CN117402823A - Nk细胞外泌体在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents
Nk细胞外泌体在肿瘤治疗中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117402823A CN117402823A CN202311359309.5A CN202311359309A CN117402823A CN 117402823 A CN117402823 A CN 117402823A CN 202311359309 A CN202311359309 A CN 202311359309A CN 117402823 A CN117402823 A CN 117402823A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- exosomes
- peripheral blood
- nci
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 75
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 45
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title abstract description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 12
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 6
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000011325 microbead Substances 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 6
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 abstract description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 3
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 3
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 3
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 3
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000003738 lymphoid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0631—Mammary cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0688—Cells from the lungs or the respiratory tract
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
- C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了NK细胞外泌体在肿瘤治疗中的应用，本发明是改良了传统的NK细胞外泌体的制备方法，通过与肿瘤细胞共培养技术实现NK细胞的体外增殖，并通过超速离心手段制备获得NK细胞外泌体。经验证，本发明制备得到的NK细胞外泌体保留了NK细胞杀伤活性的标志分子，对肿瘤细胞具备较强的杀伤性能，可有效用于各种类型的肿瘤治疗。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗的技术领域，更具体地，涉及NK细胞外泌体在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
自然杀伤细胞( natural killer cell，NK细胞)来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。NK细胞不同于T、B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。NK细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。
NK细胞分泌的外泌体具有肿瘤归巢能力，一些研究已经报道了NK细胞衍生外泌体在多种肿瘤动物模型的归巢能力，在数分钟至数小时即可在肿瘤内观察到外泌体存在。目前缺乏大规模获得NK细胞分泌的外泌体的分离方法，这限制了其临床应用开发。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了NK细胞外泌体在肿瘤治疗中的应用。本发明改良了传统的NK细胞外泌体的制备方法，通过与肿瘤细胞共培养技术实现NK细胞的体外增殖，并通过超速离心手段制备获得NK细胞外泌体。经验证，本发明制备得到的NK细胞外泌体保留了NK细胞杀伤活性的标志分子，对肿瘤细胞具备较强的杀伤性能，可有效用于各种类型的肿瘤治疗。
具体而言，本发明首先是提供了一种NK细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）从健康受试者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；
2）将步骤1）中分离得到的外周血单个核细胞进行分选，收集富含NK细胞的细胞悬液；
3）将步骤2）得到的富含NK细胞的细胞悬液与肿瘤细胞在培养基中共培养7天；
4）共培养结束后，用流式细胞术进一步分选CD3-CD56+CD16+NK细胞，并通过4℃，2000×g条件下收集细胞上清液；
5）对步骤4）中的上清液采用滤膜过滤后，进行超高速离心，离心条件为4℃，100000×g，60min，离心结束后，收集沉淀；
6）采用1×PBS重悬步骤5）中的沉淀，并再次进行超速离心，离心条件为4℃，100000×g，60min；
7）采用1×PBS重悬步骤6）中的沉淀，经滤膜过滤收集滤液即为NK细胞外泌体。
优选地，步骤1）中是采用淋巴细胞分离液获得外周血单个核细胞；
优选地，步骤2）是采用NK cell Biotin-Antibody Cocktail和NK cellMicroBead Cocktail（购自德国Miltenyi公司）作细胞阳性分选；
优选地，步骤3）中的肿瘤细胞是选自乳腺癌细胞系、白血病细胞系、肺癌细胞系和黑色素瘤细胞系中的一种或多种；
进一步优选地，步骤3）中的乳腺癌细胞系是选择MDA-MB-231、、SKBR-3、MDA-MB-231-UR、MCF-12A、HBL101、MDA-MD-435、MCF-7、HS598T、MCF-10A、BT-20、MCF-10F、468、AU565、 ZR-75-1、 BT-483、BT-474、MDA-MB-453中的一种或多种；
进一步优选地，步骤3）中的白血病细胞系是选自K562、U937、HL-60、ML-2、THP-1、KO52、NOMO-1中的一种或多种；
进一步优选地，步骤3）中的肺癌细胞系是选自16HBE、A549、SKMES1、NCIH460、HCC827、NCI-H1299、Calu-1、Calu-3 、LTEP-a-2、MSTO-211H、NCI-H1650、NCI-H292、T84、A-427、NCI-H1395、NCI-H1975中的一种或多种；
进一步优选地，步骤3）中的黑色素瘤细胞系是选自A375、MEL202、A2058、A875、B16中的一种或多种；
优选地，步骤3）中的培养基是选自DMEM、RPMI 1640、F12K、B16F10-LUC中的一种或多种；
优选地，步骤5）和7）中的滤膜为０.22μｍ孔径大小的滤膜；
进一步地，本发明还提供了一种NK细胞外泌体，其特征在于，所述外泌体是通过以上方法制备得到。
进一步地，本发明还提供了一种NK细胞外泌体在制备肿瘤治疗药物中的用途。
优选地，所述NK外泌体对各种肿瘤细胞类型均具备杀伤性能。
本发明的优点：本发明是改良了传统的NK细胞外泌体的制备方法，通过与肿瘤细胞共培养技术实现NK细胞的体外增殖，并通过超速离心手段制备获得NK细胞外泌体。经验证，本发明制备得到的NK细胞外泌体保留了NK细胞杀伤活性的标志分子，对肿瘤细胞具备较强的杀伤性能，可有效用于各种类型的肿瘤治疗。
附图说明
图1是NK细胞外泌体对肿瘤细胞杀伤作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
NK细胞外泌体的制备：
1）从健康受试者的外周血中用淋巴细胞分离液常规方法分离得到外周血单个核细胞；
2）将步骤1）中分离得到的外周血单个核细胞进行分选，收集富含NK细胞的细胞悬液；
3）将步骤2）得到的富含NK细胞的细胞悬液与MDA-MB-231肿瘤细胞在DMEM完全培养基中共培养7天；
4）共培养结束后，用流式细胞术进一步分选CD3-CD56+CD16+NK细胞，并通过4℃，2000×g条件下收集细胞上清液；
5）对步骤4）中的上清液采用滤膜过滤后，进行超高速离心，离心条件为4℃，100000×g，60min，离心结束后，收集沉淀；
6）采用1×PBS重悬步骤5）中的沉淀，并再次进行超速离心，离心条件为4℃，100000×g，60min；
7）采用1×PBS重悬步骤6）中的沉淀，经滤膜过滤收集滤液即为NK细胞外泌体。
实施例2
NK细胞外泌体的制备：
1）从健康受试者的外周血中用淋巴细胞分离液常规方法分离得到外周血单个核细胞；
2）将步骤1）中分离得到的外周血单个核细胞进行分选，收集富含NK细胞的细胞悬液；
3）将步骤2）得到的富含NK细胞的细胞悬液与K562肿瘤细胞在RPMI 1640完全培养基中共培养7天；
4）共培养结束后，用流式细胞术进一步分选CD3-CD56+CD16+NK细胞，并通过4℃，2000×g条件下收集细胞上清液；
5）对步骤4）中的上清液采用滤膜过滤后，进行超高速离心，离心条件为4℃，100000×g，60min，离心结束后，收集沉淀；
6）采用1×PBS重悬步骤5）中的沉淀，并再次进行超速离心，离心条件为4℃，100000×g，60min；
7）采用1×PBS重悬步骤6）中的沉淀，经滤膜过滤收集滤液即为NK细胞外泌体。
实施例3
NK细胞外泌体的制备：
1）从健康受试者的外周血中用淋巴细胞分离液常规方法分离得到外周血单个核细胞；
2）将步骤1）中分离得到的外周血单个核细胞进行分选，收集富含NK细胞的细胞悬液；
3）将步骤2）得到的富含NK细胞的细胞悬液与A549肿瘤细胞在F12K完全培养基中共培养7天；
4）共培养结束后，用流式细胞术进一步分选CD3-CD56+CD16+NK细胞，并通过4℃，2000×g条件下收集细胞上清液；
5）对步骤4）中的上清液采用滤膜过滤后，进行超高速离心，离心条件为4℃，100000×g，60min，离心结束后，收集沉淀；
6）采用1×PBS重悬步骤5）中的沉淀，并再次进行超速离心，离心条件为4℃，100000×g，60min；
7）采用1×PBS重悬步骤6）中的沉淀，经滤膜过滤收集滤液即为NK细胞外泌体。
实施例4
NK细胞外泌体的制备：
1）从健康受试者的外周血中用淋巴细胞分离液常规方法分离得到外周血单个核细胞；
2）将步骤1）中分离得到的外周血单个核细胞进行分选，收集富含NK细胞的细胞悬液；
3）将步骤2）得到的富含NK细胞的细胞悬液与B16肿瘤细胞在B16F10-LUC细胞专用培养基中共培养7天；
4）共培养结束后，用流式细胞术进一步分选CD3-CD56+CD16+NK细胞，并通过4℃，2000×g条件下收集细胞上清液；
5）对步骤4）中的上清液采用滤膜过滤后，进行超高速离心，离心条件为4℃，100000×g，60min，离心结束后，收集沉淀；
6）采用1×PBS重悬步骤5）中的沉淀，并再次进行超速离心，离心条件为4℃，100000×g，60min；
7）采用1×PBS重悬步骤6）中的沉淀，经滤膜过滤收集滤液即为NK细胞外泌体。
实施例5
NK细胞外泌体杀伤活力测定：通过检测NK细胞外泌体的颗粒酶B和穿孔素的表达水平来分析实施例1-4所述方法制备的NK细胞外泌体的体外杀伤活性。其中，处理组为实施例1-4，对照组为不经肿瘤细胞共培养处理的NK细胞外泌体。
颗粒酶B、穿孔素均为体现NK细胞外泌体杀伤活性的标志分子，通过分析上述标志分子可以直观反映出NK细胞外泌体的杀伤活力。结果如表1，NK细胞杀伤活性相关标志分子的表达水平均显著性升高，且明显高于对照组。进一步证明本发明的NK细胞外泌体具备良好的杀伤活力。
表1颗粒酶B、穿孔素表达水平
实施例6
NK细胞外泌体对肿瘤细胞杀伤作用：以A549肿瘤细胞为例，采用MTT方法分析细胞的杀伤率。结果如图1所示：经共培养得到的NK细胞外泌体对靶细胞A549有显著杀伤效果。对于其他肿瘤细胞的杀伤效果同上所述，具体实验结果不再赘述。以上证实本发明的NK细胞外泌体对肿瘤细胞具有普遍的显著杀伤效果。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种NK细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）从健康受试者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；
2）将步骤1）中分离得到的外周血单个核细胞进行分选，收集富含NK细胞的细胞悬液；
3）将步骤2）得到的富含NK细胞的细胞悬液与肿瘤细胞在培养基中共培养7天；
4）共培养结束后，用流式细胞术进一步分选CD3-CD56+CD16+NK细胞，并通过4℃，2000×g条件下收集细胞上清液；
5）对步骤4）中的上清液采用滤膜过滤后，进行超高速离心，离心条件为4℃，100000×g，60min，离心结束后，收集沉淀；
6）采用1×PBS重悬步骤5）中的沉淀，并再次进行超速离心，离心条件为4℃，100000×g，60min；
7）采用1×PBS重悬步骤6）中的沉淀，经滤膜过滤收集滤液即为NK细胞外泌体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中是采用淋巴细胞分离液获得外周血单个核细胞。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）是采用NK cell Biotin-AntibodyCocktail和NK cell MicroBead Cocktail（购自德国Miltenyi公司）作细胞阳性分选。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中的肿瘤细胞是选自乳腺癌细胞系、白血病细胞系、肺癌细胞系和黑色素瘤细胞系中的一种或多种。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3）中的乳腺癌细胞系是选择MDA-MB-231、、SKBR-3、MDA-MB-231-UR、MCF-12A、HBL101、MDA-MD-435、MCF-7、HS598T、MCF-10A、BT-20、MCF-10F、468、AU565、 ZR-75-1、 BT-483、BT-474、MDA-MB-453中的一种或多种。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3）中的白血病细胞系是选自K562、U937、HL-60、ML-2、THP-1、KO52、NOMO-1中的一种或多种。
7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3）中的肺癌细胞系是选自16HBE、A549、SKMES1、NCIH460、HCC827、NCI-H1299、Calu-1、Calu-3 、LTEP-a-2、MSTO-211H、NCI-H1650、NCI-H292、T84、A-427、NCI-H1395、NCI-H1975中的一种或多种。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3）中的黑色素瘤细胞系是选自A375、MEL202、A2058、A875、B16中的一种或多种。
9. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3）中的培养基是选自DMEM、RPMI 1640、F12K、B16F10-LUC中的一种或多种。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）和7）中的滤膜为０.22μｍ孔径大小的滤膜。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311359309.5A CN117402823A (zh) | 2023-10-20 | 2023-10-20 | Nk细胞外泌体在肿瘤治疗中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311359309.5A CN117402823A (zh) | 2023-10-20 | 2023-10-20 | Nk细胞外泌体在肿瘤治疗中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117402823A true CN117402823A (zh) | 2024-01-16 |
Family
ID=89488490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311359309.5A Pending CN117402823A (zh) | 2023-10-20 | 2023-10-20 | Nk细胞外泌体在肿瘤治疗中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117402823A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115521914A (zh) * | 2022-10-12 | 2022-12-27 | 西北工业大学 | 一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20200163993A1 (en) * | 2017-05-09 | 2020-05-28 | Saint Louis University | Treatment of cancer and infectious diseases with natural killer (nk) cell-derived exosomes |
| WO2021022124A1 (en) * | 2019-08-01 | 2021-02-04 | The Regents Of The University Of California | Systems and methods for evaluating nk cells |
| WO2023109657A1 (zh) * | 2021-12-15 | 2023-06-22 | 深圳先进技术研究院 | 一种促进t淋巴细胞的肿瘤浸润性的外泌体及其制备方法 |
| CN116333987A (zh) * | 2023-03-29 | 2023-06-27 | 生物角(厦门)科技股份有限公司 | 一种外泌体提取方法获得的nk细胞外泌体在抗肿瘤中的应用 |
| CN116333986A (zh) * | 2023-03-13 | 2023-06-27 | 广州市普森生物科技有限公司 | 一种外泌体激活nk细胞的培养方法 |
| CN116875547A (zh) * | 2023-09-04 | 2023-10-13 | 山东德升细胞治疗工程技术有限公司 | 一种利用细胞外泌体激活nk细胞的体外扩增培养方法 |
-
2023
- 2023-10-20 CN CN202311359309.5A patent/CN117402823A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20200163993A1 (en) * | 2017-05-09 | 2020-05-28 | Saint Louis University | Treatment of cancer and infectious diseases with natural killer (nk) cell-derived exosomes |
| WO2021022124A1 (en) * | 2019-08-01 | 2021-02-04 | The Regents Of The University Of California | Systems and methods for evaluating nk cells |
| WO2023109657A1 (zh) * | 2021-12-15 | 2023-06-22 | 深圳先进技术研究院 | 一种促进t淋巴细胞的肿瘤浸润性的外泌体及其制备方法 |
| CN116333986A (zh) * | 2023-03-13 | 2023-06-27 | 广州市普森生物科技有限公司 | 一种外泌体激活nk细胞的培养方法 |
| CN116333987A (zh) * | 2023-03-29 | 2023-06-27 | 生物角(厦门)科技股份有限公司 | 一种外泌体提取方法获得的nk细胞外泌体在抗肿瘤中的应用 |
| CN116875547A (zh) * | 2023-09-04 | 2023-10-13 | 山东德升细胞治疗工程技术有限公司 | 一种利用细胞外泌体激活nk细胞的体外扩增培养方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| DI PACE AL 等: "Characterization of Human NK Cell-Derived Exosomes: Role of DNAM1 Receptor In Exosome-Mediated Cytotoxicity Against Tumor", 《 CANCERS》, vol. 12, no. 3, 12 March 2020 (2020-03-12), pages 1 - 6 * |
| ENOMOTO Y 等: "Cytokine-enhanced cytolytic activity of exosomes from NK Cells", 《 CANCER GENE THER.》, vol. 29, no. 6, 27 July 2021 (2021-07-27), pages 734 - 749, XP037893753, DOI: 10.1038/s41417-021-00352-2 * |
| HATAMI Z 等: "Natural killer cell-derived exosomes for cancer immunotherapy: innovative therapeutics art", 《 CANCER CELL INT》, vol. 23, no. 1, 31 August 2023 (2023-08-31), pages 1 - 9 * |
| 熊文杰 等: "骨髓瘤细胞来源外泌体对NK细胞表面活化受体的影响", 《中国实验血液学杂志》, vol. 25, no. 6, 23 January 2018 (2018-01-23), pages 1713 - 1717 * |
| 韩悦 等: "优化脂肪间充质干细胞外泌体提取方法的研究", 《云南医药》, vol. 44, no. 3, 28 June 2023 (2023-06-28), pages 96 - 99 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115521914A (zh) * | 2022-10-12 | 2022-12-27 | 西北工业大学 | 一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法 |
| CN115521914B (zh) * | 2022-10-12 | 2024-04-19 | 西北工业大学 | 一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104357394B (zh) | 一种自体外周血淋巴细胞dc‑cik的培养方法 | |
| CN117402823A (zh) | Nk细胞外泌体在肿瘤治疗中的应用 | |
| CN108676775B (zh) | 一种体外扩增脐血nk的方法 | |
| AU2019215034C1 (en) | Method of producing natural killer cells and composition for treating cancer | |
| CN104371974B (zh) | 一种自体外周血淋巴细胞cik的培养方法 | |
| CN105176927A (zh) | 一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤nk/cik细胞的制备方法 | |
| KR20180117829A (ko) | 세포밀도 조절을 이용한 자연살해세포의 대량증식방법 | |
| Qu et al. | Effect of DC-CIK cell on the proliferation, apoptosis and differentiation of leukemia cells | |
| US10125351B2 (en) | Industrial preparations of natural killer (NK) cells and injections containing NK cells | |
| CN115466726B (zh) | 一种nk细胞的高效基因转导方案 | |
| CN115505567A (zh) | 临床级混合型免疫细胞的制备方法 | |
| WO2019152663A1 (en) | Method of producing natural killer cells and composition for treating cancer | |
| CN102755512B (zh) | 一种提高cik细胞增殖速率的中药提取物及其制备方法 | |
| CN107523541B (zh) | 一种以白术内酯ⅱ为促增殖剂的cik细胞培养基 | |
| CN105969731B (zh) | 一种利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性til细胞的方法 | |
| CN111518834A (zh) | Car-t细胞及其制备方法和药物 | |
| RU2015119164A (ru) | Совместная дифференцировка моноцитов от аллогенных доноров | |
| CN109010811B (zh) | 凋亡小体疫苗免疫制备广谱抗肿瘤小鼠模型 | |
| CN106222139B (zh) | 一种利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性til细胞的方法 | |
| CN1844372A (zh) | 肿瘤抗原特异性t淋巴细胞的体外扩增方法 | |
| TWI458485B (zh) | 毒殺型樹突細胞群組用於製備藥物的用途及包含其之醫藥組合物 | |
| KR20190093499A (ko) | 자연살해세포의 생산방법 | |
| CN105861484B (zh) | 一种含有白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白的细胞培养基组合物 | |
| CN113684180A (zh) | 一种提高骨髓瘤杀伤活性的nk细胞制备方法 | |
| CN103710308B (zh) | 利用胞壁二肽诱导dc-cik的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |