CN115814078A - 百里酚在增强抗pd-1抗体治疗肺腺癌疗效中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了百里酚在增强抗PD‑1抗体治疗肺腺癌疗效中的应用。本发明首次鉴定出了靶向IL4I1表达的小分子药物百里酚，并首次发现百里酚靶向IL4I1可阻断AHR信号通路，从而重塑肺腺癌激活型免疫微环境。此外，还首次发现百里酚可显著增强肺腺癌抗PD‑1抗体的疗效，可为临床上肺腺癌患者的免疫治疗提供新的方案和策略，具有较大的应用前景。
Description
技术领域
本发明创造属于生物医药领域，尤其是涉及百里酚在增强抗PD-1抗体治疗肺腺癌疗效中的应用。
背景技术
肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均位居我国恶性肿瘤之首，而肺腺癌(Lung adenocarcinoma,LUAD)是肺癌最常见的病理类型。以抗PD-1抗体为代表的免疫检查点抑制剂是目前最有发展前景的肿瘤治疗新方法。目前已有多种抗PD-1抗体被批准用于晚期肺腺癌患者的一线治疗了，但是临床试验的结果却不容乐观，大多数患者仍然不能从抗PD-1抗体的治疗中获益。研究发现肺腺癌患者对抗PD-1抗体药物的临床反应率低于20％。因此，进一步开发联合治疗方案，提高抗PD-1抗体在肺腺癌中的疗效是临床上面临的重要问题。
色氨酸(Tryptophan，Trp)/芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor，AHR)通路是肿瘤中重要的代谢免疫通路，肿瘤细胞内Trp呈现高代谢状态，其产生的代谢产物可激活AHR，活化的AHR入核后通过调控下游靶基因的表达促进肿瘤抑制性免疫微环境的形成。由于Trp/AHR通路可通过抑制T细胞活化、促进抑制性免疫细胞浸润等多种机制促进肿瘤免疫逃逸，因此靶向该通路的治疗是肿瘤免疫治疗的重要策略。
IL4I1属于L-氨基酸氧化酶(L-amino-acid oxidase，LAAO)家族，其可催化苯丙氨酸分解生成苯丙酮酸。既往研究发现IL4I1可以通过调控多种免疫细胞的功能促进卵巢癌、淋巴瘤等恶性肿瘤的进展。2020年CELL杂志的一篇研究发现，在神经胶质瘤和黑色素瘤中，IL4I1是Trp/AHR通路激活的关键酶类，其可通过激活Trp/AHR通路促进神经胶质瘤的免疫逃逸。发明人在同期研究中鉴定出IL4I1是增强肺腺癌抗PD-1抗体疗效的重要新靶点。敲低IL4I1可通过阻断Trp/AHR通路重塑肺腺癌激活型免疫微环境，从而显著增强抗PD-1抗体的疗效。因此开发靶向IL4I1的小分子药物是增强肺腺癌抗PD-1抗体疗效的重要策略和方向。然而，目前并没有报道有效靶向IL4I治疗肿瘤的小分子药物。
百里酚(Thymol)的化学名称为5-甲基-2-异丙基苯酚，分子式为C10H14O，又可称为百里香酚、麝香草酚、麝香草脑，是从中药百里香、麝香草中分离出来的单萜酚。百里酚通常被用于制作香料和指示剂，也常用于皮肤霉菌和癣症。既往研究发现百里酚具有广泛的生物活性和治疗活性，如抗真菌活性、抗利什曼原虫活性和抗病毒活性。但目前关于百里酚在肿瘤免疫微环境及肿瘤免疫治疗中的作用并没有报道，也并没有体内实验证据表明其在肺腺癌中的作用，其对IL4I1及其下游AHR通路的作用也尚不明确。
抗PD-1抗体是肺腺癌中最有前景的肿瘤治疗新方法，但目前临床上肺腺癌患者对抗PD-1抗体药物的临床反应率仍低于20％。因此，亟需进一步开发新的联合治疗方案，提高抗PD-1抗体在肺腺癌治疗中的疗效。
发明内容
有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出了百里酚在增强抗PD-1抗体治疗肺腺癌疗效中的应用。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
作为本发明的第一方面，提出了百里酚和抗PD-1抗体联合在制备用于预防和/或治疗肺腺癌药物中的应用。
优选的，所述百里酚以IL4I1为靶点发挥其预防和/或治疗肺腺癌的作用。
优选的，所述药物起到以下作用中的一项或多项：
1)阻断肺腺癌细胞中AHR入核达到抑制肺腺癌生长的作用；
2)抑制肺腺癌细胞中AHR下游靶基因表达达到抑制肺腺癌生长的作用；
3)抑制肺腺癌细胞中AHR通路的活性达到抑制肺腺癌生长的作用；
4)调控肺腺癌免疫微环境达到抑制肺腺癌生长的作用；
5)增强CD8+T细胞对肺腺癌的杀伤活性的作用；
6)增敏肺腺癌抗PD-1抗体疗效的作用。
作为本发明的第二方面，提出了一种用于预防和/或治疗肺腺癌的联合用药物，所述联合用药物包括百里酚和抗PD-1抗体。
优选的，所述联合用药物通过抑制或降低IL4I1的表达和/或活性来增强肺腺癌抗PD-1抗体的疗效。
优选的，所述联合用药物起到以下作用中的一项或多项：
1)阻断肺腺癌细胞中AHR入核达到抑制肺腺癌生长的作用；
2)抑制肺腺癌细胞中AHR下游靶基因表达达到抑制肺腺癌生长的作用；
3)抑制肺腺癌细胞中AHR通路的活性达到抑制肺腺癌生长的作用；
4)调控肺腺癌免疫微环境达到抑制肺腺癌生长的作用；
5)增强CD8+T细胞对肺腺癌的杀伤活性的作用；
6)增敏肺腺癌抗PD-1抗体疗效的作用。
相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：
(1)本发明首次发现百里酚治疗可以显著增强抗PD-1抗体在肺腺癌中的治疗效果，肿瘤几乎完全被抑制且小鼠的生存期显著延长，说明百里酚联合抗PD-1抗体是肺腺癌联合免疫治疗的新策略；
(2)本发明首次发现百里酚可显著抑制肿瘤免疫治疗新靶点IL4I1的表达及其下游AHR通路的激活；
(3)本发明首次发现百里酚靶向IL4I1可显著重塑肺腺癌激活型免疫微环境。
附图说明
图1为百里酚对肺腺癌细胞IL4I1表达的抑制作用；(A.不同浓度梯度下百里酚对LLC细胞中IL4I1 mRNA水平的抑制效率；B.不同时间梯度下百里酚对LLC细胞中IL4I1蛋白水平的抑制效率；C.不同浓度梯度下百里酚对A549细胞中IL4I1 mRNA水平的抑制效率。)
图2为百里酚对肺腺癌细胞中AHR通路的抑制作用。(A.5μM百里酚对LLC细胞中IL4I1和AHR水平的影响；B-C.5μM百里酚对LLC细胞胞浆和细胞核中AHR水平的影响及灰度定量分析；D.5μM百里酚对LLC细胞中AHR下游靶基因表达的影响；E.20μM百里酚对A549细胞中IL4I1和AHR水平的影响；F-G.20μM百里酚对A549细胞胞浆和细胞核中AHR水平的影响及灰度定量分析；H.20μM百里酚对A549细胞中AHR下游靶基因表达的影响。)
图3为百里酚在肺腺癌抗PD-1抗体治疗中的作用。(A.原位肺腺癌小鼠给予百里酚和(或)抗PD-1抗体治疗的模式图；B.四组小鼠小动物活体成像检测原位肿瘤的大小；C.四组小鼠小动物活体成像的荧光定量统计；D.四组小鼠的生存期分析；E.对照组及百里酚治疗组小鼠肿瘤中IL4I1蛋白的表达差异；F.对照组及百里酚治疗组小鼠肿瘤中IL4I1 mRNA的表达差异；G.对照组及百里酚治疗组小鼠肿瘤中IL4I1的免疫组化染色及H评分的定量统计分析。)
图4为百里酚对肺腺癌肿瘤免疫微环境的调控作用。(A.对照组及百里酚治疗组小鼠肿瘤中CD8+T细胞、GZMB+CD8+T细胞、Treg细胞、巨噬细胞及M2型巨噬细胞的比例；B.对照组及百里酚治疗组小鼠肿瘤中CD8+T细胞的免疫组化染色及统计学分析；C.对照组及百里酚治疗组小鼠肿瘤中GZMB+T细胞的免疫组化染色及统计学分析。)
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1百里酚可显著抑制肺腺癌细胞中IL4I1的表达
实验方法如下：分别用DMSO，0.1μM，1μM，5μM以及10μM的百里酚处理LLC细胞，24h后提取细胞的RNA，并进行反转录和qRT-PCR，检测IL4I1的mRNA水平变化。用5μM百里酚处理LLC细胞，分别处理24h，48h及72h，提取细胞总蛋白，通过western blot检测IL4I1蛋白水平的变化。分别用DMSO，5μM，10μM，20μM以及50μM的百里酚处理A549细胞，24h后提取细胞的RNA，并进行反转录和qRT-PCR，检测IL4I1的mRNA水平变化。
实验结果如图1所示，由图1可以看出百里酚对LLC细胞中IL4I1的抑制效率呈浓度依赖性和时间依赖性，最佳抑制浓度为5μM，5μM百里酚可将LLC细胞中内源性IL4I1的表达抑制至12.66％(图1A-B)。百里酚对A549细胞中IL4I1的抑制效率也呈浓度依赖性，最佳抑制浓度为20μM，20μM百里酚可将A549细胞中内源性IL4I1的表达抑制至33.31％(图1C)。因此说明百里酚可显著抑制肺腺癌细胞中IL4I1的表达。
实施例2百里酚抑制肺腺癌细胞中AHR通路的活化
实验方法如下：用5μM百里酚处理LLC细胞，48h后提取细胞总蛋白，通过westernblot检测总AHR和IL4I1蛋白水平的变化。用5μM百里酚处理LLC细胞，48h后收集细胞沉淀用核质分离提取试剂盒提取胞浆蛋白和核蛋白，用western blot检测胞浆蛋白和核蛋白中AHR的表达。用5μM百里酚处理LLC细胞，48h后提取细胞总RNA，通过反转录及qRT-PCR检测AHR下游靶基因的表达。用20μM百里酚处理A549细胞，用上述方法检测A549细胞中总AHR和IL4I1蛋白水平的变化、胞浆蛋白和核蛋白中AHR的表达以及AHR下游靶基因的表达。因此说明百里酚可有效抑制肺腺癌细胞中AHR通路的激活。
实验结果如图2所示，由图2可以看出：5μM百里酚可显著抑制LLC细胞中IL4I1的表达并显著抑制AHR的入核及其下游靶基因的表达(Il6,Il10,Il22,Il1b,Arg1,Serpinb2,Tiparp,Mmp13,Cyp1b1)(图2A-D)。20μM百里酚可显著抑制A549细胞中IL4I1表达、AHR入核及AHR下游靶基因的表达(图2E-H)。
实施例3百里酚靶向IL4I1显著增强抗PD-1抗体在肺腺癌小鼠中的治疗效果
实验方法如下：用带有luciferase的LLC细胞构建肺原位移植瘤模型。C57BL/6小鼠，用碘伏消毒右侧胸部，用1mL针头经皮穿刺将LLC细胞混合等体积的Matrigel胶种植到右肺中叶，每只小鼠注射1×106细胞，种瘤5天后，将小鼠随机分为四组，分别为对照组，百里酚治疗组，抗PD-1抗体(CD279)治疗组以及百里酚联合抗PD-1抗体治疗组(每组5只)。抗PD-1抗体10mg/kg腹腔注射，每周一次。百里酚75mg/kg腹腔注射，隔天一次。种瘤后21天用小动物活体成像检测肿瘤大小。同样通过上述方式构建肺腺癌小鼠治疗模型(每组7只)，观察小鼠的生存期。
种瘤后21天，将对照组及百里酚治疗组小鼠的肿瘤组织剥离出来，一部分放入Trizol溶液中进行组织破碎，提取RNA和总蛋白，通过qRT-PCR和western blot检测肿瘤中IL4I1 mRNA和蛋白水平的表达；另一部分放入4％多聚甲醛溶液中，进行固定、脱水、包埋、切片等，通过免疫组化检测肿瘤中IL4I1的表达。
实验结果如图3所示，由图3可以看出：百里酚单药可显著抑制肿瘤进展并延长小鼠生存期；与单独百里酚或单独抗PD-1抗体治疗组相比，联合治疗组小鼠的肿瘤几乎完全被抑制，并且小鼠的生存期显著延长(图3A-D)。此外，百里酚治疗组小鼠的肿瘤中IL4I1的蛋白表达量和mRNA表达量明显低于对照组(图3E-F)。免疫组化结果也显示百里酚治疗组小鼠的肿瘤中IL4I1的染色强度明显低于对照组(图3G)。因此说明百里酚靶向IL4I1表达可显著抑制肺腺癌进展并增强抗PD-1抗体的疗效。
实施例4百里酚重塑肺腺癌激活型免疫微环境
实验方法如下：用带有luciferase的LLC细胞构建肺原位移植瘤模型，分别用对照或百里酚(75mg/kg腹腔注射，隔天一次)处理小鼠。种瘤21天后将小鼠的肿瘤组织剥离出来，将一部分组织磨碎后加入0.1％的胰蛋白酶和0.2μg/mL的胶原酶，吹打混匀后，放置到37℃摇床消化2-4h，用红细胞裂解液裂解红细胞并清洗后，将细胞悬液用40μm尼龙滤网过滤成单细胞悬液后转移到流式管中，根据抗体说明书的建议浓度，向流式管中加入一定量的胞膜流式抗体，重悬细胞，冰上避光孵育30min。对胞内因子的染色，则继续应用流式固定液、流式破膜液处理细胞后，用胞内因子染色，冰上避光孵育30min。染色结束后，清洗两次，用流式细胞仪进行分析。CD8+T细胞染色方案为：CD45-APC,CD3-FITC,CD8-PE/CY7,GZMB-PE；Tregs细胞的染色方案为：CD45-APC,CD4-PE,CD25-FITC；巨噬细胞的染色方案为：CD45-PE,CD11b-APC,F4/80-APC/CY7和CD206-FITC。将另一部分肿瘤组织放入4％多聚甲醛溶液中，进行固定、脱水、包埋及切片后，进行CD8和GZMB的免疫组化染色。
实验结果如图4所示，由图4可以看出：与对照组小鼠相比，百里酚治疗组小鼠的肿瘤中CD8+T细胞的数量及表达GZMB的CD8+T细胞的数量均显著增加，而Treg细胞及M2型巨噬细胞的比例则明显下降(图4A)。此外，免疫组化染色也发现百里酚治疗组小鼠的肿瘤中CD8+T细胞及GZMB+T细胞的浸润明显高于对照组小鼠(图4B-C)。说明百里酚可促进肺腺癌激活型免疫微环境的形成。
综上，本发明首次鉴定出了靶向IL4I1表达的小分子药物百里酚，并首次发现百里酚靶向IL4I1可阻断AHR信号通路，从而重塑肺腺癌激活型免疫微环境。此外，还首次发现百里酚可显著增强肺腺癌抗PD-1抗体的疗效，可为临床上肺腺癌患者的免疫治疗提供新的方案和策略，具有较大的应用前景。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (6)
1.百里酚和抗PD-1抗体联合在制备用于预防和/或治疗肺腺癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述百里酚以IL4I1为靶点发挥其预防和/或治疗肺腺癌的作用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物起到以下作用中的一项或多项：
1)阻断肺腺癌细胞中AHR入核达到抑制肺腺癌生长的作用；
2)抑制肺腺癌细胞中AHR下游靶基因表达达到抑制肺腺癌生长的作用；
3)抑制肺腺癌细胞中AHR通路的活性达到抑制肺腺癌生长的作用；
4)调控肺腺癌免疫微环境达到抑制肺腺癌生长的作用；
5)增强CD8+T细胞对肺腺癌的杀伤活性的作用；
6)增敏肺腺癌抗PD-1抗体疗效的作用。
4.一种用于预防和/或治疗肺腺癌的联合用药物，所述联合用药物包括百里酚和抗PD-1抗体。
5.根据权利要求4所述的联合用药物，其特征在于：所述联合用药物通过抑制或降低IL4I1的表达和/或活性来增强肺腺癌抗PD-1抗体的疗效。
6.根据权利要求4所述的联合用药物，其特征在于：所述联合用药物起到以下作用中的一项或多项：
1)阻断肺腺癌细胞中AHR入核达到抑制肺腺癌生长的作用；
2)抑制肺腺癌细胞中AHR下游靶基因表达达到抑制肺腺癌生长的作用；
3)抑制肺腺癌细胞中AHR通路的活性达到抑制肺腺癌生长的作用；
4)调控肺腺癌免疫微环境达到抑制肺腺癌生长的作用；
5)增强CD8+T细胞对肺腺癌的杀伤活性的作用；
6)增敏肺腺癌抗PD-1抗体疗效的作用。
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