。

3日后，根据裸鼠体重灌胃给药，给药前12h禁食不禁水。3种阿魏挥发油组剂量均为1.5g生药/kg。顺铂给药剂量为5mg/kg，每隔3d给药1次。正常组和模型组分别灌胃给予等体积0.2mL/10g相应溶媒，每日记录各组荷瘤裸鼠的体重。连续给药4W。

2.原位肿瘤瘤重、抑瘤率的测定

SGC7901胃癌原位种植裸鼠给药4W后，于末次给药1h时记录各组裸鼠体质量。迅速摘取各组裸鼠腋窝下的肿瘤瘤体，用滤纸拭去脏器组织上的血液、水分，分别称取、记录质量。计算裸鼠抑瘤率，并进行统计分析。

3.裸鼠胃癌种植瘤生长和转移的测定

将裸鼠拉颈处死，解剖动物，肉眼观察移植瘤的局部生长、腹水、肝脏转移情况。

4.肿瘤组织的HE染色

肿瘤组织从中切开，浸泡在10％的中性福尔马林溶液中固定，每日更换新的固定液，常规石蜡包埋、切片，HE染色，在显微镜下观察，并记录。

三、结果

(一)利用气质联用(GC-MS)技术对准噶尔阿魏挥发油成分进行了分析，通过检索标准数据库，参照标准谱图，结合人工谱图解析，明确准噶尔阿魏挥发油的成分组成，采用峰面积归一法测定其成分的百分含量，将其进行分析比较，结果如图1和表1所示。

图1为准噶尔阿魏挥发油GC-MS指纹图谱。

图1的结果显示准噶尔阿魏挥发油所含有化学成分种类较多，分别在22min、27min、29min、32min、37-49min、52min的峰面积明显，其中29min、48min、49min的峰面积较大。

表1准噶尔阿魏挥发油成分分析

(二)3种阿魏抑制血管新生实验

1. 3种阿魏对斑马鱼节间血管生成的影响

斑马鱼节间血管的发育起始时间24hpf；正常对照组斑马鱼节间血管生长良好，节间血管呈均匀纵向排列，完整无缺失，无断裂，荧光强。3种阿魏挥发油处理组荧光缺失明显，出现血管变细、部分缺失，新疆阿魏挥发油、准噶尔阿魏挥发油组节间血管数量与正常对照组比较差异有显著性(P<0.01)，抑制率分别达到了31.37％、38.75％，同时镜下可见节间血流明显减少。结果如图2和表2所示。

图2为3种阿魏对斑马鱼节间血管生成的影响。其中，A：正常对照组，B～D依次为：多伞阿魏组、新疆阿魏组、准噶尔阿魏组。

表2 3种阿魏对斑马鱼节间血管生成的影响

注：与正常对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

2. 3种阿魏对SGC 7901移植瘤斑马鱼肠下静脉血管新生的影响

共聚焦镜下观察显示：正常对照组斑马鱼胚胎肠下静脉血管(SIVs)呈半月形，呈栅栏状，连续无分支，无侧枝及出芽；SGC 7901荷瘤模型组SIVs显示有明显增生，静脉弯曲延长，出现侧枝与分支，部分区域呈网状结构；与模型组比较，3种阿魏挥发油组显示出肠下静脉丛OD值随浓度增加减少，出芽及侧枝数量减少，其作用具有明显剂量依赖性，与模型组比较，新疆阿魏挥发油、准噶尔阿魏挥发油组差异有显著性(P<0.01)。结果如图3和表3所示。

图3为3种阿魏对SGC 7901移植瘤斑马鱼肠下静脉血管新生的影响。其中，A：正常对照组，B：模型对照组，C～E依次为：多伞阿魏组、新疆阿魏组、准噶尔阿魏组。

表3 3种阿魏对SGC 7901移植瘤斑马鱼肠下静脉血管新生的影响

注：与模型对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

3. 3种阿魏对人脐静脉内皮细胞管腔形成能力的影响

如表4的小管形成实验显示，各组8h后均有明显管腔形成，与正常对照组相比，3种阿魏挥发油作用后人脐静脉内皮细胞管腔单位面积长度和分支点数目均下降(P<0.01)，说明3种阿魏均抑制了人脐静脉内皮细胞的成管能力，其中准噶尔阿魏挥发油的抑制作用最好。

表4 3种阿魏对人脐静脉内皮细胞管腔形成能力的影响

注：与正常对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

(三)3种阿魏对人胃癌SGC-7901细胞增殖、划痕、迁移、侵袭的影响

1. 3种阿魏挥发油对人胃癌SGC-7901细胞增殖影响

如表5所示，随受试药物浓度的增加，3种阿魏对人胃癌SGC 7901细胞增殖的抑制越加明显，根据美国国立癌症研究所公布的天然药物抗肿瘤作用标准，植物的粗提物对肿瘤细胞IC₅₀＜30mg·L^-1或100mg·L^-1抑制率在80％左右，可初步认为有一定的抗肿瘤作用，有进一步研究的价值。结果表明，多伞阿魏、新疆阿魏、准噶尔阿魏挥发油均有一定的抑制胃癌细胞作用，以准噶尔阿魏组的抑制作用最好，IC₅₀为9.71mg·L^-1。

表5 3种阿魏挥发油对人胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制影响结果

2.划痕愈合法检测3种阿魏对人胃癌SGC 7901细胞的迁移抑制作用

细胞划痕愈合法实验结果显示，与空白对照组比较，新疆阿魏挥发油组、多伞阿魏挥发油组、准噶尔阿魏挥发油组均使人胃癌SGC 7901细胞迁移率明显下降，以准噶尔阿魏挥发油作用最明显，迁移率为22.68％(P<0.01)。结果如图4和表6所示。

图4为3种阿魏对人胃癌SGC 7901细胞迁移的影响。其中，A：空白对照组，B～D依次为：新疆阿魏、多伞阿魏、准噶尔阿魏组，E：顺铂组。

表6 3种阿魏对人胃癌SGC 7901细胞迁移的影响

注：与空白对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

3.Transwell小室检测3种阿魏对人胃癌SGC 7901细胞迁移的抑制作用

药物作用48h后，空白对照组细胞穿膜个数为206.70±7.87，与空白对照组比较，各给药组对人胃癌SGC 7901细胞的穿膜个数明显降低(P<0.01)，结果显示3种阿魏均有效的抑制了细胞的迁移。准噶尔阿魏挥发油作用最好，SGC 7901细胞穿膜个数为5.80±1.00。结果如图5和表7所示。

图5为3种阿魏干预人胃癌SGC 7901细胞迁移的抑制作用。其中，A：空白对照组，B～D依次为：新疆阿魏、多伞阿魏、准噶尔阿魏组，E：顺铂组。

表7阿魏对人胃癌SGC 7901细胞迁移能力的影响结果

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4.Transwell小室检测3种阿魏对人胃癌SGC 7901细胞侵袭能力的抑制

药物作用48h后，空白对照组细胞穿膜个数为96.36±2.92。与空白对照组比较，各给药组对人胃癌SGC 7901细胞的穿膜个数明显降低(P<0.01)，结果显示3种阿魏均有效的抑制了细胞的侵袭。其中，准噶尔阿魏挥发油作用最好，SGC 7901细胞穿膜个数为12.28±1.58。结果如图6和表8所示。

图6为3种阿魏干预人胃癌SGC 7901细胞侵袭的抑制作用。其中，A：空白对照组，B～D依次为：新疆阿魏、多伞阿魏、准噶尔阿魏组，E：顺铂组。

表8 3种阿魏对人胃癌SGC 7901细胞侵袭能力的影响结果

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

(四)3种阿魏抑制SGC7901胃癌皮下移植瘤作用的研究

1. 3种阿魏对SGC 7901异位移植瘤裸鼠肿瘤体积的影响

如表9所示，肿瘤模型组裸鼠腋窝肿瘤的体积增长迅速，由于肿瘤细胞的恶性增殖，胃癌裸鼠表现为精神萎靡，食欲下降，活动受限。3种阿魏给药组裸鼠的肿瘤生长速度随着时间的增加，肿瘤的生长速度显著减缓，肿瘤体积显著低于肿瘤模型组(P<0.05)。且裸鼠的精神状态较好。

表9 3种阿魏对SGC 7901异位移植瘤裸鼠肿瘤体积的影响

注：与肿瘤模型组比较^*P<0.05。

2. 3种阿魏对SGC 7901异位移植瘤裸鼠瘤重、抑瘤率的作用

如图7和表10所示，胃癌SGC 7901皮下移植瘤裸鼠模型建立后，腋窝接种的第5d，腋下出现明显的肿瘤瘤体，成模率为100％。给药2w后，模型组裸鼠肿瘤体积及质量显著增加。与肿瘤模型组相比，3种阿魏挥发油组裸鼠肿瘤的质量显著低于肿瘤模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，其中，准噶尔阿魏挥发油抑制肿瘤作用最好。

图7为3种阿魏对SGC 7901异位移植瘤裸鼠的作用。其中，A：模型对照组，B：顺铂组，C～E依次为：新疆阿魏、多伞阿魏、准噶尔阿魏组。

表10 3种阿魏对SGC 7901异位移植瘤裸鼠瘤重、抑瘤率作用的影响

注：与肿瘤模型组比较*P<0.05。

(五)3种阿魏抑制SGC7901胃癌原位种植模型及肝转移的研究

1. 3种阿魏对SGC7901胃癌原位种植裸鼠瘤重、抑瘤率的作用

如表11所示，胃癌SGC7901原位种植裸鼠模型建立后，模型组动物出现弓背消瘦，生长缓慢情况。给药4W后，模型组裸鼠肿瘤体积及质量显著增加。与肿瘤模型组相比，3种阿魏挥发油组裸鼠肿瘤的重量均显著低于肿瘤模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。其中准噶尔阿魏抗胃癌作用最好。

表11 3种阿魏对SGC7901胃癌原位种植裸鼠瘤重、抑瘤率作用的影响

注：与模型对照组比较，^#P＜0.05。

2. 3种阿魏对肿瘤肝转移及腹水的影响

与模型对照组相比较，3种阿魏挥发油组的肿瘤肝脏转移率及癌性腹水形成率均减少，其中准噶尔阿魏组7只裸鼠有3只出现肝脏转移(42.9％)，7只裸鼠有4只出现腹水(57.1％)，与模型对照组之间差异有统计学意义(P<0.05)。

表12 3种阿魏对肿瘤肝转移及腹水的影响

注：与模型对照组比较，^#P＜0.05。

3.肿瘤组织的HE染色

病理结果如图8所示，胃癌SGC 7901裸鼠模型组显示，组织中肿瘤细胞密集排列，具有大量的非典型细胞分布呈块状，有丝分裂现象多，肿瘤细胞浸润到脂肪、肌肉层。化疗药物顺铂组肿瘤组织中的细胞排列松散，可以观察到胃癌SGC 7901肿瘤细胞的有丝分裂被抑制，肿瘤细胞的增殖受阻。3种阿魏挥发油组肿瘤细胞数量明显低于模型组，细胞排列松散，有丝分裂象及肿瘤细胞的浸润显著低于模型组，且准噶尔阿魏组抑制肿瘤作用更加显著。

图8为3种阿魏对SGC7901胃癌原位种植裸鼠肿瘤的病理结果(HE，×200)。其中，A：肿瘤模型组，B：新疆阿魏组，C：多伞阿魏组，D：准噶尔阿魏组，E：顺铂组。

四、结论

1.准噶尔阿魏挥发油的提取及GC-MS分析

准噶尔阿魏挥发油所含成分中以1-甲基-8-(1-甲基乙基)-三环[4.4.0.0(2，7)]癸-3-烯-3-甲醇(24.56％)；2-过氧氢-2-(2-环氧乙烷基)-金刚烷(13.86％)与2-羟基-2，4，4-三甲基-3-(3-甲基丁基-1，3-二烯基)环己酮(12.75％)为主，但查询比较相关文献，此类物质并没有见相关报道，考虑有可能是准噶尔阿魏的特征性成分，有待进一步的研究。

新疆阿魏挥发油中主要成分为含硫化合物和萜类，其特殊的葱蒜样臭味主要是由于挥发油中含有含硫化合物，多伞阿魏挥发油中含有的化合物主要有倍半萜、芳香酸酯等物质，本次实验研究准噶尔阿魏挥发油发现其主要成分是醇类物质，考虑7-γ-桉叶油醇(1.28％)，榄香醇(1.13％)是准噶尔阿魏特殊气味的主要来源之一。但在准噶尔阿魏挥发油中并没有发现硫化物类物质，所以准噶尔阿魏没有明显的蒜臭样气味。在传统分类中，新疆阿魏和多伞阿魏属臭阿魏，准噶尔阿魏属香阿魏，所以从主要化学成分或是气味都可将其分离开来。

2. 3种阿魏抑制血管新生实验

2.1 3种阿魏对斑马鱼节间血管生成的影响

本发明所使用的转基因斑马鱼为血管内皮生长因子Ⅱ型受体(VEGFR2)标记绿色荧光蛋白的斑马鱼，3种阿魏挥发油处理后的斑马鱼节间血管荧光减弱或者消失，镜下血流数量减少，且准噶尔阿魏作用最好，说明准噶尔阿魏挥发油对于斑马鱼生理状态下血管生成有抑制作用。

2.2 3种阿魏对SGC 7901移植瘤斑马鱼肠下静脉血管新生的影响

体外研究结果显示，3种阿魏挥发油可使SGC 7901胃癌移植瘤斑马鱼肠下血管面积显著减小，表明可明显抑制肿瘤引起的肠下静脉血管新生，提示其可能通过抑制肿瘤血管生成发挥抗肿瘤作用。

2.3 3种阿魏对人脐静脉内皮细胞管腔形成能力的影响

内皮细胞迁移、相互融合并形成管状结构是血管形成过程中的重要环节，如能抑制这一环节，就可对肿瘤的血管形成起到抑制作用。将内皮细胞培养在特制的纤维蛋白胶中，肿瘤细胞产生的大量血管形成因子可刺激内皮细胞形成类似组织中毛细血管的微管状结构。用不同浓度受试药物的培养液进行培养，内皮细胞小管形成将受到影响，根据管状结构形成的多少及长度，可判断药物的作用。结果显示，3种阿魏挥发油均可使人脐静脉内皮细胞管腔单位面积长度和分支点数目下降，准噶尔阿魏挥发油作用最好，说明准噶尔阿魏抑制了人脐静脉内皮细胞的成管能力，有抑制肿瘤血管生成的作用。

3. 3种阿魏对人胃癌SGC-7901细胞增殖、划痕、迁移、侵袭的影响

根据天然药物抗肿瘤作用标准，植物粗提物对肿瘤细胞IC₅₀＜30mg·L^-1或100mg·L^-1抑制率在80％左右，可初步认定有一定的抗肿瘤作用，本实验结果显示准噶尔阿魏对人胃癌SGC-7901细胞的IC₅₀为9.71mg·L^-1。可初步认定准噶尔挥发油有抗肿瘤作用且有一定的选择性，有待于进一步在动物实验中验证。

通过体外细胞划痕实验与Transwell小室实验，结果表明人胃癌SGC-7901细胞经3种阿魏干预后，其划痕迁移率较模型对照组小，人胃癌细胞穿过Transwell小室的数量显著减少，表明准噶尔阿魏可显著抑制SGC-7901细胞体外的迁移。通过带基质胶的Transwell小室实验研究发现，与模型对照组比较，准噶尔阿魏对SGC-7901细胞的侵袭有一定的抑制作用。

4. 3种阿魏抑制SGC7901胃癌皮下移植瘤作用的研究

SGC7901胃癌皮下移植瘤动物实验结果显示，3种阿魏挥发油对肿瘤的抑制率分别为54.19％，39.35％，63.22％。《抗肿瘤药效学指导原则》要求，研究抗肿瘤药物时，天然药物对实验小鼠肿瘤的抑制率超过40％，且统计分析具有显著差异，经过多次重复实验评估，得到抗肿瘤作用的结果稳定时，则初步判断受试的抗肿瘤天然药物有一定的抗肿瘤作用。本研究结果表明新疆阿魏、准噶尔阿魏阿魏对SGC7901胃癌皮下移植瘤裸鼠有抗肿瘤作用。

5. 3种阿魏抑制SGC7901胃癌原位种植模型及肝转移的研究

转移是恶性肿瘤恶性程度的主要标志，而血管形成被认为是肿瘤转移的一个主要步骤，因此，抗肿瘤新生血管形成已成为目前肿瘤防治研究中的一个热点。我们的研究表明3种阿魏有抗血管形成、抗增殖、抗侵袭迁移作用，因此我们进一步研究3种阿魏抗肿瘤转移作用。

结果表明，在远处脏器转移上，3种阿魏挥发油组的肿瘤肝脏转移率及癌性腹水形成率均减少，其中，准噶尔阿魏作用最好，提示准噶尔阿魏挥发油有抗胃癌转移的作用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.阿魏挥发油在制备抗肿瘤血管生成、抗肿瘤细胞增殖或抗肿瘤细胞侵袭迁移的药物中的应用；所述阿魏为准噶尔阿魏；所述肿瘤为胃癌。

2.阿魏挥发油在制备抗胃癌的药物中的应用；所述阿魏为准噶尔阿魏。

3.阿魏挥发油在制备抗肿瘤肝转移和/或抗肿瘤腹水的药物中的应用；所述阿魏为准噶尔阿魏；所述肿瘤为胃癌。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述阿魏挥发油是将阿魏的根粉碎后，加入水，回流提取得到的油状液体。

5.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述阿魏挥发油的给药量为1.5g生药/kg。

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