CN114984217A - 一种共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法及其应用 - Google Patents

一种共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法及应用，共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法为：通过化学偶联的方法将AS1411修饰在铁蛋白外表面；并通过温度法将紫杉醇与锰酞菁两种药物共负载在适配体铁蛋白内。本发明修饰了适配体AS1411的铁蛋白纳米载药系统，不仅增强了纳米粒子的靶向性，而且共负载的两种药物结合了化学治疗与光动力治疗，提高了肿瘤细胞的抑制效果，为后续药物靶向肿瘤细胞治疗提供了非常好的载体模型，具有很好的应用前景。

Description

一种共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方 法及其应用
技术领域
本发明涉及一种共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法及其应用，属于抗肿瘤技术领域。
背景技术
癌症发病率和死亡率在全球范围内迅速增长，已经严重危害到人类的生命健康安全。传统的化学治疗具有副作用大的缺点，于是各种纳米粒子装载药物的治疗方法一涌而出，其中铁蛋白是一种优良的天然纳米粒子，具有生物相容性好等特点，使它成为十分有潜力的药物递送系统。
紫杉醇(PTX)是一种二萜生物碱类化合物，在对抗人类恶性肿瘤中表现出较好的活性，并且是目前发现的最好的天然抗癌药物之一，紫杉醇已经广泛应用于临床治疗的各种癌症，如乳腺癌、非小细胞肺癌等。锰酞菁(MnPc)是酞菁类化合物中的一种，是一种良好的光敏剂，在730nm的激光照射下，可以产生活性氧，具有一定的抗肿瘤作用。
现有技术中利用铁蛋白装载药物时，存在装载量少，蛋白沉淀多的问题，尤其是利用铁蛋白同时装载两种药物时，很容易导致铁蛋白大量沉淀、且装载的药物量过少，而达不到所需治疗量。
发明内容
本发明提供一种共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法及其应用，本申请首先通过碳二亚胺法将适配体偶联在铁蛋白表面，形成适配体铁蛋白纳米粒子，然后将紫杉醇和锰酞菁两种药物共负载进铁蛋白内腔中，通过将适配体AS1411通过化学方法偶联在铁蛋白表面，可同时靶向癌细胞表面的转铁蛋白受体1(TfR1)和核仁素(Nucleolin)，显著增强了靶向性，可更高效地将紫杉醇和锰酞菁递送至癌细胞，加载的化疗药物与光动力治疗药物显著提高了抗肿瘤效果，同时减少了蛋白的沉淀，提高了装载量，具有很好的应用前景。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
1)将适配体AS1411通过化学方法偶联在铁蛋白表面，得适配体铁蛋白；
2)适配体铁蛋白通过温度法共同负载紫杉醇和锰酞菁，即得共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒。
上述紫杉醇和锰酞菁均为疏水性物质。
本申请首先通过碳二亚胺法将适配体偶联在铁蛋白表面，形成适配体铁蛋白纳米粒子，然后将紫杉醇和锰酞菁两种药物共负载进铁蛋白内腔中。其中铁蛋白负载药物的方法主要有三种：pH法、温度法和尿素法。发明人经研究发现，温度法可以极大地减少铁蛋白的损耗并提高装载量；锰酞菁在酸性条件下不稳定，而紫杉醇在碱性条件下不稳定，pH法不适用于共同装载两种药物；与低浓度的尿素处理相比，温度法不仅能同时装载两种药物，还可以进一步增强负载的药物数量。
发明人经研究发现，适配体AS1411通过化学方法偶联在铁蛋白表面，显著提高了药物靶向性，可通过对癌细胞转铁蛋白受体1(TfR1)以及对核仁素(Nucleolin)的靶向性有效地递送两种药物；同时通过适配体AS1411的偶联和温度法的选择，可根据需要加载所需量的紫杉醇和锰酞菁，装载量多，装载率高，且蛋白沉淀少。
为了进一步提高靶向性及装载效果，步骤1)中，将适配体AS1411与铁蛋白通过碳二亚胺法偶联，超滤离心，得到适配体铁蛋白；其中，适配体AS1411是DNA适配体，基因序列为5’(COOH)-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’，铁蛋白为人重链铁蛋白。
为了提高改性和治疗效果，同时降低治疗成本，上述步骤1)中，适配体AS1411与铁蛋白的优选摩尔比为(2±0.1):1，当适配体AS1411用量过少时，改性效果较差，当用量超出此比例时，改性效果不会继续增加，且会影响到下一步药物的装载。
为了进一步提高靶向性及装载效果，步骤1)包括如下步骤：
1.1)将适配体AS1411溶于超纯水中，得浓度为100±20μM的适配体AS1411水溶液；
1.2)将铁蛋白溶于GFC溶液，得浓度为0.6±0.2mg/mL铁蛋白GFC溶液；
1.3)将步骤1.1)制得的适配体AS1411水溶液加入MES溶液，然后加入EDC溶液和NHS溶液，冰浴搅拌30±5min；随后加入步骤1.2)制得的铁蛋白GFC溶，用pH为8～8.5的GFC溶液调pH至7～7.5以上，冰浴搅拌2±0.5h，然后5000×g离心5±1min去除失活铁蛋白，取出上清3200×g超滤离心20±2min，再超滤置换到pH＝7.0±0.1的GFC溶液中，14000±1000rpm离心15～20min，取上清，即为偶联了AS1411的适配体铁蛋白。
上述步骤1.2)中，铁蛋白GFC溶液中，氯化钠浓度25±1mM，磷酸二氢钠50±1mM，pH＝7.0±0.1；步骤1.3)中，MES溶液的浓度为8±0.1mg/mL，pH为6±0.1；EDC溶液的浓度为200±5mM；NHS溶液的浓度为100±5mM；GFC溶液中，氯化钠浓度为25±1mM，磷酸二氢钠为50±1mM。
本申请中，EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，NHS为(N-羟基琥珀酰亚胺)。GFC为氯化钠/磷酸二氢钠。本申请没有特别解释的，均参照本领域中常规解释。
为了进一步减少铁蛋白的损失，步骤2)中，将紫杉醇和锰酞菁加入到适配体铁蛋白中，孵育后离心，分离上清液，透析、离心、过滤，得到共负载药物纳米粒。
上述步骤2)中，适配体铁蛋白与紫杉醇的质量比为(2±0.1)：1，适配体铁蛋白与锰酞菁的质量比为(5±0.2)：1。紫杉醇与锰酞菁的质量比为5:2是具有最佳治药物装载效率的装载比例。而紫杉醇与锰酞菁具体加入的量与适配体铁蛋白的浓度相关，如果加入的紫杉醇与锰酞菁的量低于前述比列，紫杉醇与锰酞菁的装载个数比较少，不能满足后续治疗所满足的量，如果加入紫杉醇与锰酞菁量过多，则蛋白沉淀过多，装载的量也不能满足要求。
为了提高装载率，步骤2)中，将紫杉醇与锰酞菁溶于DMSO(二甲基亚砜)溶液后，再加入到适配体铁蛋白中。紫杉醇与锰酞菁均为亲脂性药物，均不溶于水，溶于DMSO药物装载效率高，蛋白沉淀较少，若换为其它有机溶剂，则药物装载效率明显降低、且蛋白沉淀明显增多。
为了提高装载效率，步骤2)中，孵育为60℃恒温水浴30～60min；孵育后离心的转速为12000rpm，离心时间为10～15min。孵育温度过高或者过低都会对药物装载量产生影响。
为了确保产品性能，步骤2)中，透析的时间为24～48h，透析温度为4±1℃，透析后在5000×g条件下离心8～10min，上清液使用0.45μm的滤膜过滤，即为负载了紫杉醇和锰酞菁药物的适配体铁蛋白载药纳米粒。
上述制备方法制得的共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒用于递送抗肿瘤药物。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
本发明共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法，通过适配体AS1411的偶联，显著提高了药物靶向性，且不会改变铁蛋白原有的生化性质，制得的纳米粒可通过对癌细胞转铁蛋白受体1(TfR1)以及对核仁素(Nucleolin)的靶向性有效地递送紫杉醇和锰酞菁；通过适配体AS1411的偶联和温度法的选择，提高了紫杉醇和锰酞菁的装载量和装载效率，步骤简单，不改变铁蛋白的原有结构，降低了蛋白的损失率，提高了药物的装载效率，并且两种药物结合了化学治疗与光动力治疗，提高了对肿瘤细胞的抑制效果，为后续药物靶向肿瘤细胞治疗提供了非常好的载体模型，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1和例2中适配体铁蛋白的生成与紫杉醇(PTX)和锰酞菁(MnPc)药物被适配体铁蛋白负载示意图。
图2为实施例1和例2中适配体铁蛋白与负载药物适配体铁蛋白纳米粒子的表征；其中，A:铁蛋白偶联了适配体之后的Native-page与琼脂糖凝胶电泳；B:铁蛋白与适配体铁蛋白纳米粒子的SEC聚合态分析；C:纳米粒子的DLS表征(左为铁蛋白，右为适配体铁蛋白)；D:偶联适配体与药物封装前后纳米粒子的透射电镜图像；E:HFtn、HAS1411纳米粒子的圆二色谱图；F：四种纳米粒子的SEC聚合态分析；G：HS1411、HS1411-PTX-MnPc、HAS1411-PTX和HAS1411-MnPc四种纳米粒子的圆二色谱图；H：PTX的HPLC分析。
图3为实施例3中的free PTX、free MnPc、HAS1411-PTX-MnPc的药物释放。
图4为实施例4中用Western blot分析MCF-7细胞中TfR1与Nucleolin受体的表达量。分析得TfR1受体与NCL受体相对于GAPDH的表达量分别为1.03与0.75。说明HFtn与AS1411偶联得到的HAS1411具有双靶向性，即HFtn自身有靶向TfR1的能力，修饰的AS1411可靶向NCL。
图5为实施例5中激光共聚焦、流式细胞仪检测MCF-7细胞对FITC标记的铁蛋白与适配体铁蛋白摄取情况。
图6为实例6中细胞毒性实验(A)适配体铁蛋白与MCF-7细胞共同孵育24h后体外细胞活力；(B)负载药物的纳米粒与MCF-7细胞共同孵育24h后体外细胞活力。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1：
碳二亚胺法制备适配体铁蛋白：
适配体AS1411(购自Takara)是DNA适配体，基因序列为：5’(COOH)-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’，将适配体AS1411溶于超纯水中，得浓度为100μM的适配体AS1411水溶液；由大肠杆菌表达纯化的人重链铁蛋白溶于GFC溶液得浓度为0.6mg/mL的铁蛋白GFC溶液，其中，氯化钠浓度25mM，磷酸二氢钠50mM，pH＝7.0。
大肠杆菌表达纯化人重链铁蛋白的过程如下：重组人重链铁蛋白pET-20b(+)-HFtn质粒由思普金合成(基因序列参考PDB里面的3AJO)，将质粒热激至大肠杆菌BL21内。大肠杆菌BL21在LB培养基中30℃、6h条件下表达铁蛋白，收集大肠杆菌细胞，在裂解缓冲液(50mM磷酸二氢钠，10mM咪唑，300mM氯化钠，pH 8.0)中重悬，超声离心。随后，将上清液装入Ni-NTA树脂(QIAGEN)上纯化，用体积排阻色谱(SEC)进一步纯化，流动相为GFC缓冲液(氯化钠浓度25mM，磷酸二氢钠50mM pH＝7.0)，得到纯的人重链铁蛋白。)
取500μL(8mg/mL，pH 6.0)MES Buffer，分别向其中加入20μL(100μM)适配体AS1411水溶液、50μL(200mM)EDC、50μL(100mM)NHS，冰浴搅拌30min。随后加入1mL铁蛋白GFC溶液(0.6mg/mL，HFtn：AS1411摩尔比为1:2)HFtn进行偶联，用pH 8～8.5的GFC Buffer调pH7～7.5，冰浴搅拌2±0.5h后，然后5000×g离心5min去除失活铁蛋白，取出上清3200×g超滤离心20min，再超滤置换到pH 7的GFC中，保留体积1mL，14000rpm离心20min，沉淀为未反应完的AS1411，取上清，即为偶联了AS1411的适配体铁蛋白(HAS1411)。制备方法如图1所示，表征结果如图2所示。
经检测，每个铁蛋白偶联约2个AS1411适配体。
实施例2：
温度法共负载紫杉醇和锰酞菁药物的适体铁蛋白纳米粒的制备：
将0.8mg的紫杉醇(购自麦克林生化试剂公司)与0.32mg锰酞菁(购自麦克林生化试剂公司)共溶于100μL DMSO溶液，得紫杉醇和锰酞菁共溶药物。
将2mL(0.8mg/mL)适配体铁蛋白(实施例1制得)在60℃温度下孵育1h左右，使适配体铁蛋白通道打开，其中蛋白溶液存在于GFC(NaCl 25mM，NaH2PO4 50mM、pH＝7.0)溶液中。100μL紫杉醇和锰酞菁共溶药物加入到的适配体铁蛋白中，适配体铁蛋白与紫杉醇的质量比为2：1，适配体铁蛋白与锰酞菁的质量比为5：1，在60℃孵育1h后，12000rpm离心10min，分离上清液，在PBS中透析24-36h，每8h换一次PBS。透析结束后，在5000×g条件下离心5min，上清液使用0.45μm的滤膜过滤，即为负载了紫杉醇和锰酞菁药物的适配体铁蛋白载药纳米粒(HAS1411-PTX-MnPc)。
制备方法如图1所示，表征结果如图2所示.图2中，图A为铁蛋白偶联了适配体之后的Native-page与琼脂糖凝胶电泳，证明适配体AS1411成功偶联在铁蛋白表面；图B为铁蛋白与适配体铁蛋白纳米粒子的SEC聚合态分析，可以得出修饰了适配体AS1411的铁蛋纳米粒子与铁蛋白纳米粒子的尺寸无明显变化；图C为纳米粒子的DLS表征，从图中可知，适配体铁蛋白纳米粒子的水动力直径略高于铁蛋白，说明适配体成功偶联到铁蛋白表面；图D为偶联适配体与药物封装前后纳米粒子的透射电镜图像，五种纳米粒子仍然为粒径均一的笼状结构，表明PTX和MnPc药物的装载并没有影响笼状结构的稳定性；图E为HFtn、HAS1411纳米粒子的圆二色谱图，从图上可知制备的纳米粒子均在208nm和222nm附近出现明显特征吸收峰，证明修饰的AS1411并没有影响铁蛋白的二级结构，依旧为α-螺旋；通过监测222nm的波长，评价HFtn和HAS411在20～95℃温度范围下的热变性。HAS1411的Tm约为82℃，略低于HFtn(88℃)，说明适体AS1411的修饰对铁蛋白的热稳定性影响很小。图F为四种纳米粒子的SEC聚合态分析，可以得出所制备的纳米粒子仍然为24聚体，证明药物封装在蛋白笼内，热处理没有影响蛋白载体的聚合状态；(G)HS1411、HS1411-PTX-MnPc、HAS1411-PTX和HAS1411-MnPc四种纳米粒子的圆二色谱图，从图上可知制备的纳米粒子均在208nm和222nm附近出现明显特征吸收峰。证明PTX和MnPc药物封装在铁蛋白内腔中并没有影响铁蛋白的二级结构，依旧为α-螺旋；图H为PTX的HPLC分析，适体铁蛋白通过酸性解聚释放PTX，通过HPLC分析，证明紫杉醇被封装在适体铁蛋白内。
经检测，上述共同负载紫杉醇-锰酞菁药物的适配体铁蛋白纳米粒，蛋白保留率81.36％；紫杉醇载个数为34个，紫杉醇装载浓度为35.21μg/mL，封装效率(实际装载进蛋白药物的量/加入药物的量)为8.80％；锰酞菁装载个数为50个，锰酞菁装载浓度34.98μg/mL，封装效率21.86％。
按照上述方法，改变紫杉醇与锰酞菁的加入比例：减少紫杉醇用量，至紫杉醇与锰酞菁的质量比为3:2，紫杉醇与锰酞菁的装载个数均的减少了8.7％以上，蛋白保留率下降了5％以上，继续减少紫杉醇用量，装载个数和蛋白保留率均呈继续下降趋势；增加紫杉醇用量，至紫杉醇与锰酞菁的质量比为7:2，蛋白保留率下降了20％以上，紫杉醇与锰酞菁的装载个数均的减少了6.5％以上，继续增加紫杉醇用量，装载个数和蛋白保留率均呈继续下降趋势；综上，当紫杉醇与锰酞菁为5：2时，药物装载效率最高。
实施例3：
共负载紫杉醇和锰酞菁两种药物的适配体铁蛋白纳米粒体外药物释放研究：
将实施例2温度法制备的1mL的HAS1411-PTX-MnPC与freePTX、free MnPc溶液置于透析袋(MWCO 6-8kDa)中，分别放置在pH＝5.0和pH＝7.4的PBS缓冲液中，在37℃下以100rpm的搅拌速度透析60h。在设定时间点(0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48和60h)，取出300μL透析液，并用等体积的PBS替换。用高效液相色谱检测PTX释放量，UV-vis检测MnPc释放量，释放结果如图3所示。从图中可以看出游离的PTX与MnPc在pH 7.4和5.0时都表现出了快速释放的特性，在24h内释放量均高于85％。而HAS1411共装载的PTX与MnPc，pH为7.4时的PTX与MnPc相对稳定，PTX与MnPC的释放量分别为29.6％和28.2％。在酸性条件下，铁蛋白快速释放PTX与MnPc分子，PTX与MnPc的释放量为78.5％与72.8％。
实施例4：
Western blot分析MCF-7细胞中TfR1和Nucleolin受体的表达量研究：
将贴壁细胞用胰蛋白酶消化后PBS重悬，12000rpm离心5min，去上清，用Western细胞裂解缓冲液(购自碧云天生物试剂公司)在冰下裂解细胞，每15min涡旋1次，在4℃下12000rpm离心10min，然后收集上清液到新的试管中。随后，使用BCA试剂盒(购自上海捷瑞生物试剂公司)来测定蛋白的浓度。将共20-50μg蛋白装载于10％SDS-PAGE上，转移到PVDF(购自默克公司)膜上，用5％BSA封闭，与一抗(购自碧云天生物试剂公司)在4℃孵育过夜。然后，将膜与二抗(购自碧云天生物试剂公司)在室温下孵育4h。用含0.1％Tween20洗涤剂的Tris缓冲盐水洗涤膜3次，并使用增强化学发光试剂ECL(购自Tanon)在化学膜上观察。分析得TfR1受体与NCL受体相对于GAPDH的表达量分别为1.03与0.75。说明HFtn与AS1411偶联得到的HAS1411具有双靶向性，即HFtn自身有靶向TfR1的能力，修饰的AS1411可靶向NCL。
实施例5：
共负载紫杉醇和锰酞菁两种药物的适配体铁蛋白纳米粒体外细胞摄取研究：
为研究细胞对共负载紫杉醇和锰酞菁两种药物的适配体铁蛋白的摄取情况，将MCF-7细胞以每孔3×104接种于放置了玻璃爬片的24孔板中，培养24h后，加入30μg/mLFITC(购自上海源叶生物试剂公司)标记的HAS1411与HFtn纳米颗粒，孵育4h后用PBS清洗3遍细胞，并用4％多聚甲醛室温下固定30min；再用PBS清洗两遍，然后加入DAPI(购自碧云天生物试剂公司)进行细胞核染色，使用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像，在竞争性受体研究中，细胞与过量的HFtn蛋白孵育1h，使肿瘤细胞表面TfR1受体饱和，然后添加FITC标记的HFtn或HAS1411纳米颗粒，结果如图5所示，FITC标记的HAS1411纳米颗粒的荧光强度明显高于FITC标记的HFtn组和FITC组。且在竞争性试验中，在TfR1受体被饱和的情况下，FITC标记的HAS1411组仍然显出较高的荧光强度。这说明适配体AS1411修饰HFtn后增强了细胞对HAS1411的摄取，相同的结果在流式细胞仪定量中也被得到。
实施例6：
适配体铁蛋白与共负载紫杉醇和锰酞菁药物的适配体铁蛋白纳米粒的体外细胞毒性研究：
为研究共适配体铁蛋白与负载紫杉醇和锰酞菁两种药物的适配体铁蛋白纳米粒的体外细胞毒性，将MCF-7细胞以每孔5000个细胞的密度种于96孔板中，在37℃下培养24h后，紫杉醇和锰酞菁含量分别为10μg/mL和15μg/mL的PTX、MnPC、HAS1411-PTX、HAS1411-MnPc、HHAS1411-PTX-MnPc加入相同的孔中培养24h，24h后，每孔730nm激光照射5min(1W/cm3)，37℃再孵育4h。PBS清洗两遍后再在培养基中加入MTT(购自上海源叶生物试剂公司)孵育4h后离心，小心除去上清后加入二甲基亚砜(DMSO)，在490nm处测紫外吸收，MCF-7细胞在紫杉醇和锰酞菁药物以及载药纳米粒在+NIR与-NIR作用下的存活率如图6所示，表明共负载紫杉醇和锰酞菁药物的适配体铁蛋白纳米粒在+NIR条件下表现出更强的细胞毒性，说明紫杉醇与激光照射的锰酞菁由适配体铁蛋白递送能够达到更好的治疗效果。
通过实施例1中碳二亚胺法制备适配体铁蛋白显著增强了纳米粒子的靶向性；通过实施例2的温度法成功负载了紫杉醇-锰酞菁两种药物，且减少了适配体铁蛋白的损耗。

Claims (10)

1.一种共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将适配体AS1411通过化学方法偶联在铁蛋白表面，得适配体铁蛋白；
2)适配体铁蛋白通过温度法共同负载紫杉醇和锰酞菁，即得共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒。
2.如权利要求1所述的共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤1)中，将适配体AS1411与铁蛋白通过碳二亚胺法偶联，超滤离心，得到适配体铁蛋白；其中，适配体AS1411是DNA适配体，基因序列为5’(COOH)-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’，铁蛋白为人重链铁蛋白。
3.如权利要求1或2所述的共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤1)中，适配体AS1411与铁蛋白的摩尔比为(2±0.1):1。
4.如权利要求1或2所述的共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤1)包括如下步骤：
1.1)将适配体AS1411溶于超纯水中，得浓度为100±20μM的适配体AS1411水溶液；
1.2)将铁蛋白溶于GFC溶液，得浓度为0.6±0.2mg/mL铁蛋白GFC溶液；
1.3)将步骤1.1)制得的适配体AS1411水溶液加入MES溶液，然后加入EDC溶液和NHS溶液，冰浴搅拌30±5min；随后加入步骤1.2)制得的铁蛋白GFC溶，用pH为8～8.5的GFC溶液调pH至7～7.5以上，冰浴搅拌2±0.5h，然后5000×g离心5±1min去除失活铁蛋白，取出上清3200×g超滤离心20±2min，再超滤置换到pH＝7.0±0.1的GFC溶液中，14000±1000rpm离心15～20min，取上清，即为偶联了AS1411的适配体铁蛋白。
5.如权利要求4所述的共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤1.2)中，铁蛋白GFC溶液中，氯化钠浓度25±1mM，磷酸二氢钠50±1mM，pH＝7.0±0.1；步骤1.3)中，MES溶液的浓度为8±0.1mg/mL，pH为6±0.1；EDC溶液的浓度为200±5mM；NHS溶液的浓度为100±5mM；GFC溶液中，氯化钠浓度为25±1mM，磷酸二氢钠为50±1mM。
6.如权利要求1或2所述的共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤2)中，将紫杉醇和锰酞菁加入到适配体铁蛋白中，孵育后离心，分离上清液，透析、离心、过滤，得到共负载药物纳米粒。
7.如权利要求6所述的共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤2)中，适配体铁蛋白与紫杉醇的质量比为(2±0.1)：1，适配体铁蛋白与锰酞菁的质量比为(5±0.2)：1；将紫杉醇与锰酞菁溶于DMSO后，再加入到适配体铁蛋白中。
8.如权利要求6所述的共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤2)中，孵育为60℃恒温水浴50-60min；孵育后离心的转速为12000rpm，离心时间为10～15min。
9.如权利要求6所述的共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤2)中，透析的时间为24～48h，透析温度为4±0.1℃，透析后在5000×g条件下离心8～10min，上清液使用0.45μm的滤膜过滤，即为负载了紫杉醇和锰酞菁药物的适配体铁蛋白载药纳米粒。
10.权利要求1～9任意一项所述的制备方法制得的共负载紫杉醇和锰酞菁的适配体铁蛋白纳米粒在递送抗肿瘤药物上的应用。
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