CN102000028B - 澳洲茄边碱脂质体及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明是一种澳洲茄边碱脂质体，其特征在于：它是由下述重量配比的原料组成，澳洲茄边碱1；磷脂8~80；胆固醇2~20；乳化剂1~10。本发明还公开了一种澳洲茄边碱脂质体的制备方法。本发明将澳洲茄边碱包裹于脂质体的磷脂双层间，提高了其水溶性，而且它的物理稳定性好，可放置较长时间。本发明澳洲茄边碱脂质体的制备方法简单，成熟，便于工业化生产。

Description

澳洲茄边碱脂质体及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及一种生物碱脂质体，特别是一种澳洲茄边碱脂质体；本发明还涉及该澳洲茄边碱脂质体的制备方法及其用途。 

背景技术

澳洲茄边碱，英文名称：solamargine，分子式：C₄₅H₇₃NO₁₅，结构式： 

澳洲茄边碱为白色粉末，不溶于水，易溶于甲醇，可从茄科植物龙葵Solanum nigrum L.的干燥地上部分经现有技术中公开的任何一种提取工艺提取精制而成，也可由市场购得，澳洲茄边碱的含量最好达95%以上。澳洲茄边碱在龙葵全草中的含量以未成熟果实为最多，可达4.2%。

龙葵为茄科植物龙葵Solanum nigrum L.的干燥地上部分，味苦、微甘，性寒，归肺、肝、胃经；功能清热解毒，活血消肿。许多中医典籍记载，龙葵既有解毒利水消肿之长，又有抗癌化瘀散结之功，兼有扶正祛邪之妙，一举三得，故中医临床上常用于癌症的治疗。研究发现澳洲茄碱、澳洲茄边碱等生物碱苷为龙葵的主要抗癌活性成分 ，（安磊，唐劲天，刘新民，等. 龙葵抗肿瘤作用机制研究进展[J]，中国中药杂志，2006, 31(5)：1225-1226.），研究认为龙葵的抗肿瘤机制主要是龙葵中的生物碱可通过改变细胞膜的结构和功能，影响DNA和RNA的合成以及改变细胞周期分布来抑制肿瘤。但是澳洲茄边碱不溶于水，并且有一定的溶血等毒副作用，对其作为单体药物的应用产生了障碍。 

脂质体是指由磷脂为膜材及附加剂组成的封闭囊泡，是一种类似生物膜结构的双分子层小囊，可包封水溶性或脂溶性的药物，其膜材可在体内生物降解且无毒性和免疫原性，从而可作为药物载体。因此脂质体具有提高药物的稳定性，减少药物用量，降低药物毒性的作用，同时还可以减缓药物释放，减低体内消除速度。由于脂质体是一种外源性物质，进入体内会受到体内防御系统的摄取，因而正常人体内，脂质体主要会在肝、脾、肺等部位富集，出现比较高的局部药物浓度，还可以起到被动靶向载体的效果。作为抗肿瘤药物的载体，它可以减少药物在正常组织的分布，增加药物在肿瘤组织的蓄积量，从而改善药物的治疗指数。鉴于脂质体的独特性能，对其研究目前正处有蓬勃发展的阶段，一些药物的脂质体已经用于多种给药途径和制剂，并开展了临床应用。目前尚无将澳洲茄边碱制成脂质体的相关报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种物理稳定性好，能提高澳洲茄边碱的水溶性，降低其毒副作用的澳洲茄边碱脂质体。 

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了上述澳洲茄边碱脂质体的制备方法。 

本发明所要解决的再一个技术问题是提供了上述澳洲茄边碱脂质体的用途。 

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种澳洲茄边碱脂质体，其特点是：它是由下述重量配比的原料组成， 

澳洲茄边碱    1     ；   磷脂      8~80   ；

胆固醇       2~20   ；   乳化剂    1~10   。

以上所述的澳洲茄边碱脂质体技术方案中，优选的技术方案是： 

1、各原料优选的重量配比是：

澳洲茄边碱     1    ；    磷脂     15~25    ；

胆固醇        2~10  ；    乳化剂   2~8    。

2、本发明所述的澳洲茄边碱可以是单体也可以是提取物，提取物中澳洲茄边碱的含量优选大于80%，最优选含量大于95%的澳洲茄边碱；所述的澳洲茄边碱可以是从中药材龙葵中提取的澳洲茄边碱单体或提取物，或者直接从市场上购买的市售澳洲茄边碱单体或提取物。 

3、所述的磷脂可以为天然提取磷脂、半合成或全合成磷脂，优选：大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、双肉豆蔻磷脂酰胆碱、双肉豆蔻磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂胆碱或者二棕榈酰磷脂酰甘油。磷脂可选自上市的商品，也可以按现有技术公开的方法制得。 

4、所述的乳化剂优选吐温、泊洛沙姆、聚乙二醇或者N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种按合适比例组成的混合物。 

本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案进一步实现。 

本发明所述的澳洲茄边碱脂质体，可以通过以下方法制备： 

方法一：

（1）用注射用水配制pH值为3~6.5的弱酸性缓冲盐溶液，将澳洲茄边碱、乳化剂溶于该缓冲液，得水相；

（2）按所述比例称取磷脂、胆固醇，溶于有机溶剂中，得有机相；

（3）将水相与有机相混合后，先采用逆向蒸发法或薄膜分散法或注入法处理，然后超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体。

方法二： 

（1）用注射用水配制pH值为3~6.5的弱酸性缓冲盐溶液，将乳化剂溶于该缓冲液，得水相；

（2）按所述比例称取磷脂、胆固醇、澳洲茄边碱，溶于有机溶剂中，得有机相；

（3）将水相与有机相混合后，先采用逆向蒸发法或薄膜分散法或注入法处理，然后超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体。

以上所述的澳洲茄边碱脂质体的制备方法一和方法二技术方案中：所述的弱酸性缓冲盐溶液为磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液，如：磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液或者柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH值为3~6.5。所述的有机溶剂优选三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷、正己烷、乙醇、甲醇中的一种或者多种组成的混合液。 

本发明所述的澳洲茄边碱脂质体可以应用于制备治疗肝癌、肺癌及其它癌症的药物中。 

本发明制得的澳洲茄边碱脂质体及其制法具有以下优点： 

1、该制备方法简单易行，磷脂具有良好的生物相容性，可生物降解，来源广，成本低，脂质体对人体无免疫抑制作用，毒性较小。

2、将澳洲茄边碱包裹于脂质体的磷脂双层间，提高了其水溶性。 

3、澳洲茄边碱脂质体的物理稳定性好，可放置较长时间。 

4、该澳洲茄边碱脂质体制备方法简单，成熟，便于工业化生产。 

5、将澳洲茄边碱做成脂质体注射剂，与普通澳洲茄边碱注射液相比，澳洲茄边碱脂质体溶血作用、肌肉和血管刺激均得到改善，且能通过靶向作用在一定程度上提高动物实验的抗肿瘤效果。 

本发明对澳洲茄边碱脂质体的药理作用进行了下述深入研究。 

实验1 。澳洲茄边碱脂质体的溶血实验。 

1 实验材料。 

1.1药物。 

澳洲茄边碱注射液，浓度0.76mg/ml；澳洲茄边碱脂质体A（按照实施例1制备），1.0mg/ml；澳洲茄边碱脂质体B（按照实施例3制备），1.0mg/ml。 

1.2 动物。青紫兰家兔1只，雌雄不拘，体重1.8~2.2kg。 

2 实验方法。 

2.1 药物配制。 

取澳洲茄边碱注射液和澳洲茄边碱脂质体A、B分别用生理盐水稀释成三个浓度：0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml，作为供试品备用，每个样品加做一个重复管做溶血检查。 

2.2 实验方法。 

取青紫兰家兔1只，心脏取血约10ml于锥形瓶内，加入玻璃珠搅拌10min去除纤维蛋白原，使之成为脱纤血液。将脱纤血液移入玻璃试管中，每支试管加入生理盐水约5ml，混匀后离心5min(2000转/min)，除去上清液，再加入生理盐水5ml，混匀，离心。如此反复2～3次，至上清液呈无色透明（不显红色）为止。将所得的红细胞按体积用生理盐水配制成2%的红细胞混悬液，供实验用。 

取洁净试管，分别进行编号后排列在试管架上。按下图1所示加入各种试液，其中1号管为阴性对照管，2号管为阳性对照管，每个样品重复一管。各种试液混匀后，立即置于37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育，开始每隔15分钟观察1次，连续3小时，3小时后每2～3小时观察一次。12小时后，取各管溶液的上清液（约2.5ml），1000r，10min离心后，吸取上清，于分光光度计上读取各管OD值，测定波长545nm，以蒸馏水调零。 

2.3 结果观察与计算。 

若试验中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血发生。 

若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生。如有红细胞凝聚的现象，可按下法进一步判定是真凝聚还是假凝聚。若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加2滴0.9%氯化钠溶液，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚。 

当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生时，若受试物管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚，则受试物可以注射使用；若受试物管中的溶液在3小时内发生溶血和（或）凝聚，则受试物不宜注射使用。 

2.4 分光光度法。 

    用下式计算各试验管的溶血率（%）： 

溶血率（%） = ( OD_t- OD_NC) / (OD_PC - OD_NC) ×100%

其中OD_t：试验管吸光度；OD_NC：阴性对照管吸光度；OD_PC：阳性对照管吸光度。

参考评价标准：溶血率﹥5%表明有溶血发生，并进行统计学处理。 

3 实验结果。 

经实验观察发现：阴性对照管试管上层无色澄清，红细胞下沉完全，不溶血；阳性管红细胞全部溶解，溶液颜色深红，完全溶血。澳洲茄边碱注射液0.05mg/ml浓度管不溶血，0.1mg/ml浓度试管上层澄清，但红细胞下沉不完全，0.15mg/ml浓度试管红细胞部分下沉，上层液体呈红色，有一定的溶血现象。澳洲茄边碱脂质体三个浓度试管均不溶血。分光光度法检测结果见图2： 

由图2可知：澳洲茄边碱注射液溶血安全浓度约0.1mg/ml，澳洲茄边碱两种脂质体在浓度0.15mg/ml时仍无溶血现象，说明脂质体制剂能够一定程度上改善澳洲茄边碱注射液的溶血作用。

实验2。  血管刺激性实验。 

1 实验材料。 

1.1药物。 

澳洲茄边碱注射液，浓度0.76mg/ml；澳洲茄边碱脂质体A（按照实施例1制备），1.0mg/ml；澳洲茄边碱脂质体B（按照实施例3制备），1.0mg/ml。 

1.2 动物。青紫兰家兔9只，雌雄不拘，体重1.8~2.2kg。 

2 实验方法。 

取健康青紫兰家兔9只，雌雄不拘，体重1.8～2.2kg，随机分为3组，即澳洲茄边碱注射液组、澳洲茄边碱脂质体A组、澳洲茄边碱脂质体B组，每组3只。 

每日给家兔右耳缘静脉注射浓度为0.1mg/ml的澳洲茄边碱注射液或脂质体制剂5ml/只，左耳缘静脉注射等量氯化钠注射液作对照，连续3日，每只耳朵给药前后以75%酒精消毒。最后一次注射后48小时，处死2只家兔，剪下给药双侧耳朵，10%甲醛溶液固定，作病理切片观察。剩余1只家兔继续观察14天后，处死，剪下给药双侧耳朵，10%甲醛溶液固定，作病理切片观察。血管病理学检查包括血管壁和内皮细胞、血栓、炎症、组织变化、坏死等。 

3 实验结果。 

给药后澳洲茄边碱注射液组家兔每只右耳注射部位血管暗红或紫红色，有较明显的水肿，未见糜烂；给药结束后12日左右，注射部位回复正常；脂质体A和B组给药兔耳外观与对照组比较无明显变化。 

4 病理学检查结果如下： 

给药期。

氯化钠注射液对照耳：每只兔耳各取材点处耳缘静脉管壁完整，结构清晰。血管壁内衬单层扁平上皮，细胞无肿胀，或坏死脱落。血管腔内未见附壁血栓形成。管壁、管周无炎细胞浸润及出血现象。 

    澳洲茄边碱注射液组：每只兔耳各取材点处血管内皮细胞变性、坏死、脱落，血管腔内有明显血栓形成，血管壁、血管周围轻度水肿，有少量炎细胞浸润。 

澳洲茄边碱脂质体A组：每只兔耳各取材点处耳缘静脉管壁完整，结构清晰。血管壁内衬单层扁平上皮，偶见脱落。血管腔内未见附壁血栓形成。 

澳洲茄边碱脂质体B组：每只兔耳各取材点处耳缘静脉管壁完整，结构清晰。血管壁内衬单层扁平上皮，偶见脱落。壁、管周无炎细胞浸润及出血现象。 

澳洲茄边碱注射液组：每只兔耳各取材点处血管内皮细胞变性、坏死、脱落，血管腔内无明显血栓形成，血管壁、血管周围轻度水肿，有少量炎细胞浸润。 

恢复期。

每只兔耳各取材点处耳缘静脉管壁完整，结构清晰。血管壁内衬单层扁平上皮细胞无肿胀，或坏死脱落。血管腔内未见附壁血栓形成。管周无炎细胞浸润及出血现象。 

由上述结果可知，澳洲茄边碱脂质体血管刺激作用弱于普通注射液。 

实验 3。肌肉刺激性实验。 

1 实验材料。 

1.1药物。 

澳洲茄边碱注射液，浓度0.76mg/ml；澳洲茄边碱脂质体A（按照实施例1制备），1.0mg/ml；澳洲茄边碱脂质体B（按照实施例3制备），1.0mg/ml。 

1.2 动物。青紫兰家兔6只，雄性不拘，体重1.8 ~2.2kg。 

2 试验方法。 

取健康青紫兰家兔6只，体重1.8～2.2kg，随机分为3组，每组2只。分别于右侧股四头肌处以无菌操作方法注入三种澳洲茄边碱剂型供试品1ml，另一侧相同部位注入等容积氯化钠注射液作对照。每日1次，共3次。末次给药48h后处死家兔，解剖后取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位的刺激反应，按图3换算成相应的反应分值，并作局部组织病理学检查。 

根据图3计算出6块股四头肌反应级的总和。若各股四头肌反应级的最高与最低之差大于2时，应另取2只动物重新试验。 

3 实验结果。 

每只家兔肌肉刺激反应情况见图4。由图4可知，6只家兔肌肉刺激反应平均反应分值在2以下。 

病理学检查结果如下： 

氯化钠注射液对照组：股四头肌为横纹肌，光镜下肌纤维横纹清晰，间质血管无扩张充血，间质量少，无急性、慢性炎细胞浸润及出血现象。    

澳洲茄边碱注射液给药组：股四头肌未见肌纤维变性、坏死，间质未见充血、出血等病变，偶见炎细胞浸润症。

澳洲茄边碱脂质体组：股四头肌为横纹肌，光镜下肌纤维横纹清晰，间质血管无扩张充血，间质量少，无急性、慢性炎细胞浸润及出血现象。 

根据肌肉刺激评分和病理结果可知，澳洲茄边碱脂质体在同浓度下肌肉刺激比普通注射剂轻。 

实验4。 异常毒性实验。 

1 实验材料。 

1.1药物。 

澳洲茄边碱注射液，浓度0.76mg/ml；澳洲茄边碱脂质体A（按照实施例1制备），1.0mg/ml；澳洲茄边碱脂质体B（按照实施例3制备），1.0mg/ml。 

1.2 动物。ICR小鼠15只，♀，18～22g。 

2 实验方法。 

取ICR小鼠15只，♀，18～22g，随机分为三组，每组5只，分别尾静脉注射澳洲茄边碱（0.1mg/kg）、澳洲茄边碱脂质体A（0.1mg/kg）、澳洲茄边碱脂质体B（0.1mg/kg）0.5ml/只，观察小鼠给药后的反应。全部小鼠在48小时内不得有死亡，如有死亡，则应另取体重18～19g的小鼠10只复试，复试小鼠在48小时内不得有死亡。 

3 实验结果。 

三组共15只小鼠在24h和48h内观察均正常，无死亡现象出现。在本次实验条件下，三种制剂小鼠异常毒性实验均合格。 

实验5。澳洲茄边碱脂质体对小鼠肝癌H22移植瘤抑瘤作用研究实验。 

1 实验材料。 

1.1 实验动物。 

澳洲茄边碱注射液，浓度0.76mg/ml；澳洲茄边碱脂质体A（按照实施例1制备），1.0mg/ml；澳洲茄边碱脂质体B（按照实施例3制备），1.0mg/ml。 

1.2 实验动物。ICR小鼠50只，雌性，体重18-22g。 

1.3 肿瘤株。小鼠肝癌H22， 瘤株由小鼠腹水传代。 

2 实验方法。 

取经腹水传代的肝癌H22种鼠，无菌环境中脱颈椎处死，立即腹部大面积碘酊消毒，抽取乳白色腹水，以生理盐水按照1∶4稀释备用。取ICR小鼠50只，雌性，分别在其右侧颈背部皮下接种制备的瘤细胞混悬液，每只接种0.2ml，接种后24h把小鼠随机分为5组，即：（1）模型组（生理盐水，iv）；（2）环磷酰胺组（25mg/kg，ip）；（3）澳洲茄边碱组（1.2mg/kg，iv）；（4）澳洲茄边碱脂质体A组（1.2mg/kg，iv）；（5）澳洲茄边碱脂质体B组（1.2mg/kg，iv）。每组10只。分组当天开始给药，每日一次，共给药8次，每次给药24后处死小鼠，剥去肿瘤组织称重，计算给药组抑瘤率；同时取小鼠胸腺和脾脏，计算脏器指数比较组间差异；于实验初和实验末分别称小鼠体重，计算小鼠体重增加率。 

3 实验结果。 

3.1 对小鼠瘤重和抑瘤率的影响。 

由图5可知：小鼠尾静脉注射给予澳洲茄边碱1.2mg/kg，注射液剂型的抑瘤率为51.16%，相同剂量的两种脂质体A和B抑瘤率分别为57.26%和58.87%，与原注射剂比较抑瘤效果更好，可能是因脂质体有一定的靶向作用，能够提高药效。 

3.2 对小鼠脏器指数的影响。 

由图6可知：小鼠给予澳洲茄边碱注射液后胸腺指数和脾脏指数都有一定降低，且与模型组比较有显著性差异（P<0.05，P<0.01），药物在此剂量下显示出一定的副作用。而相同剂量的澳洲茄边碱脂质体对小鼠胸腺和脾脏只有轻微的抑制趋势，与模型组比较无显著性差异（P>0.05）。结果提示澳洲茄边碱脂质体副作用相比普通注射液更小，更有利于临床使用。 

3.3 对小鼠体重的影响。 

由图7可知：澳洲茄边碱连续尾静脉注射后能显著抑制小鼠体重增长，与模型组比较有显著性差异（P<0.01），而相同剂量的澳洲茄边碱脂质体则对小鼠体重无明显影响。 

实验6。澳洲茄边碱脂质体对艾氏腹水瘤（EAC）移植瘤抑瘤作用研究。 

1 实验材料。 

1.1 实验动物。 

澳洲茄边碱注射液，浓度0.76mg/ml；澳洲茄边碱脂质体A（按照实施例1制备），1.0mg/ml；澳洲茄边碱脂质体B（按照实施例3制备），1.0mg/ml。 

1.2 实验动物。ICR小鼠50只，雌性，体重18-22g。 

1.3 肿瘤株。小鼠艾氏腹水瘤， 瘤株由小鼠腹水传代。 

2 实验方法。 

取经腹水传代EAC种鼠，无菌环境中脱颈椎处死，立即腹部大面积碘酊消毒，抽取乳白色腹水，以生理盐水按照1比4稀释备用。取ICR小鼠50只，雌性，分别在其右侧颈背部皮下接种制备的瘤细胞混悬液，每只接种0.2ml，接种后24h把小鼠随机分为5组，即（1）模型组（给与生理盐水，iv）；（2）环磷酰胺组（给与25mg/kg，ip）；（3）澳洲茄边碱组（1.2mg/kg，iv）；（4）澳洲茄边碱脂质体A组（1.2mg/kg，iv）；（5）澳洲茄边碱脂质体B组（1.2mg/kg，iv）。每组10只。分组当天开始给药，每日一次，共给药8次，每次给药24后处死小鼠，剥去肿瘤组织称重，计算给药组抑瘤率；同时取小鼠胸腺和脾脏，计算脏器指数比较组间差异；于实验初和实验末分别称小鼠体重，计算小鼠体重增加率。 

3 实验结果。 

3.1 对小鼠瘤重和抑瘤率的影响。 

由图8可知：小鼠尾静脉注射给予澳洲茄边碱1.2mg/kg，注射液剂型的抑瘤率为51.16%，相同剂量的两种脂质体A和B抑瘤率分别为62.25%和62.35%，与原注射剂比较抑瘤效果更好，可能是因脂质体有一定的靶向作用，能够提高药效，两种脂质体配方的药效相当。 

3.2 对小鼠脏器指数的影响。 

由图9可知：小鼠给予澳洲茄边碱注射液后胸腺指数和脾脏指数都有一定降低，但与模型组比较有无显著性差异（P>0.05）。相同剂量相同给药方式的澳洲茄边碱脂质体对小鼠胸腺有轻微的抑制趋势，与模型组比较无显著性差异（P>0.05）；同时脂质体对小鼠脾脏无明显影响。从数据比较来看，澳洲茄边碱脂质体对小鼠胸腺和脾脏的抑制作用弱于普通注射液剂型，更有利于临床使用。 

3.3 对小鼠体重的影响。 

由图10可知：澳洲茄边碱连续尾静脉注射后小鼠体重增长率为能显著抑制小鼠体重增长，与模型组比较有显著性差异（P<0.05），而相同剂量的澳洲茄边碱脂质体则对小鼠体重无明显影响。 

实验 7。澳洲茄边碱脂质体对路易斯肺癌（Lewis）移植瘤抑瘤作用研究。 

1 实验材料。 

1.1 实验动物。 

澳洲茄边碱注射液，浓度0.76mg/ml；澳洲茄边碱脂质体A（按照实施例1制备），1.0mg/ml；澳洲茄边碱脂质体B（按照实施例3制备），1.0mg/ml。 

1.2 实验动物。C₅₇bl/6小鼠50只，雌性，体重18-22g。 

1.3 肿瘤株。小鼠路易斯肺癌（Lewis）瘤株；体外培养。 

2 实验方法。 

取体外处于对数生长期的路易斯肺癌细胞，经消化洗涤后用不含血清的培养基调整细胞浓度至10⁷个/ml。取C₅₇bl/6小鼠50只，雌性，分别在其右侧颈背部皮下接种制备的肿瘤细胞混悬液，每只接种0.2ml，接种后24h把小鼠随机分为5组，即（1）模型组（给与生理盐水，iv）；（2）环磷酰胺组（给与CTX25mg/kg，ip）；（3）澳洲茄边碱组（1.2mg/kg，iv）；（4）澳洲茄边碱脂质体A组（1.2mg/kg，iv）；（5）澳洲茄边碱脂质体B组（1.2mg/kg，iv）。每组10只。分组当天开始给药，每日一次，共给药8次，每次给药24后处死小鼠，剥去肿瘤组织称重，计算给药组抑瘤率；同时取小鼠胸腺和脾脏，计算脏器指数比较组间差异；于实验初和实验末分别称小鼠体重，计算小鼠体重增加率。 

3 实验结果。 

3.1 对小鼠瘤重和抑瘤率的影响。 

由图11可知：小鼠尾静脉注射给予澳洲茄边碱1.2mg/kg，注射液剂型的抑瘤率为47.69%，相同剂量的两种脂质体A和B抑瘤率分别为54.55%和57.58%，与原注射剂比较抑瘤效果更好，可能是因脂质体有一定的靶向作用，能够提高药效。 

3.2 对小鼠脏器指数的影响。 

由图12可知：小鼠给予澳洲茄边碱注射液后胸腺指数和脾脏指数都有一定降低，药物在此剂量下显示出一定抑制胸腺和脾脏的副作用。而相同剂量相同给药方式的澳洲茄边碱脂质体对小鼠胸腺和脾脏的抑制作用小于普通注射液。结果提示澳洲茄边碱脂质体副作用相比普通注射液更小。 

3.3 对小鼠体重的影响。 

由图13可知：澳洲茄边碱连续尾静脉注射后能显著抑制小鼠体重增长，体重增长率为9.57%，与模型组比较有显著性差异（P<0.01），而相同剂量的澳洲茄边碱脂质体组小鼠体重与模型组体重增长率稍低，但无显著性差异（P<0.05），提示澳洲茄边碱脂质体对小鼠体重抑制作用比普通注射剂低，副作用更小。 

附图说明

图1 为溶血实验加样量表。 

图2 为分光光度法溶血检查实验结果。 

图3 为注射剂肌肉刺激反应评分标准。 

图4为 家兔肌肉刺激性实验肌肉刺激反应情况。 

图5 为澳洲茄边碱对荷瘤小鼠瘤重和抑瘤率的影响。 

图6 为澳洲茄边碱对荷瘤小鼠脏器指数的影响。 

图7 为澳洲茄边碱对荷瘤小鼠体重的影响。 

图8 为澳洲茄边碱对荷瘤小鼠瘤重和抑瘤率的影响。 

图9为 澳洲茄边碱对荷瘤小鼠脏器指数的影响。 

图10 为澳洲茄边碱对荷瘤小鼠体重的影响。 

图11 为澳洲茄边碱对荷瘤小鼠瘤重和抑瘤率的影响。 

图12 为澳洲茄边碱对荷瘤小鼠脏器指数的影响。 

图13 为澳洲茄边碱对荷瘤小鼠体重的影响。 

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。 

实施例1。澳洲茄边碱脂质体制备。 

组方： 

澳洲茄边碱                     0.1g

注射用大豆卵磷脂               1.5g

胆固醇                         0.4g

吐温-80                        0.2g

pH=4.9磷酸盐缓冲盐溶液        100ml

称取处方量的注射用大豆卵磷脂、胆固醇溶于300ml乙醚中，澳洲茄边碱溶于100ml磷酸盐缓冲盐溶液中，有机相和水相混合均匀，再加入处方量的吐温-80，水浴加热至35℃，超声处理15min，减压蒸发掉有机溶剂至无醚味，再超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体，包封率61.5%。

实施例2。澳洲茄边碱脂质体制备。 

组方： 

澳洲茄边碱                     0.1g

注射用大豆卵磷脂               1.5g

胆固醇                         0.4g

吐温-80                        0.2g

pH=4.9磷酸盐缓冲盐溶液        100ml

称取处方量的注射用大豆卵磷脂、胆固醇溶于300ml氯仿中，转移至圆底烧瓶中，在40℃的水浴温度下，转速为150r/min，减压蒸发掉有机溶剂成膜，待膜形成后，充氮气数分钟，使有机溶剂完全除去。称取处方量澳洲茄边碱和吐温-80溶于100ml磷酸盐缓冲盐溶液，将缓冲液转入烧瓶中，室温、常压下旋转洗膜，至薄膜完全脱落，水化30min，再超声处理20min，即得澳洲茄边碱脂质体，包封率59.3%。

实施例3。澳洲茄边碱脂质体制备。 

组方： 

澳洲茄边碱                      0.1g

注射用大豆卵磷脂                1.5g

胆固醇                          0.4g

泊洛沙姆F-68                    0.2g

pH=4.9磷酸盐缓冲盐溶液         100ml

称取处方量的注射用大豆卵磷脂、胆固醇溶于300ml乙醚中，泊洛沙姆F-68、澳洲茄边碱溶于100ml磷酸盐缓冲盐溶液中，有机相和水相混合均匀，水浴加热至35℃，超声处理15分钟，减压蒸发掉有机溶剂至无醚味，再超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体，包封率70.5%。

实施例4。澳洲茄边碱脂质体制备。 

组方： 

澳洲茄边碱                     0.1g

注射用大豆卵磷脂               1.5g

胆固醇                         0.4g

吐温-80                        0.2g

pH=5.0柠檬酸盐缓冲盐溶液       100ml

将处方量的注射用大豆卵磷脂、胆固醇溶于20ml乙醚中，缓慢滴加至溶有澳洲茄边碱和吐温-80的100ml柠檬酸盐缓冲盐溶液中，滴加速度1ml/min，滴加完毕后继续搅拌2h，除尽有机溶剂，剩余液体超声处理15min，即得澳洲茄边碱脂质体，包封率62.9%

实施例5。澳洲茄边碱脂质体注射剂制备。

将实施例1-4中任一项所述的澳洲茄边碱脂质体过0.22μm微孔滤膜，灌封，充氮气，灭菌，得澳洲茄边碱脂质体注射剂。 

实施例6。澳洲茄边碱脂质体粉针剂制备。 

将实施例1-4中任一项所述的澳洲茄边碱脂质体加入10%甘露醇，过0.22μm微孔滤膜，分装，冷冻干燥，得粉针剂。

实施例7。一种澳洲茄边碱脂质体，它是由下述重量配比的原料组成， 

澳洲茄边碱    1     ；   磷脂      8   ；

胆固醇       2      ；   乳化剂    1  。

所述的澳洲茄边碱为市售澳洲茄边碱提取物，其中澳洲茄边碱单体含量为95%；所述的磷脂为蛋黄卵磷脂；所述的乳化剂为泊洛沙姆。 

所述的澳洲茄边碱脂质体可以采用常规的脂质体的制备方法制成。 

实施例8。一种澳洲茄边碱脂质体，它是由下述重量配比的原料组成， 

澳洲茄边碱    1     ；    磷脂      80   ；

胆固醇       20   ；     乳化剂    10   。

所述的澳洲茄边碱为市售澳洲茄边碱提取物，其中澳洲茄边碱单体含量为90%；所述的磷脂为氢化大豆卵磷脂；所述的乳化剂为聚乙二醇； 

其制备方法的具体步骤是：

（1）用注射用水配制pH值为3的弱酸性缓冲盐溶液，将澳洲茄边碱、乳化剂溶于该缓冲液，得水相；

（2）按所述比例称取磷脂、胆固醇，溶于有机溶剂中，得有机相；

（3）将水相与有机相混合后，先采用逆向蒸发法处理，然后超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体。

实施例9。一种澳洲茄边碱脂质体，它是由下述重量配比的原料组成， 

澳洲茄边碱    1    ；    磷脂     15    ；

胆固醇        2  ；    乳化剂   2   。

所述的澳洲茄边碱为市售澳洲茄边碱提取物，其中澳洲茄边碱单体含量为98%；所述的磷脂为氢化蛋黄卵磷脂；所述的乳化剂为N, N-二甲基甲酰胺。 

其制备方法的具体步骤是： 

（1）用注射用水配制pH值为6.5的弱酸性缓冲盐溶液，将澳洲茄边碱、乳化剂溶于该缓冲液，得水相；

（2）按所述比例称取磷脂、胆固醇，溶于有机溶剂中，得有机相；

（3）将水相与有机相混合后，先采用薄膜分散法处理，然后超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体。

实施例10。一种澳洲茄边碱脂质体，它是由下述重量配比的原料组成， 

澳洲茄边碱     1    ；    磷脂     25    ；

胆固醇        10  ；    乳化剂   8    。

所述的澳洲茄边碱为市售澳洲茄边碱提取物，其中澳洲茄边碱单体含量为80%；所述的磷脂双肉豆蔻磷脂酰胆碱；所述的乳化剂为吐温与泊洛沙姆的混合物。 

其制备方法的具体步骤是： 

（1）用注射用水配制pH值为4的弱酸性缓冲盐溶液，将澳洲茄边碱、乳化剂溶于该缓冲液，得水相；

（2）按所述比例称取磷脂、胆固醇，溶于有机溶剂中，得有机相；

（3）将水相与有机相混合后，先采用注入法处理，然后超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体。

实施例11。一种澳洲茄边碱脂质体，它是由下述重量配比的原料组成， 

澳洲茄边碱     1    ；    磷脂     20    ；

胆固醇        5 ；    乳化剂   5    。

所述的澳洲茄边碱为市售澳洲茄边碱提取物，其中澳洲茄边碱单体含量为85%；所述的磷脂为双肉豆蔻磷脂酰甘油；所述的乳化剂吐温与聚乙二醇的混合物。 

其制备方法的具体步骤是： 

（1）用注射用水配制pH值为5的弱酸性缓冲盐溶液，将澳洲茄边碱、乳化剂溶于该缓冲液，得水相；

（2）按所述比例称取磷脂、胆固醇，溶于有机溶剂中，得有机相；

（3）将水相与有机相混合后，先采用逆向蒸发法或薄膜分散法或注入法处理，然后超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体。

实施例12。一种澳洲茄边碱脂质体，它是由下述重量配比的原料组成， 

澳洲茄边碱     1    ；    磷脂     18    ；

胆固醇        7  ；    乳化剂   4    。

所述的澳洲茄边碱为澳洲茄边碱单体；所述的磷脂为双肉豆蔻磷脂酰胆碱或双肉豆蔻磷脂酰甘油；所述的乳化剂为吐温与N, N-二甲基甲酰胺的混合物。 

其制备方法的具体步骤是： 

（1）用注射用水配制pH值为3的弱酸性缓冲盐溶液，将乳化剂溶于该缓冲液，得水相；

（2）按所述比例称取磷脂、胆固醇、澳洲茄边碱，溶于有机溶剂中，得有机相；

（3）将水相与有机相混合后，先采用逆向蒸发法或薄膜分散法或注入法处理，然后超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体。

实施例13。一种澳洲茄边碱脂质体，它是由下述重量配比的原料组成， 

澳洲茄边碱     1    ；    磷脂     22    ；

胆固醇        4  ；    乳化剂   6    。

所述的澳洲茄边碱为澳洲茄边碱单体；所述的磷脂为二油酰磷脂酰胆碱、或者二棕榈酰磷脂酸；所述的乳化剂为泊洛沙姆与聚乙二醇的混合物。 

其制备方法的具体步骤是： 

（1）用注射用水配制pH值为6.5的弱酸性缓冲盐溶液，将乳化剂溶于该缓冲液，得水相；

（2）按所述比例称取磷脂、胆固醇、澳洲茄边碱，溶于有机溶剂中，得有机相；

（3）将水相与有机相混合后，先采用逆向蒸发法或薄膜分散法或注入法处理，然后超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体。

所述的弱酸性缓冲盐溶液为磷酸盐缓冲溶液或者柠檬酸盐缓冲溶液；所述的有机溶剂为三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷、正己烷、乙醇、甲醇中的一种。 

实施例14。一种澳洲茄边碱脂质体，它是由下述重量配比的原料组成， 

澳洲茄边碱    1     ；   磷脂      10   ；

胆固醇       15  ；   乳化剂    3  。

所述的澳洲茄边碱为市售澳洲茄边碱提取物，其中澳洲茄边碱单体含量为87%；所述的磷脂为二棕榈酰磷脂胆碱；所述的乳化剂为泊洛沙姆与N, N-二甲基甲酰胺的混合物。 

其制备方法的具体步骤是： 

（1）用注射用水配制pH值为4的弱酸性缓冲盐溶液，将乳化剂溶于该缓冲液，得水相；

（2）按所述比例称取磷脂、胆固醇、澳洲茄边碱，溶于有机溶剂中，得有机相；

（3）将水相与有机相混合后，先采用逆向蒸发法或薄膜分散法或注入法处理，然后超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体。

所述的弱酸性缓冲盐溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。所述的有机溶剂为三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷、正己烷、乙醇、甲醇中的任意二种组成的混合液。 

实施例15。一种澳洲茄边碱脂质体，它是由下述重量配比的原料组成， 

澳洲茄边碱    1     ；   磷脂      50   ；

胆固醇       12   ；   乳化剂    9   。

所述的澳洲茄边碱为市售澳洲茄边碱提取物，其中澳洲茄边碱单体含量为96%；所述的磷脂为二棕榈酰磷脂酰甘油；所述的乳化剂聚乙二醇与N, N-二甲基甲酰胺的混合物。 

其制备方法的具体步骤是： 

（1）用注射用水配制pH值为4.5的弱酸性缓冲盐溶液，将乳化剂溶于该缓冲液，得水相；

（2）按所述比例称取磷脂、胆固醇、澳洲茄边碱，溶于有机溶剂中，得有机相；

（3）将水相与有机相混合后，先采用逆向蒸发法或薄膜分散法或注入法处理，然后超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体。

所述的弱酸性缓冲盐溶液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；所述的有机溶剂为三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷、正己烷、乙醇、甲醇中的任意三种组成的混合液。 

实施例16。一种澳洲茄边碱脂质体，它是由下述重量配比的原料组成， 

澳洲茄边碱    1     ；   磷脂      40   ；

胆固醇       14   ；   乳化剂    5   。

所述的澳洲茄边碱为市售澳洲茄边碱提取物，其中澳洲茄边碱单体含量为92%；所述的磷脂为天然提取磷脂、半合成或全合成磷脂；所述的乳化剂选自吐温、泊洛沙姆、聚乙二醇或者N, N-二甲基甲酰胺中的一种或几种。 

其制备方法的具体步骤是： 

（1）用注射用水配制pH值为5.5的弱酸性缓冲盐溶液，将乳化剂溶于该缓冲液，得水相；

（2）按所述比例称取磷脂、胆固醇、澳洲茄边碱，溶于有机溶剂中，得有机相；

（3）将水相与有机相混合后，先采用逆向蒸发法或薄膜分散法或注入法处理，然后超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体。

所述的弱酸性缓冲盐溶液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；所述的有机溶剂选自三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷、正己烷、乙醇或者甲醇。 

Claims (10)

1.一种澳洲茄边碱脂质体，其特征在于：它是由下述重量配比的原料组成，

澳洲茄边碱1；磷脂8～80；

胆固醇2～20；乳化剂1～10。

2.根据权利要求1所述的澳洲茄边碱脂质体，其特征在于：各原料的重量配比是：

澳洲茄边碱1；磷脂15～25；

胆固醇2～10；乳化剂2～8。

3.根据权利要求1所述的澳洲茄边碱脂质体，其特征在于：所述的磷脂为天然提取磷脂、半合成或全合成磷脂。

4.根据权利要求3所述的澳洲茄边碱脂质体，其特征在于：所述的磷脂选自：大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、双肉豆蔻磷脂酰胆碱、双肉豆蔻磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂胆碱或者二棕榈酰磷脂酰甘油。

5.根据权利要求1所述的澳洲茄边碱脂质体，其特征在于：所述的乳化剂选自吐温、泊洛沙姆、聚乙二醇或者N，N-二甲基甲酰胺中的一种或几种。

6.一种如权利要求1-5任何一项所述的澳洲茄边碱脂质体的制备方法，其特征在于，其具体步骤是：

(1)用注射用水配制pH值为3～6.5的弱酸性缓冲盐溶液，将澳洲茄边碱、乳化剂溶于该缓冲液，得水相；

(2)按所述比例称取磷脂、胆固醇，溶于有机溶剂中，得有机相；

(3)将水相与有机相混合后，先采用逆向蒸发法或薄膜分散法或注入法处理，然后超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体。

7.一种如权利要求1-5任何一项所述的澳洲茄边碱脂质体的制备方法，其特征在于，其具体步骤是：

(1)用注射用水配制pH值为3～6.5的弱酸性缓冲盐溶液，将乳化剂溶于该缓冲液，得水相；

(2)按所述比例称取磷脂、胆固醇、澳洲茄边碱，溶于有机溶剂中，得有机相；

(3)将水相与有机相混合后，先采用逆向蒸发法或薄膜分散法或注入法处理，然后超声使其分散，即得澳洲茄边碱脂质体。

8.根据权利要求6或7所述的澳洲茄边碱脂质体的制备方法，其特征在于：所述的弱酸性缓冲盐溶液为磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液。

9.根据权利要求6或7所述的澳洲茄边碱脂质体，其特征在于：所述的有机溶剂选自三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷、正己烷、乙醇、甲醇中的一种或者多种组成的混合液。

10.权利要求1～5中任何一项所述的澳洲茄边碱脂质体在制备治疗肝癌、肺癌的药物中的应用。

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