MX2010013048A - Filtro giratorio con roscas externas y metodos. - Google Patents

Abstract

Un arreglo de filtro que asegura, en forma roscada, una cabeza de filtro incluye un alojamiento que tiene una pared circundante que define un volumen interior, una entrada abierta que proporciona acceso al volumen interior y un extremo opuesto de la entrada abierta. La pared circundante tiene un exterior y un interior. Una construcción de medios de filtro es mantenida, en forma operativa, dentro del volumen interior. Un manguito, distinto del alojamiento, es asegurado en el exterior de la pared circundante adyacente a la entrada de alojamiento y que se extiende, en forma parcial, a lo largo de la pared circundante. El manguito tiene un exterior y un interior. El exterior del manguito define roscas de montaje construidas y colocadas para su montaje, en forma removible, con la cabeza de filtro, cuando el arreglo de filtro es asegurado en la cabeza de filtro. El interior del manguito se encuentra contra el exterior de la pared circundante. Un primer miembro de sello es orientado contra el manguito para crear un sello con una cabeza de filtro, cuando el arreglo de filtro es asegurado en la cabeza de filtro. Un montaje de filtro incluye un arreglo de filtro y una cabeza de filtro. El arreglo de filtro es asegurado, en forma removible, en la cabeza de filtro a través de una conexión roscada entre el manguito y la cabeza de filtro. Un sistema incluye un motor que utiliza un líquido y un montaje de filtro en comunicación fluida con el motor para filtrar el líquido. Los métodos de elaboración de arreglos de filtro incluyen la utilización de las estructuras caracterizadas con anterioridad.

Description

EPA DE LEVADURA PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS GALACTOSA ALFA-1 ,3-EN LAZADA TERMINAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de biología m particular la invención se refiere a cepas de levadura genéti ñadas que producen N-glucanos con la estructura de azúcar ominante, Gal-a1 ,3-Gal^1 ,4-GlcNAc-R.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Todos los mamíferos, salvo los humanos y algun ates, contienen glucoproteínas que tienen estructuras de ctosil (alfa-gal) glucano terminales que resultan de la activid idas contra el epítope de alfa-1 ,3-galactosa (Galili et al., Bloo 3). Los antígenos que exhiben este epítope son reconocido cuerpos circulantes, resultando en activación del compleme vación eficiente de células que presentan antígeno por medio d iada por el receptor Fcy y la estimulación de una respuesta de tóxicas. Se ha mostrado que el dirigir un complejo inmune haci presentan antigeno, reduce la cantidad de antígeno requerido pa respuesta de las células T.

Las vacunas recombinantes actuales sufren general falta de respuesta inmunógena específica. Además, las vacunas uieren con frecuencia estimuladores inmunes generales conocid uvantes para inducir una respuesta de células T citotoxicas sost demostración limitada, se ha reportado que una vacuna b teínas con N-glucanos que contienen a-1 ,3-galactosa terminal, unogenicidad de dicha molécula (Abdel-Motal et aA, J Virology nces los residuos de NANA in vitro por digestión enzimática par residuos de galactosa P-1 ,4-enlazados, y añadiendo subsiguiente galactosa termina! a través de adición enzimática (véase, Galili E.U.A. 6,361 ,775). Este procedimiento es costoso, problemáti lmente aumenta a escala en proporción. Se han hecho inte ducir epítopes de alfa-gal en proteínas virales tales como la hem virus de la influenza (Henion et ai , Vaccine, 15: 1174-1 82 (199 del-Motal et a/., J. Virology, 80: 6943-6951 (2006)); y e cerosas (Unfer et al., Cáncer Res., 63: 987-993 (2003)).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por consiguiente, un propósito de la presente invenci arrollo de otros sistemas de expresión de proteínas para lev gos filamentosos, tales como Pichia pastoris, con base en v La presente invención puede usarse para mejorar ual de la técnica de vacunas basadas en proteínas. Puede espe vacuna de proteínas glucosiladas producida en las cepas gené ñadas descritas en la presente, induzca una respuesta inmune és de la presentación mejorada del antígeno en comparación una con p-1 ,4-galactosa terminal, ácido siálico terminal o mañosa a tecnología es aplicable a cualquier número de vacunas qu arrollarse como moléculas basadas en proteínas recombinantes.

Los desarrollos recientes permiten la producción péutica completamente humanizada en organismos h arióticos inferiores, levaduras y hongos filamentosos, tales co toris (Gerngross, patente de E.U.A. 7,029,872, cuya descri orpora en la presente como referencia). Los presentes inven arrollado otras modificaciones para producir organismos hospe dan usarse para la producción a escala comercial de vacun rólogos que codifican para enzimas de glucosiiación tales anos que tienen residuos de a-1 ,3-galactosa terminales q entes en la glucoproteína antigénica producida por la célula hosp En modalidades preferidas de la presente invención, e ificar el genoma de células eucarióticas inferiores, tales como le gos filamentosos, por ejemplo, Pichia pastoris. La célula h ariótica inferior transformada resultante es capaz de oproteínas de vacuna antigénicas con residuos de a-1 ,3- inales a una proporción suficientemente alta de N-glucanos, de ejora la antigenicidad/inmunogenicidad de las glucoproteínas d ltantes. La presente invención tiene ventajas adicionales porqu pederas eucarióticas inferiores, tales como Pichia pastoris, son producir glucoproteínas de vacuna a alto rendimiento, en donde l ominante de glucoproteína tiene residuos de a-1 ,3-galactosa t antigenicidad mejorada, en comparación con la producción de la ñada para ser específicamente localizada hacia el Golgi de la a optimizar su actividad. Secuencias de determinación d ticulares pueden elegirse, identificando construcciones de prot ión para las proteínas de fusión más activas. En un ejemplo de m lfa-1 ,3-galactosil transferasa de S. scrofa es fusionada a un d lización de determinación del blanco del Golgi de transm nn2p.

Las modalidades de esta invención incluyen un pedera eucariótica inferior, más preferiblemente una célula hos go filamentoso o levadura, la cual ha sido diseñada para coproteínas que tienen un N-glucano predominante que comp tope de a-galactosilo terminal.

Las modalidades de esta invención incluyen un spedera eucariótica inferior, más preferiblemente una célula hos igo filamentoso o levadura, en donde la célula hospedera Las modalidades de esta invención incluyen un pedera eucariótica inferior, más preferiblemente una célula hosp go filamentoso o levadura, en donde la glucoproteína de vacuna una proteína de vacuna antiviral, una proteína de vacuna antiba proteína de vacuna contra el cáncer.

Las modalidades de esta invención incluyen un pedera eucariótica inferior, más preferiblemente una célula hosp go filamentoso o levadura, en donde la proteína de vacuna antivi virus de la influenza. Más preferiblemente, las proteínas del vi enza son las glucoproteínas hemaglutinina (HA) o neuraminidasa Las modalidades de esta invención incluyen un pedera eucariótica inferior, más preferiblemente una célula hosp go filamentoso o levadura, en donde la proteína de vacuna antivi virus del herpes simple. Más preferiblemente, se usan glucoproteí )ierta del herpes, gB, gC y gD. go filamentoso o levadura, en donde la glucoproteína d ibacteriana se deriva de una proteína de vacuna bacteria feriblemente, la proteína de vacuna bacteriana es una pr mbrana integral, o es una proteína de la membrana exterior, teína de la superficie exterior, o es de Mycobacterium, o es de S s de Borrelia, o es de Haemophilus.

Las modalidades de esta invención incluyen u pedera eucariótica inferior, más preferiblemente una célula hos ngo filamentoso o levadura, en donde la glucoproteína de vacuna icer se deriva de un péptido epitópico derivado de una célula can no un epitope Her-2, un epitope neu o un epitope del antígeno dre de próstata (PSCA).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 2. Comparación de los azúcares terminales enc los N-glucanos entre humanos y la mayoría de los otros mamí oría de los mamíferos exhibe un porcentaje menor de galacto zada terminal, una estructura que carece por completo de los N-los humanos.

Figura 3. Modificación gradual de la maquinaria osilación de levadura. La humanización de los glucanos N-enla dura resulta en una serie de cepas de levadura capaces de ructuras de N-glucano intermediarias de humano/mamífero. Una dura capaz de producir dicho N-glucano intermediario G l)2GlcNAc2Man3GlcNAc2, puede ser modificada para produci ano GS5.9 uniforme, (a-Gal)2(P-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2 ño de una a-GalT activa adecuadamente localizada en ausenci il transferasa.

Figuras 4A y 4B. Una cepa de levadura glucodiseñad tienen a-Gal (GS5.8 y GS5.9) en una MS MALDI-TOF. 2.0, Man5 , (P-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2; 5.8, ( )2GlcNAc2Man3GlcNAc2; 5.9, (a-Gal)2(p-Gal)2G!cNAc2Man3Glc Figuras 5A y 5B. La optimización de la maqui cosilación hacia el extremo 5' en una cepa de levadura gluco I5.0 que expresa a-GalT, incrementa la uniformidad de los N- í, una a-1 ,3-GalT de ratón, no optimizada en codones u optim lización, fue diseñada en una cepa de la levadura P. pastoris hui 5.0 optimizada. Esta cepa expresa EPO recombinante de rat trol del promotor fuerte AOX1. Se produjo la proteína rrEPO rcada con His por inducción en medio que contiene metano!, purif matografía de afinidad de Ni++, y N-glucanos fueron liber estión con PNGasa F y sometidos a MS MALDI-TOF. Puede obse lT activa por la aparición de picos que contienen a-Gal (GS5.8 y MS MALDI-TOF. 2.0, Man5GlcNAc2¡ 5.0, (p-Gal)2GlcNAc2Man3 Figuras 7A-7C. La expresión de una colección de a-G ización en codones para P. pastoris, mejora la transferencia d Í, a-1 ,3-GalT de M. musculus, a-1 t3-GalT de S. scrofa y a-1 ,3-G liaris optimizadas en codones pero no optimizadas en localizació ñadas en una cepa de la levadura P. pastoris humanizada mizada. Esta cepa expresa rrEPO bajo el control del promotor fue cible. Se produjo la proteina rrEPO secretada marcada con cción en medio que contiene metanol, purificada por cromato idad de Ni++, y N-glucanos fueron liberados por digestión con PN etidos a MS MALDI-TOF. La actividad de la a-GalT puede obser parición de picos que contienen a-Gal (GS5.8 y GS5.9) en una M . 2.0, Man5GlcNAc2¡ 5.0, (P-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2; 5.8, ( 2GlcNAc2Man3GlcNAc2¡ 5.9, (a-Gal)2(p-Gai)2GlcNAc2Man3Glc Figuras 8A y 8B. La expresión de Kringle 3 en una cep GaIT de S. scrofa localizada con ScMnt11-58, da N-glucanos si la aparición de picos que contienen a-Gal (GS5.8 y GS5.9) en .DI-TOF. 2.0, Man5GlcNAc2; 5.0, (P-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc )(p-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2; 5.9, (a l)2GlcNAc2Man3GlcNAc2.

Figura 9. La optimización de la localización de la secue la a-GalT introducida en una cepa GFI5.0, incrementa la cantidad inal transferida a los N-glucanos. Aquí, una a-1 ,3-GalT imizada en codones y optimizada en localización con ScMnn2 ñada en una cepa de la levadura P. pastoris humanizad imizada. Esta cepa expresa el dominio Kringle 3 del plasminógen o el control del promotor fuerte AOX1. Se produjo proteína K3 rcada con His por inducción en medio que contiene metanol, purif matografía de afinidad de Ni++, y N-glucanos fueron liber estión con PNGasa F y sometidos a MS MALDI-TOF. La activida IT puede observarse por la aparición de picos que contienen a-G de la influenza marcada con His (variante A/Hong Kong/1/58) po stern blot del sobrenadante de cultivo, entonces la proteína purifi atografía de afinidad de Ni++ fue sometida a digestión con PN lisis por MS MALDI-TOF. 2.0, Man5GlcNAc2; 5 )2GlcNAc2Man3GlcNAc2; 5.8, (a-Gal)(P-Gal)2GlcNAc2Man3GlcN al)2( -Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2.

Figura 1 1. Expresión de una proteina del ectodominio nfluenza en una cepa de la levadura P. pastoris glucodiseñad a cepa contiene a-1 ,3-GalT de ovino optimizada en codones y o localización, diseñada en una cepa de la levadura P. pastoris hui I5.0 optimizada. Se demostró ia expresión del ectodominio de enza marcada con His (variante A/Carolina del Sur/1/18 vari lisis Western blot del sobrenadante de cultivo, y entonces la ificada por cromatografía de afinidad de Ni++ fue sometida a dige Gasa F y análisis por MS MALDI-TOF. 2.0, Man5GlcNAc2; 5.9, (a etida a digestión con PNGasa F y análisis por MS MALDI- n5GlcNAc2; 5.0, (p-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2; 5.8, l)2GlcNAc2Man3GlcNAc2; 5.9, (a-Gal)2( -Gal)2GlcNAc2Man3Glc Figura 13. Expresión de la proteína del ectodominio g n una cepa de la levadura P. pastoris glucodiseñada GFI5.9 o ta cepa contiene a-1 ,3-GalT de ovino optimizada en codones y o localización, diseñada en una cepa de la levadura P. pastoris hu I5.0 optimizada. Se demostró la expresión de la proteína del ec de HSV-2 marcada con His, por análisis Western blot del sobreñ tivo, y entonces la proteína purificada por cromatografía de a »¦+ fue sometida a digestión con PNGasa F y análisis por MS M ), Man5GlcNAc2; 5.0, (p-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2; 5.8, il)2GlcNAc2Man3GlcNAc2; 5.9, (a-Gal)2(p-Gal)2GicNAc2Man3Glc BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS TTAATTAATCAGACATTATTTCTAACCAAATT SEQ ID NO: 3, es una secuencia de aminoác dominio (es decir, que carece del dominio de transmembrana C-a proteina HA tipo H3 de la influenza A (Hong Kong).

SEQ ID NO: 3: LPGNDNSTATLCLGHHAVPNG'aVKTnODQIEV*raATCLVQSSS1OKICN CTUD A LLG DPHC V FQNETWDLF VERSKAFSNC YP Y D VP Y A S LRS L VA FT\V TG VTQNG G SN A CKR G P G SGFFSRLN WUTKSG S ??? V L VTM PNN DN fVHBPSTNQEQTSLYVQASGRV ^ L V lis5 S G N í IA R G YF . M RTG S S L RS D APIDTC ISEC1TPN G S IPN D K P FQ N C PKYVKQNTI MTGM RNVPF QTRGLFGATAGFIENG FXJMIDGWYGFI AADLKSTQAAIDQINGKLNRVIEKI E F IQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVE YN AEIX V A ? .ENQHTIDLTDSEM LFEKTR QLR-EN AEDMGNC JCF I YHK .NGT YDH D V YRDEALNNRFQI G VELK.SG Y DWI'L IS FAl SC FLLC V V LLG G ÍR CNÍC1 GG 1 -?-?? ? ÍT ? 11 ??? I SEQ ID NO: 4, es una secuencia de aminoáci dominio (es decir, que carece del dominio de transmembrana C-a proteína HA tipo H1 de la influenza A (A/Carolina del Sur/1/18).

SEQ ID NO: 4: ICTG Y H ANN STDTV DTVLE VTVTHS VNL.L EDSH GK LC KXK I A PLQLG LG P ECD L L LT A S S VVS YI V ETSN S EN GTC YPG DFI D Y E EL R EQ í ,S S VS S F E K F ALADPSL ADPNR.FRGKNLPVLDQLTDPPGV VYHJQPS.LEDPFQPPSIP R\CRSVLLHAPSEAPQlVRGASDEAR HTYNLTIA\VYRMGD CAíPITV HAPAFETAOTYJ.-RLV J.N.D BRARASO YAJ .Pl .Rl PPAACI , PSKA YQQG V rVDSIGNil^PRFJPE QRTVAL GP PPYTSJ^LPPE]^DT? 1?^¾PELVPEDPEDS?LLEDPAGT\ÍSSQJPPNW PHHAP/VAPS PGGGHHHHHHHHH.

SEQ ID NO: 6: Ectodominio de la proteína gD 306NQ d -2G ALADPSL M.ADPNRFRGKNLPVLDOLTDPPCJVKRVYHIQPSLEDPFQPPSÍP ERA CRS V L L H A P S E A PQ I V R ( ? A SD E A R K H T YN LTl A W Y R M G ON C A ( P ?? V M KSLG VCP1RTQPRWS Y YDSf SA VSEDNIXiFLM HAP AFETÁGTY LR.L V KIN I) HRARA S CK Y A L P LRJ P P A AC LT SKA Y QQG VTV DS IGM L P R FIP ENQ RT V A L GP PPYTSTrJ.PPELSDTT ATOPEEVPEDPEDSAU.EONQGGGHHHHFÍHH SEQ ID NO: 7, es una secuencia dominio de la proteína gC de la cepa HSV-2 G.

SEQ ID NO: 7: Ectodominio de la proteína N A S PG RTI T V G P RGNTA SNA A P S A S PRN AS A PR TTPTPPQ PRK A T S A S G A PP I^SEPVRC RHDPLARYGSRVQÍRCRFPNSTRTEFRLQÍWRYATA'I'DAE V VNVS.^PGGQLVyDSAPNRTDPHVlWAEGAGPGASPRLYSVVGPLGRQ ETQG M Y Y W V WGR I RPSA YGTWV VRVFRPPSLTn ÍPMA VLEGQPFf A T " ' técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por érminos singulares incluirán los términos plurales, y los términos irán el singular. En general, las nomenclaturas usadas con relac icas de bioquímica, enzimología, biología molecular y obiología, genética, y química de proteínas y ácidos nucl dación descritas en la presente, son aquellas bien conocidas y únmente en la técnica. Los métodos y técnicas usados para ob trucciones genéticas básicas de la presente invención, se ralmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocid ica y como se describe en varias referencias generales y más es se citan y se discuten a lo largo de la presente especificación, se indique de otra manera. Véase, por ejemplo, Sambroo cular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring ratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel et al., ocois in Molecular Biology, Greene Publishing Associates ( Todas las publicaciones, patentes y otras re cionadas en la presente, se incorporan en su totalidad en la o referencia.

Debe entenderse que los siguientes términos, a meno que de otra manera, tienen los siguientes significados: Como se usa en la presente, los términos "N-gl coforma" se usan recíprocamente, y se refieren a un oligosa zado, por ejemplo, un oligosacárido que es unido por un e aragina-N-acetilglucosamina entre un residuo de N-acetilglucosa osacárido y un residuo de asparagina de un polipéptido. Los ominantes encontrados en las glucoproteínas son glucos ctosa (Gal), mañosa (Man), fucosa (Fue), N-acetilgalac lNAc), N-acetilglucosamina (GIcNAc) y ácido siálico (por ejemplo, til-neuramínico (NANA) y ácido N-glucolil-neuramínico (NG cesamiento de los grupos azúcar ocurre por co-traducción en el l plo, complejo o híbrido de alto contenido de mañosa). Un N-glu alto contenido de mañosa" tiene cinco o más residuos de manos ano tipo "complejo" tiene típicamente por lo menos una GIcNAc o de a-1 ,3-manosa, y por lo menos una GIcNAc unida al brazo osa de un núcleo de "trimanosa". Los N-glucanos complejos pue bién residuos de galactosa ("Gal") o N-acetilgalactosamina ("GalN opcionalmente modificados con ácido siálico o derivados (por NA" o "NeuAc", en donde "Neu" se refiere a ácido neuraminico, re a acetilo). "a-Gal" se refiere a una galactosa a-1 ,3-enlazada, efiere a una galactosa p-1 ,4-enlazada. Los N-glucanos complejo r también sustituciones intracadena que comprenden GIcNAc "bi cosa central. Los N-glucanos complejos pueden tener también tiples en el "núcleo de trimanosa", referidas con frecuencia como " narios múltiples". Un N-glucano "híbrido" tiene por lo menos NAc unida al extremo no reductor del brazo de a-1 ,3 mañosa del n cción positiva o negativa para la presencia o ausencia de la s tro de una célula hospedera. Por ejemplo, el gen URA5 de P. p gen marcador, debido a que su presencia puede seleccionars acidad de las células que contienen el gen, de crecer en aus io. Su presencia puede seleccionarse también por la incapacid las que contienen el gen, para crecer en presencia de 5-F uencias o genes marcadores no necesariamente necesita ctividad positiva y negativa. Ejemplos no limitativos de secu es marcadores de P. pastoris, incluyen ADE1, ARG4t HIS4 y UR es marcadores de resistencia a antibióticos, se usan comúnmen resistencia a kanamicina, neomicina, geneticina (o G418), parom omicina, que permiten el crecimiento en presencia de estos antibi Las secuencias de control de la expresión "e rativamente", se refieren a un enlace en el cual la secuencia de c xpresión es contigua con el gen de interés para controlar el gen d ucción de secuencias de ácido nucleico. Las secuencias de con resión incluyen secuencias de inicio de la transcripción, termina motor e intensificador adecuadas; señales de procesamiento ientes tales como señales de empalme y poliadenilación; secue bilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que aumentan la efic raducción (por ejemplo, sitios de unión del ribosoma); secuen joran la estabilidad de las proteínas; y, cuando se desee, secue oran la secreción de las proteínas. La naturaleza de dichas secu trol difiere, dependiendo del organismo hospedero; en procariont uencias de control incluyen generalmente promotor, sitio de soma y secuencia de terminación de la transcripción. Se preten ino "secuencias de control" incluya, a un mínimo, todos los com a presencia es esencial para la expresión, y pueden incluir ponentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por uencias guía y secuencias del miembro de fusión. o, idéntica a la célula progenitora, pero se incluye aún dentro del término "célula hospedera" como se usa en la presente. Un ederá recombinante puede ser una célula aislada o linea de tenida en cultivo, o puede ser una célula que reside en un nismo vivo.

El término "eucariótico" se refiere a una célula u or eado, e incluye células de insecto, células vegetales, células de m las animales y células eucarióticas inferiores.

El término "células eucarióticas inferiores" incluye le gos, flagelados de collar, microsporidios, alveolados (por flagelados), estramenópilos (por ejemplo, algas pardas, proto fitas (por ejemplo, algas rojas), plantas (por ejemplo, algas verde étales, musgos) y otros protistas. Las levaduras y hongos fila yen, pero no están limitados a: Pichia pastoris, Pichia finlandic alophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia veromyces sp., Candida albicans, cualquier Aspergilius sp., Tric ei, Chrysosporium luchnowense, cualquier Fusarium sp. y Ne sa.

El término "péptido", como se usa en la presente, se refi éptido corto, por ejemplo, uno que es típicamente de m ximadamente 50 aminoácidos de longitud, y más típicamente m ximadamente 30 aminoácidos de longitud. El término, como se enté, abarca análogos y miméticos que imitan la función estruct manera la función biológica.

El término "polipéptido" abarca proteínas de ocurrencia currencia no natural, y fragmentos, mutantes, derivados y análog as, indicados por el contexto de uso. Un polipéptido pu oméríco o polimérico. Además, un polipéptido puede comprender inios diferentes, cada uno de los cuales tiene una o más ac intas. ontracto en la naturaleza, o incluye análogos de aminoácido o der ontrados en la naturaleza, o enlaces diferentes de los enlaces ándar). De esta manera, un polipéptido que es sintetizado químic tetizado en un sistema celular diferente de la célula de la cual uralmente, estará "aislado" de sus componentes asociados ural. Puede hacerse también que un polipéptido o prote tancialmente libre de componentes asociados naturalm amiento, usando técnicas de purificación de proteínas bien conoc teria. Como se define de esta manera, el término "aislado" no esariamente que la proteína, polipéptido, péptido u oligopéptid esta manera, haya sido removido físicamente de su ambiente nati El término "fragmento de polipéptido", como se u isente, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción, por eje leción amino-terminal y/o carboxi-terminal en comparación ipéptido de longitud completa. En una modalidad preferida, el frag itud. Un fragmento puede comprender un dominio con una ntiva.

Un "derivado modificado" se refiere a polipéptidos o fra os mismos que son sustancialmente homólogos en secuencia e aria pero que incluyen, por ejemplo, modificaciones quí uímicas in vivo o in vitro, o los cuales incorporan aminoácidos q entran en el polipéptido nativo. Dichas modificaciones inclu plo, acetilación, carboxilación, fosforilación, glucosilación, ubiqui cación, por ejemplo, con radionúclidos, y varias modifi máticas, como lo apreciarán fácilmente los expertos en la técn dad de métodos para la marcación de polipéptidos y de sustitu eas útiles para dichos propósitos son bien conocidos en la t yen isótopos radiactivos tales como 125l, 32P, 35S y 3H, ligando a antiligandos marcados (por ejemplo, anticuerpos), fluoróforos, ioluminiscentes, enzimas y antiligandos que pueden serv Los términos "gen quimérico" o "secuencias de nu éricas", se refieren a una secuencia de nucleótidos que compre encia de nucleótidos o fragmento acoplado a una o más secue eótidos heterólogos. Las secuencias quiméricas son útiles esión de proteínas de fusión. Los genes quiméricos o secue eótidos quiméricas pueden comprender también uno o más frag inios que son heterólogos a la célula hospedera deseada, y lo en tener propiedades benéficas para la producción de mbinantes heterólogas. En general, una secuencia de nu érica comprende por lo menos 30 nucleótidos contiguos de un g eriblemente por lo menos 60 ó 90 o más nucleótidos. Las secue eótidos quiméricas que tienen por lo menos un fragmento o do eterólogo a la célula hospedera deseada, pero el cual es homól eína recombinante deseada, tienen utilidad particular en la nción. Por ejemplo, un gen quimérico deseado para su uso en un ás proteínas diferentes. Una proteína de fusión comprende por l minoácidos contiguos de un polipéptido de interés, más preferi lo menos 20 o 30 aminoácidos, aún más preferiblemente por lo m 60 aminoácidos, todavía más preferiblemente por lo menos 75, 1 oácidos. Las fusiones que incluyen la totalidad de las proteín enté invención, tienen utilidad particular. El polipéptido heterólog tro de la proteína de fusión de la presente invención es de por lo oácidos de longitud, con frecuencia por lo menos 8 aminoá itud, y útilmente por lo menos 15, 20 y 25 aminoácidos de long nes incluyen también polipéptidos más largos, o incluso ras, tal como la proteína fluorescente verde ("GFP"); las proteí ienen cromóforo, tienen utilidad particular. Las proteínas de fusió ucirse en forma recombinante, construyendo una secuencia leico que codifique para el polipéptido o un fragmento del misr eo de lectura, con una secuencia de ácido nucleico que codifique noácidos convencionales, aminoácidos no naturales tale noácidos a-,a-disustituidos, N-alquil aminoácidos y otros aminoá vencionales, pueden ser también componentes adecuados péptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoá vencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?,?, a, e-?-acetil lisina, O-fosfoserina, N-acetílserina, N-formilmeti ilhistidina, 5-hidroxilisina, N-metilarginina, y otros aminoácidos si oácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de pol da en la presente, el extremo izquierdo corresponde al extrem inal, y el extremo derecho corresponde al extremo carboxi-ter erdo con el uso y convención estándar.

El término "región", como se usa en la presente, se refi ción físicamente contigua de la estructura primaria de una biomol aso de proteínas, una región es definida por una porción conti uencia de aminoácidos de esa proteina. écula, péptido, proteína, azúcar, nucleótido, ácido nucleico, lípid o compuesto puede ser natural o sintético.

Como se usa en la presente, se entenderá que el prende" o variaciones tales como "comprende" o "que co lica la inclusión de un entero o grupo de enteros establecido, p lusión de cualquier otro entero o grupo de enteros.

Como se usa en la presente, se entenderá que el dominantemente" o variaciones tales como "la predominante" o l ominante", significan la especie de glucano que tiene el por cient es más alto de N-glucanos totales que pueden identificarse de la glucoproteína ha sido tratada con PNGasa, y los glucanos líbe lizan por espectroscopia de masa, por ejemplo, MS MALDI-TOF. bras, el término "predominante" se define como una entidad indi o una glucoforma específica, que está presente en un por ciento or que cualquier otra entidad individual. Por ejemplo, si una co uesta inmune a la proteína o glucoproteína usada como la "pr una" o "glucoproteína de vacuna". La proteína de vacuna o gluc vacuna puede comprender una proteína o glucoproteína nativa d pleta, o puede comprender uno o más dominios aislados de una lucoproteína nativa. La proteína de vacuna o glucoproteína d de usarse en una vacuna junto con otras proteínas de ? oproteínas de vacuna, así como en formulaciones que co ntes activos y/o vehículos farmacéuticos adicionales. El término vacuna" o "glucoproteína de vacuna" puede usarse íprocamente con el término "proteína objetivo" o "glucoproteína ob Como se usa en la presente, el término "epítope" se r ción de un antígeno que es capaz de inducir una respuesta inmu capaz de ser reconocido por un anticuerpo. Los epítopes cons uencia de un conjunto de aminoácidos múltiples, porci bohidratos, o ambos. Los epítopes que son referidos como lin epítope de a-galactosilo incluyen las siguientes estructuras de ificadas: (a-Gal)(p-Gal)GlcNAcMan5GlcNAc2; ( )2GlcNAc2Man3GlcNAc2; y (a-Gal)2(P-Gal)2GlcNAc2Man3 se también GS5.7, GS5.8 y GS5.9 en la figura 3. Como se sente, el término "adyuvante" se refiere a un compuesto o sustan aumentar la respuesta inmunogéna a una vacuna o proteina de v tenga efecto antigénico específico alguno mismo. Los adyuvante uir lipopolisacárido bacteriano, liposomas, sales de aluminio y acei A menos que se defina de otra manera, todos los nicos y científicos usados en la presente tienen el mismo signific ntienden comúnmente los expertos en la técnica a la cual esta i tenece. Ejemplos de métodos y materiales se describen más a todos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la den usarse también en la práctica de la presente invención, entes para los expertos en la técnica. Todas las publicacione I. Generalidades La invención provee métodos y materiales para la exp coproteínas de vacuna que tienen galactosa alfa-enlazada d spederas recombinantes, cuyas células hospederas recombin o transformadas con vectores que codifican para proteínas de va coproteínas de vacuna resultan en calidad mejorada de la glu ombinante producida de la célula hospedera, en particular une incrementada obtenida de las glucopróteínas de vacuna p las células hospederas recombinantes transformadas con estos v Aunque los métodos se ejemplifican con respecto a la organismos eucarióticos inferiores, en particular levaduras nerse en práctica también en organismos eucarióticos sup cterias. Los métodos implican la transformación de células hospe a molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína d ajorada, especialmente una glucoproteína de vacuna y, de est ndo células que han sido diseñadas para la producción oproteínas de vacuna secretadas mejoradas.

II. Expresión de las proteínas de vacuna Ácido nucleico que codifica para la proteína o qlucopr una Las glucoproteínas descritas anteriormente, son codific os nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, tip N. El ácido nucleico que codifica para la glucoproteína es rablemente a secuencias reguladoras que permiten la exp reción de la glucoproteína. Dichas secuencias reguladoras in motor y opcionalmente un intensifteador hacia el extremo 5', o 5', o nucleico que codifica para la proteína, y un sitio de terminac scripción 3' o hacia el extremo 3' del ácido nucleico que codific uencia un componente de un vector replicable en células en las oproteina es expresada. El vector puede contener también un r permite el reconocimiento de las células transformadas. Sin nos tipos de células, en particular las levaduras, pue sformadas exitosamente con un ácido nucleico que carece de se añas del vector.

Los ácidos nucleicos que codifican para las gluco eadas pueden obtenerse de varias fuentes. Pueden am uencias de ADNc de lineas de células que se sabe exp oproteina, usando iniciadores para regiones conservadas (vé mplo, Marks et al., J Mol. BioL 581 -596 (1991 )). Los ácidos dén ser también sintetizados de novo con base en secuenci atura científica. Los ácidos nucleicos pueden ser sintetizados ta ensión de oligonucleótidos traslapantes que abarcan una S eada (véase, por ejemplo, Caldas et al., Protein Engineering, 13, resencia de residuos de alfa-1 ,3-galactosa terminales puede re la inmunogenicidad de una glucoproteína de vacuna, o puede a nmunogenicidad de las gtucoproteínas de vacuna que están ucidas.

III. Objetivos virales y otros objetivos de la vacuna Los objetivos de la vacuna que pueden ser adecuados enté invención, incluyen aquellos para los cuales una r énica puede ser aumentada por la unión de una porción de al emo de un antígeno. En modalidades preferidas, la proteína d prenderá un péptido o proteína derivado del objetivo. El objeti erencia un vector de enfermedad, tal como un virus, hongo, bacte obio. En otras modalidades, el objetivo puede ser un tipo parti la, tal como una célula cancerosa que expresa un péptido ocido, el cual puede usarse como la proteína objetivo. Por influenza (PIV, por ejemplo, PIV tipo III), virus del papiloma /, por ejemplo, HPV-16, los cuales pueden estar asociados con ical), virus de Epstein-Barr, adenovirus, virus de la inmunod ana (VIH, el cual está asociado con el SIDA), y citomegalovirus IV)f paramoxivirus (tales como aquellos asociados con la paroti mpión), poxvirus, Reoviridae (incluyendo rotavirus, reovirus y vi re por garrapatas de Colorado) y poliovirus.

Las proteínas objetivo preferidas para virus incluyen pro ápside, proteínas de la cubierta de superficie, proteínas estruc s proteínas que pueden ser accesibles al sistema inmune, espe ellas proteínas que son naturalmente glucosiladas. Uno o más osilación adicionales pueden diseñarse en la secuencia de ifica para la proteína objetivo. En donde no exista un sitio de glu ural, uno o más sitios de glucosilación artificiales pueden diseñars uencia de ADN que codifica para la proteína objetivo. Secuencia rnational Committee on Taxonomy of Viruses: The Univers abase, versión 3; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICT ://www.virology.net garryfavwebindex.html#specific.

En modalidades preferidas, una o más prot oproteínas virales pueden usarse en conjunto como parte de un puesta. La vacuna compuesta puede comprender proteínas d tiples del mismo virus objetivo, así como proteínas de vacuna mú entes virus objetivo. Los siguientes, son ejemplos no limitativ S objetivo y proteínas virales que pueden servir como la pro una en la presente invención: Virus de la influenza: giucoproteína hemaglutinin oproteína neuraminidasa (NA); proteína de matriz; proteína M1 ; proteína M3; péptido de nucleoproteína (NP); proteína PA; proteí eína PB2; proteína Rev. Véase McCauley y Mahy, Biochem. J., (1983); Lamb et a/. , Proc Nati Acad Sci USA., 78: 4170-4174 (19 3; VP26; ICP1 -2; ICP35; ICP47. Véase, Roizman, Proc Nati Acad 1 1307-1 1312 (1996); Whitley y Roizman, J. Clin. Invest. 1 10(2): 2); Dunn et al., Proc Nati Acad Sci USA, 100: 14223-14228 (2 del herpes incluyen también al virus de la varicela zoster (ca cela); y el virus de Epstein-Barr.

Flavivirus (los cuales pueden incluir al virus del dengue; Occidental; virus de la hepatitis; y virus GB); dengue: proteína C; roteína E. Véase, Chambers et al., Annual Review of Microbio -688 (1990). Virus de la hepatitis: (incluyendo virus GB) antíg erficie, tales como HBsAg; p17e/HBeAg; HBe1 ; HBe2; p21 /GP42; p24/GP27; GP33/GP36; preS1 ; pre-S2; proteína S; p74 ( 5B); p20 (proteína central); HDAg-p24; HDAg-p27. Véase, Sel S USA 84: 1005-1009 (1987); Heermann et al., J. Virology 52: 4); Svitkin et a/., J. Virology; 79: 6868-6881 (2005); Salfeld logy 63: 798-808 (1989); Grottola eí a/., Liver Transpl. 8: 443-44 taneumovirus. Típicamente, el genoma incluye genés que codif proteína de la nucleocápside (N); y una fosfoproteína de la nucl , las cuales pueden servir como la proteína de vacuna viral. Véas ente de E.U.A. 6,264,957; algunos de los paramixovirus contiene proteína neuraminidasa (NA), la cual puede servir como la pr una viral en la presente invención. El virus posee también con f aglutinina (H) y glucoproteínas fusión (F) sobre su superfici dén comprender proteínas de vacuna viral.

Virus del papiloma humano (HPV, por ejemplo, P les pueden estar asociados con el cáncer cervical), proteínas de l ificadas por L1 y L2¡ péptido antigénico E7. Véase, Cárter et al 4664-72 (2006); Pastrana et aL , Virology 337: 365-72 (2005).

Filovirus (incluyendo virus del Ebola). VP30; VP35; imerasa L; VP40; VP24; y glucoproteína GP/SGP. Véase, Folk dicine 4: 16-17 (1998); y Feldmann, Virus Research 24: 1 -19 (199 oproteínas de la cubierta (GP120 y GP41 ); proteína de la cáp 4); proteínas de la nucleocápside (p6 y p7); y proteína de mat teínas reguladoras del VIH (Tat, Rev, Nef). Véase, Wain-Hobson, genome variability in vivo. AIDS 3: supl. 1 ; 13-9 (1989); y Rat ure 313: 277-84 (1985).

Bunyaviridae (incluyendo Hantavirus): glucoproteína ierta (glucoproteínas GP1 ; GP2); proteínas de la nucleocápside Véase, Schmaljohn e/ a/., J. Gen. Virol. 69: 1949-1955 (1988).

Nidovirus (Coronavirus y Arterivirus): (incluyendo virus el síndrome respiratorio agudo severo (SARS)). S (glucoprote iga); E (proteína de la cubierta); M (glucoproteína de membra maglutinina esterasa); N (fosfoproteína). Véase, Pyrc et al., Vi ://www.virologyj.com/content/1/1 7 (2004).

Reoviridae (incluyendo Rotavirus, reovirus y virus de la apatas de Colorado): s1 , s2 y s3; pi e; VP1 , VP2, VP3, VP4, VP ales, tales como Mycobacterium (tuberculosis; lepra; inf icas); Haemophilus infiuenzae (infecciones respiratorias; m untivitis; chancroide); Mycoplasma (neumonía atípica; inf enitales); Bacillus (ántrax; intoxicación alimentaria); Salmonell ea; enteritis; intoxicación alimentaria); Clostridium (tétanos; b rena gaseosa; bacteremia); Treponema (sífilis); Borrelia rrente; enfermedad de Lyme); Ureaplasma (infecciones uro tunistas); Staphylococcus (abscesos de la piel; infecciones oport ptococcus (inflamación séptica de la garganta y otras inf iratonas; abscesos de la piel y otros abscesos; fiebre p ciones oportunistas); Leptospira (leptospirosis); Camp cciones del tracto digestivo/urogenital); Helicobacter (úlceras p domonas (infecciones del tracto urinario; quemaduras; onella (neumonía; infecciones respiratorias); Neisseria (g ingitis; infecciones nasofaríngeas); Moraxella (conjuntivitis); iadas con heridas por mordedura de perros y mmatobacterium (granuloma inguinal); Gardnerella (vaginitis); cciones de heridas); Streptobacillus (infecciones asociad edura de rata); BacteroidesIFusobacterium (infecciones stivas, respiratorias y urogenitales; heridas y abscesos); V robiota oral y abscesos); Rickettsia (tifo; fiebre de las Montañas ttsiosis pustulosa); Rochalimaea (fiebre de las trincheras); Coxiel Bartonella (fiebre de Oroya); Chlamydia (tracoma; conjunti sión; uretritis no gonocócica; fiebre de los loros); Peptococcus (se -parto; lesiones viscerales); Peptostreptococcus (fiebre p ciones piogénicas); Lactobacillus (microflora del tracto dig na); Listeria (listeriosis); Erysipolothrix (erisipeloide); Coryneb ria y oportunistas de la piel); Propionibacterium (enferme ciones de heridas); Eubacterium (infecciones orales y otras infe nomyces (actinomicosis); Nocardia (nocardiosis; micetoma; absc que codifica para la proteína objetivo. El objetivo puede co bién un péptido fusionado a un polisacárido o lipido, en sacárido o lipido puede derivarse óptimamente de un polisacárid rodea o encapsula naturalmente a las bacterias objetivo. Secue que codifican para la proteína objetivo pueden ser clo tizadas, y pueden ser optimizadas para expresión en las pederás de la presente invención.

La proteína de vacuna útil en la presente invenció prender la totalidad o fragmentos de la proteína o las terianas objetivo. El experto en la técnica puede localizar o i eínas bacterianas adecuadas adicionales por referencia a las s genómicas bacterianas continuamente en expansión, tal ellas disponibles en el sitio web del Sanger ://www.sanqer.ac.uk/Pro¡ects/Microbes/). En modalidades preferi ás proteínas o glucoproteínas bacterianas pueden usarse en Salmonella (fiebre tifoidea; enteritis; intoxicación ali teínas de la cubierta (envA; envD; envZ/ompB/tppA/tppB); proteí brana exterior (ompA; ompC; ompD; ompF; ompH; ompR; pefC; A; tctA; tctB); proteina porina de la membrana exterior (nmpC); pr la membrana exterior (pgtE); fosfolipasa A de la membrana exteri teína de los poros de la membrana exterior inducible por limit ato (phoE); transportador de espermidina y putrescina (p inoácido esterasa unida a la membrana (apeE); sensor uni mbrana (arcB); sitio de unión unido a la membrana (atdA). Véas J. Bacteriol. 187: 4720-4727 (2005); véase .salmonell.org/genomics/.

Mycobacteríum (tuberculosis; lepra; infecciones teínas de membrana integrales (amt; arsA; arsB1 ; arsB2; ar A; cysT; cysW; dppB; dppC; drrB; drrC). Véase, Camus et al., Mic : 2967-2973 (2002; Colé et a/. , Nature 393: 537-544 (1998). rior (TonB); proteínas de membrana para la salida de proteína F); proteínas adhesivas Hap y HWM1/HMW2; lgA1 proteasa ://cmr.tigr.org/tigr-ipts/CMR/shared/AIIGeneList.cgi?sub_org_val=ghi&feat_type=OR bster et a/., J. Histochem Cytochem 54: 829-842 (2006) ischmann y Adams, Science, 269: 496-512 (1995); Berenso ction and Immunity, 73: 2728-2735 (2005); Green et ai, Infect I 1 -3198 (1991 ).

Mycoplasma (neumonía atípica; infecciones urog teínas de membrana p52f p67 (pMGA) y p77; véase, Jan et a ression and Purification; 7: 160-166 (1996); proteínas de ciadas con lípidos (LAMPs); véase, Lo et a/., Clinical Infectious 1246-53 (2003).

Treponema (sífilis): proteína de membrana (tmpA); 3; antígeno de membrana, específico del patógeno (tpd); pr elar; proteína fliJ flagelar. Véase, McKevitt et al. f Infection and I 4445-4450 (2005).

Borrelia (fiebre recurrente; enfermedad de Lyme): proteí erficie exterior (OspA; OspB; OspC). Véase, Anderton et al., Infe unity, 72: 2035-2044 (2004).

Brucella (brucelosis): Proteína de la membrana ex p31 ); véase, Cassataro et a/., Infection and Immunity; 73: 8 05); OMPs mayores Omp25, OMP31 y Omp2b; OMPs menos ab p10, Omp16 y Omp19; y lipopolisacárido uniforme (S-LPS) eckaert et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology; 6: 99). Proteína de la membrana exterior inducible por pH ácido (Ao cella: Molecular and Cellular Biology (López-Goñi e Ignacio Moriy rizon Press (2004).

Streptococcus (inflamación séptica de la garganta cciones respiratorias; abscesos de la piel y otros absces V. Células hospederas Eucariontes inferiores tales como las levaduras, se la expresión de las glucoproteínas, debido a que pueden nómicamente, dan altos rendimientos y cuando son mo cuadamente, son capaces de exhibir glucosilación adecua duras ofrecen particularmente una genética establecida que das transformaciones, estrategias de localización de proteínas p ba y técnicas fáciles para genes con expresión bloqueada. cuados tienen secuencias de control de la expresión, tal otores, que incluyen 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glu origen de replicación, secuencias de terminación, y similares, ee.

Varias levaduras, tales como . lactis, Pichia pastori hanolica y Hansenula polymorpha se prefieren para el cultivo d ido a que son capaces de crecer a altas densidades de células y senula sp., Kluyveromyces sp., Candida albicans, Aspergillus ergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucht arium gramineum, Fusarium venenatum y Physcomitrella patens.

Eucariontes inferiores, en particular levaduras y entosos, pueden ser genéticamente modificados, de modo que oproteínas en las cuales el patrón de glucosilación sea de tipo h anizado. Esto puede lograrse eliminando enzimas de gluc ógenas seleccionadas, y/o suministrando enzimas exógenas rito por Gerngross et a/., documento US 20040018590, cuya de incorpora en la presente como referencia. Por ejemplo, ccionarse una célula hospedera, o puede diseñarse para riorada en el inicio de la actividad de alfa-1 ,6-manosiltransferasa adena exterior), con respecto al glucano o una glucoprotei iinuido o agotado en actividad de dolichi-P-Man:Man5GlcNAc2-P 3 manosiltransferasa, lo cual de otra manera añadiría residuos de enzimas que generan un cúmulo de UDP-galactosa, transport mbrana del Golgi adecuados y un gen que codifica para una ß sferasa (por ejemplo, una ß-GalT), dan una cepa hospedera que transferir un N-glucano humano tipo complejo con P-1 ,4-galactos ase, Bobrowicz et al., Glycobiology; 14: 757-66 (2004)).

VI. Introducción de a-GalT en una cepa de levadura qu qlucano híbrido qlucodiseñado Una cepa de P. pastoris glucodiseñada que secreta n N-glucanos híbridos de mamífero que contienen GIcNAc termin P3, se genera por eliminación de una porción de una N-glucosil adura (tal como PpOCHI ) y que expresa una a-1 ,2-MNS1 y enzi ecuadamente localizadas en el retículo endoplásmico (Choi et 03; Bobrowicz et al., Glycobiology; 14: 757-66 (2004)). Además, e secreta N-glucanos de mamífero híbridos con P-1 ,4-galactosa te sformado en esta cepa que produce N-glucano híbrido terminado actosa. Los transformantes se seleccionan en medio selectivo de ándar, tal como aquel que contiene nourseotricina o higromicin l el plásmido contiene un gen de resistencia, e integrantes cor ntifican por la PCR del lisado de células de levadura. Los recombi ntifican entonces para la expresión funcional de la a-1 ,3 nsferasa adecuadamente dirigida, analizando los N-glucanos libe igesta con PNGasa F, de la proteína reportera secretada tal co ectrometría de masa de ionización/desorción con láser asistida p po de vuelo (MS MALDI-TOF). La adición correcta de a-1 ,3-ga lucano aceptor terminado en p-1 ,4-galactosa híbrido, es identif sas que se observan consistentes con la adición de un r actosa a-enlazada individual al N-glucano GFI l)GlcNAcMan5GlcNAc2 de RDP39-6, que da el N-glucano G l)(P-Gal)GlcNAcMan5GlcNAc2. oproteínas de vacuna de la presente invención comprenden un comprende un residuo de a-galactosilo terminal. En ciertas mo N-glucano que comprende un residuo de a-galactosilo terminal cano predominante. En modalidades preferidas, el N-glucano pred prende por lo menos 30 por ciento en moles, de preferencia por por ciento en moles, y más preferiblemente por lo menos 50 por les, de los N-glucanos presentes en la glucoproteína en la compo dalidades preferidas particulares, el N-glucano predominante se s grupo que consiste de (a-Gal)( -Gal)GlcNÁcMan5GlcNAc2; l)2GlcNAc2Man3GlcNAc2; y (a-Gal)2(p-Gal)2GlcNAc2Man3GlcN Las composiciones de vacuna de la presente prenden de preferencia una glucoproteína de vacuna que es l o bacteriano. La glucoproteína de vacuna es de prefere coproteína que es naturalmente glucosilada. En forma alter coproteína de vacuna puede comprender una glucoproteína qu cciona del grupo que consiste de un epítope Her-2, un epitope ope de antígeno de célula madre de próstata (PSCA). E alidades preferidas, la composición de vacuna puede compre posición de vacuna compuesta, que comprende proteínas de oproteínas de vacuna múltiples. En dichos casos, las proteínas d lucoproteinas de vacuna pueden comprender glucoproteinas d tiples dirigidas hacia el mismo virus, bacteria u otro péptido tivo; pueden comprender glucoproteinas de vacuna dirigida ha terias y/o péptidos epitópicos distintos múltiples, tales como ópicos dirigidos hacia una célula cancerosa o célula tumoral.

En los siguientes ejemplos, las glucoproteinas de vacu expresan en células hospederas de la especie Pichia pasto plos demuestran la invención con respecto a modalidades ecificas de la invención, y de ninguna manera son limitativos. El e técnica, habiendo leído la descripción y los ejemplos en la EJEMPLOS I. Clonación de alfa 1 ,3-qalactosa transferasa El gen que codifica para una ct-1 ,3-galactosil transferas sculus pero que carece del dominio de localización del smembrana putativo (MmaGaIT), fue amplificado por reacción e polimerasa usando ADN de riñon de ratón (Clontech) como m iadores RCD446 (TTGGCGCGCCAACAGCCCAGACGGCTCT Q ID NO: 1 ) y TTAATTAATCAGACATTATTTCTAACCAAATT) (SEQ ID NO ducto resultante fue clonado en el vector pCR2.1 Topo (In uenciado y nombrado como pRCD680.. El gen de MmaGaIT fue di D680 usando Ascl/PacI y clonado en el plásmido pRCD508, un ado en pUC19 que contiene el dominio catalítico de ß-1 t4- sferasa I de humano flanqueado por sitios Asc\IPac\ (el do ? que codifica para el dominio de localización de levadura de M erevisiae y el dominio catalítico de la proteína MmaGalT. El D683 fue digerido con Sfi\ para linealizar y liberar las se erianas de pUC19 para transformación en P. pastoris.

II. Generación de una cepa hospedera receptora adecú alT Los N-glucanos no humanos que contienen a-1 ,3- inal, son N-glucanos tipo complejo generados por la adición de u galactosa a-1 ,3-enlazada a una estructura intermedia de N-glu ífero que contiene p-1 ,4-galactosa terminal. Estos glucanos resul petencia por la p-1 ,4-galactosa terminal por SiaIT y a-GalT. Para a competencia, se eligió una cepa de levadura glucodiseñada a de partida. La cepa contenía las enzimas necesarias para pr anos humanos tipo complejo con p-1 ,4-galactosa termin lizados hacia la vía secretoria para generar eficientemente N- híbrido de mamífero (Choi et ai, 2003). En otro paso, se diseña a un gen de manosidasa II (MNSM) y un gen de GIcNAc trans ???), y fueron adecuadamente localizados hacia la vía secret erar eficientemente N-glucanos tipo complejo de mamífero (Hamilt nce 301 : 1244-6 (2003)). Por último, diseñando adicionalmente a enzimas que generan un cúmulo de UDP-galactosa, transporta brana del Golgi adecuados y un gen que codifica para ß-sferasa (ß-GalT), se generó una cepa de levadura que es C sferir un N-glucano de humano tipo complejo con p-1 ,4-galactosa se, Bobrowicz et a/., Glycobiology: 14: 757-66 (2004)). Una dura que produce predominantemente P-1 ,4-galactosa terminal a hospedera adecuada para recibir una a-GalT catalíticamen ajadamente localizada. ???, así como genes que codifican para los transportadores de UD DP-Gal del Golgi y UDP-galactosa 4-epimerasa (véase, G citud de patente de E.U.A. 7,029,872; Davidson et a/., solicitud d E.U.A. 2006/0040353; y Bobrowicz, solicitud de patente d 6/021 1085, cuya descripción se incorpora en la presente como re P 109 expresa también el dominio Kringle 3 de plasminógeno hu o una proteína reportera secretada (Choi et al., Proc Nati Acad . 5022-7 (2003)). Se seleccionaron transformantes en medio qu histidina, y se identificaron integrantes correctos por siembra co transformantes hacia un medio que carecía de arginina. Se ide onces recombinantes HIS+/arg- para la expresión funcional actosil transferasa adecuadamente dirigida, analizando los N-irados por la digesta con PNGasa F de la proteína reportera K3 espectrometría de masa de ionización/desorción con láser asi triz-tiempo de vuelo (MS MALDI-TOF). Se identificaron dos trans T por medio de una colección combinatoria Los N-glucanos producidos por las cepas RDP109, R 242, incluyen cantidades significativas de N-glucanos tipo hibrid figuras 1 , 4A-4B). Por lo tanto, se creó una colección de ce tificar una secuencia de localización guía óptima par ctosiltransferasa I (hp-GalTI) de humano (similar a la estrategia Í et a/. , 2003). La cepa PBP235 es una cepa de levadura odiseñada para producir N-glucanos de mamífero triantenarios c i GIcNAc terminal. Esta cepa se generó introduciendo fusiones alizadas de mMNS1 (m = ratón), hGnTI (h = humano), dMN sophila), hGnTII y hGnTIVb en una cepa en la cual se el quinaria de N-glucosilación de levadura (PpOCHI (Pp = Pichi'a 3N01 , PpMNN4B y PpPBS2). Esta cepa fue transformada con una strucciones que contenían genes de fusión de diferentes do alTI reveló varios en los cuales se redujeron los N-giucanos híbri lucanos biantenarios. Una de estas construcciones que dio N-ntenarios e híbridos reducidos, contenía un gen de fusión que cod 58 aminoácidos N-terminales de Mntl p de S. cerevisiae (Sc nt . cerevisiae) fusionados con h GalTI.

Mediante el uso de los datos de la colección co ntificada para las secuencias guía de hpGalTI, se creó una cepa, que secreta proteínas con N-glucanos de mamífero compl actosa p-1 ,4-enlazada terminal casi homogénea (GS5.0, figura ). Esta cepa ha sido glucodiseñada para eliminar la N-glucosil adura, y expresa fusiones localizadas de mMNSI, hGnTI, dMNSII, alTI. Con base en la colección combinatoria identificada, hpGa i de fusión que codifica para ScMntl1 -58 como un dominio de loc bido a la localización mejorada de la secuencia guía, esta cepa ha nificativamente los N-glucanos tipo híbrido, en comparación con epa RDP1030. El análisis de los N-glucanos liberados por la di Gasa F de RDP1030 por MALDI-TOF, reveló la presencia d anos GFI5.8 (a-Gal)( -Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2 y GFI5.9 (a )2GlcNAc2Man3GlcNAc2 (figura 5B), por medio de la adición de iduos de a-1 ,3-galactosa a la estructura de GFI l)2GlcNAc2Man3GlcNAc2. Sin embargo, los N-glucanos híbridos las figuras 4A-4B son casi indetectables (compárense las figur las figuras 5A-5B), resultando de la localización mejorada de sumiblemente de la competencia reducida de h GalTI con nTII para substratos híbridos.

V. La identificación de una colección de a-1 ,3-GalTs sferencia de a-Gal Se creó una cepa YGLY1 169 de P. pastoris, una cepa P699-2, y secreta proteínas con N-glucanos de mamífero comp a manera similar a RDP699-2 (no mostrada). Esta cepa es tam ido a que el gen PpURA5 ha sido deletado. Se crearon plás tenían fusiones de genes que codifican para ScMnt11 -58 fusi inio catalítico de varias a-GalTs (figuras 6A-6B), incluyendo aq s musculus (pGLY1892), Sus scrofa (pGLY1893) y Canis LY1894). Todos estos plásmidos contienen al gen PpURAS rcador seleccionare. Los plásmidos pGLY1892, 1893 y 18 sformados en la cepa YGLY1 169, y se seleccionaron los transf medio que carecía de uracilo, resultando en las cepas Y LY1785 y YGLY1787, respectivamente. Cada una de estas c sformada con el plásmido pSH692, que contiene un gen que cod como un reportero secretado, y el gen shBLE como un eccíonable. El plásmido pSH692 fue transformado en las cepas Y LY1785 y YGLY1787, y se analizaron los N-glucanos liberad esta con PNGasa F de los transformantes resultantes a partir d VI. La optimización de la secuencia de localización GalT por medio de una colección de fusión combinatoria, r sferencia de a-Gal Para mejorar la transferencia de a-galactosa, se cción de plásmidos para identificar secuencias de localiza imas para SsaGaIT, con base en el plásmido pGLY2169. El LY2169 contiene al gen que codifica para el dominio catalítico de un dominio de localización de levadura, sino más bien un par d tricción, Not\ y AscI, y contiene también al gen NAT (que cod istencia al aminoglucósido nourseotricina) como un ccionable. Una colección de secuencias de ADN que codifican inios de localización de levadura (enumerados como 33-67, 74 nada en este vector usando Not\/Asc\, y los plásmidos resultant brados como pGLY2169-33 - pGLY2169-756. Esta cole smidos fue transformada en la cepa RDP1482 de P. pasto proteína reportera bajo el control del promotor AOX1. Se pr uciendo cultivos en metanol como única fuente de carbono, y se teína del sobrenadante de transformantes, y los N-glucanos libe esta con PNGasa se analizaron por MALDI-TOF. Los resultado cuando el gen de fusión ScMntl1 -58-SsaGalT fue expresado, s relación similar de N-glucanos de GFI5.0, GFI5.8 y G paración con los transformantes de la cepa YGLY1785 (figura embargo, varias fusiones de SsaGalT-dominio de localización/ a, revelaron un incremento significativo en la transferencia d gar por la relación de masas de GFI5.0, GFI5.8 y GFI5.9 observa fusión de secuencia guía-SsarGaIT individual, ScMnn21-36- 5.9 fue el único pico que se observó, indicando la transfere ntitativa de a-gal al substrato de ß-1 ,4-galactosa (figura 9).

Sur (pGLY2767) [SEQ ID NO: 4], fueron sintetizadas y clonadas ). Cada uno de estos plásmidos fue subclonado en un vector de P. pastoris que contenía al promotor AOX1 y el marcador de res acos ShBLE, y fusionado en el marco de lectura con una col tidos de señal de secreción, incluyendo la señal de pre-pro-sec tor de apareamiento a de S. cerevisiae. La cepa YGLY2229 de codiseñada con GFI5.9 fue transformada con cada uno de los plá resión que contienen a HA de la influenza, y se seleccionaron c dio mínimo que contenía 300 mg/L de zeocina. Varios transfor eccionaron y se cultivaron en placas profundas de 96 cavidad as a 26°C en medio líquido con glicerol como la única fuente de onces se centrifugaron y se resuspendieron en medio con metan ca fuente de carbono, y se incubaron a 26°C por 24 horas. Las trifugaron, y 7 µ? de sobrenadante se sometieron a análisis We ándar bajo condiciones no reductoras y sondeo con un anticuerp apareamiento alfa de S. cerevisiae (pGLY2922) expresada en Y ra 10).

Asimismo, otra cepa YGLY3812 de P. pastoris gluco GFI5.9 optimizada, fue transformada con cada uno de los plás resión que contienen a HA de la influenza, y se seleccionaron co io mínimo que contenía 300 mg/L de zeocina. Se seleccionar sformantes y se cultivaron como se indicó anteriormente. Desp ficación de la proteína por cromatografía de afinidad de Ni, dige asa para remover los N-glucanos y análisis por MS MALDI- as de N-glucano que corresponden a las glucoformas GS5.0, 5.9 se observaron para todas las proteínas HA de la influenza eba en relaciones similares a otras proteínas reporteras. Como un uestran N-glucanos de la influenza A HA Carolina del Sur expré LY3812 (figura 1 1 ). erólogos, Asn y Gln, anexos al extremo C-terminal después de 306NQ, pGLY2758). Cada uno de estos plásmidos fue subclon tor de expresión de P. pastoris que contenía al promotor A rcador de resistencia a fármacos ShBLE y fusionado en el marco la señal de pre-secreción del factor de apareamiento a de S. cer brados como pGLY2960 y pGLY2961 , respectivamente. LY3812 de P. pastoris glucodiseñada con GFI5.9 fue transfor a uno de los plásmidos de expresión que contenían a gD de HS ccionaron colonias en medio mínimo que contenía 300 mg/L d íos transformantes se seleccionaron y se cultivaron en placas pro cavidades por 72 horas a 26°C en medio líquido con glicerol com nte de carbono, entonces se centrifugaron y se resuspendieron metanol como la única fuente de carbono, y se incubaron a 26 as. Las células se centrifugaron, y 7 µ? de sobrenadante se so lisis Western blot estándar bajo condiciones reductoras y sond Una secuencia de ADN que codifica para el ectodomi teína gC de la cepa HSV-2 G, fue sintetizada y clonada y nombr LY3640 [SEQ ID NO: 7] (Gene Art. Inc., Toronto, CA). La sec N de este plásmido fue subclonada en un vector de expresi toris que contenía al promotor AOX1 y el marcador de resi acos ShBLE, y fusionada en el marco de lectura con la seña reción del factor de apareamiento a de S. cerevisiae, y nombr LY3653. La cepa YGLY3812 de P. pastoris glucodiseñada con G sformada con el plásmido de expresión que contenían a gC de seleccionaron colonias en medio mínimo que contenía 300 cina. Varios transformantes se seleccionaron y se cultivaron fundas de 96 cavidades por 72 horas a 26°C en medio líquido co o la única fuente de carbono, entonces se centrifugar uspendieron en medio con metanol como la única fuente de carb glucoformas GS5.8 y GS5.9, siendo la glucoforma GS5.9 l ominante (figura 13).

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Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1. - Una célula hospedera de hongo filamentoso o leva ie producir glucoproteínas recombinantes que tienen N-gluca en por lo menos un epítope de a-galactosilo terminal. 2. - La célula hospedera de conformidad con la reivindi cterizada además porque dicha célula hospedera es deteriorada actividad de a-1 ,6 manosiltransferasa con respecto al gluca oproteína. 3. - La célula hospedera de conformidad con la reivindi cterizada además porque la célula hospedera es disminuida o a vidad de dolichi-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-dolichil osiltransferasa. N-acetil glucosamina transferasa I (GnT), una actividad de ß- sferasa (ß-GalT) y una actividad de UDP-galactosa-4 epimerasa. 6.- La célula hospedera de conformidad con la reivindi cterizada además porque la célula hospedera se selecciona del siste de Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophil lamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minu neri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia saiictari rcuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pi charomyees cerevisiae, Saccharomyces sp. , Hansenula po/ yveromyces sp. , Kluyveromyces lactis, Candida aibicans, A lans, Aspergillus niger, Aspergilius oryzae, Trichoderma ysosporium lucknowense, Fusarium sp. , Fusarium gramineum, enatum, Physcomitrella patens y Neurospora crassa. ? · La célula hospedera de conformidad con la reivindi acterizada además porque el hospedero expresa una proteína consiste de: (a-Gal)(p-Gal)GlcNAc an5GlcNAc2; l)2GlcNAc2Man3GlcNAc2; y (a-Gal)2(p-Gal)2GlcNAc2Man3GlcN 9. - La célula hospedera de conformidad con la reivind acterizada además porque la célula hospedera ha sido diseñ ducir una proteína de vacuna. 10. - La célula hospedera de conformidad con la reivind acterizada además porque la proteina de vacuna se selecciona consiste de una glucoproteína de vacuna antiviral, una glucopr una antibacteriana y una glucoproteína de vacuna contra el cánc 1 1. - Un método para producir una célula hospedera ducir N-glucanos que tienen residuos de a-galactosilo termin prende: (a) proveer una célula hospedera de hongo fílam radura recombinante capaz de producir N-glucanos que tienen por a alfa-galactosa terminal en el extremo no reductor del N-gluc roducir un ácido nucleico que codifica para una proteína de f dura recombinante capaz de producir N-glucanos que tienen por a-galactosa terminal en el extremo no reductor del N-glu ducir un ácido nucleico que codifica para el polipéptido en pedera; (c) expresar el polipéptido en la célula hospedera; y (d) olipéptido de las células hospederas, en donde el polipéptido tie nos un N-glucano en el mismo que tiene un residuo de a-g inal. 13.- Una célula hospedera de hongo o levadura e rior recombinante que produce glucoproteínas tipo humano, pedera comprendiendo un ácido nucleico que codifica para una fusión capaz de transferir un residuo de a-galactosa en un resi actosa terminal de una rama de oligosacárido N-enlazado de un tiene un núcleo de trimanosa de una glucoproteína producida po pedera, en donde la rama del oligosacárido N-enlazado ti ructura seleccionada del grupo que consiste de: Gaipi ,4-Glc e una estructura seleccionada del grupo que consiste de: ( )GlcNAcMan5GlcNAc2; (a-Gal)(p-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2; )2(p-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2. 16. - Una composición de vacuna que compre oproteína de vacuna producida por una célula hospedera d entoso o levadura, en donde la glucoproteina comprende un ominante que comprende un epítope de a-galactosilo terminal. 17. - La composición de vacuna de conformidad ndicación 16, caracterizada además porque el N-glucano predom cciona del grupo que consiste de: (a-Gal)(P-Gal)GlcNAcMan5 al)(p-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2; y (C )2GlcNAc2Man3GlcNAc2.