CN110812384A

CN110812384A - 一种甘草中有效成分及其衍生物的医药新用途

Info

Publication number: CN110812384A
Application number: CN201911324253.3A
Authority: CN
Inventors: 张婧; 李翔
Original assignee: Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2020-02-21

Abstract

本发明公开了一种甘草中有效成分及其衍生物的医药新用途，所述甘草中有效成分及其衍生物包括甘草苷、甘草素、甘草次酸、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草酸及其衍生物甘草酸单铵盐，所述甘草中有效成分及其衍生物用于制备抗癌药。本发明通过提出甘草中有效成分及其衍生物能诱发肿瘤细胞产生免疫原性细胞死亡，提供了一种疗效确切、安全方便、来源广泛的肿瘤治疗药物，其可以与药学上可接受的一种或多种载体或赋形剂结合制成甘草中有效成分及其衍生物的药物组合物或制剂，为肿瘤免疫治疗提供了新的药物，对提高肿瘤治疗效果，改善患者生存质量具有重要意义，有效成分来源于水果蔬菜和药材，副作用小，成本低廉，便于推广使用。

Description

一种甘草中有效成分及其衍生物的医药新用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种甘草中有效成分及其衍生物的医药新用途。

背景技术

理化因素在诱导肿瘤细胞凋亡的同时，肿瘤细胞由不具备免疫原性转变为具有免疫原性，并由此激活特异性T淋巴细胞，诱发机体产生特异性细胞免疫应答，达到清除肿瘤的目的，这就是免疫原性细胞死亡( immunogenic cell death，ICD)。一旦诱发了肿瘤免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death，ICD)后，肿瘤内细胞毒性T细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)/Treg的比例上升，患者预后良好。抗肿瘤免疫的重要性，免疫治疗如PD-1抗体、嵌合抗原受体疗法(CART)等有望成为第4种肿瘤治疗方法，免疫治疗更是被Science评为2013年年度重大科学突破。

由于肿瘤细胞免疫原性转化并非所有凋亡肿瘤细胞的固有特征，而是特定肿瘤细胞在特定凋亡刺激因素作用下发生的特有现象，而至今发现的能引起肿瘤细胞发生免疫原性转化的药物还非常有限，CART目前主要是针对B淋巴细胞白血病，PD-1抗体也只是对部分肿瘤有效，尚存在一定的局限性，特别是肿瘤负荷过重的患者。因此，筛选新的能使肿瘤细胞发生免疫原性转化的药物，具有重要的意义。

甘草为常用中药材，为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.，或光果甘草Glycyrrhiza glabra L. 的干燥根和根茎。具补脾益气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、调和诸药之功效。目前，未见任何有关甘草中有效成分甘草苷（glycyrrhizin）、甘草素（liquiritigenin）、甘草次酸（glycyrrhitinicacid）、异甘草素（isoliquiritigenin）、甘草查尔酮A（licorice chalcone A）、甘草酸（glycyrrhizic acid）及其衍生物甘草酸单铵盐（Monoammonium glycyrrhizinate，MAG）与药学上可接受的一种或多种载体或赋形剂结合制成甘草中有效成分及其衍生物的药物组合物或制剂用作诱发肿瘤细胞免疫原性死亡的报道或专利。

而现有的抗癌药大多使用抗生素等刺激药物对肿瘤进行抑制，长时间使用后破坏人体细胞活性，副作用大。

因此，发明一种甘草中有效成分及其衍生物的医药新用途来解决上述问题很有必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘草中有效成分及其衍生物的医药新用途，通过提出甘草中有效成分及其衍生物能诱发肿瘤细胞产生免疫原性细胞死亡，提供了一种疗效确切、安全方便、来源广泛的肿瘤治疗药物，其可以与药学上可接受的一种或多种载体或赋形剂结合制成甘草中有效成分及其衍生物的药物组合物或制剂，为肿瘤免疫治疗提供了新的药物，对提高肿瘤治疗效果，改善患者生存质量具有重要意义，有效成分来源于水果蔬菜和药材，副作用小，成本低廉，便于推广使用，以解决技术中的上述不足之处。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种甘草中有效成分及其衍生物的医药新用途，所述甘草中有效成分及其衍生物包括甘草苷、甘草素、甘草次酸、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草酸及其衍生物甘草酸单铵盐，所述甘草中有效成分及其衍生物用于制备抗癌药。

优选的，所述甘草中有效成分及其衍生物制备的抗癌药用于诱发肿瘤细胞产生免疫原性死亡。

优选的，所述该抗癌药还包括药学上可接受的载体，所述载体为碳纳米管-温敏凝胶缓释体。

优选的，所述抗癌药设置为注射剂、片剂、胶囊剂、控释剂、缓释剂或纳米制剂中的一种。

优选的，所述抗癌药有效诱发免疫原性死亡肿瘤细胞种类包括结直肠癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌和黑色素瘤。

优选的，所述该抗癌药成分中还包括三柳施福秘环磷酸腺苷、三萜类化合物、维生素C、含β-谷固醇、含β-胡萝卜素、B 族维生素、含干扰素诱生剂、含淀粉酶和番茄红素，所述三柳施福秘环磷酸腺苷、三萜类化合物、维生素C、含β-谷固醇、含β-胡萝卜素、B 族维生素、含干扰素诱生剂、含淀粉酶和番茄红素均从水果和蔬菜中提取。

在上述技术方案中，本发明提供的技术效果和优点：

本发明首次提出甘草中有效成分及其衍生物能诱发肿瘤细胞产生免疫原性细胞死亡，提供了一种疗效确切、安全方便、来源广泛的肿瘤治疗药物，其可以与药学上可接受的一种或多种载体或赋形剂结合制成甘草中有效成分及其衍生物的药物组合物或制剂，为肿瘤免疫治疗提供了新的药物，对提高肿瘤治疗效果，改善患者生存质量具有重要意义，有效成分来源于水果蔬菜和药材，副作用小，成本低廉，便于推广使用。

附图说明

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

图1为本发明的CT-26细胞膜表面CRT表达展示图；

图2为本发明的CT-26细胞释放HMGB1 直方图；

图3为本发明的CT-26细胞释放ATP 直方图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。

本发明提供了如图1-3所示的一种甘草中有效成分及其衍生物的医药新用途，所述甘草中有效成分及其衍生物包括甘草苷、甘草素、甘草次酸、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草酸及其衍生物甘草酸单铵盐，所述甘草中有效成分及其衍生物用于制备抗癌药。

进一步的，在上述技术方案中，所述甘草中有效成分及其衍生物制备的抗癌药用于诱发肿瘤细胞产生免疫原性死亡；

进一步的，在上述技术方案中，所述该抗癌药还包括药学上可接受的载体，所述载体为碳纳米管-温敏凝胶缓释体；

进一步的，在上述技术方案中，所述抗癌药设置为注射剂、片剂、胶囊剂、控释剂、缓释剂或纳米制剂中的一种；

进一步的，在上述技术方案中，所述抗癌药有效诱发免疫原性死亡肿瘤细胞种类包括结直肠癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌和黑色素瘤；

进一步的，在上述技术方案中，所述该抗癌药成分中还包括三柳施福秘环磷酸腺苷、三萜类化合物、维生素C、含β-谷固醇、含β-胡萝卜素、B 族维生素、含干扰素诱生剂、含淀粉酶和番茄红素，所述三柳施福秘环磷酸腺苷、三萜类化合物、维生素C、含β-谷固醇、含β-胡萝卜素、B 族维生素、含干扰素诱生剂、含淀粉酶和番茄红素均从水果和蔬菜中提取。

研究表明，ICD取决于特异性刺激诱导细胞凋亡的同时诱发免疫原性信号。这些信号将转化为损伤关联分子模式( damage-associated molecular patterns，DAMPs)，到目前为止，有3种DAMPs在ICD诱导剂诱导免疫应答的过程中发挥关键作用，即死亡肿瘤细胞发出信号：钙网蛋白(calreticulin，CRT)的暴露("吞噬我"的信号)、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）释放("危险"信号)、腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine triphosphate，ATP）的释放（“寻找我”的信号），进而引起树突状细胞（Dendritic cell，DC）对抗原的摄取及Toll样受体4（TLR4）依赖的抗原呈递。

实施例1：

用药环境培养小鼠结肠癌细胞，并使用CCK-8检测细胞增殖情况。该试剂中含有WST-8[化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。具体步骤如下：

步骤一：取CT-26细胞悬液（小鼠结肠癌细胞）接种于96 孔培养板中，培养1d 至细胞单层60%致密度；

步骤二：用DMEM 培养液孵育15min，加入一系列不同浓度的甘草苷、甘草素、甘草次酸、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草酸及甘草酸单铵盐的DMSO溶液，每个浓度设立4个复孔，孵育24h；

步骤三：24h后，加入CCK-8测定在450nm的吸光度，计算IC50值。

结果显示：IC50值为生物过程（此处为细胞活力）抑制一半时所需的药物的浓度。IC50值越小，说明药物细胞毒性越大。甘草苷、甘草素、甘草次酸、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草酸及甘草酸单铵盐对CT-26细胞的IC50值分别为40.2、45.3、38.5、40.9、51.1、35.4、33.2 µM，表示甘草苷、甘草素、甘草次酸、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草酸及甘草酸单铵盐均对结肠癌细胞具有杀伤能力，其中甘草酸、甘草次酸、甘草酸单铵盐效果最好。

实施例2：

用药环境培养小鼠结肠癌细胞，并使用免疫荧光法检测CRT由内质网向细胞膜表面的转移情况。CRT是存在于内质网中的钙结合蛋白，参与蛋白质合成期间的折叠，并且通过绑定Ca²⁺增加内质网中的Ca²⁺稳定性。在凋亡期间CRT外翻暴露在肿瘤微环境，以“eat me”信号募集并刺激抗原提呈细胞成熟，与表面受体结合，刺激Rac-1促进对肿瘤细胞的吞噬。CRT的外翻膜外表达对于触发T细胞依赖的抗肿瘤免疫至关重要。具体步骤如下：

步骤一：取CT-26细胞悬液（小鼠结肠癌细胞）接种于6 孔培养板中，培养1d 至细胞单层60%致密度；

步骤二：用DMEM培养液孵育15min，加入甘草苷、甘草素、甘草次酸、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草酸及甘草酸单铵盐的DMSO溶液，使最终孵育浓度均为4 µM，孵育4h；

步骤三：4h后，PBS 洗涤后用1：2000稀释的兔抗鼠CRT多克隆抗体室温孵育30 min；

步骤四：PBS洗涤后用FITC标记的羊抗兔IgG 多克隆抗体室温孵育1 h，PBS洗涤后，DAPI染核，封片，于倒置荧光显微镜下观察；

如图1所示：A-G分别为甘草苷、甘草素、甘草次酸、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草酸及甘草酸单铵盐的CT-26细胞膜表面CRT表达，其中绿色（外侧部分）为FITC-CRT，蓝色（内侧部分）为DAPI-细胞核，结果显示甘草苷、甘草素、甘草次酸、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草酸及甘草酸单铵盐均可引发结肠癌细胞CRT的膜转移。内质网压力反应导致CRT转位至质膜表面，有利于进一步诱导机体免疫应答杀伤肿瘤细胞。

实施例3：

用药环境培养小鼠结肠癌细胞，并使用ELISA检测HMGB1的释放情况。HMGB1分布广泛，是一种与炎性反应相关的细胞因子，在胞核中高度表达，调节染色质结构和基因转录。在稳态下，HMGB1在胞质和胞核之间穿梭。在ICD晚期，由于受损的细胞核和质膜，HMGB1暴露在凋亡细胞表面，与抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）上很多受体结合，激活炎症通路反应。具体步骤如下：

步骤二：用DMEM培养液孵育15min，加入甘草苷、甘草素、甘草次酸、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草酸及甘草酸单铵盐的DMSO溶液，使最终孵育浓度均为40 µM，孵育24h；

步骤三：24h后，收集细胞培养液，采用HMGB1-ELISA检测试剂盒，测定细胞培养液中HMGB1的含量。

如图2所示：显示以上成分均可引发结肠癌细胞释放HMGB1，且甘草苷、甘草素、甘草次酸、甘草酸及其衍生物甘草酸单铵盐组培养基中HMGB1浓度最高，推测此三个成分孵育可有效促进细胞释放HMGB1，利于招募未成熟DC至肿瘤部位，与细胞表面TLR2结合激活受体介导的信号通路，可诱导DC成熟。

实施例4：

用药环境培养小鼠结肠癌细胞，并使用荧光素酶法检测ATP的分泌情况。肿瘤细胞释放的ATP促进免疫反应，是一种“find me”信号，可以快速募集包括DC在内的髓系细胞到肿瘤部位，调节其生物学活性；ATP可以改善机体的先天免疫功能，促进细胞毒性自然杀伤细胞的增殖。具体步骤如下：

步骤二：用DMEM培养液孵育15min，加入甘草苷、甘草素、甘草次酸、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草酸及甘草酸单铵盐的DMSO溶液，使最终孵育浓度均为4 0µM，孵育24h；

步骤三：24h后，收集细胞培养液，采用ATP检测试剂盒，测定细胞培养液中ATP的含量；

结果见图3，显示甘草苷、甘草素、甘草次酸、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草酸及甘草酸单铵盐均可促进肿瘤细胞释放ATP，且甘草次酸、甘草酸及其衍生物甘草酸单铵盐培养基中ATP浓度最高，推测此三个成分孵育可有效促进细胞释放ATP。

综上所述，甘草苷、甘草素、甘草次酸、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草酸及甘草酸单铵盐等成分对于肿瘤免疫治疗提存在明显的有益效果。

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种甘草中有效成分及其衍生物的医药新用途，所述甘草中有效成分及其衍生物包括甘草苷、甘草素、甘草次酸、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草酸及其衍生物甘草酸单铵盐，其特征在于：所述甘草中有效成分及其衍生物用于制备抗癌药。

2.根据权利要求1所述的一种甘草中有效成分及其衍生物的医药新用途，其特征在于：所述甘草中有效成分及其衍生物制备的抗癌药用于诱发肿瘤细胞产生免疫原性死亡。

3.根据权利要求1所述的一种甘草中有效成分及其衍生物的医药新用途，其特征在于：所述该抗癌药还包括药学上可接受的载体，所述载体为碳纳米管-温敏凝胶缓释体。

4.根据权利要求1所述的一种甘草中有效成分及其衍生物的医药新用途，其特征在于：所述抗癌药设置为注射剂、片剂、胶囊剂、控释剂、缓释剂或纳米制剂中的一种。

5.根据权利要求1所述的一种甘草中有效成分及其衍生物的医药新用途，其特征在于：所述抗癌药有效诱发免疫原性死亡肿瘤细胞种类包括结直肠癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌和黑色素瘤。

6.根据权利要求1所述的一种甘草中有效成分及其衍生物的医药新用途，其特征在于：所述该抗癌药成分中还包括三柳施福秘环磷酸腺苷、三萜类化合物、维生素C、含β-谷固醇、含β-胡萝卜素、B 族维生素、含干扰素诱生剂、含淀粉酶和番茄红素；所述三柳施福秘环磷酸腺苷、三萜类化合物、维生素C、含β-谷固醇、含β-胡萝卜素、B 族维生素、含干扰素诱生剂、含淀粉酶和番茄红素均从水果和蔬菜中提取。