KR20210078518A - 조직 거주 기억-유사 t 세포의 생산 방법 및 이의 용도 - Google Patents

조직 거주 기억-유사 t 세포의 생산 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본원에서는 저산소증 및 TGFβ의 조합에 의해 조직 거주 기억-유사 T 세포의 생성을 위한 방법이 제공된다. 본원에서는 추가로 입양 세포 치료요법으로서 조직 거주 기억 T 세포를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

조직 거주 기억-유사 T 세포의 생산 방법 및 이의 용도
[001] 본 출원은 2018년 10월 18일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/747,523호 및 2019년 5월 10일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/846,270호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원 둘다는 본원에 참조로 인용된다.
서열 목록의 도입
[002] “UTFCP1408WO_ST25.txt” 파일명으로 포함된 서열목록은 크기가 8 KB (Microsoft Windows®로 측정시)이고 2019년 10월 17일자로 작성되었고 본원 출원과 함께 전자 제출에 의해 출원되었으며 본원에 참조로 인용된다.
1. 기술분야
[003] 본 발명은 일반적으로 의학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 조직 거주 기억-유사 T 세포의 생산 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 기재
[004] 조직 거주 기억 세포 (TRM)는 바이러스 질환에 대한 국소 최전선 방어에 중요한 기억 T 세포의 최근에 동정된 서브세트이다. 최근 보고는 또한 상기 표현형을 갖는 세포가 항종양 면역력에서 중요한 역할을 수행함을 보고하였다. 상대적으로 RTRM 분화에 관한 것은 거의 알려지지 않았고 내인성 조직 거주 기억 세포는 단리하기가 어려워, 기본 연구 및 입양 세포 치료요법에서 이들의 적용에 관한 연구를 지연시킨다. 따라서, 조직 거주 기억 세포를 생성하는 방법에 대한 필요성이 충족되지 않고 있다.
발명의 개요
[005] 하나의 구현예에서, 본원의 개시내용은 조직 거주 기억-유사 T 세포(TRM-유사 T 세포)를 생성하기 위한 시험관내 방법을 제공하고 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) T 세포의 출발 집단을 수득하는 단계; (b) 상기 T 세포의 출발 집단을 저산소 조건하에서 또는 저산소증-유도제의 존재하에 배양하여 초기 이펙터 세포를 생성시키는 단계; 및 (c) 형질전환 성장 인자 베타 1 (TGF-β1)의 존재하에 초기 이펙터 세포를 추가로 배양하여 TRM-유사 T 세포를 생성하는 단계.
[006] 또 다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 조직 거주 기억-유사 T 세포(TRM-유사 T 세포)를 생성하기 위한 시험관내 방법을 제공하고 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) T 세포의 출발 집단을 수득하는 단계; (b) 상기 T 세포의 출발 집단을 저산소 조건하에서 또는 저산소증-유도제의 존재하에 배양하여 초기 이펙터 세포를 생성시키는 단계; 및 (c) 형질전환 성장 인자 베타 1 (TGF-β1), 형질전환 성장 인자 베타 2 (TGF-β2), 형질전환 성장 인자 베타 3 (TGF-β3) 또는 형질전환 성장 인자 베타 4 (TGF-β4)의 존재하에 초기 이펙터 세포를 추가로 배양하여 TRM-유사 T 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 배양은 상기 T 세포 출발 집단을 활성화시켜 초기 이펙터 세포를 생성함을 포함한다.
[007] 또 다른 구현예에서, 본원의 개시내용은 TRM-유사 T 세포를 생성하기 위한 시험관내 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) T 세포의 출발 집단을 수득하는 단계; (b) 상기 T 세포의 출발 집단을 저산소 조건하에서 또는 저산소증-유도제의 존재하에 배양하는 단계; 및 (c) TGF-β1의 존재하에 상기 T 세포의 출발 집단을 추가로 배양하여 TRM-유사 T 세포를 생성하는 단계.
[008] 일부 양상에서, 상기 T 세포 출발 집단은 CD8+ 말초 혈액 T 세포이다. 특정 양상에서, CD8+ 말초 혈액 T 세포는 사람 CD8+ 말초 혈액 T 세포이다. 특정 양상에서, 사람 CD8+ 말초 혈액 T 세포를 수득하는 단계는 말초 혈액 샘플로부터 CD45RA+CCR7+CD8+ 나이브 T 세포를 선택하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 말초 혈액 샘플은 건강한 대상체로부터 수득된다. 일부 양상에서, 말초 혈액 샘플은 암을 앓는 것으로 진단되거나 암을 앓을 것으로 의심되는 대상체로부터 수득된다. 일부 양상에서, 말초 혈액 샘플은 바이러스 질환을 갖는 것으로 진단되거나 바이러스 질환을 가질 것으로 의심되는 대상체로부터 수득된다. 특정 양상에서, 상기 T 세포의 출발 집단은 펩타이드, 전장 항원 또는 세포 용해물로 펄싱된 항원 제공 세포에 의한 나이브 T 세포의 자극에 의해 생성되었다. 특정 양상에서, T 세포는 종양 부위로부터 수득되거나 종양 침윤 림프구이다. 일부 양상에서, T 세포는 나이브 T 세포이다. 예를 들어, 세포 용해물은 종양 용해물이다. 특정 양상에서, 항원은 암 항원이다. 일부 양상에서, 펩타이드는 암 세포에서 차등적으로 발현되거나 고도로 발현되는 단백질 기원의 펩타이드이다. 일부 양상에서, 펩타이드는 신규항원으로부터 또는 돌연변이를 포함하는 단백질로부터 기원하는 펩타이드이다. 특정 양상에서, 상기 T 세포의 출발 집단은 관심 대상의 항원에 특이적인 T 세포에 대해 집적시킨다. 특정 양상에서, 상기 T 세포의 출발 집단은 CD8-양성 펩타이드 MHC 사량체-양성 세포를 집적시키기 위해 정제한다. 일부 양상에서, 상기 T 세포의 출발 집단은 형광성 활성화된 세포 분류에 의해 정제한다. 특정 양상에서, 상기 T 세포 출발 집단은 가공된 T 세포이다. 일부 양상에서, 가공된 T 세포는 클로닝된 T 세포 수용체 (TCR)를 숙주 세포 집단에 도입하여 생성되었다. 특정 양상에서, 숙주 세포 집단은 말초 혈액 단핵 세포이다. 일부 양상에서, 클로닝된 TCR은 비-바이러스 방법, 예를 들어, 에피좀 벡터 또는 트랜스포존-트랜스포사제 시스템에 의해 숙주 세포의 집단으로 도입된다. 특정 양상에서, 클로닝된 TCR은 형질도입에 의해 숙주 세포의 집단으로 도입된다. 일부 양상에서, 숙주 세포 집단은 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄를 포함하는 바이러스 벡터에 의해 형질도입된다. 특정 양상에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 양상에서, 상기 숙주 세포의 형질도입된 집단은 CD8-양성 펩타이드 MHC 사량체-양성 세포를 집적시키기 위해 정제한다. 특정 양상에서, 가공된 T 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하였다. 특정 양상에서, 키메라 항원 수용체는 클로닝된 TCR을 포함한다. 일부 양상에서, 상기 T 세포의 출발 집단은 대상체로부터 수득된 종양 침윤 림프구이다.
[009] 특정 양상에서, 저산소 조건은 추가로 5% 미만의 산소, 예를 들어, 4%, 3%, 2%, 1% 이하의 산소로서 정의된다. 일부 양상에서, 저산소증-유도제는 저산소증 모방제이다. 특정 양상에서, 저산소증-유도제 또는 저산소증 모방제는 염화코발트(CoCl2), 데퍼옥사민 메실레이트 (DFOM), 디메틸옥살리글라이신(DMOG), 또는 프롤릴 하이드록실라제 억제제, 예를 들어, 2-OG 유사체이다. 일부 양상에서, 프롤릴 하이드록실라제 억제제는 록사두스타트 (FG-4592)이다.
[0010] 일부 양상에서, 단계 (b)의 배양은 TCR 자극 및 동시 자극의 존재하에 수행한다. 특정 양상에서, TCR 자극 및 동시 자극은 항-CD3 및 항-CD28 항체, 항-CD3 및 항-CD28 비드, 피더(feeder) 세포, 항원 제공 세포, 인공 항원 제공 세포, 펩타이드 및/또는 단백질 항원 또는 이의 조합물을 포함한다. 일부 양상에서, TCR 자극 및 동시 자극은 항-CD3 및 항-CD28 비드를 포함한다. 특정 양상에서, 단계 (b)의 배양은 3 내지 5일 동안, 예를 들어, 4일동안이다. 특정 양상에서, 단계 (b)의 배양은 정상 산소 상태, 예를 들어, 20% 산소에서 수행한다. 특정 양상에서, 단계 (b)의 배양 단계는 IL-2, 예를 들어, 25-100 IU/mL, 예를 들어, 25, 50, 또는 75 IU/mL의 존재하에 수행한다. 일부 양상에서, 단계 (b)의 배양은 저산소 조건, 예를 들어, 2% 산소에서 수행한다. 특정 양상에서, 상기 배양은 IL-15의 존재하에 수행한다. 일부 양상에서, IL-15은 5-20 ng/mL, 예를 들어, 7-12ng/mL, 구체적으로 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 ng/mL의 농도로 존재한다.
[0011] 특정 양상에서, TGF-β1은 추가로 재조합 인간 TGF-β1 (rhTGF-β1)으로서 정의된다. 일부 양상에서, rhTGF-β1은 0.1 내지 5 ng/mL, 예를 들어, 1 내지 1.5 ng/mL, 구체적으로 1.1, 1.15, 1.2, 1.25, 1.3, 1.35, 1.4, 1.45 또는 1.5 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, rhTGF-β1은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ng/mL의 농도로 존재한다. 여전히 다른 구현예에서, rhTGF-β1은 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 양상에서, 단계 (c)의 배양은 저산소 조건하에 또는 저산소증-유도제의 존재하에 수행된다. 특정 양상에서, 단계 (c)의 배양은 1 내지 3일 동안, 예를 들어, 2일동안이다.
[0012] 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 CD69+CD103+이다. 특정 양상에서, 단계 (c)에서 생성된 세포의 적어도 30%, 예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 이상은 CD69+CD103+ 세포이다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 PD-1, CD101 및/또는 CD49a이다. 특정 양상에서, TRM-유사 T 세포 발현 PD-1, CD101, 및/또는 CD49a는 세포 표면 발현 (예를 들어, 유동 세포측정을 통해)으로서 측정된다. 특정 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 CD69, ITGAE, PDCD1, 및/또는 CD101의 보다 높은 발현을 갖는다. 특정 양상에서, CD69, ITGAE, PDCD1, 및/또는 CD101의 보다 높은 발현은 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 CD69, ITGAE, PDCD1, 및/또는 CD101 단백질의 보다 높은 발현이다. 다른 양상에서, CD69, ITGAE, PDCD1, 및/또는 CD101의 보다 높은 발현은 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 CD69, ITGAE, PDCD1, 및/또는 CD101 mRNA 전사체의 보다 높은 발현을 갖는다.
[0013] 특정 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 TNFA, GZMB, SLC2A1, 및/또는 VEGF의 보다 높은 발현을 갖는다. 특정 양상에서, TNFA, GZMB, SLC2A1, 및/또는 VEGF의 보다 높은 발현은 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 TNFα, GZMB, GLUT1, 및/또는 VEGF 단백질의 보다 높은 발현이다. 다른 양상에서, TNFA, GZMB, SLC2A1, 및/또는 VEGF의 보다 높은 발현은 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 TNFA, GZMB, SLC2A1, 및/또는 VEGF mRNA 전사체의 보다 높은 발현이다.
[0014] 특정 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 S1PR1, KLF2, 및/또는 SELL의 감소된 발현을 갖는다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 S1PR1, KLF2, 및/또는 CD62L 단백질의 감소된 발현을 갖는다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 S1PR1, KLF2, 및/또는 SELL mRNA 전사체의 감소된 발현을 갖는다.
[0015] 특정 양상에서, TRM-유사 T 세포는 CXCR6 단백질을 필수적으로 발현하지 않는다. 특정 양상에서, TRM-유사 T 세포는 CXCR6 단백질을 필수적으로 검출가능하게 세포 표면 발현하지 않는다.
[0016] 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, RGS1, ITGA1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CCL4, CCL5, NOTCH1, RBPJ, STRIP2, ARHGEF40, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3의 보다 높은 발현을 갖는다. 특정 양상에서, GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, RGS1, ITGA1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CCL4, CCL5, NOTCH1, RBPJ, STRIP2, ARHGEF40, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3 단백질은 보다 높게 발현된다. 특정 양상에서, GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, RGS1, ITGA1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CCL4, CCL5, NOTCH1, RBPJ, STRIP2, ARHGEF40, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3 mRNA 전사체는 보다 높게 발현된다.
[0017] 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, 및/또는 RGS1의 보다 높은 발현을 갖는다. 특정 양상에서, GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, 및/또는 RGS1의 보다 높은 발현은 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, 및/또는 RGS1 단백질의 보다 높은 발현이다. 특정 양상에서, GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, 및/또는 RGS1의 보다 높은 발현은 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, 및/또는 RGS1 mRNA 전사체의 보다 높은 발현이다.
[0018] 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 ITGAE, ITGA1, PDC1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CXCL13, CCL20, NOTCH1, RBPJ, NR4A1, EGR2, 및/또는 RGS1의 보다 높은 발현을 갖는다. 특정 양상에서, ITGAE, ITGA1, PDCD1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CXCL13, CCL20, NOTCH1, RBPJ, NR4A1, EGR2, 및/또는 RGS1의 보다 높은 발현은 ITGAE, ITGA1, PDCD1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CXCL13, CCL20, NOTCH1, RBPJ, NR4A1, EGR2, 및/또는 RGS1 단백질의 보다 높은 발현이다. 특정 양상에서, ITGAE, ITGA1, PDCD1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CXCL13, CCL20, NOTCH1, RBPJ, NR4A1, EGR2, 및/또는 RGS1의 보다 높은 발현은 ITGAE, ITGA1, PDCD1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CXCL13, CCL20, NOTCH1, RBPJ, NR4A1, EGR2, 및/또는 RGS1 mRNA 전사체의 보다 높은 발현이다.
[0019] 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에서 배양된 세포와 비교하여 MYO7A, STRIP2, ARHGEF40, ITGAE, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CXCL13, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3의 보다 높은 발현을 갖는다. 특정 양상에서, MYO7A, STRIP2, ARHGEF40, ITGAE, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CXCL13, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3의 보다 높은 발현은 MYO7A, STRIP2, ARHGEF40, ITGAE, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CXCL13, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3 단백질의 보다 높은 발현이다. 특정 양상에서, MYO7A, STRIP2, ARHGEF40, ITGAE, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CXCL13, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3의 보다 높은 발현은 MYO7A, STRIP2, ARHGEF40, ITGAE, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CXCL13, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3 mRNA 전사체의 보다 높은 발현이다.
[0020] 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, KLF2, RASGRP2, FAM65B, SERPINE2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, TNFSF8, DUSP2, PLEK, GOLGA2P7, FOSB, PLCG2, SLAMF7, SLC6A8, SOCS3, 및/또는 PTGER2의 보다 낮은 발현을 갖는다. 특정 양상에서, CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, KLF2, RASGRP2, FAM65B, SERPINE2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3 TNFSF8, DUSP2, PLEK, GOLGA2P7, FOSB, PLCG2, SLAMF7, SLC6A8, SOCS3, 및/또는 PTGER2의 보다 낮은 발현은 CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, KLF2, RASGRP2, FAM65B, SERPINE2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, TNFSF8, DUSP2, PLEK, GOLGA2P7, FOSB, PLCG2, SLAMF7, SLC6A8, SOCS3, 및/또는 PTGER2 단백질의 보다 낮은 발현이다. 특정 양상에서, CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, KLF2, RASGRP2, FAM65B, SERPINE2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3 TNFSF8, DUSP2, PLEK, GOLGA2P7, FOSB, PLCG2, SLAMF7, SLC6A8, SOCS3, 및/또는 PTGER2의 보다 낮은 발현은 CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, KLF2, RASGRP2, FAM65B, SERPINE2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, TNFSF8, DUSP2, PLEK, GOLGA2P7, FOSB, PLCG2, SLAMF7, SLC6A8, SOCS3, 및/또는 PTGER2 mRNA 전사체의 보다 낮은 발현이다.
[0021] 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에서 배양된 세포와 비교하여 CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, RASGRP2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, 및/또는 TNFSF8의 보다 낮은 발현을 갖는다. 특정 양상에서, CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, RASGRP2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, 및/또는 TNFSF8의 보다 낮은 발현은 CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, RASGRP2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, 및/또는 TNFSF8 단백질의 보다 낮은 발현이다. 특정 양상에서, CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, RASGRP2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, 및/또는 TNFSF8의 보다 낮은 발현은 CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, RASGRP2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, 및/또는 TNFSF8 mRNA 전사체의 보다 낮은 발현이다.
[0022] 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, 및/또는 RGS1의 보다 높은 발현을 갖는다. 특정 양상에서, GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, 및/또는 RGS1의 보다 높은 발현은 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, 및/또는 RGS1 단백질의 보다 높은 발현이다. 특정 양상에서, GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, 및/또는 RGS1의 보다 높은 발현은 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, 및/또는 RGS1 mRNA 전사체의 보다 높은 발현이다.
[0023] 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에서 배양된 세포와 비교하여 MYO7A, STRIP2, ARHGEF40, ITGAE, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CXCL13, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3의 보다 높은 발현을 갖는다. 특정 양상에서, MYO7A, STRIP2, ARHGEF40, ITGAE, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CXCL13, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3의 보다 높은 발현은 MYO7A, STRIP2, ARHGEF40, ITGAE, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CXCL13, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3 단백질의 보다 높은 발현이다. 특정 양상에서, MYO7A, STRIP2, ARHGEF40, ITGAE, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CXCL13, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3의 보다 높은 발현은 MYO7A, STRIP2, ARHGEF40, ITGAE, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CXCL13, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3 mRNA 전사체의 보다 높은 발현이다.
[0024] 추가의 양상에서, 상기 방법은 관심 대상의 항원에 대해 특이성을 갖는 TRM-유사 T 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 관심 대상의 항원에 대해 특이성을 갖는 TRM-유사 T 세포는 TRM-유사 T 세포에 관심 대상의 항원에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 형질도입함에 의해 가공된다. 다른 양상에서, 관심 대상의 항원에 대해 특이성을 갖는 TRM-유사 T 세포는 관심 대상의 항원에 대해 특이성을 갖는 T 세포의 출발 집단을 사용함에 의해 생성된다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 단계 (b) 동안에, 상기 T 세포의 출발 집단을 펩타이드-펄싱된 항원 제공 세포와 함께 배양함에 의해 활성화된다. 일부 양상에서, APC는 성숙한 수지상 세포이다. 특정 양상에서, 단계 (b) 및 (c)는 적어도 1회 반복한다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 단계 (b) 및/또는 단계 (c) 동안에 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제의 존재하에 배양한다. 특정 양상에서, HDAC 억제제는 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 보리노스타트 (수버라닐로하이드록삼산 또는 SAHA, Zolinza®로서 시판됨), 벨리노스타트 (PXD101, Beleodaq®로서 시판됨), 파노비노스타트 (Farydaq®로서 시판됨), 다시노스타트 (LAQ824), 엔티노스타트(SNDX-275 또는 MS-275), 타세디날린(CI994), 및 모세티노스타트 (MGCD0103)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[0025] 일부 양상에서, 관심 대상의 항원은 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종을 포함하는), 복막, 위장 또는 위암(위장암 및 위장 기질 암을 포함하는), 췌장암, 자궁암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 콩팥 또는 신장암, 전립선암, 음경암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암 또는 흑색종을 표적화하거나 치료하기 위한 것이다.
[0026] 본원에서는 추가로 CXCR6 단백질의 발현 부재, 실질적으로 발현 부재 또는 필수적으로 발현 부재인 TRM-유사 T 세포가 제공된다. 일부 양상에서, CXCR6 단백질의 발현 부재는 CXCR6 단백질의 세포 표면 발현 부재이다. 다른 양상에서, TRM-유사 T 세포는 CXCR6 mRNA 전사체를 발현하지만 세포 표면 상에 CXCR6 단백질을 발현하지 않거나 CXCR6 단백질을 발현한다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 관심 대상의 항원에 특이적이다. 또 다른 구현예에서, 상기 제공된 바와 같은 TRM-유사 T 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 또 다른 구현예에서, CXCR6 단백질의 필수적으로 발현 부재인 TRM-유사 T 세포의 집단 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 본원의 구현예의 방법에 의해 생성된다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포(들)는 PD-1, CD101, 및/또는 CD49a을 발현한다. 특정 양상에서, 세포의 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60% 이상은 CD69+CD103+ 세포이다. 특정 양상에서, TRM-유사 T 세포(들)은 CD69+CD103+ 세포이다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, RGS1, ITGA1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CCL4, CCL5, NOTCH1, RBPJ, STRIP2, ARHGEF40, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3의 보다 높은 발현을 갖는다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, 및/또는 RGS1의 보다 높은 발현을 갖는다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 ITGAE, ITGA1, PDC1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CXCL13, CCL20, NOTCH1, RBPJ, NR4A1, EGR2, 및/또는 RGS1의 보다 높은 발현을 갖는다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에서 배양된 세포와 비교하여 MYO7A, STRIP2, ARHGEF40, ITGAE, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CXCL13, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3의 보다 높은 발현을 갖는다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, KLF2, RASGRP2, FAM65B, SERPINE2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, TNFSF8, DUSP2, PLEK, GOLGA2P7, FOSB, PLCG2, SLAMF7, SLC6A8, SOCS3, 및/또는 PTGER2의 보다 낮은 발현을 갖는다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에서 배양된 세포와 비교하여 CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, RASGRP2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, 및/또는 TNFSF8의 보다 낮은 발현을 갖는다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 KLF2, KLF3, SELL, FAM65B, 및/또는 SERPINE2의 보다 낮은 발현을 갖는다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 대기 산소 조건하에서 배양된 세포와 비교하여 DUSP2, PLEK, GOLGA2P7, FOSB, PLCG2, ITGAM, FOS, KLF3, SLAMF7, TNFSF8, SLC6A8, KLF2, SOCS3, 및/또는 PTGER2의 보다 낮은 발현을 갖는다.
[0027] 또 다른 구현예에서, CXCR6 단백질의 필수적으로 발현 부재인 유효량의 TRM-유사 T 세포, 예를 들어, 본원의 구현예의 방법에 의해 생성된 TRM-유사 T 세포를 포함하는, 대상체에서 면역-관련 장애의 치료를 위한 조성물이 제공된다. 특정 양상에서, TRM-유사 T 세포는 관심 대상의 항원에 대해 특이성을 갖는다.
[0028] 추가로, 본원에서는 대상체에서 면역 관련 장애의 치료를 위한 CXCR6 단백질의 필수적으로 발현 부재인 유효량의 TRM-유사 T 세포, 예를 들어, 본원의 구현예의 방법에 의해 생성된 TRM-유사 T 세포의 용도가 제공된다. 특정 양상에서, TRM-유사 T 세포는 관심 대상의 항원에 대해 특이성을 갖는다.
[0029] 일부 양상에서, 관심 대상의 항원은 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종을 포함하는), 복막, 위장 또는 위암(위장암 및 위장 기질 암을 포함하는), 췌장암, 자궁암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 콩팥 또는 신장암, 전립선암, 음경암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암 또는 흑색종을 표적화하거나 치료하기 위한 것이다.
[0030] 추가의 구현예에서, CXCR6 단백질의 필수적으로 발현 부재인 유효량의 TRM-유사 T 세포, 예를 들어, 본원의 구현예의 방법에 의해 생성된 TRM-유사 T 세포를 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 면역-관련 장애의 치료를 위한 방법이 제공된다. 일부 양상에서, 대상체는 사람이다.
[0031] 일부 양상에서, 면역-관련 장애는 암, 자가면역 장애, 이식편 대 숙주 질환, 동종이식 거부 또는 염증성 병태이다. 특정 양상에서, 대상체는 조직 또는 기관 이식체를 받았다.
[0032] 추가의 양상에서, 상기 방법은 추가로 적어도 하나의 치료학적 제제를 투여함을 포함한다. 일부 양상에서, 적어도 하나의 제2 치료학적 제제는 화학치료요법, 면역치료요법, 수술, 방사선치료요법 또는 생물치료요법을 포함한다. 일부 양상에서, TRM 유사 T 세포 및/또는 적어도 하나의 제2 치료학적 제제는 정맥내로, 복막내로, 기관내, 종양내, 근육내, 내시경으로, 병변내, 경피적으로, 피하내, 국부적으로, 또는 직접 주사 또는 관류에 의해 투여된다. 특정 양상에서, TRM-유사 T 세포는 상기 제2 치료학적 제제 전에 투여된다. 일부 양상에서, TRM-유사 T 세포는 제2 치료학적 제제 후에 투여된다. 특정 양상에서, TRM-유사 T 세포는 상기 제2 치료학적 제제와 동시에 투여된다. 특정 양상에서, 면역치료요법은 4-1BB 효능제이다. 특정 양상에서, 상기 4-1BB 효능제는 4-1BB 항체이다. 다른 양상에서, 제2 치료학적 제제는 면역 관문 억제제이다. 특정 양상에서, 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4, 항-PD1 또는 항-PD-L1 억제제이다.
[0033] 또 다른 구현예에서, 필수적으로 CXCR6 발현 부재인 유효량의 TRM-유사 T 세포, 예를 들어, 본원의 방법에 의해 생성된 TRM-유사 T 세포, 예를 들어, 하나 이상의 바이러스 항원에 대해 특이성을 갖는 TRM-유사 T 세포를 투여함을 포함하는, 대상체에서 바이러스 감염을 치료하기 위한 방법이 제공된다.
[0034] 본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해 질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본 발명의 바람직한 구현예를 제시하는 구체적인 실시예는, 상기 상세한 설명으로부터 본 발명의 개념과 범위 내에서 다양한 변화 및 변형을 줄 수 있음이 당업계의 숙련자에게는 명백하기 때문에, 단지 예시로서만 제공되는 것임을 알아야 한다.
[0035] 하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 개시 내용의 특정 양태를 추가로 설명하기 위해 포함되어 있다. 본원의 개시내용은 본원에 제공된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 보다 잘 이해될 수 있다.
[0036] 도 1: 조직 거주 기억 세포를 생성하기 위한 방법을 도시하는 도식.
[0037] 도 2a-2e: 저산소증 및 TGF-β1에 노출된 인간 CD8+ T-세포는 TRM-유사 전사 프로필을 갖는다. 말초 혈액으로부터 단리된 나이브 CD8+ T-세포는 4일 동안 20% 또는 2% O2 (저산소증)에서 활성화시키고 이어서 추가로 2일 동안 rhTGF-β1의 첨가와 함께 활성화시킨다. TRM과 연관된 유전자의 발현 수준은 정량적 실시간 PCR을 통해 분석하였다. (A-E) AtmosO2 (~20% O2) + TGF-β1 보다 저산소증 (2% O2) + TGF-β1에서 유전자 전사체 수준의 배수 변화. 포준(Canonical) 저산소증 반응 유전자는 세포 저산소증 반응의 활성화를 지적하기 위한 대조군으로서 (E)에 나타낸다. CX3CR1 발현은 검출될 수 없다. n = 6, 3 독립 실험; 다중 비교를 위해 벤자미니(Benjamini), 크리에거(Krieger) 및 예쿠티엘리(Yekutieli) 보정을 사용한 대응표본 t-시험; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; FDR < 0.05, 데이터는 평균 +/- SEM이다.
[0038] 도 3a-3c: TGF-β1과 조합된 저산소증은 사람 TRM-연관된 마커를 발현하는 CD69+CD103+ 집단을 유도한다. 건강한 사람 공여자의 말초 혈액으로부터 단리된 나이브 CD8+ T-세포는 4일 동안 대기 산소 (대략 20%) 또는 저산소증 (2% 산소)에서 활성화시키고 이어서 추가로 2일 동안 rhTGF-β1의 첨가와 함께 활성화시킨다. (A) CD69+CD103+ TRM-유사 집단의 빈도 및 (B 및 C) TRM-연관된 마커의 발현은 이어서 유동 세포측정에 의해 평가하였다. 1 공여자로부터의 대표적인 결과는 (B)에 나타내고, 회색 히스토그램은 형광성 - 하나의 (FMO) 대조군을 나타낸다. n = 7, 3 독립적 실험; 비율 대응표본의 t-시험 (A) 또는 ANOVA (C); *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, **** P < 0.0001.
[0039] 도 4a-4b: 저산소증 및 TGF-β1은 상승작용하여 CD69+CD103+ 세포를 유도한다. 나이브 CD8+ T 세포는 rhTGF-β1의 첨가 또는 첨가 없이 도 2에 기재된 바와 같이 활성화시켰다. (A) CD69+CD103+ 집단의 빈도 및 (B) TRM-연관된 마커의 발현은 유동 세포측정에 의해 평가하였고 대표적인 결과는 (A) 1 공여자. n = 4, 이원 (two-way) ANOVA (A) 또는 일원 (one-way) ANOVA (B)에 대해 나타내고, *P < 0.05, **P < 0.01
[0040] 도 5a-5f: 저산소증 및 TGF-β1 유도된 TRM-표현형 세포는 내인성 TRM에 대해 보고된 것들과 유사한 전사 차이를 보여준다. CD69-CD103-, CD69+CD103-, 및 CD69+CD103+ CD8+ T-세포는 앞서 기재된 바와 같이 생성하였고 RNA-서열분석을 통한 전사체 분석을 위한 RNA의 단리 전 분류하였다(n = 3). (A) 범용 전사체를 기반으로 하는 대응표본 CD69-CD103-, CD69+CD103-, 및 CD69+CD103+ CD8+ T-세포의 주요-성분 분석 (PCA). (B) 각각 20% O2, 2% O2, 및 2% O2 + TGF-β1에서 생성된 CD69- CD103- (좌측), CD69+CD103- (중앙), 및 CD69+CD103+ (우측) 세포에 대해 상위 150개 차등적으로 발현된 유전자들의 비지도 (unsupervised) 클러스터링. |log2FC| ≥ 1 및 FDR < 0.05에 의해 결정된 차등적 발현. (C) 선택된 차등적으로 발현된 TRM-연관된 유전자들의 발현 수준. 정규화된 집적 스코어 (NES)로서 제공된 (D) CD69+CD103+ 대 CD69-CD103- 및 (E) CD69+CD103+ 대 CD69+CD103- 세포의 전사체에서 내인성 TRM 및 TILRM으로부터 유래된 유전자 시그니처의 GSEA. (F) (E)에 나타낸 TILRM GSEA로부터 상위 34개 차등적으로 발현된 유전자.
[0041] 도 6a-6b: 대사, 이동, 및 TRM 생성 및 유지에 관여하는 경로는 저산소증 및 TGF-β1 유도된 TRM에서 차등적으로 조절된다. (A) CD69-CD103- 세포에서 이들의 발현, 및 음성-로그-형질전환된 P 값 (우측 수직 축; 피셔 정확도 시험(Fisher's exact test))에 상대적으로 CD69+CD103+ 세포에서 상향조절되거나 하향조절된 각각의 경로의 성분을 암호화하는 차등적으로 발현된 유전자의 빈도로서 나타낸, CD69+CD103+ 시험관내 유도된 TRM이 풍부한 인게니티 (Ingenuity) 경로 분석 (IPA) 데이터베이스로부터 상위 30개 표준(canonical) 경로; 막대 위의 숫자는 각각의 경로에서 전체 유전자를 나타내고, 막대는 유의성 순서로 나타낸다. (B) 저산소증 + TGF-β1 시험관내 유도된 TRM 및 내인성 사람 TRM에서 차등적으로 조절된 IPA 표준 경로
[0042] 도 7a-7d: 저산소증 및 TGF-β1에서 사람 CD8+ T-세포의 분화는 CD69+CD103+ 집단을 유도한다. (A) 유동 세포측정 분석에 사용된 게이팅 전략. (B) 유동 세포측정 분석에서 고정될 수 있는 생존능 염료 (Invitrogen)에 의해 결정된 세포 생존능. (C 및 D) 유동 세포측정에 의해 결정된 20% O2 + TGF-β1 및 2% O2 + TGF-β1 조건을 비교하는 집단 빈도에서의 변화. n = 7, 3 독립적 실험; 대응표본 t-시험 (B), 비율 대응표본 t-시험 (C), 또는 ANOVA (D); *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
[0043] 도 8a-8f: 10% O2 및 TGF-β1에서 분화된 사람 CD8+ T-세포는 TRM-유사 전사 프로필을 갖지 않는다. 말초 혈액으로부터 단리된 나이브 CD8+ T-세포는 4일 동안 20%(Atmos O2) 또는 10% O2 (순환O2)에서 활성화시키고 이어서 추가로 2일 동안 rhTGF-β1의 첨가와 함께 활성화시킨다. TRM과 연관된 유전자의 발현 수준은 정량적 실시간 PCR을 통해 분석하였다. (A-E) 20% O2 + TGF-β1 보다 10% O2 + TGF-β1에서의 유전자 전사 수준의 배수 변화. (F) CD69+CD103+ TRM- 유사 집단의 빈도는 이어서 유동 세포측정에 의해 평가하였다. 1 공여자로부터의 대표적인 결과는 (F)에 나타낸다. n = 3, 2 독립 실험; (A-E) 다중 비교를 위해 벤자미니, 크리에거 및 예쿠티엘리 보정을 사용한 대응표본 t-시험; FDR < 0.05, 데이터는 평균 +/- SEM; (F) 비대응표본 t-시험, *P < 0.05.
[0044] 도 9a-9b: 저산소증 및 TGF-β1 유도된 TRM-표현형 세포는 내인성 TRM에 대해 보고된 것들과 유사한 전사 차이를 보여준다. CD69-CD103-, CD69+CD103-, 및 CD69+CD103+ T-세포는 도 4에 기재된 바와 같이 생성하였고 RNA-서열분석을 통한 전사체 분석을 위한 RNA의 단리 전 분류하였다(n = 3). (A) 내인성 사람 TRM의 전사체 분석에서 통상적으로 보고된 선택된 유전자의 발현을 보여주는 히트맵. (B) 사람 폐 및 CD69+CD103+ 저산소증으로부터의 CD8+CD69+ 대 CD8+CD69- T 세포에서(문헌참조: Kumar et al., 2017, 본원에 참조로 인용됨) 및 정상 세포 배양 조건 (TGF-β1 부재하에 20% O2)으로부터 TGF-β1 시험관내 유도된 TRM (i-TRM) 대 CD69-CD103- 세포에서 전사 차이 (로그2FC)를 비교하는 히트맵. |log2FC| ≥ |1| 및 FDR < 0.05에 의해 결정된 차등적 발현.
[0045] 도 10a-10c: (A) 말초 혈액으로부터 단리된 나이브 CD8+ T-세포는 HIF 프롤릴 하이드록실라제 억제제 FG-4592 (Roxadustat)의 존재하에 4일 동안 20% O2 (AtmosO2)에서 활성화시키고 이어서 추가로 2일 동안 rhTGF-β1으로 활성화시킨다. 4일째 rhTGF-β1의 첨가와 함께 2% O2 (저산소증)에서 활성화된 세포는 비교용으로 나타낸다. CD69+CD103+ 집단의 빈도는 유동 세포측정에 의해 평가하고, 대표적인 결과는 1 공여자에 대해 FACS 플롯에 나타낸다. n = 3 (B) MART-1 펩타이드-펄싱된 자가 수지상 세포를 사용한 자극. 나이브 CD8+ T-세포는 4일째 rhTGF-β1의 첨가와 함께 20% O2 (AtmosO2) 또는 2% O2에서 7일 동안 MART-1(M27) 펩타이드로 펄싱된 자가 단핵구-유래된 수지상 세포로 자극하여 유동 세포측정에 의해 검출된 CD69+CD103+ 항원-특이적 (사량체+) T-세포를 생성하였다. 1 공여자에 대해 FACS 플롯에 나타낸 대표적인 결과. n = 4, 비대응표본 t-시험, **P < 0.01. 데이터는 평균 +/- SEM이다. (C) 변형된 신속한 확장 프로토콜은 항원-특이적 T 세포에서 TRM 표현형을 유도한다. 저산소증 및 rhTGF-β1은 변형된 신속한 확장 프로토콜에 사용하여 항원-특이적 T 세포에서 TRM 표현형을 유도하였다.　 항원-특이적 T-세포는 자가 MART-1 펩타이드-펄싱된 수지상 세포 (ETC)를 사용한 자극 또는 gp100-특이적 TCR (TCRT)의 형질도입을 통해 생성하였고, 형광단-접합된 사량체로 표지시키고 분류하였다. 분류된 항원-특이적 T 세포는 이어서 항-CD3 (OKT3)으로 자극하고 IL-2 (통상적인 REP)가 보충된 20% O2에서 또는 IL-15가 보충된 2% O2에서 방사선 조사된 피더 세포로 자극하고 4일 연속으로 rhTGF-β1을 첨가하였다. 막대 그래프는 MART-1 ETC에 대한 결과를 보여주고, 데이터는 평균 +/- SEM, n = 3, 비대응표본 t-시험, **P < 0.01이다.
[0046] 조직 거주 기억 세포 (TRM)는 비-재순환 기억 T 세포이고, 이는 조직에 거주하고, 조직으로부터 이탈하고 림프절로 이동할 수 있는 분자가 결여되어 있으며 최전선 응답자로서 작용한다(문헌참조: mi-Chouaib and Tartour, 2019). TRM 분화에 대해 상대적으로 거의 알려진 바 없다. 조직에 진입하는 이펙터 T 세포는 조직에 체류시키는 유전자를 상향 또는 하향조절함에 의해 TRM이 될 수 있다. 본 연구에서, 저산소증 및 TGF-β1은 사람 말초 혈액 CD8+ T-세포에서 TRM-유사 표현형을 유도할 수 있다. 본 연구는 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포와 같은 사람 말초 혈액 T 세포가 시험관내 저산소증 및 TGF-β1에서 분화된 경우, 이들이 TRM 표현형을 나타내고 조직 거주 기억 세포와 통상적으로 연관된 단백질 마커 및 유전자를 발현함을 보여주었다(표 1). 이들 발견은 TRM 분화에 대해 이전에 보고되지 않은 단서를 동정하고, 입양 세포 치료요법과 같은 기본 연구 및 해독 적용을 위해 TRM-표현형 세포를 생성하는 용이한 수단을 가능하게 한다.
[0047] 따라서, 본원 개시내용의 특정 구현예는 TRM-표현형 세포를 생성하기 위한 방법을 제공한다. 용어 “TRM-표현형 세포” 및 “TRM-유사 세포"는 본원에서 본원의 방법에 의해 제공된 세포를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 방법은 저산소증 또는 저산소증을 유도하거나 모방하는 제제의 존재하에 말초 혈액 T 세포를 배양함을 포함할 수 있거나, 예시적인 저산소증 모방제는 염화코발트 (CoCl2), 데퍼옥사민 메실레이트(DFOM), 메틸옥살리글라이신 (DMOG), 또는 프롤릴 하이드록실라제 억제제, 예를 들어, Roxadustat를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 기간 동안에, 세포는 폴리클로날적으로 예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 비드에 의해 활성활성화되어 초기 이펙터 세포를 생성할 수 있다. 용어 “초기 이펙터 세포”는 나이브 상태로부터 활성화 1주 이내에 있는 세포를 언급한다. 활성화는 TCR 자극 및 항-CD3/항-CD28 항체, 항-CD3/항-CD28 비드, 피더 세포, 항원 제공 세포, 인공 항원 제공 세포, 펩타이드 및/또는 단백질 항원 또는 이의 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 동시-자극의 존재하에 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 초기 이펙터 세포를 생성하기 위한 활성화 후, 세포는 추가로 TGF-β1의 존재하에 배양하여 TRM-표현형 세포를 생성한다. 따라서, 저산소증 및 TGF-β1을 사용하여 사람 TRM-연관된 마커를 발현하는 CD8+CD69+CD103+ 세포 집단을 유도할 수 있다. 저산소증 및 TGF-β1에서 분화된 사람 CD8+ T-세포는 TRM-유사 전사 프로필을 갖는다.
[0048] TRM-유사 세포에는 항원-특이성이 부여될 수 있다. 하나의 방법은 본원에 기재된 조건하에 나이브 T 세포의 폴리클로날 활성화로 TRM-유사 세포를 생성시킴에 이어서 형질도입에 의해 항원-특이적 TCR을 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 변형된 버젼의 ETC 자극 방법에서, 나이브 T 세포는 저산소증에서 펩타이드-펄싱된 항원 제공 세포 (또는 인공 항원 제공 세포)를 통해 활성화시킴에 이어서 추가로 rh TGF-β1의 존재하에 배양할 수 있다. 이러한 활성화는 2라운드 동안 수행하여 항원-특이적 세포를 생성할 수 있다. 또 다른 방법에서, 항원-특이적 TRM-유사 세포는 저산소증 및 TGF-β1을 후생적 변형제, 예를 들어, HDAC 억제제와 조합하여 이미 확장된 항원-특이적 세포를 TRM 표현형으로 분화시킴에 의해 생성될 수 있다.
[0049] 본원의 T 세포, 예를 들어, T 세포의 출발 집단은 가공된 T 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 가공된 T 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포(CAR T 세포)를 포함한다. 특정 구현예에서, 가공된 T 세포는 종양-특이적 에피토프 또는 네오에피토프에 결합할 수 있는 재조합 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 가공된 T　세포는 당업자에게 공지된 임의의 많은 잘 확립된 유전자 전달 방법을 사용하여 작제된다. 특정 구현예에서, 가공된 세포는 목적하는 표적 종양 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체를 암호화하거나 목적하는 종양-특이적 에피토프 또는 네오에피토프에 특이적인 재조합 TCR을 암호화하는 핵산을 도입하기 위해 바이러스 벡터 기반 유전자 전달 방법을 사용하여 작제된다. 특정 구현예에서, 가공된 세포는 목적하는 표적 종양 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체를 암호화하거나 목적하는 종양-특이적 에피토프 또는 네오에피토프에 특이적인 재조합 TCR을 암호화하는 핵산을 도입하기 위해 비-바이러스 벡터 기반 유전자 전달 방법을 사용하여 작제된다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터 기반 유전자 전달 방법은 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터 기반 유전자 전달 방법은 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터 기반 유전자 전달 방법은 아데노바이러스 또는 아데노 관련 바이러스 벡터를 포함한다. 비-바이러스 벡터 기반 유전자 전달 방법은 에피좀 벡터 또는 트랜스포존-트랜스포사제 시스템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 트랜스포존-트랜스포사제 시스템은 널리 공지된 슬리핑 뷰티 (Sleeping Beauty), 프로그 프린스 (Frog Prince) 트랜스포존-트랜스포사제 시스템 또는 TTAA-특이적 트랜스포존 PiggyBac 시스템일 수 있다. 특정 구현예에서, 비-바이러스 벡터 기반 유전자 전달 방법은 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 및 클러스터링된 규칙적 간극의 짧은 팔린드롬 반복체(CRISPR)/CRISPR-연합된 단백질 9 (Cas9) 뉴클레아제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자 편집 방법을 포함한다. 특정 구현예에서, 비-바이러스 벡터 기반 유전자 편집 방법은 지질감염, 핵감염, 유전자총, 비로좀(virosome), 리포좀, 다가양이온(polycation) 또는 지질:핵산 접합체, 나출된 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 제제 증진된 취득으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 형질감염 또는 형질전환 방법을 포함한다.
[0050] 특정 구현예에서, CAR T 세포는 세포외 항원-결합 도메인, 선택적 스페이서 서열, 막관통 도메인, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 및 CAR T 세포를 활성화시키거나 불활성화시키기 위한 하나 이상의 선택적 조절 서열을 포함하는 CAR 작제물을 발현한다.
[0051] 특정 구현예에서, 세포외 항원-결합 도메인은 목적하는 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기를 포함한다. 특정 구현예에서, 목적하는 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 이의 항원-결합 단편은 목적하는 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 단일쇄 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 특정 구현예에서, 목적하는 표적은 종양-특이적 항원이다. 특정 구현예에서, 종양-특이적 항원은 CD19, CD20, CD22, 암배아 항원, 알파페토단백질, CA-125, MUC-1, 상피 종양 항원, 흑색종-관련 항원 (MAGE) (예를 들어, MAGE-1, MAGE-11, 또는 MAGE-A), 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2/Neu, ERBB2, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파쇄, 람다쇄, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, VEGFR2, 및 사람 파필로마 바이러스 (HPV)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 목적하는 표적은 종양-특이적 네오에피토프이다. 특정 구현예에서, 종양 특이적 네오에피토프는 인 실리코 분석에 의해 동정된다. 특정 구현예에서, 종양-특이적 네오에피토프는 사람 대상체로부터 유래된 자가 TIL 집단으로부터 동정되고 정제된다.
[0052] 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 세포 막에 걸칠 수 있는 구조를 형성할 수 있는 임의의 합성 또는 천연 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 막에 걸칠 수 있는 구조물은 알파 헬릭스를 포함한다. 특정 구현예에서, 막관통 영역은 CD3ζ, CD3ε, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, 4-1BB/CD137, CD154, 유도성 T 세포 동시자극인자 (ICOS)/CD278, 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질 (GITR)/CD357, NKG2D, TCRα 및 TCRβ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 천연적으로 존재하는 막관통 단백질로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 천연적으로 존재하는 막관통 단백질로부터 유래된 막관통 영역은 다른 신호전달 단백질과의 상호작용에 관여하는 것으로 공지된 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
[0053] 특정 구현예에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 세포내 티로신 기반 활성화 모티프 (“ITAM”)를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 ITAM은 CD3-제타 (CD3z) 분자 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 추가로 CD28, 4-1BB/CD137, ICOS, OX40, CD2, CD40L, CD27, 라이트(Light)-R, GITR, 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 동시자극 신호전달 도메인을 포함한다.
[0054] 특정 구현예에서, T 세포는 종양-특이적 에피토프 또는 네오에피토프에 결합할 수 있는 재조합 T 세포 수용체를 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 T 세포 수용체는 대상체로부터 단리된 T 세포로부터 클로닝된 천연적으로 존재하는 TCR을 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 TCR은 TCR 알파 (TCRα) 폴리펩타이드 및 TCR 베타 (TCRβ) 폴리펩타이드 (즉, TCRαβ)를 포함하는 이종이량체를 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 TCR은 TCR 감마 (TCRγ) 폴리펩타이드 및 TCR 델타 (TCRδ) 폴리펩타이드 (즉, TCRγδ)를 포함하는 이종이량체를 포함한다.
[0055] 특정 구현예에서, 재조합 TCRαβ는 대상체로부터 단리되고 목적하는 표적으로부터 유래된 펩타이드 항원에 특이적인 클로닝된 TCRαβ를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 특정 구현예에서, 포유동물은 사람이다. 특정 구현예에서, 목적하는 표적은 CD19, CD20, CD22, 암배아 항원, 알파페토단백질, CA-125, MUC-1, 상피 종양 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2/Neu, ERBB2, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파쇄, 람다쇄, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, 및 VEGFR2로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 재조합 TCRγδ는 대상체로부터 단리되고 목적하는 표적으로부터 유래된 펩타이드 항원에 특이적인 클로닝된 TCRγδ를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 특정 구현예에서, 포유동물은 사람이다. 특정 구현예에서, 목적하는 표적은 CD19, CD20, CD22, 암배아 항원, 알파페토단백질, CA-125, MUC-1, 상피 종양 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2/Neu, ERBB2, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파쇄, 람다쇄, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, 및 VEGFR2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 종양 특이적 항원이다.
[0056] 추가로 본원에서는 예를 들어, 암 또는 바이러스 질환을 치료하기 위해 입양 세포 치료요법을 위해 제공된 TRM-유사 세포의 사용 방법이 제공된다. 세포는 예를 들어, 이식편 대 숙주 질환(GVHD), 조직 또는 기관 거부, 또는 자가면역 병태를 갖는 대상체에 대한 면역억제를 위해 사용될 수 있다.
[0057] [표 1]
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I. 정의
[0058] 본원에서, 특정 성분과 관련하여 "필수적으로 부재"라는 용어는 해당 특정 성분이 의도적으로 조성물 내로 전혀 조제하여 넣지 않았고/않았거나 해당 특정 성분이 오염물로서만 존재하거나 미량으로만 존재하는 것을 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 야기된 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01%이다. 표준 분석 방법으로 특정 성분의 양이 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
[0059] 본원 명세서에서, 단수형 관사("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원 청구항에서, 단수형 관사 ("a" 또는 "an")는 "포함하는" 이라는 단어와 함께 사용되는 경우 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
[0060] 청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서 "또 다른" 이라는 말은 적어도 두번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다. 용어 “약”, “실질적으로” 및 “대략적으로”는 일반적으로 기재된 값의 + 또는 - 5%를 의미한다.
[0061] "자가면역 질환"은 면역계가 결과적으로 조직에 대한 손상과 함께, 정상 숙주의 일부인 항원 (즉, 자가항원)에 대한 면역 반응 (예를 들어, B 세포 또는 T 세포 반응)을 생성하는 질환을 언급한다. 자가항원은 숙주 세포로부터 유래될 수 있거나, 정상적으로 점막 표면에 군집하는 미생물 (공생 유기체로서 공지된)과 같은 공생 유기체로부터 유래할 수 있다.
[0062] 용어 "이식편 대 숙주 질환 (GVHD)"은 골수 또는 다른 조직 이식의 통상적이고 중증의 합병증을 언급하고, 여기에서 이식 수용자 자신의 조직에 대하여 기부된 면역학적 적격의 림프구의 반응이 있다. GVHD는 관련된 또는 관련되지 않은 공여자로부터 기원하는 줄기 세포를 사용하거나 함유하는 임의의 이식체의 가능한 합병증이다. 일부 구현예에서, GVHD는 만성 GVHD (cGVHD)이다.
[0063] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “키메라 항원 수용체”, “CAR”, “키메라 T 세포 수용체”, “인공 T 세포 수용체” 또는 “키메라 면역수용체”는 목적하는 비-MHC-제한된 항원-결합 특이성을 면역 이펙터 세포, 예를 들어, 이펙터 T 세포상으로 이식하는 가공된 키메라 수용체 작제물을 언급한다. CAR은 예를 들어, 세포외 항원-결합 도메인 (예를 들어, 목적하는 항원 특이성을 갖는 단일쇄 가변 단편 (scFv)와 같은 항체 또는 항체 단편), 스페이서 서열, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 세포내 티로신-기반 활성화 모티프 (“ITAMs”), 예를 들어, CD3-제타(CD3z), 및/또는 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인. 예를 들어, CD28, 4-1BB/CD137, ICOS, OX40, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
[0064] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “치료한다”, “치료”, “치료하는” 등은 예를 들어, 치료학적 제제를 대상체에 투여함에 의해 또는 대상체에 대해 수술. 임상 또는 다른 의학적 절차를 수행함에 의해 대상체에서 질환 또는 병태의 증상을 완화시키거나, 감소시키거나 다르게는 경감시키는 과정을 언급한다.
[0065] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “대상체” 또는 “환자”는 본원에서 상호교환적으로 사용되어 개체, 예를 들어, 사람 또는 비-사람 유기체, 예를 들어, 영장류, 포유동물 또는 척추동물을 언급한다.
[0066] 본원 전반에 걸쳐 사용된 바와 같은 용어 "치료학적 이득" 또는 "치료학적 유효량"은 상기 병태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 웰빙을 촉진시키거나 증진시키는 어떠한 것을 언급한다. 이것은 질환의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도에서의 감소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 암의 치료는 예를 들어, 종양 크기에서의 감소, 종양 공격성에서의 감소, 암 성장율에서의 감소 또는 전이의 예방을 포함할 수 있다. 암의 치료는 또한 암을 갖는 대상체의 생존을 지연시키는 것을 언급할 수 있다.
[0067] 본 명세서에서 일반적으로 사용되는 "약제학적으로 허용되는"은, 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유익/위험 비율에 적합하고, 사람 및 동물의 조직, 기관 및/또는 체액과의 접촉에 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 제형을 의미한다.
[0068] “약제학적으로 허용되는 염”은 상기 정의된 바와 같이 약제학적으로 허용되고 목적하는 약리학적 활성을 갖는 본원에 기재된 화합물의 염을 의미한다. 상기 염은 무기산, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등; 또는 유기산, 예를 들어, 1,2-에탄디설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 3-페닐프로피온산, 4,4′-메틸렌비스(3-하이드록시-2-엔-1-카복실산), 4-메틸바이사이클로[2.2.2]옥트-2-엔-1-카복실산, 아세트산, 지방족 모노- 및 디카복실산, 지방족 황산, 방향족 황산, 벤젠설폰산, 벤조산, 캄포르설폰산, 카본산, 신남산, 시트르산, 사이클로펜탄프로피온산, 에탄설폰산, 푸마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 헵탄산, 헥산산, 하이드록시나프토산, 락트산, 라우릴설푸르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 무콘산, o-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 옥살산, p-클로로벤젠설폰산, 페닐-치환된 알칸산, 프로피온산, p-톨루엔설폰산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 3급 부틸아세트산, 트리메틸아세트산 등과 형성된 산 부가염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 또한 존재하는 산성 부분이 무기 또는 유기 염기와 반응할 수 있는 경우 형성될 수 있는 염기 부가염을 포함한다. 허용되는 무기 염기는 수산화나트륨, 탄산나트륨, 수산화칼륨, 수산화알루미늄 및 수산화칼슘을 포함한다. 허용되는 유기 염기는 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등을 포함한다. 본 발명의 임의의 염의 일부 형성하는 특정 음이온 또는 양이온은 전반적으로 염이 약제학적으로 허용될 수 있는 한 중요하지 않는 것으로 인지되어야 한다. 약제학적으로 허용되는 염, 및 이의 제조 방법 및 용도의 추가의 예는 문헌[참조: Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002)]에 제공된다.
[0069] “약제학적으로 허용되는 담체”, “약물 담체”, 또는 단순히 “담체”는 화학적 제제를 운반하고, 전달하고/하거나 수송하는데 관여하는 활성 성분 약물과 함께 제형화되는 약제학적으로 허용되는 물질이다. 약물 담체를 사용하여 예를 들어, 약물 생물유용성을 조절하고, 약물 대사를 감소시키고/시키거나 약물 독성을 감소시키기 위한 제어 방출 기술을 포함하는, 약물의 전달 및 효과를 개선시킬 수 있다. 일부 약물 담체는 특정 표적 부위로의 약물 전달의 효과를 증가시킬 수 있다. 담체의 예는 다음을 포함한다: 리포좀, 미소 구체(예를 들어, 폴리(락틱-코-글리콜)산으로 구성되는), 알부민 미소 구체, 합성 중합체, 나노섬유, 단백질-DNA 복합체, 단백질 접합체, 적혈구, 비로솜 및 덴드리머.
[0070] 용어 “배양”은 적합한 배지에서 세포의 시험관내 유지, 분화 및/또는 증식을 언급한다. “집적된”이란 이들이 유기체에 존재하는 조직에서 발견되는 것 보다 총 세포의 보다 큰 퍼센트로 존재하는 세포를 포함하는 조성물을 의미한다.
[0071] "단리된" 생물학적 성분(예를 들어, 혈액학적 물질의 일부, 예를 들어, 혈액 성분)은 성분이 천연적으로 존재하는 유기체의 다른 생물학적 성분들로부터 실질적으로 분리되거나 정제된 성분을 언급한다. 단리된 세포는 세포가 천연적으로 존재하는 유기체의 다른 생물학적 성분으로부터 실질적으로 분리되거나 정제된 세포이다.
II. 사용 방법
[0072] 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 본원 개시내용의 유효량의 TRM 세포를 투여함을 포함하는 입양 세포 치료요법을 위한 방법을 제공한다. 본원 개시내용의 특정 구현예에서, 암 또는 바이러스 질환은 면역 반응을 유발하는 TRM 세포 집단의 입양 전달에 의해 치료된다. 일부 구현예에서, TRM 세포 집단 자체는 면역 반응을 매개한다. 생체내 활성화되면, TRM 세포는 다양한 염증 촉진 인자, 예를 들어, 케모킨 및 사이토킨을 생성할 수 있고, 이들은 면역 반응을 유발한다. 본원에서는 유효량의 TRM 세포 집단을 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 방법이 제공된다. 본원에서는 유효량의 TRM 세포 집단을 개체에게 투여함을 포함하는 개체 내 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 방법이 제공된다. 본 발명의 방법은 면역 장애, 고형 암, 혈액암 및 바이러스 감염의 치료를 위해 적용될 수 있다. 예를 들어, 본원 구현예에 따른 치료를 위한 바이러스 감염은 HIV, HBV 또는 헤르페스 바이러스 감염일 수 있다.
[0073] 본 발명의 치료 방법이 유용한 종양은 임의의 악성 세포 유형, 예를 들어, 고형 종양 또는 혈액학적 종양에서 발견되는 것들을 포함한다. 예시적인 고형 종양은 췌장, 결장, 맹장, 위, 뇌, 머리, 목, 난소, 신장, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선 및 유방으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기관의 종양을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 혈액학적 종양은 골수의 종양, T 또는 B 세포 악성 종양, 백혈병, 림프종, 모세포종, 골수종 등을 포함한다. 본원에 제공된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암의 추가의 예는 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종을 포함하는), 복막, 위장 또는 위암(위장암 및 위장 기질 암을 포함하는), 췌장암, 자궁암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 콩팥 또는 신장암, 전립선암, 음경암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암 및 흑색종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[0074] 상기 암은 구체적으로 하기의 조직학적 유형을 가질 수 있지만 이들에 제한되지 않는다: 악성 신생물; 암종; 미분화된 암종; 거대 및 스핀들 세포 암종; 소세포 암종; 유두 암종; 편평 세포 암종; 림프구상피 암종; 기저 세포 암종; 섬모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두 이행 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관 암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선낭 암종; 선종폴립 내 선암종; 가족성 폴립증 콜리 선암종; 고형 암종; 악성 카시노이드 종양; 세기관지-폐포 선암종; 유두 선암종; 색소형성 암종; 호산성 암종; 호산소성 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화 암종; 부신피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속 암종 (skin appendage carcinoma); 아포크린 선암종(apocrine adenocarcinoma); 피지 선암종; 귀지 선암종(ceruminous adenocarcinoma); 점막상피 암종; 낭선암종; 유두 낭선암종; 유두 장액성 낭선암종(papillary serous cystadenocarcinoma); 점소양 낭선암종; 점소양 선암종; 시그넷 환 세포 암종(signet ring cell carcinoma); 침윤 도관 암종(infiltrating duct carcinoma); 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유방 파게트 질환(paget's disease, mammary); 소포 세포 암종; 선편평세포 암종; 선암종 w/편평 상피화생; 악성 흉선종thymoma; 악성 난소 기질 종양(ovarian stromal tumor, malignant); 악성 포막종(thecoma, malignant); 악성 과립막 세포 종양(granulosa cell tumor, malignant); 악성 암성모세포종; 세르톨리 세포 암종(sertoli cell carcinoma); 악성 라이디히 세포 종양(leydig cell tumor, malignant); 악성 지질 세포 종양; 악성 부신결정종(paraganglioma, malignant); 악성 유선외 부신결정종(extra-mammary paraganglioma, malignant); 크롬친화세포종(pheochromocytoma); 사구체혈관육종(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 흑색점 악성 흑색종(lentigo malignant melanoma); 선단 흑자성 흑색종(acral lentiginous melanomas); 결절성 흑색종; 거대 색소성모반에서 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 악성 청색모반(blue nevus, malignant); 육종; 섬유육종; 악성 섬유 조직구종; 점액육종(myxosarcoma); 지방육종; 평활근육종(leiomyosarcoma); 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양; 뮬러관 혼합 종양; 신아세포종(nephroblastoma); 간아세포종(hepatoblastoma); 암육종; 악성 중간엽종; 악성 브레너 종양 (brenner tumor, malignant); 악성 엽상 종양(phyllodes tumor, malignant); 활액 육종; 악성 중피종(mesothelioma, malignant); 미분화배세포종(dysgerminoma); 배아 암종(embryonal carcinoma); 악성 기형종(teratoma, malignant); 악성 난소갑상선종(struma ovarii, malignant); 융모암종; 악성 중신종(mesonephroma, malignant); 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종(hemangiopericytoma, malignant); 림프관 육종; 골육종; 피질주위 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종; 악성 연골모세포종; 간엽성 연골육종(mesenchymal chondrosarcoma); 골의 거대 세포 종양; 어윙 육종(ewing's sarcoma); 악성 치원성 종양(odontogenic tumor, malignant); 에나멜아세포 치원서육종(ameloblastic odontosarcoma); 악성 에나멜아세포종(ameloblastoma, malignant); 사기질모세포섬유육종; 악성 송과체부종양; 척색종; 악성 신경교종; 뇌실막세포종(ependymoma); 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지교모세포종(oligodendroblastoma); 원시 신경외배엽종양; 소뇌 육종; 신경절아세포종(ganglioneuroblastoma); 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 뇌수막종(meningioma, malignant); 신경섬유육종(neurofibrosarcoma); 악성 신경초종(neurilemmoma, malignant); 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨(hodgkin's); 파라육아종(paragranuloma); 소림프구 악성 림프종(malignant lymphoma, small lymphocytic); 대형 세포 확산 악성 림프종(malignant lymphoma, large cell, diffuse); 여포성 악성 림프종(malignant lymphoma, follicular); 균상식육종(mycosis fungoides); 다른 특정 비-호지킨 림프종; B-세포 림프종; 저급/여포성 비-호지킨 림프종(NHL); 소림프구(SL) NHL; 중간 등급/여포 NHL; 중간 등급 확산 NHL; 고등급 면역아구성 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소 비-절단된 세포 NHL; 벌크 질환 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia); 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프구 백혈병; 혈장 세포 백혈병; 적백혈병)(erythroleukemia); 림프구육종 세포 백혈병; 골수백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵아구 백혈병; 골수 육종; 모발 세포 백혈병; 만성 림프구 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 급성 골수 백혈병 (AML); 및 만성 골수아구성 백혈병.
[0075] 특정 구현예는 백혈병의 치료 방법에 관한 것이다. 백혈병은 혈액암 또는 골수 암이고 혈액 세포, 일반적으로 백혈구 세포 (백혈구)의 비정상적 증식 (증식에 의한 생성)을 특징으로 한다. 이것은 혈액학적 신생물로 불리우는, 광범위한 그룹의 질환의 일부이다. 백혈병은 광범위한 질환을 포괄하는 광범위한 용어이다. 백혈병은 임상적으로 및 병리학적으로 급성 및 만성 질환으로서 분류된다.
[0076] 본원 개시내용의 특정 구현예에서, TRM 세포는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 암 또는 바이러스 감염과 같은 감염을 갖는 개체에게 전달된다. 상기 세포는 이어서 각각의 암 또는 병원성 세포를 공격하는 개체의 면역계를 증진시킨다. 일부 경우에, 상기 개체에는 하나 이상의 용량의 세포가 제공된다. 개체에게 2 이상의 용량의 면역 세포가 제공되는 경우에, 투여 사이의 지속 기간은 개체내 증식을 위한 시간을 허용하기 위해 충분해야만 하고 특정 구현예에서, 투여 사이의 지속 기간은 l, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상이다.
[0077] 본원 개시내용의 특정 구현예는 면역-매개된 장애를 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 대상체는 자가면역 질환을 갖는다. 자가면역 질환의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 자가면역 애디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트 질환(Behcet's disease), 수포성 유사천포창, 심근증, 셀리악 스페이트-피부염(celiac spate-dermatitis), 만성 피로 면역 기능부전 증후군(CFIDS), 만성 ㅇ며증 탈수초 다발신경병증, 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 반흔성 유천포창(cicatrical pemphigoid), CREST 증구훈, 한냉응집질환(cold agglutinin disease), 크론 질환, 원판성 루프스(discoid lupus), 한랭 글로불린혈증(essential mixed cryoglobulinemia), 섬유근통-섬유근염(fibromyalgia-fibromyositis), 사구체신염(glomerulonephritis), 그레이브스 질환(Graves' disease), 길리안-바레(Guillain-Barre), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신경병증, 소아 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스(lupus erthematosus), 메니어 질환(Meniere's disease), 혼성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 1형 또는 면역-매개된 진성 당뇨병, 중증 근무력증, 신증후군(예를 들어, 최소 변화 질환, 병소 사구체경화증, 또는 막성 신장병증), 심상성천포창(pemphigus vulgaris), 악성 빈혈(pernicious anemia), 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군(polyglandular syndromes), 류마티스성 다발근통, 다발근염 및 피부근염, 1차 무감마글로불린혈증, 1차 담즙성 경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노드 현상(Raynaud's phenomenon), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 경피증(scleroderma), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 강직 인간 증후군, 전신 홍반성 낭창, 홍반 루프스, 궤양성 대장염, 포도막염, 맥관염 (예를 들, 결절성 다발관절염( polyarteritis nodosa), 타카야수 관절염(takayasu arteritis), 측두 동맥염(temporal arteritis)/거대 세포 관절염(giant cell arteritis), 또는 피부염 포진 혈관염), 백반증, 및 베게너 육아종증. 본원에 기재된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 자가면역 질환의 일부 예는 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창, I형 진성 당뇨병, 크론 질환; 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 사구체신염, 강직성 척추염, 혈관염 또는 건선을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대상체는 또한 천식과 같은 알레르기 질환을 가질 수 있다.
[0078] 여전히 또 다른 구현예에서, 대상체는 이식된 기관 또는 줄기 세포의 수용자이고 TRM 세포를 사용하여 거부를 예방하고/하거나 치료한다. 특정 구현예에서, 대상체는 이식편 대 숙주 질환을 갖거나 발병할 위험에 처해 있다. GVHD는 관련된 또는 관련되지 않은 공여자로부터 기원하는 줄기 세포를 사용하거나 함유하는 임의의 이식체의 가능한 합병증이다. 급성 및 만성의 2가지 종류의 GVHD가 있다. 급성 GVHD는 이식 후 처음 3개월 이내에 나타난다. 급성 GVHD의 징후에는 손과 발에 붉은 피부 발진이 나타나 피부가 벗겨 지거나 물집이 생겨 퍼지고 더 심해질 수 있다. 급성 GVHD는 또한 위 및 장에 영향을 줄 수 있고 이 경우에 경련, 메스꺼움 및 설사가 나타난다. 피부와 눈의 황변 (황달)은 급성 GVHD가 간에 영향을 미쳤음을 나타낸다. 만성 GVHD는 중증도에 따라 순위가 매겨진다: 1 단계/등급은 약하고; 4 단계/등급은 중증이다. 만성 GVHD는 이식 후 3개월 이후에 나타난다. 만성 GVHD의 증상은 급성 GVHD의 증상과 유사하지만, 추가로 만성 GVHD는 눈의 점액선, 입의 타액선 및 위 내벽과 내장을 윤활하는 샘에도 영향을 줄 수 있다. 본원에 기재된 임의의 면역 세포의 집단이 사용될 수 있다. 이식된 기관의 예는 고체 기관 이식체, 예를 들어, 신장, 간, 피부, 췌장, 폐 및/또는 심장, 또는 세포 이식체, 예를 들어, 섬(islet), 간세포, 근아세포, 골수, 또는 조혈 또는 다른 줄기 세포를 포함한다. 이식체는 복합 이식체, 예를 들어, 얼굴 조직일 수 있다. 면역 세포는 이식 전에 이식과 동시에 또는 이식 후에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 이식 전, 예를 들어, 이식 전 적어도 1시간, 적어도 12 시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 또는 적어도 1개월째에 투여된다. 하나의 특정 비제한적인 예에서, 치료학적 유효량의면역 세포의 투여는 이식 전 3 내지 5일째에 일어난다.
[0079] 일부 구현예에서, 대상체에게 TRM 세포 집단 전에 비골수절제성 림프구고갈 화학치료요법이 투여될 수 있다. 비골수절제성 림프구고갈 화학치료요법은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있는, 임의의 적합한 상기 치료요법일 수 있다. 비골수절제성 림프구고갈 화학치료요법은 예를 들어, 특히 암이 전이성일 수 있는 흑색종인 경우 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 투여를 포함할 수 있다. 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 예시적 경로는 정맥내이다. 또한, 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 임의의 적합한 용량이 투여될 수 있다. 특정 양상에서, 약 60 mg/kg의 사이클로포스파미드가 2일 동안 투여되고 이후 약 25 mg/m2의 플루다라빈은 5일동안 투여된다.
[0080] 특정 구현예에서, TRM 세포 집단의 성장 및 활성화를 촉진시키는 성장 인자는 TRM 세포 집단과 동시에 대상체에게 또는 후속적으로 면역 세포에 투여된다. 성장 인자는 TRM 세포 집단의 성장 및 활성화를 촉진시키는 임의의 적합한 성장 인자일 수 있다. 적합한 면역 세포 성장 인자의 예는 인터류킨 (IL)-2, IL-7, IL-15, 및 Il-12를 포함하고, 이는 단독으로 또는 다양한 조합으로, 예를 들어, IL-2와 IL-7, IL-2와 IL-15, IL-7과 IL-15, IL-2, IL-7와 IL-15, IL-12와 IL-7, IL-12와 IL-15, 또는 IL-12와 IL-2로 사용될 수 있다.
[0081] 치료학적 유효량의 TRM 세포는 비경구 투여, 예를 들어, 정맥내, 복막내, 근육내, 흉골하 또는 관절내 주사 또는 주입을 포함하는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
[0082] 입양 세포 치료요법에 사용하기 위한 TRM 세포의 치료학적 유효량은 치료받는 대상체에서 목적하는 효과를 성취하는 양이다. 예를 들어, 이것은 진행을 억제하거나 자가면역 또는 동종면역 질환의 퇴행을 유발하기 위해 필요하거나 자가면역 질환, 예를 들어, 통증 및 염증에 의해 유발된 증상을 경감시킬 수 있는 TRM 세포의 양일 수 있다. 염증, 예를 들어, 암, 부종 및 승온과 같은 염증과 연관된 증상을 경감시키기 위해 필요한 양일 수 있다. 이것은 또한 이식된 기관의 거부를 감소시키거나 방지하는데 필요한 양일 수 있다.
[0083] TRM 세포는 상기 질환의 치료를 위한 표준 치료에 맞는 치료 용법으로, 예를 들어, 질환 상태를 개선하기 위해 1일 내지 수일에 걸쳐 단일 용량 또는 수회 용량 또는 질환 진행을 억제하고 질환 재발을 예방하기 위해 연장된 기간 동안 주기적 용량으로 투여될 수 있다. 제형 중에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 중증도에 의존하고 임상의의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야만 한다. 면역 세포의 치료학적 유효량은 치료받는 대상체, 환부의 중증도 및 유형 및 투여 방식에 의존한다. 일부 구현예에서, 사람 대상체의 치료에 사용될 수 있는 용량은 적어도 3.8×104, 적어도 3.8×105, 적어도 3.8×106, 적어도 3.8×107, 적어도 3.8×108, 적어도 3.8×109, 또는 적어도 3.8×1010 면역 세포/m2의 범위이다. 특정 구현예에서, 사람 대상체의 치료에 사용되는 용량은 약 3.8×109 내지 약 3.8×1010 면역 세포/m2의 범위이다. 추가의 구현예에서, 면역 세포의 치료학적 유효량은 체중 kg 당 약 5×106 세포 내지 체중 kg 당 약 7.5×108 세포, 예를 들어, 체중 kg 당 약 2×107 세포 내지 약 5×108 세포, 또는 체중 kg 당 약 5×107 세포 내지 약 2×108 세포로 다양할 수 있다. 면역 세포의 정확한 양은 대상체의 연령, 체중, 성별 및 생리학적 병태를 기준으로 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
[0084] TRM 세포는 면역 매개된 장애의 치료를 위해 하나 이상의 다른 치료학적 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 조합 치료요법은 하나 이상의 항-미생물 제제(예를 들어, 항생제, 항-바이러스 제제 및 항-진균제), 항-종양 제제(예를 들어, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 플루다라빈, 에토포시드, 독소루비신, 또는 빈크리스틴), 면역-고갈 제제(예를 들어, 플루다라빈, 에토포시드, 독소루비신, 또는 빈크리스틴), 면역억제제 (예를 들어, 아자티오프린, 또는 글루코코르티코이드, 예를 들어, 덱사메타손 또는 프레드니손), 소염제 (예를 들어, 글루코코르티코이드, 예를 들어, 하이드로코르티손, 덱사메타손 또는 프레드니손, 또는 비-스테로이드성 소염제, 예를 들어, 아세틸살리실산, 이부프로펜 또는 나프록센 나트륨), 사이토카인(예를 들어, 인터류킨-10 또는 형질전환 성장 인자-베타), 호르몬(예를 들어, 에스트로겐), 또는 백신을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 추가로, 칼시뉴린 억제제(예를 들어, 사이클로스포린 및 타크롤리무스); mTOR 억제제 (예르 들어, 라파마이신); 마이코페놀레이트 모페틸, 항체 (예를 들어, CD3, CD4, CD40, CD154, CD45, IVIG, 또는 B 세포를 인지하는); 화학치료학적 제제(예를 들어, 메토트렉세이트, 트레오설판, 부설판); 조사; 또는 케모킨, 인터류킨 또는 이들의 억제제(예를 들어, BAFF, IL-2, 항-IL-2R, IL-4, JAK 키나제 억제제)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역억제 또는 관용성 제제가 투여될 수 있다. 상기 추가의 약제학적 제제는 목적하는 효과에 의존하여 면역 세포의 투여 전, 투여 동안에 또는 투여 후 투여될 수 있다. 세포 및 제제는 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 및 동일 부위에 또는 상이한 부위에 투여될 수 있다.
A. 조합 치료요법　
[0085] 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 추가로 적어도 하나의 추가의 치료학적 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 모든 추가의 치료학적 제제는 임의의 잠재적 독성. 가능한 부작용 및 임의의 다른 관련 인자를 고려하여, 각각 특정 조성물 또는 치료요법에 대해 양호한 임상 관행에 따라 대상체에게 투여된다.
[0086] 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 면역치료요법, 방사선 치료요법, 수술 (예를 들어, 종양의 수술 절제), 화학치료요법, 골수 이식 또는 이전의 조합일 수 있다. 추가의 치료요법은 표적화된 치료요법일 수 있다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 1차 치료 전 (즉, 보조제 치료요법으로서) 투여된다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 1차 치료 후 (즉, 신규보조제 치료요법으로서) 투여된다.
[0087] 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 면역치료요법을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역치료요법은 면역 관문 억제제를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 관문 억제제는 프로그램화된 세포사 경로 1 (PD-1/CD279) 및 이의 리간드(PD-L1/CD274 및 PD-L2/CD273), 세포독성 T 림프구-관련 항원 4 (CTLA-4/CD152), 림프구-활성화 유전자 3 (LAG-3/CD223), B 및 T 림프구 약독화인자 (BTLA), Ig 및 면역수용체 티로신-기반 억제성 모티프 (ITIM) 도메인 (TIGIT)을 갖는 T 세포 면역수용체, T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 (TIM-3/HAVcr2), 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR/CD158), T 세포 활성화의 V-도메인 면역글로불린 서프레서(VISTA), 및 아데노신 A2a 수용체 (A2aR)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역 관문 단백질을 억제한다. 일부 양상에서, 면역치료요법은 4-1BB 효능제이다. 예시적인 4-1BB 효능제는 4-1BB 효능제 항체 (예를 들어, 우토밀루맙), 재조합 4-1BB (가용성, 매트릭스-결합된, 스캐폴드 결합된 형태), 및 4-1BB 압타머를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[0088] 특정 구현예에서, 면역 관문 억제제는 PD-1 결합 길항제이다. 특정 구현예에서, 상기 PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체이다. 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 CT-011로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 면역어드헤신　(예를 들어,　면역글로불린 불변 영역 (예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역어드헤신)이다.
[0089] 특정 구현예에서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4 결합 길항제이다. 특정 구현예에서, 상기 CTLA-4 결합 길항제는 항-CTLA-4 항체이다. 특정 구현예에서, 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙 및 트레멜리무맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[0090] 특정 구현예에서, 추가의 치료학적 제제는 방사선치료요법을 사용한 치료를 포함한다. 특정 구현예에서, 방사선치료요법은 감마선 (γ-선), X-선, 마이크로파, 양성자 빔 조사, 자외선 조사 및 방사능동위원소의 종양으로의 지시된 전달로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 방사선치료요법은 X-선을 사용한 치료를 포함한다. 특정 구현예에서, X-선은 3 내지 4주의 기간 동안 50 내지 200 뢴트겐의 하루 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, X-선은 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 용량으로 투여된다.　 특정 구현예에서, 방사선치료요법은 방사능동위원소의 종양으로의 지시된 전달을 포함한다. 방사능동위원소에 대한 용량 범위는 동위원소의 반감기, 방출된 조사 강도 및 유형 및 종양 세포에 의한 흡수 정도에 의존하여 광범위하게 다양하지만 적당한 치료학적 유효량의 결정은 당업계 기술 수준내에 있다.
[0091] 특정 구현예에서, 추가의 치료학적 제제는 1차 치료와 연관된 부작용 (예를 들어, 구역질. 악액질 등)의 치료를 위한 제제의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 면역치료요법을 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 방사선 치료요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 방사선치료요법은 감마 조사를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 수술을 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 방사선 치료요법 및 수술의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 알킬화제, 안트라사이클린, 세포골격 붕괴제, 에포틸론, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제, 키나제 억제제, 뉴클레오타이드 유사체 및 뉴클레오타이드 전구체 유사체, 펩타이드 항생제, 백금계 화합물, 레티노이드, 빈카 알칼로이드 및 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화학치료학적 제제 부류를 사용한 치료를 포함한다.
[0092] 본원에서 고려되는 추가의 치료요법은 본원에 제공된 조성물의 투여 전, 투여 후 또는 투여와 동시에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 본원에 제공된 조성물 전에 투여된다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 본원에 제공된 조성물 후에 투여된다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 본원에 제공된 조성물의 투여 전 또는 후에 하나 이상의 간격으로 투여된다. 치료받는 대상체가 조합 치료요법으로 부터 혜택을 받을 수 있도록 추가의 치료요법의 투여를 위한 적당한 간격의 결정은 당업자의 기술 수준 내에 있다.
B. 약제학적 조성물　
[0093] 또 다른 양상에서, 본원에서 TRM 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형이 제공된다.
[0094] 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물 및 제형은 수용액 형태. 예를 들어, 생리 식염수(예를 들어. 0/9%) 및 사람 혈청 알부민 (예를 들어, 10%)의 형태로, 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분 (예를 들어, 항체 또는 폴리펩타이드)을 혼합함에 의해 제조할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012). 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 겔라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이팅 제제, 예를 들어, EDTA; 슈가, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 역이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, 아연- 단백질 착물); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG).
III. 키트
[0095] 일부 구현예에서, 예를 들어, TRM 세포의 생성을 위한 하나 이상의 배지 및 성분들을 포함할 수 있는 키트가 제공된다. 상기 제형은 TRM 세포를 조합하기 위해 적합한 형태로 인자들의 칵테일을 포함할 수 있다. 시약 시스템은 수성 배지 중에 또는 동결건조된 형태로 적절히 포장될 수 있다. 키트 용기의 수단으로는 일반적으로 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기, 또는 성분이 배치될 수 있는 다른 용기 수단, 바람직하게는 적절히 분취될 수 있는 다른 용기 수단 중 하나 이상을 포함한다. 키트 내에 하나 이상의 성분이 존재하는 경우, 상기 키트는 일반적으로 추가의 성분들이 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가의 용기들을 포함할 것이다. 그러나, 성분들을 다양하게 조합하여 하나의 바이알에 포함시킬 수도 있다. 키트의 성분들은 건조 분말로 제공될 수도 있다. 시약 및/또는 성분들이 건조 분말로 제공되는 경우, 상기 분말은 적절한 용매를 첨가하여 재구성될 수 있다. 상기 용매는 또 다른 용기 수단에 제공될 수도 있다. 또한, 상기 키트는 통상적으로 상업적 판매를 위해 긴밀하게 밀폐된 상태로 키트 성분들을 포함하기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기들로는 목적하는 바이알들을 보존하는 사출 성형 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 인쇄형 또는 전자 포맷, 예컨대 디지털 포맷의 사용설명서를 포함할 수도 있다.
IV. 실시예
[0096] 하기의 실시예를 들어 본 발명의 바람직한 구현예를 설명한다. 당업계의 숙련자라면, 하기의 실시예에 기술된 기법들이 본 발명을 잘 수행하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기법들을 대표하는 것이기 때문에, 발명의 수행에 대한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 구현예에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.
실시예 1 - 조직 거주 기억 T 세포의 생성
[0097] 말초 혈액 샘플은 건강한 사람 대상체로부터 수득하였다. 혈액은 FACS를 사용하여 분류하여 나이브 (CD45RA+CCR7+) CD8+ T 세포를 단리하였다. 상기 T 세포는 이어서 대기 산소 (대략 20%) 또는 저산소증 (2% O2) 중에 4일동안 폴리클로날적으로 활성화시켜 “초기 이펙터”를 생성하였다. 초기 이펙터는 이어서 1.25 ng/mL rhTGF-β1의 존재하에 추가로 2일 동안 배양하였다. 세포는 이어서 TRM 연관된 유전자 및 표면 마커의 발현을 위해 수거하고 분석하였다.
[0098] CD69 및 CD103을 포함하는 사람 TRM-연관된 마커를 발현하는 CD69+CD103+ 집단을 유도하는 것으로 밝혀졌다(도 3). TRM-유사 T 세포는 추가로 추가의 유전자의 발현에서의 변화에 대해 분석하였다. 저산소증 대 대기 산소 조건에서 배양된 세포는 TRM 표현형과 연관된 유전자 발현에서의 변화를 갖는 것으로 밝혀졌다(도 2).
[0099] 나이브 CD8+ T-세포는 rhTGF-β1의 첨가 또는 첨가 없이 저산소증에 의해 활성화시켰다. CD69+CD103+ 집단의 빈도는 유동 세포측정에 의해 평가하였다. 저산소증 및 TGF-β1은 상승작용하여 CD69+CD103+ 세포를 유도하는 것으로 관찰되었다(도 4).
[00100] 저산소증 및 TGF-β1 유도된 TRM-표현형 세포는 내인성 TRM에 대해 보고된 것들과 유사한 전사 차이를 보여주는 것으로 밝혀졌다. CD69-CD103-, CD69+CD103-, 및 CD69+CD103+ T-세포는 RNA-서열분석을 통한 전사체 분석을 위한 RNA의 단리 전 생성하고 분류하였다(n = 3). 도 9a는 내인성 사람 TRM의 전사체 분석에서 통상적으로 보고된 선택된 유전자의 발현을 보여주는 히트맵을 보여준다. 도 9b는 사람 폐 및 CD69+CD103+ 저산소증으로부터의 CD8+CD69+ 대 CD8+CD69- T 세포에서 및 정상 세포 배양 조건 (TGF-β1 부재하에 20% O2)으로부터 TGF-β1 시험관내 유도된 TRM (i-TRM) 대 CD69-CD103- 세포에서 전사 차이 (로그2FC)를 비교하는 히트맵을 보여준다. |log2FC| ≥ 1 및 FDR < 0.05에 의해 결정된 차등적 발현.
[00101] 본원의 연구는 저산소증 및 TGF-β1이 상승작용하여 사람 TRM-연관된 마커를 발현하고 내인성 사람 TRM의 것과 유사한 전사 프로필을 갖는 CD8+CD69+CD103+ 세포 집단을 유도한다. 상기 연구는 생체내 TRM 분화에 대한 또 다른 가능한 단서를 밝히고, 상기 특유의 세포 유형을 사용한 입양 세포 치료요법의 개발을 가능하게 하는 항원-특이적 TRM-유사 세포를 생성하기 위한 시험관내 방법을 위한 기반을 제공한다. 따라서, 본원의 방법을 사용하여 TRM 표현형을 갖는 세포를 생성할 수 있다.
실시예 2 - 재료 및 방법
[00102] 세포 단리 및 시험관내 세포 배양: 건강한 공여자 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 백혈구성분채집술에 의해 수거하였고 사용때까지 액체 질소에 저장하였다. 모든 인간 샘플 수거는 사전 동의하게 수행되었고 기관(institutional review board (IRB) of UT MD Anderson Cancer Center)에 의해 승인되었다. CD8+ T 세포는 StemCell EasySepTM 키트를 사용하여 건강한 공여자 PBMC로부터 집적하였다. 세포는 이어서 CD8, CD45RA, 및 CCR7에 대해 형광단-접합된 항체로 염색하였다. 나이브 CD8+CD45RA+CCR7+ 세포는 FACSAriaTM III 또는 융합 세포 분류기(BD Biosciences)를 사용하여 분류하였다. 분류된 나이브 세포는 10 IU/ml IL-2 (Prometheus)을 갖는 세포 배양 배지 (10% FBS, L-글루타민, 및 페니실린-스트렙토마이신을 갖는 RPMI)에 재현탁시키고, 저산소 챔버 (Coy Laboratory Products) 중에 2% 산소 또는 표준 세포 배양 항온처리기(Thermo Fisher)에서 대기 산소(대략 20%)로 밤새 평형화시켰다. 평형화 후, 세포는 4일동안 항-CD3/항-CD28 비드(Dynabeads®, Gibco)로 활성화시켰다. 4일째에, 1.25 ng/ml의 재조합 사람 TGF-b1 (Biolegend)를 첨가하고 세포는 추가로 2일 동안 배양하였다. 자가 펩타이드 펄싱된 수지상 세포를 사용한 자극 또는 TCR 형질도입에 이어서 사량체-기반 분류에 의해 생성된 항원-특이적 CD8+ T 세포는 통상적인 신속한 확장 프로토콜 (REP) 또는 TRM 변형 REP를 사용하여 확장시켰다. 사량체-양성 세포는 i) 통상적인 REP의 경우에 20% 산소 및 IL-2 (50 Iu/ml)이 보충된 것 또는 ii) TRM 표현형을 유도하기 위해 변형된 REP의 경우에 2% 산소, 및 IL-15 (10 ng/ml) 및 rhTGF-b1 (1.25 ng/ml, 4일째 개시하여)이 보충된 것에서 피더 세포로서 30ng/mL의 항-CD3(OKT3) 및 200x 방사선 조사된 동종이계 PBMC 및 LCL을 사용하여 10 내지 14일 동안 확장시켰다.
[00103] 유동 세포측정: 사람 TRM-연관된 마커의 분석을 위해, 비드는 세포로부터 제거하고 세포는 염색 완충액 중에 1회 세척하고, 생/사 고정할 수 있는 Aqua (Life Technologies) 및 CD8, CD69, CD103, PD-1, CD101, CXCR6, 및 CD49a (모두 Biolegend)에 대한 형광단-접합된 항체로 염색하였다. 염색 후 세포는 4% 파라포름알데하이드 고정 완충액 (Biolegend) 중에 고정시키고, 세척하고 분석때까지 염색 완충액 중에 저장하였다. 염색된 세포는 ACEA Novocyte® 3000 유동 세포측정기를 사용하여 분석하였다. 단일 형광단-염색된 보상 비드(UltraCompTM, eBioscience) 및 형광성 마이너스 원(fluorescence minus one) (FMO) 샘플은 대조군으로서 사용하였다. 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
[00104] 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR 또는 qPCR): 사람 TRM-연관된 유전자 발현의 분석을 위해, 비드를 세포로부터 제거하고 세포는 PBS 중에서 1회 세척하였다. RNA는 제조업자의 지침에 따라 Qiagen RNeasy® 플러스 소형 키트를 사용하여 단리하였다. 필요한 경우, RNA는 제조업자의 지침에 따라 정제하고/하거나 Qiagen RNeasy® MinElute 클린업 키트를 사용하여 추가로 정제하고/하거나 농축시켰다. 제1 가닥 cDNA는 M-MLV 역전사 효소 (Thermo Fisher)를 사용하여 합성하였다. 정량적 실시간 PCR은 QuantStudio® 5 실시간 PCR 시스템 및 PowerUpTM SYBR® 그린 마스터 믹스(Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific)를 사용하여 수행하였다. 상대적 mRNA 유전자 발현은 하우스키핑 유전자 RPL13A로 정규화하였다. 사용된 프라이머는 하기의 표에 열거한다.
[00105] [표 2]
Figure pct00002
Figure pct00003
[00106] RNA-서열분석 전사체 분석: 세포는 Qiagen RNeasy® 플러스 소형 키트에 이어서 Qiagen RNeasy® MinElute 클린업 키트를 사용한 RNA 단리 전 FACSAriaTM Illu 세포 분류기 (BD Biosciences)를 사용하여 분류하였다. 라이브러리는 Illumina TruSeq 가닥 mRNA 키트를 사용하여 작제하였다. RNA 서열분석은 Illumina NextSeq®500 플랫폼을 사용하여 수행하였다. 미가공 판독값은 HISAT2 (버젼 2.1.0)에 의해 호모 사이언스(Homo sapiens) 참조 게놈 및 전사체(GRCh38, GENCODEV23)에 맵핑하였다. Htseq-카운트 (버젼: 2.1.0)를 사용하여 유전자에 대한 카운트를 수득하였다. R 및 바이오컨덕터 팩키지 DESeq2 (버젼 1.14.1)를 사용하여 차등적으로 발현되는 유전자를 동정하였다. FDR < 0.05 및 |배수-변화| > 2를 갖는 유전자들 (단독의 mRNA, p-값 조정을 위해 단백질-암호화 유전자를 취득하여)은 차등적으로 발현되는 것으로 간주된다. R 및 바이오컨덕터 팩키지 fgsea (버젼 1.10.0)를 사용하여 최우선 한정된 세트의 유전자가 2개의 생물학적 상태 (예를 들어, 표현형)간의 통계학적으로 유의적인 일치된 차이를 보이는지를 결정하였다. 유전자 세트는 여러 이전에 공개된 T 세포 시그니처로부터 유래하였다. TRM 시그니처는 여러 연구로부터 작제하였다. 폐 TRM 및 유방암 TIL 시그니처는 각각 유전자 발현 옴니버스 (GEO), GSE61397 및 GSE110938로부터 다운로드하였다. 0.05 미만의 거짓-발견률 (FDR) 조정된 p-값은 유의적 또는 “참”으로 간주되었다.
[00107] 유의적으로 차등적으로 발현된 유전자 (FDR < 0.05 및 |배수-변화| > 2)의 기능성 분석은 코어 분석에서 참조 세트 및 우측-테일드 피셔 정확도 시험으로서 인게니티 지식 염기에서 모든 유전자를 사용한 Ingenuity® 경로 분석 (IPA) 소프트웨어 (버젼 48207413, Qiagen)과 함께 수행하여 경로가 조건 (로그10[p 값] > 1.3) 간에 유의적으로 변경되었는지를 결정하였다.
[00108] 통계학적 분석: 데이터의 그래프 제공 및 통계학적 분석은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) (버젼 7, 그래프패드 소프트웨어, San Diego, Ca)을 사용하여 수행하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 나타낸다. 실험 그룹 간의 결과는 도면 범례에 기재된 통계학적 시험 (항상 ANOVA에 이어서 터키 다중 비교 시험)을 사용하여 비교하였다. p < 0.05는 통계학적으로 유의적인 것으로 간주되었다.
실시예 3 - 저산소증은 사람 조직 거주 기억 T-세포 분화를 위한 실험 단서로서 작용한다
[00109] 저산소증 및 TGF-β1에서 분화된 사람 CD8 + T-세포는 T RM -유사 표현형을 획득한다. 염증 조직에서 상대적 저산소증을 고려하면, 저산소 긴장이 TRM 분화에 대한 추가의 단서를 제공할 수 있는 것으로 추정되었다. 저산소증이 TRM 표현형의 유도에 기여할 수 있는지를 결정하기 위해, 나이브 (CD45RA+ CCR7+) CD8+ T-세포는 사람 말초 혈액으로부터 분류하고, 이들을 저산소증 (2% O2) 또는 정상 세포 배양 조건(대기 산소, 대략적으로 20% O2)에서 4일동안 활성화시켜 “초기 이펙터”를 생성하고 이어서 추가로 rhTGF-β1의 존재하에 2일동안 배양하였다.
[00110] 정량적 실시간 PCR (qPCR)을 사용하여 TRM 전사 프로필과 연관된 유전자 패널의 발현을 위해 벌크 집단을 평가하였다. 2% O2 + TGF-β1에서 분화된 세포는 사람 TRM, 즉 CD69, ITGAE (CD103), PDCD1 (PD-1), CD101, 및 CXCR6의 코어 전사 시그니처로서 문헌 (참조: Kumar et al. 2017)(본원에서 참조로 인용된)에 의해 동정된 유전자들의 대부분의 상향조절을 보여주었다(도 2a). 현저하게, 어떠한 차이도 TGA1 (CD49a)의 전사체 수준에서 관찰되지 않았다. 추가로, T-세포 재순환에 중요한 유전자들(S1PR1, KLF2, SELL (CD62L))의 전사체는 하향조절되었고 이는 추가로 거주 기억 표현형을 시사한다(도 2b). 마우스 모델에서 이전의 보고는 S1PR1 및 KLF2의 하향조절이 TRM 분화에 중요하고 이들 유전자의 감소된 수준이 또한 내인성 사람 TRM에서 관찰됨을 입증하였다. 전사 인자 에오메스(Eomes)에 대한 전사체는 급격히 감소하였다(도 2c). 마우스에서 연구는 에오메스 (Eomes)의 소멸이 TGF-β1 반응성 및 TRM 확립을 위해 필요함을 입증하였다.. IRF4 및 RUNX3은 상향조절되었다. TRM에서 IRF4의 특정 역할은 규명되지 않았지만 이의 상향조절은 사람 TRM에서 보고되었다. 전사 인자 RUNX3는 최근에 TRM 분화의 주요 조절인자로서 동정되었다. 최종적으로, 이펙터 분자 TNF-a 및 그랜자임 b를 암호화하는 전사체의 상승된 수준이 관찰되었고 이는 사람 폐 TRM 에서 보고된 발견과 유사하다(도 2d). 표준 저산소증 반응 유전자 SLC2A1 (Glut-1) 및 VEGF 의 상승된 발현은 세포가 저산소증 조건에 반응함을 확인하였다(도 1e). 총체적으로, 이들 결과는 TGF-β1과 조합하여 저산소증에서 분화된 경우, 이들은 조직 거주 기억-유사 전사 프로필을 획득함을 지적한다.
[00111] 마커의 단백질-수준 발현을 평가하기 위한 유동 세포측정 분석은 사람 TRM의 코어 시그니처인 것으로 고려되었다. 시험된 모든 건강한 공여자에서는 20% O2 + TGF-β1와 비교하여 2% O2 + TGF-β1 조건에서 CD69+CD103+ 세포에서 증가하였다(도 2a). 세포 생존능은 20% O2 + TGF-β1 세포에 비해 2% O2 + TGF-β1 세포에서 상응하거나 양호하였다(도 7b). 이들 CD69+CD103+ 세포는 PD-1, CD101, 및 CD49a을 발현하였다 (도 3b). 현저하게, CXCR6 표면 단백질 발현은 전사 상향조절에도 불구하고 관찰되지 않았다. CD69 및 CD103 둘다의 발현은 현재 TRM을 한정하기 위해 통상적으로 사용되지만, 이들 표면 마커 중 어느 것이 TRM을 동정하는데 사용하기에 최상인지에 관한 논란이 여전히 있고, 이는 부분적으로 내인성 거주 기억 세포에서 CD69 및 CD103의 이종성 발현으로 인한 것이다. 따라서, TRM-연관된 마커 PD-1, CD101, 및 CD49a의 발현 수준은 2% O2 + TGF-β1 조건으로부터 CD69-CD103+, CD69+CD103+, 및 CD69+CD103- 집단 중에서 비교하였다. 예상된 바와 같이, CD69+CD103+ 집단은 PD-1 및 CD101 표면 발현의 최고 수준을 가졌다(도 3c). CD49a의 발현은 또한 높지만 CD69+CD103- 집단에서 관찰된 발현 수준과 균등하였다. 상이한 산소 조건을 비교하는데 있어서, 집단 배수 변화에서 대부분의 급격한 증가는 CD69+CD103+ 집단에 있는 것으로 밝혀졌다(도 7c, 7d). 이들 결과를 기준으로, CD69+CD103+ 집단에 대한 추가의 분석에 집중하기 위해 시험관내 유도된 TRM 세포로서 선택되었다.
[00112] 저산소증 및 TGF-β1 노출은 T RM 표현형 획득을 위한 상승작용 신호이다: 정상 조직 배양 조건에서 대기 산소 수준은 생체내 T 세포에 의해 경험되는 것 보다 높기 때문에, T-세포가 순환계 중에 노출되는 생리학적으로 관련된, 비-저산소 수준인 10% O2의 효과를 평가하였다. 20% O2 + TGF-β1과 비교하여 10% O2 + TGF-β1에서 CD69+CD103+ T-세포가 약간 증가하였지만, 다중 비교를 위한 보정은 TRM 시그니처 유전자의 발현에서 2개의 조건간에 유의적 차이가 없음을 밝혔다(도 8a-e). 추가로, CD69+CD103+ 집단의 배수-증가(20% O2 + TGF-β1에 비해)는 10% O2 + TGF-β1에 비해 2% O2 + TGF-β1 조건에서 상당히 컸다(도 8f).
[00113] TRM 표현형 세포의 유도에 대한 저산소증 및 TGF-β1의 개별 기여도를 평가하기 위해, 시험관내 분화 실험은 rhTGF-β1의 첨가 또는 이의 부재하에 2% 또는 20% O2에서 수행되었다. 저산소증은 주로 CD69+ 세포를 유도한 반면 TGF-β1은 CD103+ 세포를 유도하였고, 이는 저산소증 및 TGF-β가 각각 이들 마커의 발현을 구동할 수 있다는 공개된 보고와 일치한다. 저산소증 또는 TGF-β1 단독이 CD69+CD103+ 세포의 온건한 집단을 유도하였지만, 저산소증 및 TGF-β1의 조합은 조합 효과가 단독의 조건의 상가적 효과 보다 현저히 크기 때문에 거주 표현형의 유도에 상승작용하는 것으로 보인다(도 4a). 저산소증 및 TGF-β1에 의해 유도된 CD69+CD103+ 세포는 20% O2 및 2% O2 조건에서 다수의 집단 (각각 CD69-CD103- 및 CD69+CD103-)과 비교하여 고수준의 TRM 마커 PD-1, CD101, 및 CD49a를 발현하였다(도 4b).
[00114] 시험관내 유도된 T RM 은 내인성 사람 T RM 유전자 시그니처에 대한 집적을 보여준다: CD69-CD103- (20% O2), CD69+CD103- (2% O2) 및 CD69+CD103+ (2% O2 + TGF-β1) 세포 중에서 TRM 마커 발현에서의 차이는 이들이 특유의 집단을 나타냄을 시사하기 때문에, 각각의 표현형은 분류되었고 이들의 전사 프로필은 RNA 서열분석을 통해 분석되었다. 주요 성분 분석(PCA)은 이들 3개의 집단이 서로 구분됨을 확인하였다(도 5a). 비지도 계층적 클러스터링은 CD69-CD103- 및 CD69+CD103+ 세포에 대해 특유한 유전자 시그니처를 보여준 반면, CD69+CD103- 세포는 어느정도 중간정도의 전사 프로필을 가졌다(도 5b, 5c). CD69+CD103+와 CD69-CD103- 세포 간에 상위 차등적으로 발현된 유전자들의 비교는 유전자 발현 패턴을 밝혔고, 이는 내인성 사람 TRM에 대해 보고된 것들과 일치하였고, 이는 ITGAE, EGR2, GNLY, BMF, RASGEF1B, 및 NR4A1의 증가된 발현 및 SELL, KLF2, 및 KLF3의 감소된 발현을 포함하고 이들은 비-재순환 전사 프로그램을 지적한다(도 5b, 5c). KLF2-표적 유전자인 S1PR1은 또한 하향조절되었지만 배수 변화를 위한 역치를 총족하지 못하였다. CD69+CD103+ 세포는 ITGA1, PDCD1, CD101, 및 TNFRSF9의 증가된 발현을 입증하였고 이들 모두는 내인성 사람 TRM에서 상향조절되는 것으로 일관되게 보고된다. 전사 인자 NOTCH1의 상승된 수준이 관찰되었고, 이는 노치(Notch) 신호전달에 중추 역할을 하는 RBPJ뿐만 아니라 생체내 내인성 폐 TRM의 유지에 기여하는 것으로 공지되어 있다(도 5c).
[00115] 내인성 TRM은 흔히 가능하게는 다른 면역 세포를 국소 조직으로 동원하는데 이들의 ‘알람 기능’의 일부로서 다양한 케모킨을 발현한다. 내인성 TRM의 케모킨 프로필과 일치하여, 상기 연구에서 시험관내 유도된 CD69+CD103+ 세포는 CCL4, CCL5, 및 CCL22 뿐만 아니라 CXCL13 and CCL20을 상향조절하였다(도 5c). 규명되지 않은 역할을 하지만 일관되게 내인성 사람 TRM에서 보고되는 유전자의 발현에서의 변화, 예를 들어, MYO7A 및 RGS1의 상향조절 및 SERPINE2, RAP1GAP2, RASGRP2, 및 FAM65B의 하향조절이 또한 관찰되었다.
[00116] 밝혀진 결과의 생리학적 관련성을 통찰하기 위해, 유전자 세트 집적 분석(GSEA)은 동일한 조직 부위 내 말초 혈액 또는 CD103- T-세포로부터의 CD103- 이펙터 기억 세포와 비교하여 내인성 사람 CD103+ TRM에 대한 공개된 분석으로부터의 유전자 시그니처를 사용하여 수행하였다. 상기 결과는 CD69-CD103- 세포와 비교하여 CD69+CD103+ 세포의 전사 프로필이 혈액 TEM 및 국소 CD103- T-세포와 비교하여 TRM의 시그니처와 유사한 반면 CD69+CD103-와 비교하여 CD69+CD103+ 세포는 단지 동일한 조직 내 CD103- T-세포에 비해 TRM의 시그니처와 유사함을 밝혔다(도 5d). 이들 결과는 국소 조직에 비해 순환계에서 산소 긴장에서 차이의 정도를 반영한다. 동일한 종양 내 TIL은 또한 순환계 중의 것들과 비교하여 조직에서 T 세포 보다 유사한 산소 수준을 경험하고, 다양한 고체 종양 유형에서 TIL의 다중 최근 프로필은 CD103+ 거주 기억 유사 TIL (TILRM)의 존재를 보고하였다. 따라서, 저산소증 + TGF-β1에서 유도된 CD69+CD103+ 세포는 단독의 저산소증에서 유도된 CD69+CD103- 세포와 비교하였고 CD8+CD69+CD103- 유방암 TIL에 비해 CD8+CD69+CD103+에 대해 보고된 유전자 시그니처가 집적되는 것으로 관찰되었다 (도 5e, 5f). 저산소증 및 TGF-β는 종양 미세환경의 통상의 구성임으로, 상기 결과는 이들 조건이 생체내 CD103+ TIL의 생성에 기여할 수 있음을 지적한다.
[00117] CD69+CD103+ 세포와 CD69-CD103- 세포를 비교하는 인게니티 경로 분석(Ingenuity Pathway Analysis) (IPA)은 많은 차등적으로 발현된 유전자가 해당과정, 이화과정 및 TGF-β 신호전달 경로의 성분임을 밝혔다(도 6a). 세포가 저산소증 및 TGF-β에 노출되고 저산소증이 세포 대사의 주요 조절인자인 것임을 고려하면, 이들 결과가 예상되었다. 또한 내인성 사람 폐 TRM에서 보고된, 노치 신호전달 경로에서 유전자가 집적되었다(도 6a). 이들 발견은 TRM 분화에서 대사의 역할에 관한 의문을 제기한다. 문헌(Hombrink et al.)은 폐 TRM에서 노치 신호전달의 주요 역할이, 노치 신호전달의 화학적 억제가 해당과정, 산화 인산화 및 지방산 대사 경로에 관여하는 유전자들에 영향을 미침으로써 대사 프로그램의 조절임을 시사하였다. 또한 저산소증과 같이 호기성 해당과정의 공지된 조절제인 푸린성 수용체 P2RX7의 결실이, P2RX7 결핍 세포가 감소된 미토콘드리아 질량 및 기능, 결손 호기성 해당과정 및 손상된 글루코스 취득을 나타냄으로, 대사의 탈조절을 통해 TRM 형성을 손상시키는 것으로 시사되었다.
[00118] 백혈구 혈관외유출 신호전달, 상피 어드헤렌스 연결 신호전달, 인테그린 신호전달 및 팍실린 신호전달에 관여하는 차등적으로 발현된 유전자들의 집적이 관찰되었고, 이들 모두는 집중적 접착 신호전달에 관여하고 이동 프로그래밍에서의 변화를 시사한다(도 6b). 이노시톨 포스페이트 신호전달에 관여하는 다중 경로, 즉 3-포스포이노시티드 생합성, 이노시톨 포스페이트 화합물의 슈퍼경로, D-미오-이노시톨 (1,4,5,6)-테트라키스포스페이트 생합성, 및 D-미오-이노시톨 (3,4,5,6)-테트라키스포스페이트 생합성이 또한 집적되고, 이는 PI(3)K (포스파티딜이노시톨-3-OH 키나제) 신호전달이 KLF2의 사이토킨-유도된 하향조절에 관여하고 생체내 TRM 생성에서 역할을 수행할 수 있다는 이전의 보고와 일치한다.
[00119] 저산소증 + TGF-β 유도된 TRM 전사 프로필 경로의 기능적 관련성을 보다 양호하게 이해하기 위해, 문헌(참조: Kumar et al.)에 의해 공개된 전사 데이터에 대한 분석을 수행하였고 Th1 및 Th2 활성화 및 과립구 접착 및 혈구누출 경로에서의 변화가 이들의 내인성 폐 TRM 및 시험관내 유도된 TRM에 통상적인 것으로 밝혀졌다. 현저하게, 신경돌기 가이드 경로는 또한 데이터 세트 모두에서 고도로 유의적으로 차등적으로 조절되었다. 신경돌기 가이드는 먼저 겉보기에 거주 기억 T-세포와는 관련이 없고 현재 TRM 문헌에서는 보고되지 않았지만, 이는 환경적 신호가 세포의 이동 패턴에 영향을 미치는 프로세스이다. 신경돌기 가이드를 지배하는 많은 동일한 인자들은 또한 면역 세포 트래픽킹을 조절하는 것으로 공지되어 있고 저산소증 및/또는 TGF-β에 의해 조절될 수 있다.
[00120] 추가의 연구를 수행하여 TGFB1과 조합된 HIF 프롤릴 하이드록실라제 억제제 FG-4592 (Roxadustat)의 효과를 평가하였다. 말초 혈액으로부터 단리된 나이브 CD8+ T-세포는 HIF 프롤릴 하이드록실라제 억제제 FG-4592 (Roxadustat)의 존재하에 4일 동안 및 이어서 추가로 rhTGF-β1과 함께 추가로 2일 동안 20% O2 (AtmosO2)에서 활성화시켰다. 4일째에 rhTGF-β1의 첨가와 함께 2% O2 (저산소증)에서 활성화된 세포는 도 10a에서 비교용으로 나타낸다. 상기 조합은 CD69+CD103+ 세포를 유도하는 것으로 관찰되었다(도 10a).
[00121] 이어서, 나이브 CD8+ T-세포는 4일째 rhTGF-β1의 첨가와 함께 20% O2 (AtmosO2) 또는 2% O2에서 7일 동안 MART-1(M27) 펩타이드로 펄싱된 자가 단핵구-유래된 수지상 세포로 자극하여 유동 세포측정에 의해 검출된 CD69+CD103+ 항원-특이적 (사량체+) T-세포를 생성하였다(도 10b). 저산소증 및 rhTGF-β1은 변형된 신속한 확장 프로토콜에 사용하여 항원-특이적 T 세포에서 TRM 표현형을 유도하였다.　 항원-특이적 T-세포는 자가 MART-1 펩타이드-펄싱된 수지상 세포 (ETC)를 사용한 자극 또는 gp100-특이적 TCR (TCRT)의 형질도입을 통해 생성하였고, 형광단-접합된 사량체로 표지시키고 분류하였다. 분류된 항원-특이적 T 세포는 이어서 항-CD3 (OKT3)으로 자극하고 IL-2 (통상적인 REP)가 보충된 20% O2에서 또는 IL-15가 보충된 2% O2에서 방사선 조사된 피더 세포로 자극하고 4일 연속으로 rhTGF-β1을 첨가하였다. 따라서, 또한 변형된 신속 확장 프로토콜이 항원-특이적 T 세포에서 TRM 표현형을 유도하는 것으로 나타났다(도 10c).
[00122] 따라서, 본원의 연구는 사람 말초 혈액 유래 T 세포로부터 시험 관내 TRM 표현형을 나타내고 TRM 분화를 위한 잠재적인 신호로서 저산소증을 확인했다. 사람에서 수행할 수 있는 실험으로 명백한 제한이 있지만, 기재된 연구는 저산소증이 TRM 표현형의 획득에 기여할 수 있는 환경 신호라는 강력한 증거를 제공하며, 저산소증 + TGF-β 유도된 TRM이 내인성 TRM의 전사 및 프로테오믹 환경과 이동 및 대사와 관련된 경로를 나타낸다는 관찰에 의해 지지된다.
* * *
[00123] 본원에 개시되고 청구된 모든 방법들은 본 명세서의 내용을 고려하여 과도한 실험없이 만들어 수행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 당업계의 개념, 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본원에 기술된 방법들, 상기 방법의 단계들 또는 상기 방법 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당업계의 숙련자들에게는 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 제제의 경우 이들을 사용하여도 동일하거나 유사한 결과가 달성된다면 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음도 명백할 것이다. 당업계의 숙련자들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌들은, 본원에 기술된 내용에 대하여 예시적인 절차이거나 이를 보충하는 기타 상세한 설명을 제공하는 정도로, 본원에 참고로서 상세하게 포함된다.
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SEQUENCE LISTING <110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> METHODS FOR PRODUCTION OF TISSUE RESIDENT MEMORY-LIKE T CELLS AND USE THEREOF <130> UTFC.P1408WO <150> US 62/747,523 <151> 2018-10-18 <150> US 62/846,270 <151> 2019-05-10 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 1 attgtccagg ccaatacaca tt 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 2 cctctctacc tgcgtatcgt ttt 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 3 agccatgcaa cacgtcttag a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 4 tcctcgaata tgccaccatc g 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 5 ctggacatag tcatagtgct gga 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 6 acctgtgtct gtttaggacc a 21 <210> 7 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24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 24 cctcgaccgc ctcttcttc 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 25 cccgtaccaa tgtcccatga 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 26 cctgtcacct ggcaaccatt t 21 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 27 agcaccacaa gccacttcag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 28 gggaaggagc ggtcaaactg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 29 caagctgtcc tgtgtgggca 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 30 cgctcaaagt tgcgtgcctg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 31 atggaacgat gacgcctgcc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 32 ggcctccaaa ggctcacact 20 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 33 tggaaagagg agagtgacag aaa 23 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 34 tccttgatgg tctccacact c 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 35 ggcgctcccc aagaagacag 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 36 caggcttgtc actcggggtt 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 37 caaccaatcc tgcttctgct 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 38 ccgcacctct tcagagactt 20 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 39 tggacacggg actctacatc t 21 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 40 ggcacggttc tggatcaatt aca 23 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 41 tctggcatca acgctgtctt c 21 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 42 cgataccgga gccaatggt 19 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 43 aaatgctttc tccgctctga 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 44 cccactgagg agtccaacat 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 45 cctcaaggtc gtgcgtctga 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 46 tccacgttct tctcggcctg 20

Claims (124)

  1. 조직 거주 기억-유사 T 세포(TRM-유사 T 세포)를 생성하기 위한 시험관내 방법으로서, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는 시험관내 방법:
    (a) T 세포의 출발 집단을 수득하는 단계;
    (b) 저산소증-유도제의 존재하에 저산소 조건에서 상기 T 세포의 출발 집단을 배양하여 초기 이펙터 세포를 생성하는 단계; 및
    (c) 형질전환 성장 인자 베타 1 (TGF-β1)의 존재하에 상기 초기 이펙터 세포를 추가로 배양하여 TRM-유사 T 세포를 생성하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 출발 집단의 T 세포가 CD8+ 말초 혈액 T 세포인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 CD8+ 말초 혈액 T 세포가 사람 CD8+ 말초 혈액 T 세포인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 사람 CD8+ 말초 혈액 T 세포를 수득하는 단계가 말초 혈액 샘플로부터 CD45RA+CCR7+CD8+ 나이브 T 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 말초 혈액 샘플이 건강한 대상체로부터 수득되는, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 말초 혈액 샘플이 암을 앓는 것으로 진단되거나 암을 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체로부터 수득되는, 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 말초 혈액 샘플이 바이러스 질환을 앓는 것으로 진단되거나 바이러스 질환을 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체로부터 수득되는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 출발 집단의 T 세포가 배양 전에 펩타이드, 전장 항원 또는 세포 용해물로 펄싱된 항원 제공 세포에 의해 자극되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 T 세포가 종양 부위로부터 수득되거나 종양 침윤 림프구인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 T 세포가 나이브 T 세포인, 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 세포 용해물이 종양 용해물인, 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 항원이 암 항원 또는 바이러스 항원인, 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 펩타이드가 암 세포에서 차등적으로 발현되거나 암 세포에 의해 고도로 발현되는 단백질 기원의 펩타이드인, 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 펩타이드가 신규항원으로부터 또는 돌연변이를 포함하는 단백질로부터 기원하는 펩타이드인, 방법.
  15. 제8항에 있어서, 상기 T 세포의 출발 집단이 관심 대상의 항원에 특이적인 T 세포가 집적된(enriched), 방법.
  16. 제8항에 있어서, 상기 T 세포의 출발 집단이 CD8-양성이고, 펩타이드 MHC 사량체-양성인 세포가 집적되도록 정제된, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 T 세포의 출발 집단이 형광성 활성화된 세포 분류에 의해 정제된, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 T 세포의 출발 집단이 가공된 T 세포의 집단인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 가공된 T 세포가 클로닝된 T 세포 수용체 (TCR)를 숙주 세포 집단에 도입하여 생성된, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 숙주 세포가 말초 혈액 단핵 세포인, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 클로닝된 TCR이 비-바이러스 방법에 의해 숙주 세포의 집단으로 도입된, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 클로닝된 TCR이 에피좀 벡터 또는 트랜스포존에 의해 상기 숙주 세포 집단으로 도입된, 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 클로닝된 TCR이 형질도입에 의해 숙주 세포의 집단으로 도입된, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 숙주 세포의 집단이 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄를 포함하는 바이러스 벡터에 의해 형질도입된, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 숙주 세포의 형질도입된 집단이 CD8-양성/펩타이드 MHC 사량체-양성 세포가 집적되도록 정제된, 방법.
  27. 제18항에 있어서, 상기 가공된 T 세포가 키메라 항원 수용체를 발현하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체가 암 항원, 바이러스 항원, 신규항원 또는 돌연변이를 포함하는 단백질 기원의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항원 인지 도메인을 포함하는, 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 출발 집단의 T 세포가 대상체로부터 수득된 종양 침윤 림프구인, 방법.
  30. 제1항에 있어서, 저산소 조건이 5% 미만의 산소로서 추가로 한정된, 방법.
  31. 제1항에 있어서, 저산소 조건이 2%의 산소로서 추가로 한정된, 방법.
  32. 제1항에 있어서, 상기 저산소증-유도제가 저산소증 모방제인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 저산소증-유도제 또는 저산소증 모방제가 염화코발트(CoCl2), 데퍼옥사민 메실레이트 (DFOM), 디메틸옥살리글라이신(DMOG), 또는 프롤릴 하이드록실라제 억제제인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 프롤릴 하이드록실라제 억제제가 2-OG 유사체인, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 프롤릴 하이드록실라제 억제제가 Roxadustat (Fg-4592)인, 방법.
  36. 제1항에 있어서, 단계 (b)의 배양이 TCR 자극 및 동시 자극의 존재하에 수행되는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 TCR 자극 및 동시 자극이 항-CD3 및 항-CD28 항체, 항-CD3 및 항-CD28 비드, 피더(feeder) 세포, 항원 제공 세포, 인공 항원 제공 세포, 펩타이드 및/또는 단백질 항원 또는 이의 조합물을 포함하는, 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 TCR 자극 및 동시 자극이 항-CD3 및 항-CD28 비드를 포함하는, 방법.
  39. 제1항에 있어서, 단계 (b)의 배양이 3 내지 5일 동안인, 방법.
  40. 제1항에 있어서, 단계 (b)의 배양이 4일 동안인, 방법.
  41. 제36항에 있어서, 단계 (c)의 배양이 IL-15의 존재하에 수행되는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 IL-15가 5 내지 20ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 IL-15가 10 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  44. 제1항에 있어서, TGF-β1이 추가로 재조합 사람 TGF-β1 (rhTGF-β1)으로서 한정된, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 rhTGF-β1이 0.1 내지 5ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 rhTGF-β1이 1 내지 1.5ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 rhTGF-β1이 1.25 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  48. 제1항에 있어서, 단계 (c)의 배양이 저산소 조건하에 또는 저산소증-유도제의 존재하에 수행되는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 단계 (c)의 배양이 IL-15의 존재하에 수행되는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 IL-15가 5 내지 20ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  51. 제49항에 있어서, 상기 IL-15가 10 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  52. 제1항에 있어서, 단계 (c)의 배양이 1 내지 3일 동안인, 방법.
  53. 제1항에 있어서, 단계 (c)의 배양이 2일 동안인, 방법.
  54. 제1항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 CD69+CD103+인, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 단계 (c)에서 생성된 세포의 적어도 30%가 CD69+CD103+ 세포인, 방법.
  56. 제54항에 있어서, 단계 (c)에 생성된 세포의 적어도 40%가 CD69+CD103+ 세포인, 방법.
  57. 제1항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 PD-1, CD101, 및/또는 CD49a를 발현하는, 방법.
  58. 제1항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 CD69, ITGAE, PDCD1, 및/또는 CD101의 보다 높은 발현을 갖는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, CD69, ITGAE, PDCD1 및/또는 CD101의 보다 높은 발현이 CD69, ITGAE, PDCD1 및/또는 CD101 mRNA 전사체의 보다 높은 발현인, 방법.
  60. 제58항에 있어서, CD69, ITGAE, PDCD1 및/또는 CD101의 보다 높은 발현이 CD69, ITGAE, PDCD1 및/또는 CD101 단백질의 보다 높은 발현인, 방법.
  61. 제1항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 TNFα, GZMB, SLC2A1, 및/또는 VEGF의 보다 높은 발현을 갖는, 방법.
  62. 제1항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, RGS1, ITGA1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CCL4, CCL5, NOTCH1, RBPJ, STRIP2, ARHGEF40, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3의 보다 높은 발현을 갖는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, 및/또는 RGS1의 보다 높은 발현을 갖는, 방법.
  64. 제62항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 ITGAE, ITGA1, PDC1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CXCL13, CCL20, NOTCH1, RBPJ, NR4A1, EGR2, 및/또는 RGS1의 보다 높은 발현을 갖는, 방법.
  65. 제62항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 MYO7A, STRIP2, ARHGEF40, ITGAE, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CXCL13, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3의 보다 높은 발현을 갖는, 방법.
  66. 제1항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, KLF2, RASGRP2, FAM65B, SERPINE2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, TNFSF8, DUSP2, PLEK, GOLGA2P7, FOSB, PLCG2, SLAMF7, SLC6A8, SOCS3, 및/또는 PTGER2의 보다 낮은 발현을 갖는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 대기 산소 조건하에서 배양된 세포와 비교하여 CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, RASGRP2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, 및/또는 TNFSF8의 보다 낮은 발현을 갖는, 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 KLF2, KLF3, SELL, FAM65B, 및/또는 SERPINE2의 보다 낮은 발현을 갖는, 방법.
  69. 제66항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 대기 산소 조건하에서 배양된 세포와 비교하여 DUSP2, PLEK, GOLGA2P7, FOSB, PLCG2, ITGAM, FOS, KLF3, SLAMF7, TNFSF8, SLC6A8, KLF2, SOCS3, 및/또는 PTGER2의 보다 낮은 발현을 갖는, 방법.
  70. 제1항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 대기 산소 조건하에 배양된 세포와 비교하여 S1PR1, KLF4 및/또는 SELL의 보다 감소된 발현을 갖는, 방법.
  71. 제1항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 CXCR6 단백질을 필수적으로 발현하지 않는, 방법.
  72. 제1항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 항원 특이적인, 방법.
  73. 제1항에 있어서, 항원-특이적 TRM-유사 T 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 항원-특이적 TRM-유사 T 세포를 생성하는 단계가 상기 TRM-유사 T 세포에 항원-특이적 T 세포 수용체(TCR)를 형질도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  75. 제73항에 있어서, 항원-특이적 TRM-유사 T 세포를 생성하는 단계가 단계 (b) 동안에 펩타이드 펄싱된 항원 제공 세포 (APC)와 함께 상기 T 세포의 출발 집단을 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 APC가 성숙한 수지상 세포인, 방법.
  77. 제75항에 있어서, 상기 APC가 인공 APC (aAPC)인, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 단계 (b) 및 (c)가 적어도 1회 반복되는, 방법.
  79. 제73항에 있어서, 항원-특이적 TRM-유사 T 세포를 생성하는 단계가 단계 (b) 및/또는 단계 (c) 동안에 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제의 존재하에 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 HDAC 억제제가 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 보리노스타트 (수버라닐로하이드록삼산 또는 SAHA, Zolinza®로서 시판됨), 벨리노스타트 (PXD101, Beleodaq®로서 시판됨), 파노비노스타트 (Farydaq®로서 시판됨), 다시노스타트 (LAQ824), 엔티노스타트(SNDX-275 또는 MS-275), 타세디날린(CI994), 및 모세티노스타트 (MGCD0103)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  81. TRM-유사 T 세포로서, 상기 T 세포가 CXCR6 단백질을 필수적으로 발현하지 않는, TRM-유사 T 세포.
  82. 제81항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된, TRM-유사 T 세포.
  83. 제81항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 PD-1, CD101, 및/또는 CD49a를 발현하는, TRM-유사 T 세포.
  84. 제81항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 CD69+CD103+인, TRM-유사 T 세포.
  85. 제81항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, RGS1, ITGA1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CCL4, CCL5, NOTCH1, RBPJ, STRIP2, ARHGEF40, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3을 발현하는, TRM-유사 T 세포.
  86. 제81항에 있어서, TRM-유사 T 세포가 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, 및/또는 RGS1을 발현하는, TRM-유사 T 세포.
  87. 제81항에 있어서, TRM-유사 T 세포가 ITGAE, ITGA1, PDCD1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CXCL13, CCL20, NOTCH1, RBPJ, NR4A1, EGR2, 및/또는 RGS1을 발현하는, TRM-유사 T 세포.
  88. 제81항에 있어서, TRM-유사 T 세포가 MYO7A, STRIP2, ARHGEF40, ITGAE, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CXCL13, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3을 발현하는, TRM-유사 T 세포.
  89. 제81항에 있어서, TRM-유사 T 세포가 CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, KLF2, RASGRP2, FAM65B, SERPINE2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, TNFSF8, DUSP2, PLEK, GOLGA2P7, FOSB, PLCG2, SLAMF7, SLC6A8, SOCS3, 및/또는 PTGER2를 발현하지 않거나 필수적으로 발현하지 않는, TRM-유사 T 세포.
  90. 제81항에 있어서, TRM-유사 T 세포가 CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, RASGRP2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, 및/또는 TNFSF8을 발현하지 않거나, 필수적으로 발현하지 않는, TRM-유사 T 세포.
  91. 제81항에 있어서, TRM-유사 T 세포가 KLF2, KLF3, SELL, FAM65B, 및/또는 SERPINE2를 발현하지 않거나 필수적으로 발현하지 않는, TRM-유사 T 세포.
  92. 제81항에 있어서, TRM-유사 T 세포가 DUSP2, PLEK, GOLGA2P7, FOSB, PLCG2, ITGAM, FOS, KLF3, SLAMF7, TNFSF8, SLC6A8, KLF2, SOCS3, 및/또는 PTGER2를 발현하지 않거나 필수적으로 발현하지 않는, TRM-유사 T 세포.
  93. CXCR6 단백질을 필수적으로 발현하지 않는 TRM-유사 T 세포의 집단 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  94. 제93항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는, 조성물.
  95. 제93항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 PD-1, CD101, 및/또는 CD49a를 발현하는, 조성물.
  96. 제93항에 있어서, 상기 세포의 적어도 40%가 CD69+CD103+ 세포인, 조성물.
  97. 제93항에 있어서, TRM-유사 T 세포가 CD69+CD103+ 세포인, 조성물.
  98. 제93항에 있어서, TRM-유사 T 세포가 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, RGS1, ITGA1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CCL4, CCL5, NOTCH1, RBPJ, STRIP2, ARHGEF40, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3을 발현하는, 조성물.
  99. 제93항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 GNLY, MYO7A, ITGAE, EGR2, CCL20, ATP1B1, NR4A3, PERP, RASGEF1B, NR4A1, BMF, EGR1, CXCL13, PDCD1, ITGA1, CCL22, CA10, 및/또는 RGS1을 발현하는, 조성물.
  100. 제93항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 ITGAE, ITGA1, PDC1, CD101, TNFRSF9 (4-1BB), CXCL13, CCL20, NOTCH1, RBPJ, NR4A1, EGR2, 및/또는 RGS1을 발현하는, 조성물.
  101. 제93항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 MYO7A, STRIP2, ARHGEF40, ITGAE, DBH, SRGAP3, CSGALNACT1, GPR25, RGS16, DAPK2, NCS1, COL6A3, GDPD4, SLC1A4, CXCL13, CDK14, LMCD1, ILDR2, 및/또는 ADCY3을 발현하는, 조성물.
  102. 제93항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, KLF2, RASGRP2, FAM65B, SERPINE2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, TNFSF8, DUSP2, PLEK, GOLGA2P7, FOSB, PLCG2, SLAMF7, SLC6A8, SOCS3, 및/또는 PTGER2를 발현하지 않거나 필수적으로 발현하지 않는, 조성물.
  103. 제93항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 CD58, NR3C1, RAP1GAP2, SELP, CXCR2, TBX21, ITGAL, SELL, KLF3, RASGRP2, ITGAM, KLRB1, TGFBR3, SMAD3, 및/또는 TNFSF8을 발현하지 않거나, 필수적으로 발현하지 않는, 조성물.
  104. 제93항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 KLF2, KLF3, SELL, FAM65B, 및/또는 SERPINE2를 발현하지 않거나 필수적으로 발현하지 않는, 조성물.
  105. 제93항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 DUSP2, PLEK, GOLGA2P7, FOSB, PLCG2, ITGAM, FOS, KLF3, SLAMF7, TNFSF8, SLC6A8, KLF2, SOCS3, 및/또는 PTGER2를 발현하지 않거나 필수적으로 발현하지 않는, 조성물.
  106. CXCR6 단백질을 필수적으로 발현하지 않는 유효량의 TRM-유사 T세포를 포함하는, 대상체에서 면역 관련 장애를 치료하기 위한 조성물.
  107. 제106항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는, 조성물.
  108. CXCR6 단백질을 필수적으로 발현하지 않는 유효량의 TRM-유사 T 세포의 용도로서, 대상체에서 면역 관련 장애를 치료하기 위한, 용도.
  109. 제108항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는, 용도.
  110. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 유효량의 TRM-유사 T 세포를 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 면역 관련 장애를 치료하는 방법.
  111. 제110항에 있어서, 상기 면역-관련 장가 암, 자가면역 장애, 이식편 대 숙주 질환, 동종이식 거부 또는 염증성 병태인, 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 대상체가 조직 또는 기관 이식을 받은, 방법.
  113. 제110항에 있어서, 적어도 제2 치료학적 제제를 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
  114. 제113항에 있어서, 상기 적어도 제2 치료학적 제제가 화학치료요법, 면역치료요법, 수술, 방사선치료요법 또는 생물치료요법을 포함하는, 방법.
  115. 제113항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포 및/또는 상기 적어도 제2 치료학적 제제가 정맥내로, 복막내로, 기관내, 종양내, 근육내, 내시경으로, 병변내, 경피적으로, 피하내, 국부적으로, 또는 직접 주사 또는 관류에 의해 투여되는, 방법.
  116. 제113항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 상기 제2 치료학적 제제 전에 투여되는, 방법.
  117. 제113항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 상기 제2 치료학적 제제 후에 투여되는, 방법.
  118. 제113항에 있어서, 상기 TRM-유사 T 세포가 상기 제2 치료학적 제제와 동시에 투여되는, 방법.
  119. 제114항에 있어서, 상기 면역치료요법이 4-1BB 효능제인, 방법.
  120. 제120항에 있어서, 상기 4-1BB 효능제가 4-1BB 항체인, 방법.
  121. 제114항에 있어서, 상기 면역치료요법이 면역 관문 치료요법인, 방법.
  122. 제121항에 있어서, 상기 면역 관문 치료요법이 CTLA-4, PD-1, 또는 PD-L1 차단 또는 억제인, 방법.
  123. 제110항에 있어서, 상기 대상체가 사람인, 방법.
  124. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 유효량의 TRM-유사 T 세포를 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법.
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