CN101932718A

CN101932718A - 利用发酵法生产目的物质的方法

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Publication number: CN101932718A
Application number: CN2009801020160A
Authority: CN
Inventors: 竹下亮; 角谷直树; 阿部健二
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2008-01-10
Filing date: 2009-01-08
Publication date: 2010-12-29
Anticipated expiration: 2029-01-08
Also published as: EP2749652B1; US8617852B2; CN104560847B; WO2009088049A1; EP2241632B9; US20140080185A1; CN104560847A; EP2241632A1; CN101932718B; EP2241632B1; EP2749652A2; US9228215B2; HUE032429T2; JP2011067095A; EP2749652A3; US20110003347A1; EP2241632A4

Abstract

一种利用微生物生产目的物质的方法，包括在培养基中培养微生物，在该培养基中生成并蓄积目的物质，并且从该培养物中收集目的物质，作为所述微生物，使用被赋予了异麦芽糖酶活性或者经过修饰而增加了异麦芽糖酶活性的微生物。

Description

利用发酵法生产目的物质的方法

技术领域

本发明涉及利用微生物生产目的物质的方法，具体地，本发明公开了用于在利用微生物生产L-氨基酸或核酸等目的物质的方法中，改善作为最终目的产物的物质的生产力的方法。

背景技术

作为利用微生物生产物质的方法的代表，已知利用发酵法生产L-氨基酸的方法。L-氨基酸不仅作为调味品、食品使用，还被用作医疗目的的各种营养混合物的组分。而且，L-氨基酸还被用作动物用饲料添加剂、制药业和化学工业试剂、用于由微生物产生L-赖氨酸、L-高丝氨酸等L-氨基酸的生长因子。能够通过发酵法生产L-氨基酸的微生物已知有棒状杆菌型细菌、埃希氏菌属细菌、芽孢杆菌属细菌、沙雷氏菌属细菌等。就核酸而言也是如此。

在诸如上述的利用发酵法的目的物质生产中，在原材料方面，可以说废糖蜜等含糖原材料占据了大半江山。在氨基酸发酵、核酸发酵中也不例外，以糖作为原料来实施培养。甘蔗等中含有大量淀粉，但很少将其作为原料直接使用，基本上都是将其中所含的淀粉分解至单糖或者二糖的程度再使用。作为分解方法，一般使用淀粉酶等糖化酶液，利用它们将作为多糖的淀粉分解成葡萄糖、麦芽糖或者异麦芽糖这样的较小分子的糖。

在使用淀粉水解液的发酵生产中，如果在仅有作为主成分的葡萄糖被消耗的时间点上结束发酵，那么作为杂质包含的麦芽糖、异麦芽糖等寡糖将未被同化而白白地剩下来。对于这些寡糖，特别是异麦芽糖，埃希氏菌属细菌并不具有同化能力，它们会与发酵生产物质(特别是L-氨基酸)发生Maillard反应，将在发酵生产物纯化步骤中成为问题。

此外，对于像麦芽糖这样受葡萄糖的消耗抑制的寡糖，有必要在葡萄糖消耗后也将其消耗。为此，必须延长培养时间，因而会无端地浪费光热费用等。

关于淀粉分解物中麦芽糖的利用，已经公开了利用下述微生物的技术：所述微生物中葡萄糖PTS的IIA^Glc蛋白质与麦芽糖非PTS摄入相关蛋白质MalK之间的相互作用被弱化或消除，并且能够摄入葡萄糖和麦芽糖(美国专利第7,097,999号，欧洲专利公开第1254957号)。已知E.coli(大肠杆菌)或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)通常受葡萄糖抑制。即，当对葡萄糖和其它碳源、例如麦芽糖等进行同化时，首先同化葡萄糖，然后再同化其它碳源，而上述技术使得同时同化葡萄糖和麦芽糖成为可能。

此外，可以通过在菌体表层表达α-淀粉酶，将淀粉分解成葡萄糖或作为α-1，4-葡聚糖的麦芽糖，使其被摄入到菌体中，来提高氨基酸生产能力(Tateno，T.，et al.，Appl.Microbiol.Biotech.，74，1213-1220(2007))。

关于麦芽糖，已知通过枯草芽孢杆菌(B.subtilis)glvC基因编码的GlvC蛋白质(PTS maltose enzyme IICB)将麦芽糖摄入到细胞内，通过glvA基因编码的GlvA(6-phospho-α-glucosidase)来将摄入的麦芽糖(磷酸化麦芽糖)水解(Schonert S et al.，J Bacteriol.2006 Jun；188(11)：3911-22)。但是，至今尚没有关于glvAC基因与异麦芽糖同化的相关性的报导。

另一方面，关于异麦芽糖，枯草芽孢杆菌中存在以麦芽糖、蔗糖和异麦芽糖为底物，将其分解成单糖的α-葡糖苷酶，该酶由malL基因编码(Schonert，S.，et al.，J.Bacteriol.，180，2574-2578(1998))。

对于以大肠杆菌为代表的肠杆菌科细菌群或棒状杆菌型细菌，不知晓诸如上述的酶的存在，因而认为其不能同化异麦芽糖，也不能确定其是否能够将异麦芽糖摄入到菌体中。而且，也尚未知晓能够将分解异麦芽糖的酶分泌到菌体外的微生物的存在。

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的课题是提供以异麦芽糖为原料利用微生物通过发酵法生产目的物质的方法，使用包含异麦芽糖、或异麦芽糖和麦芽糖作为杂质的培养基，利用微生物通过发酵法生产目的物质的方法，以及用于所述方法的微生物。

解决问题的手段

本发明者人等为解决所述课题进行了深入研究，结果发现：被赋予异麦芽糖酶活性或者经过修饰从而使其异麦芽糖酶活性增加的微生物能够高效地同化异麦芽糖。而且还发现，通过将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的glvA和glvC基因导入微生物，来增强异麦芽糖酶以及麦芽糖酶活性，可以减少作为培养基中的杂质的异麦芽糖以及麦芽糖，从而完成了本发明。

即，本发明如下。

(1).一种利用微生物来生产目的物质的方法，其包括在培养基中培养微生物，从而在该培养基中生成并蓄积L-氨基酸或核酸，并从该培养物中收集目的物质，其中，所述微生物被赋予了异麦芽糖酶活性或者经过修饰而增加了异麦芽糖酶活性。

(2).前述的方法，其特征在于，该微生物进一步被赋予了将异麦芽糖摄入细胞内的活性，或者经过修饰而增加了该活性。

(3).前述的方法，其特征在于，所述微生物进一步被赋予了麦芽糖酶活性，或者经过修饰而增加了麦芽糖酶活性。

(4).前述的方法，其特征在于，所述微生物进一步被赋予了麦芽糖摄入活性，或者经过修饰而增加了该活性。

(5).前述的方法，其特征在于，所述培养基包含异麦芽糖，或者包含异麦芽糖和麦芽糖。

(6).前述的方法，其特征在于，所述微生物中导入了编码芽孢杆菌属(Bacillus)细菌的异麦芽糖酶的基因。

(7).前述的方法，其中，所述异麦芽糖酶为下述(A)或(B)所示的蛋白质：

(A)由SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(B)由在SEQ ID NO：14中取代、缺失、插入或添加一个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列组成，且具有异麦芽糖酶活性的蛋白质。

(8).前述的方法，其中，所述异麦芽糖酶由下述(a)或(b)的DNA编码：

(a)具有SEQ ID NO：13所示的碱基序列的DNA；

(b)与SEQ ID NO：13所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有异麦芽糖酶活性的蛋白质的DNA。

(9).前述的方法，其中，所述异麦芽糖酶为下述(C)或(D)所示的蛋白质：

(C)由SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(D)由在SEQ ID NO：40中取代、缺失、插入或添加一个或数个氨基酸而成的氨基酸序列组成，且具有异麦芽糖酶活性的蛋白质。

(10).前述的方法，其中，所述异麦芽糖酶由下述(c)或(d)的DNA编码：

(c)具有SEQ ID NO：39所示的碱基序列的DNA；

(d)与SEQ ID NO：39所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有异麦芽糖酶活性的蛋白质的DNA。

(11).前述的方法，其特征在于，所述微生物中导入了编码芽孢杆菌属细菌的PTS麦芽糖酶IICB的基因。

(12).前述的方法，其中，所述PTS麦芽糖酶IICB是下述(E)或(F)所示的蛋白质：

(E)由SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(F)由在SEQ ID NO：42中取代、缺失、插入或添加一个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列组成，且具有将异麦芽糖摄入细胞内的活性的蛋白质。

(13).前述的方法，其中，所述PTS麦芽糖酶IICB由下述(e)或(f)所示的DNA编码：

(e)具有SEQ ID NO：41所示的碱基序列的DNA；

(f)与SEQ ID NO：41所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有将异麦芽糖摄入细胞内的活性的蛋白质的DNA。

(14).前述的方法，其中，所述微生物是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌。

(15).前述的方法，其中，所述微生物为埃希氏菌属(Escherichia)细菌。

(16)通常.前述的方法，其中，所述埃希氏菌属细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。

(17).前述的方法，其中，所述氨基酸选自L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-苯丙氨酸。

附图说明

图1：pTWV229+pMW219-ΔPlac/MG 1655株(●)及glvA+glvC/MG1655株(▲)在M9-iMal(0.2％)培养基中的生长曲线。

图2：pTWV229+pMW219-ΔPlac/MG 1655株(●)及glvA+glvC/MG1655株(▲)在M9-Glc(0.02％)-iMal(0.18％)培养基中的生长曲线。

发明的具体实施方式

以下，对本发明进行具体说明。

在本申请的发明中，可利用微生物生产的目的物质是指L-氨基酸或核酸。在本发明中，对“L-氨基酸”没有特殊限制，只要其在利用微生物的发酵法中能够在培养基中蓄积即可。对于L-氨基酸的种类没有特殊限制，可以列举出：L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-瓜氨酸这样的碱性氨基酸，L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、甘氨酸这样的脂肪族氨基酸，L-苏氨酸、L-丝氨酸这样的作为羟基单氨基羧酸的氨基酸，L-脯氨酸这样的环式氨基酸，L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸这样的芳香族氨基酸，L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸这样的含硫氨基酸，L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等酸性氨基酸及其酰胺衍生物。

本发明中使用的微生物也可以具有两种以上氨基酸的生产能力。

此外，在本发明中，L-氨基酸包括：游离体的L-氨基酸和/或其盐，例如硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐、钾盐。

在本发明中，对“核酸”没有特殊限制，只要其能够在利用微生物的发酵法中，在培养基中蓄积即可。作为核酸，可以列举出嘌呤核苷、嘌呤核苷酸等。嘌呤核苷包括肌苷、黄苷、鸟苷、腺苷等；嘌呤核苷酸包括嘌呤核苷的5’-磷酸酯例如肌苷酸(肌苷-5’-磷酸，以下也称“IMP”)、黄苷酸(黄苷-5’-磷酸，以下也称“XMP”)、鸟苷酸(鸟苷-5’-单磷酸。以下也称“GMP”)、腺苷酸(腺苷-5’-单磷酸。以下也称“AMP”)等。

本发明中使用的微生物也可以具有两种以上核酸的生产能力。

此外，在本发明中，核酸包括游离体的核酸和核酸盐，例如钠盐、钾盐。

本申请的发明中可利用的微生物是被赋予了异麦芽糖酶活性或者经过了修饰而增加了异麦芽糖酶活性的微生物。

在本发明中，“异麦芽糖酶活性”是指：将异麦芽糖分解成2分子的葡萄糖的活性(EC 3.2.1.10)，或者将异麦芽糖被摄入细胞内时产生的磷酸化的异麦芽糖分解成葡萄糖和葡萄糖磷酸的活性(EC 3.2.1.122)。此外，如无特别说明，“异麦芽糖酶”是指具有异麦芽糖酶活性的酶。例如，即使是具有分解麦芽糖的活性、通常称为麦芽糖酶的酶，只要其具有分解异麦芽糖的活性，则也相当于本发明中的异麦芽糖酶。因此，本发明中的异麦芽糖酶有时也称作麦芽糖诱导型α-葡萄糖苷酶(maltose-inducible alpha-glucosidase)或寡-1，6-葡萄糖苷酶(oligo-1，6-glucosidase)。

此外，在本发明中，“麦芽糖酶活性”是指将麦芽糖分解成2分子葡萄糖的活性(EC 3.2.1.20)，或者将磷酸化的麦芽糖分解成葡萄糖和葡萄糖磷酸的活性(EC 3.2.1.122)。

异麦芽糖酶活性可以采用Thompson J(1：J Biol Chem.1998 Oct 16；273(42)：27347-56.)报道的方法、并将底物由麦芽糖变更为异麦芽糖来测定。此外，麦芽糖酶活性可以采用上述的Thompson J报道的方法来测定。

在本发明中，除了赋予/增强异麦芽糖酶和/或麦芽糖酶活性之外，还可以赋予或增加异麦芽糖和/或麦芽糖摄入活性。“异麦芽糖摄入活性”是指：将细胞外的异麦芽糖摄入到细胞内的活性，可通过异麦芽糖的转运蛋白摄入，也可通过异麦芽糖特异性通透酶摄入细胞内。转运蛋白包括磷酸转移酶系统(Phosphotransferase system(PTS))或ABC转运蛋白、主要易化扩散载体超家族(Major Facilitator superfamily(MFS))，在本发明中优选对磷酸转移酶系统加以强化。异麦芽糖摄入活性可以采用J.Bacteriol.1991 Apr；173(7)：2180-2186或J.Biol.Chem.2006 Jun 30；281(26)：17900-17908中记载的方法来确认。

此外，在本发明中，就异麦芽糖摄入活性而言，还可以具有除了异麦芽糖之外还摄入麦芽糖的活性。

作为能够在本发明中使用的微生物，具体地可以列举出：细菌例如属于埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)、摩根氏菌属(Morganella)等的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌，棒状杆菌型细菌，芽孢杆菌属(Bacillus)细菌，链球菌属(Streptococcus)细菌或酵母属(Saccharomyces)酵母等。优选是可进行基因取代的微生物。

作为埃希氏菌属细菌，可以列举出大肠杆菌(Escherichia coli)等。在采用基因工程方法对大肠杆菌进行育种时，可以使用大肠杆菌K-12株以及其衍生株大肠杆菌MG1655株(ATCC 47076)和W3110株(ATCC 27325)。大肠杆菌K-12株或衍生株可以从例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)通过分售获得(地址：ATCC，Address：P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，United Statesof America)。

能够在本发明中使用的微生物可以是天然不具有异麦芽糖同化性的微生物，也可以是天然具有异麦芽糖同化能力的微生物。“异麦芽糖同化性”是指：当在包含异麦芽糖的培养基中培养微生物时，以异麦芽糖为碳源进行代谢的能力。

作为天然不具有异麦芽糖同化性的微生物，可以列举出肠杆菌科细菌、棒状杆菌型细菌等。此外，作为具有异麦芽糖同化能力的微生物，可以列举出具有将异麦芽糖摄入细胞内的活性的微生物以及具有细胞内异麦芽糖活性的微生物。作为这样的微生物，可以列举芽孢杆菌属细菌、链球菌属细菌、酵母菌属酵母等。

本发明的微生物可以通过以具有目的物质生产能力的微生物为亲本菌株，并赋予该亲本菌株异麦芽糖酶活性，或对其进行修饰而增强其异麦芽糖酶活性来获得。此外，本发明的微生物可以通过以被赋予了异麦芽糖酶活性或经过修饰而增加了异麦芽糖酶活性的微生物作为亲本菌株，并赋予该亲本菌株目的物质生产能力；或增强该亲本菌株的目的物质生产能力来获得。

作为埃希氏菌属细菌，可以利用Neidhardt等的著作(Neidhardt，F.C.et.al.，Escherichia coli and Salmonella Typhimurium，American Society forMicrobiology，Washington D.C.，1208，表1)中列举出的细菌，例如大肠杆菌等。作为大肠杆菌的野生菌株，可以列举出例如K12株、或其衍生株大肠杆菌MG1655株(ATCC No.47076)和W3110株(ATCC No.27325)等。这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)(地址：ATCC，地址：P.O.Box1549，Manassas，VA 20108，1，United States of America)通过分售获得。

此外，肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等；泛菌属细菌的实例包括Pantoea ananatis。而且，在近几年中，基于16S rRNA核苷酸序列分析，有些成团肠杆菌被重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoeaananatis和斯氏泛菌(Pantoea stewartii)等。在本发明中，可以使用归类在肠杆菌科中的任何细菌，无论属于肠杆菌属或泛菌属均可。在利用基因工程手段选育Pantoea ananatis的场合，Pantoea ananatis AJ13355株(FERMBP-6614)、AJ13356株(FERM BP-6615)、AJ13601株(FERM BP-7207)和它们的衍生株均可使用。这些菌株在当初分离时被鉴定为成团肠杆菌，并进行了保藏。但如上所述，通过使用16S rRNA核苷酸序列的分析，已将它们重分类为Pantoea ananatis。

作为棒状杆菌型细菌，可以利用下述微生物：它们是在《Bergey’s Manualof Determinative Bacteriology》第8版599页(1974)中定义的一组微生物，被分类为需氧性、革兰氏阳性、非耐酸性、无芽孢形成能力的杆菌。此外，棒状杆菌型细菌包括曾经归类于短杆菌属(Brevibacterium)、但现在已经统一归类于棒杆菌属(Corynebacterium)的那些细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))，并且还包括属于与棒杆菌属极其近缘的短杆菌属或微杆菌属(Microbacterium)的细菌。

这样的棒状杆菌型细菌的例子可以列举如下。

嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acctoacidophlum)

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)

烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)

美棒杆菌(Corynebacterium callunae)

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)

嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(Corynebacteriumefficiens)

力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)

二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)

Brevibacterium immariophilum

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)

产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)

白色短杆菌(Brevibacterium album)

蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)

具体地，可以示例出诸如下述的菌株。

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806

烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)ATCC21511

美棒杆菌(Corynebacterium callunae)ATCC15991

谷氨酸棒杆菌ATCC13020，ATCC13032，ATCC13060

百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)ATCC15990

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)ATCC17965

嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium efficiens)AJ12340(FERM BP-1539)

力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)ATCC13868

二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC14020

黄色短杆菌ATCC13826，ATCC14067，AJ12418(FERM BP-2205)

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869(谷氨酸棒杆菌ATCC13869)

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)ATCC13825

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)ATCC19240

产氨短杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)ATCC6871、ATCC6872

白色棒杆菌(Brevibacterium album)ATCC15111

蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)ATCC15112

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354

这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC，地址：P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，1，UnitedStates of America)通过分售获得。即，每个菌株都被给予对应的登录号，可以利用该登录号订购该菌株。与各菌株对应的登录号记载在美国典型培养物保藏中心的产品目录中(参照http://www.atcc.org/)。此外，AJ12340菌株根据布达佩斯条约的规定于1987年10月27日被保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现称独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)(

305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM BP-1539。此外，AJ12418菌株根据布达佩斯条约的规定于1989年1月5日被保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号FERM BP-2205。

在使用芽孢杆菌属细菌时，芽孢杆菌属细菌的例子包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)等。

作为枯草芽孢杆菌，可以例举枯草芽孢杆菌168Marburg(ATCC6051)、枯草芽孢杆菌PY79(Plasmid，1984，12，1-9)等；作为解淀粉芽孢杆菌，可以例举解淀粉芽孢杆菌T(ATCC23842)以及解淀粉芽孢杆菌N(ATCC23845)等。此外，作为短小芽孢杆菌，可以例举短小芽孢杆菌Gottheil No.3218(ATCC No.21005)(美国专利第3,616,206号)等。

以下描述将生产L-氨基酸或核酸的能力赋予如上所述的亲本菌株的方法。

为了赋予生产L-氨基酸或核酸的能力，可使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等的选育中常规使用的方法(参见《氨基酸发酵》(アミノ酸発酵)(株)学会出版中心(学会出版センタ一)，1986年5月30日第1版，第77-100页)，如获得营养缺陷突变体、类似物抗性菌株或代谢调控突变体，或构建L-氨基酸或核酸的生物合成系统酶的表达增强的重组菌株等。这里，在L-氨基酸生产菌的选育中，所赋予的营养缺陷突变、类似物抗性、代谢调节突变等性质可以单独赋予一种，也可以赋予两种或三种以上。此外，表达增强的L-氨基酸生物合成系统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。此外，也可以将营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质的赋予与生物合成系统酶活性的增强相结合来进行。

具有生产L-氨基酸或核酸的能力的营养缺陷突变体菌株、L-氨基酸或核酸类似物抗性菌株或代谢调控突变体菌株可以这样获得：对亲本菌株或野生型菌株施以常规的突变处理，即用X-射线或紫外线照射处理，或用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等处理；然后，从所得突变株中选择显示营养缺陷、类似物抗性或代谢调控突变，且具有L-氨基酸生产能力的那些菌株。

具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷型突变株、L-氨基酸类似物抗性株或代谢调控突变株可以这样获得：对亲本株或野生株实施常规的突变处理，即用X-射线或紫外线照射处理，或用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲磺酸乙酯(EMS)等诱变剂处理；然后，从所得突变株中选择显示营养缺陷、类似物抗性或代谢调控突变、且具有L-氨基酸生产能力的那些菌株。

以下，具体示例赋予氨基酸生产能力的方法和氨基酸生产菌。

L-赖氨酸生产菌

以下，以L-赖氨酸生产菌及其构建方法为例进行说明。

作为具有L-赖氨酸生产能力的菌株，可以列举出例如L-赖氨酸类似物抗性株或代谢制御突变株。作为L-赖氨酸类似物的例子，可以列举出氧代赖氨酸、赖氨酸氧肟酸、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(以下也简记为“AEC”)、γ-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺等，但不限于此。对于所述赖氨酸类似物具有抗性的突变株，可以通过对属于肠杆菌科细菌科的细菌或棒状杆菌型细菌实施常规的人工突变处理来获得。作为L-赖氨酸生产菌，具体可以列举出大肠杆菌AJ11442株(FERM BP-1543、NRRL B-12185；参照特开昭56-18596号公报和美国专利第4346170号说明书)、大肠杆菌VL611株(特开2000-189180号公报)等。此外，作为大肠杆菌的L-赖氨酸生产菌，也可以使用WC196株(参照国际公开第96/17930号小册子)。

此外，通过提高L-赖氨酸生物合成系统的酶活性也可以构建L-赖氨酸生产菌。所述酶活性的提高可以通过提高编码酶的基因在细胞内的拷贝数或对表达调节序列进行修饰来实现。关于提高编码L-赖氨酸生物合成系统的酶的基因在细胞内的拷贝数以及对表达调节序列进行修饰，可以按照与后述的异麦芽糖酶基因的情况相同的方法来实现。

作为编码L-赖氨酸生物合成系统酶的基因，可以列举出：二氢吡啶二羧酸合成酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脱碳酸酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(以上、国际公开第96/40934号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(特开昭60-87788号公报)、天冬氨酸氨基转移酶基因(aspC)(特公平6-102028号公报)、二氨基庚二酸差向异构酶基因(dapF)(特开2003-135066号公报)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)(国际公开第00/61723号小册子)等二氨基庚二酸途径的酶的基因，或者高乌头酸水合酶基因(特开2000-157276号公报)等氨基己二酸途径的酶等的基因。此外，可以增加亲本菌株中涉及能量效率(energy efficiency)的基因(cyo)(EP 1170376 A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利5,830,716)、编码具有L-赖氨酸分泌活性的蛋白质的ybjE基因(WO2005/073390)、编码谷氨酸脱氢酶的基因(gdhA)(Gene23：199-209(1983))或它们的任意组合的基因表达水平。括号内为所述基因的简记符号。

已知大肠杆菌来源的野生型二氢吡啶二羧酸合成酶受L-赖氨酸的反馈抑制，大肠杆菌来源的野生型天冬氨酸激酶受L-赖氨酸的抑制和反馈抑制。因此，在使用dapA基因和lysC基因时，优选这些基因是不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变型基因。

作为编码不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变型二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA，可以列举编码具有第118位的组氨酸残基被取代成酪氨酸残基的序列的蛋白质的DNA。此外，作为编码不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变型天冬氨酸激酶的DNA，可以列举编码具有第352位的苏氨酸残基被取代为异亮氨酸残基、第323位的甘氨酸残基被取代为天冬酰胺残基、第318位的甲硫氨酸被取代为异亮氨酸的序列的AKIII的DNA(关于这些突变体，可参见美国专利第5661012号和第6040160号说明书)。突变型DNA可以通过利用PCR等的定点突变方法获得。

而且，作为包含编码突变型二氢吡啶二羧酸合成酶的突变型dapA和编码突变型天冬氨酸激酶的突变型lysC的质粒，已知有广宿主域质粒RSFD80、pCAB1、pCABD2(美国专利第6040160号说明书)。用该质粒转化的大肠杆菌JM109株(美国专利第6040160号说明书)命名为AJ12396，该株于1993年10月28日被保藏在日本通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)，保藏号FERM P-13936；并于1994年11月1日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERMBP-4859。RSFD80可采用公知方法从AJ12396株获取。

而且，L-赖氨酸生产菌中，催化从L-赖氨酸生物合成途径改道而生成其它化合物的反应的酶的活性、或对L-氨基酸的合成或蓄积起负面作用的酶的活性可以是降低或缺损的。在L-赖氨酸生产中，这样的酶有高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(cadA，ldcC)、苹果酸酶(malic enzyme)等，该酶的活性已降低或缺损的菌株记载于国际公开第WO95/23864号、第WO96/17930号小册子、第WO2005/010175号小册子等。

为了使赖氨酸脱羧酶活性降低或缺损，优选降低编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因和ldcC基因这两者的表达。降低这两个基因的表达可以按照WO2006/078039号小册子所述的方法来进行。

作为降低或者缺损所述酶活性的方法，可以采用常规的突变处理法或基因重组技术，向基因组上的上述酶的基因中导入使得细胞中该酶的活性降低或缺损的突变。这样的突变的导入可以如下地实现：例如，通过基因重组缺损基因组上的编码酶的基因，或者对启动子、shine-dalgarno(SD)序列等表达调节序列进行修饰，等等。此外，还可以这样完成：向基因组上的编码酶的区域导入氨基酸取代(错义突变)、或者导入终止密码子(无义突变)、或者导入添加或缺失一～二个碱基的移码突变，或者使基因的一部分或整个区域缺失(J.Biol.Chem.272：8611-8617(1997))。此外，酶活性的降低或缺损还可以这样实现：构建编码编码区域整体或部分缺失的突变酶的基因，通过同源重组等用该基因取代基因组上的正常基因，或者将转座子、IS因子导入到该基因中。

例如，为了通过基因重组导入使得上述酶的活性降低或缺损的突变，可以采用诸如以下的方法。对目的基因的部分序列进行修饰，制备不产生正常发挥功能的酶的突变型基因，用含该基因的DNA转化属于肠杆菌科细菌科的细菌，通过突变型基因与基因组上的基因之间发生重组，可以将基因组上的目的基因替换成突变型。诸如上述的利用同源重组的基因取代包括：称为“Red驱动整合(Red-driven integration)”的方法(Datsenko，K.A，andWanner，B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97：6640-6645(2000))、组合使用Red驱动整合法与λ噬菌体来源的切出系统(Cho，E.H.，Gumport，R.I.，Gardner，J.F.J.Bacteriol.184：5200-5203(2002))的方法(参照WO2005/010175号)等使用线性DNA的方法，或者使用含温度敏感型复制起点的质粒的方法等(美国专利第6303383号、特开平05-007491号公报)。此外，基于如上述的利用了同源重组的基因取代的位点特异性突变导入还可以利用在宿主中不具有复制能力的质粒来进行。

作为优选的L-赖氨酸生产菌，可以列举出大肠杆菌WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2(WO2006/078039)。该菌株是通过在WC196株中破坏编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因、并导入包含赖氨酸生物合成系统基因的质粒pCABD2(美国专利第6,040,160号)而构建的菌株。WC196株是从大肠杆菌K-12来源的W3110株得到的菌株，其是用突变型lysC基因替换W3110株染色体上的野生型lysC基因后，再赋予AEC抗性而选育得到的(美国专利5,827,698)，所述突变型lysC基因编码由于第352位的苏氨酸被替换成异亮氨酸而解除了L-赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶III(美国专利5,661,012)。WC196株被命名为大肠杆菌AJ13069，已于1994年12月6日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、

305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM P-14690；并于1995年9月29日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-5252(美国专利5,827,698)。WC196ΔcadAΔldcC本身也是优选的L-赖氨酸生产菌。WC196ΔcadAΔldcC被命名为AJ110692，并于2008年10月7日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(

305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM BP-11027。

pCABD2包含：编码具有解除了L-赖氨酸反馈抑制的突变的大肠杆菌来源的二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPS)的突变型dapA基因、编码具有解除了L-赖氨酸反馈抑制的突变的大肠杆菌来源天冬氨酸激酶III的突变型lysC基因、编码大肠杆菌来源二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因、以及编码乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)来源的二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因(国际公开第WO95/16042、WO01/53459号小册子)。

增强诸如上述的L-赖氨酸生物合成相关酶的基因表达的方法、降低酶活性的方法对于其它编码L-氨基酸生物合成酶的基因也同样适用。

作为具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，可以列举出：S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸(AEC)抗性突变株(乳发酵短杆菌AJ11082(NRRL B-11470)株等：参照特公昭56-1914号公报、特公昭56-1915号公报、特公昭57-14157号公报、特公昭57-14158号公报、特公昭57-30474号公报、特公昭58-10075号公报、特公昭59-4993号公报、特公昭61-35840号公报、特公昭62-24074号公报、特公昭62-36673号公报、特公平5-11958号公报、特公平7-112437号公报、特公平7-112438号公报)；生长需要L-高丝氨酸等氨基酸的突变株(参照特公昭48-28078号公报、特公昭56-6499号公报)；显示AEC抗性且需要L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸等氨基酸的突变株(参照美国专利第3708395号以及第3825472号说明书)；显示DL-α-氨基-ε-己内酰胺、α-氨基-月桂内酰胺、天冬氨酸-类似物、磺胺类药、醌类、N-月桂酰亮氨酸抗性的L-赖氨酸生产突变株；显示草酰乙酸脱碳酸酶(脱羧酶)或呼吸体系酶抑制剂抗性的L-赖氨酸生产突变株(特开昭50-53588号公报、特开昭50-31093号公报、特开昭52-102498号公报、特开昭53-9394号公报、特开昭53-86089号公报、特开昭55-9783号公报、特开昭55-9759号公报、特开昭56-32995号公报、特开昭56-39778号公报、特公昭53-43591号公报、特公昭53-1833号公报)；需要肌醇或乙酸的L-赖氨酸生产突变株(特开昭55-9784号公报、特开昭56-8692号公报)；对氟代丙酮酸或34℃以上的温度显示敏感性的L-赖氨酸生产突变株(特开昭55-9783号公报、特开昭53-86090号公报)；对乙二醇显示抗性、且生产L-赖氨酸的短杆菌属或棒杆菌属的生产突变株(美国专利第4411997号说明书)等。

L-色氨酸生产菌

L-色氨酸生产菌或用于衍生L-色氨酸生产务的亲本株的例子包括但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株：大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)(美国专利5,756,345)，其中由突变的trpS基因编码的色氨酰-tRNA合成酶缺陷；大肠杆菌SV164(pGH5)(美国专利6,180,373)，其具有编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase)的trpE等位基因；色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美国专利4,371,614)；磷酸烯醇丙酮酸的生产能力增加的大肠杆菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps(WO9708333，美国专利6,319,696)等等。此外，还可以使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白的活性增强的属于埃希氏菌属的L-色氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473A1和2003/0157667A1)。

L-色氨酸生产菌或用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的例子还包括增强了选自邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)和色氨酸合酶(trpAB)中的1种以上的酶的活性的菌株。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者都受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此可以向这些酶中引入使反馈抑制解除的突变。具有此类突变的菌株的具体实例包括具有脱敏型邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164、和通过将质粒pGH5(WO94/08031)导入大肠杆菌SV164而获得的转化菌株，所述质粒pGH5包含编码解除了反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的突变的serA基因。

此外，作为L-色氨酸生产菌或用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的例子，可以例举：增强了3-磷酸丝氨酸磷酸酶(serB)活性的菌株(US4,371,614)、增强了磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pckA)活性的菌株(WO2004/090125)、组成型表达乙醛酸途径的酶的菌株(WO2005/103275)。

L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸均为芳族氨基酸，共享生物合成系统。编码芳族氨基酸生物合成系统酶的基因的实例包括脱氧阿拉伯-庚酮糖酸磷酸合酶(deoxyarabino-heptulosonate phosphate synthase)(aroG)、3-脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)(aroA)和分支酸合酶(chorismate synthase)(aroC)(欧洲申请公开763127号说明书)。此外，已知这些基因由酪氨酸抑制子(tyrR)调控，所以也可通过缺损tyrR基因来增加芳族氨基酸的生物合成系统酶活性(参考欧洲专利763127的说明书)。此外，酶名称后的括号内为基因名称(后文中亦然)。

此外，当强化各种氨基酸生产能力时，可以减弱目的芳族氨基酸以外的生物合成系统。例如当目的氨基酸为L-色氨酸时，可以减弱L-苯丙氨酸生物合成系统、L-酪氨酸生物合成系统(US4,371,614)。

在本发明中，“酶活性提高”是指例如下述情况：平均每个细胞的酶分子数增加，或者平均每个酶分子的比活性提高，等等。例如，可以通过提高酶的基因的表达量来提高活性。优选与微生物的非修饰菌株、例如野生型菌株相比，细胞内的酶的活性有所提高。

此外，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(aroF，aroG)受到芳族氨基酸的反馈抑制，因此可以对其进行修饰，以使其不受反馈抑制。例如，对于aroF，可以将N末端起第147位的L-天冬氨酸或第181位的L-丝氨酸取代为其它氨基酸残基的突变型aroF基因导入宿主，而对于aroG，可以将N末端起第146位的L-天冬氨酸、第147位的L-甲硫氨酸、第150位的L-脯氨酸或第202位的L-丙氨酸中的1个氨基酸残基、或者第157位的L-甲硫氨酸和第219位的L-丙氨酸这两个氨基酸残基取代为其它氨基酸的突变型aroG基因导入宿主，从而获得芳族生产氨基酸生产菌(EP0488424)。

L-色氨酸生产菌或用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的例子还包括导入了包含编码抑制解除型邻氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操纵子的菌株(特开昭57-71397号，特开昭62-244382号，美国专利第4,371,614)。此外，可以通过增加色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由α和β亚单位组成，这两种亚单位分别由trpA和trpB基因编码。另外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-马来酸合酶操纵子的表达来改进L-色氨酸生产能力(WO2005/103275)。

作为棒状杆菌型细菌，可以使用下列菌株：磺胺胍(sulfaguanidine)抗性株谷氨酸棒杆菌AJ12118(FERM BP-478，特许01681002号)、导入了色氨酸操纵子的棒状杆菌型细菌(特开S63240794号公报)，导入了编码棒状杆菌型细菌来源的莽草酸激酶的基因的棒状杆菌型细菌(特开01994749号公报)。

L-苯丙氨酸生产菌

L-苯丙氨酸生产菌或用于衍生L-苯丙氨酸生产菌的亲本株的例子包括，但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株：大肠杆菌AJ12739(tyrA∷Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)；保持有突变型pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC 55371)(美国专利5，354,672)；大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)；大肠杆菌NRRL B-12141，NRRL B-12145，NRRL B-12146和NRRL B-12147(美国专利4,407,952)等。此外，也可以使用大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERM BP-3566)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERMBP-12662)和命名为AJ 12604的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB](FERM BP-3579)作为亲本菌株(EP 488424B1)。此外，还可使用增加了由yedA基因或yddG基因所编码的蛋白的活性的、属于埃希氏菌属的L-苯丙氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473A1和2003/0157667A1)。

作为属于棒状杆菌型细菌的苯丙氨酸生产菌，可以使用下列菌株：降低了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或丙酮酸激酶活性的谷氨酸棒杆菌BPS-13株(FERM BP-1777)，K77(FERM BP-2062)和K78(FERM BP-2063)(欧洲专利公开公报331145，JP02303495)，酪氨酸营养缺陷株(JP05049489)等。

此外，对于苯丙氨酸生产菌，通过进行修饰使得细胞将副产物摄入细胞内，例如通过增加L-色氨酸摄取基因tnaB或mtr或者L-酪氨酸摄取基因tyrP的表达量，也可以获得高效地生产L-苯丙氨酸的菌株(EP1484410)。

L-酪氨酸生产菌

作为酪氨酸生产菌的例子，可以列举出具有不受酪氨酸抑制的脱敏型预苯酸脱水酶基因(tyrA)的埃希氏菌属细菌(欧洲专利申请公开1616940号公报)。

L-缬氨酸生产菌

L-缬氨酸生产菌或用于衍生L-缬氨酸生产菌的亲本株的例子包括但不限于经修饰而过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利第5,998,178号)。优选将ilvGMEDA操纵子中对衰减而言必需的区域移除以使操纵子的表达不会被产生的L-缬氨酸所削弱。此外，优选将操纵子中的ilvA基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。

用于衍生本发明的L-缬氨酸生产菌的亲本株的实例还包括在氨酰t-RNA合成酶中具有突变的突变株(美国专利第5,658,766号)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，该菌株在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。大肠杆菌VL1970于1988年6月24日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，117545 Moscow，1st Dorozhny proezd，1)，保藏号为VKPM B-4411。

此外，还可以使用其生长需要硫辛酸(lipoic acid)和/或缺失H⁺-ATP酶的突变株(WO96/06926)作为亲本株。

作为棒状杆菌型细菌中的L-缬氨酸生产菌，包括例如通过修饰而增强了编码L-缬氨酸生物合成相关酶的基因的表达的菌株。L-缬氨酸生物合成相关酶的实例包括由ilvBNC操纵子编码的酶，即，由ilvBN编码的乙酰羟酸合酶、由ilvC编码的异构还原酶(isomero-reductase)(ilvC)(国际公开小册子WO00-/50624号)。此外，由于ilvBNC操纵子受到L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的操纵子的表达调控，所以最好是解除弱化作用，以解除由所生成的L-缬氨酸导致的表达抑制。

棒状杆菌型细菌的L-缬氨酸生产能力的赋予或提高可以通过降低或者缺损至少一种与减少L-缬氨酸产生的物质代谢途径相关的酶的活性来进行。例如，可以考虑降低涉及L-亮氨酸合成的苏氨酸脱水酶的活性，或降低涉及D-泛酸合成的酶的活性(国际公开小册子WO0050624号)。

其它赋予L-缬氨酸生产能力的方法还包括例如赋予对氨基酸类似物等的抗性的方法。

例如，可以使用L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸营养缺陷性的、并对D-核糖、嘌呤核糖核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的、并且具有L-缬氨酸生产能力的突变菌株(FERM P-1841，FERM P-29，特公昭53-025034)，对聚酮类有抗性的突变菌株(FERM P-1763，FERM P-1764；特公平06-065314)，在以醋酸为唯一碳源的培养基中对L-缬氨酸有抗性、且在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中对丙酮酸类似物(氟丙酮酸(fluoropyruvic acid)等)敏感的突变菌株(FERM BP-3006，BP-3007，日本专利3006929号)。

此外，作为与支链氨基酸的合成相关的基因，可以例举ilvGMEDA操纵子。该操纵子受L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的操纵子表达调控(弱化作用)，因此，通过使微生物携带弱化作用所必需的区域已被除去或突变的ilvGMEDA操纵子，能够提高它们的L-氨基酸生产性能。

L-异亮氨酸生产菌

L-异亮氨酸生产菌或用于衍生L-异亮氨酸生产菌的亲本株的例子包括，但不限于对6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突变株(特开平5-304969号)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸等具有抗性的突变株，以及对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变株(特开平5-130882号)。此外，还可以使用经编码涉及L-异亮氨酸生物合成的蛋白(如苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合酶(acetohydroxatesynthase)等)的基因转化过的重组菌株作为亲本株(特开平2-458号，FR0356739，和美国专利第5,998,178号)。

棒状杆菌型细菌中的L-异亮氨酸生产菌的例子包括：扩增了编码支链氨基酸分泌蛋白的brnE基因的棒状杆菌型细菌(特开2001-169788)、通过与L-赖氨酸生产菌进行原生质体融合而被赋予了L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌(特开昭62-74293)、增强了高丝氨酸脱氢酶的棒状杆菌型细菌(特开昭62-91193)、苏氨酸氧肟酸(threonine hydroxamete)抗性菌株(特开昭62-195293)、α-酮丙二酸(α-ketomalonic acid)抗性菌株(特开昭61-15695)和甲基赖氨酸抗性菌株(特开昭61-15696)。

L-亮氨酸生产菌

L-亮氨酸生产菌或用于衍生L-亮氨酸生产菌的亲本株的例子包括，但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株：对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPM B-7386，美国专利第6,124,121号))或对亮氨酸类似物(包括β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸等)有抗性的大肠杆菌菌株(特公昭62-34397号和特开平8-70879号)；通过WO96/06926中描述的基因工程方法获得的大肠杆菌菌株；大肠杆菌H-9068(特开平8-70879号)，等等。

本发明的细菌可以是经过改良而增加了涉及L-亮氨酸生物合成的一种以上的基因的表达的。这些基因的实例优选可例举以突变leuA基因(美国专利第6,403,342号)为代表的leuABCD操纵子中的基因，其中所述突变leuA基因编码解除了L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合酶。此外，可以通过增加编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的一种以上的基因的表达来改良本发明的细菌。这类基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041 A2)。

棒状杆菌型细菌中的L-亮氨酸生产菌的例子包括：2-噻唑丙氨酸和β-羟基亮氨酸抗性菌株(特开平8-266295)，缬氨酸类似物抗性菌株(特开昭63-248392)，缬氨酸营养缺陷菌株(特公昭38-4395)，S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)抗性菌株(特公昭51-37347)以及苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸营养缺陷菌株(特公昭54-36233)。

L-谷氨酸生产菌

关于适合作为L-谷氨酸生产菌的菌株，可以例举进行修饰使得编码L-谷氨酸生物合成相关酶的基因的表达增强的方法。作为L-谷氨酸生物合成相关酶，相关基因的实例包括但不限于编码如下酶的基因：谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、顺乌头酸水合酶(acnA，acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF，lpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA，pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA，pfkB)和葡糖磷酸异构酶(pgi)，等等。

经修饰而增强了柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、异柠檬酸脱氢酶基因、丙酮酸脱氢酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达的菌株的实例包括在EP1078989A、EP955368A和EP952221A、EP1033407A中公开的那些菌株。

用于赋予L-谷氨酸生产能力的修饰还可以通过降低或缺损下述酶的活性来实现，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径改道而产生其它化合物的反应。这类催化从L-谷氨酸生物合成途径改道并产生L-谷氨酸以外的化合物的反应的酶的实例包括异柠檬酸裂合酶，α-酮戊二酸脱氢酶，乙酰羟酸合酶(acetohydorxy acid synthase)，乙酰乳酸合酶，甲酸乙酰转移酶，乳酸脱氢酶，谷氨酸脱羧酶，1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(1-pyrroline-5-carboxilatedehydrogenase)(putA)等。

例如，为了降低α-酮戊二酸脱氢酶的活性，可以通过使用编码α-酮戊二酸脱氢酶的Elo亚基的sucA(odhA)基因来进行修饰。α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的菌株包括例如如下菌株：

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ΔS株(国际公开95/34672号小册子)

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)AJ12821(参照FERMBP-4172；法国专利公报9401748号说明书)

黄色短杆菌AJ12822(FERMBP-4173；参照法国专利公报9401748号说明书)

谷氨酸棒杆菌AJ12823(FERMBP-4174；参照法国专利公报9401748号说明书)

Pantoea ananatis AJ13601(FERM BP-7207)

植生克雷伯氏菌AJ13410株(FERM BP-6617)

Pantoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614)。

这里，Pantoea ananatis AJ13356由于αKGDH-E1亚基基因(sucA)的破坏而缺损了α-酮戊二酸脱氢酶活性。该菌株在分离当时被鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)，作为成团肠杆菌AJ13356进行了保藏。但是，基于16S rRNA核苷酸序列等，其被重新分类为Pantoea ananatis。尽管AJ13356在上述保藏机构中是作为成团肠杆菌保藏的，在本说明书中仍将其描述为Pantoea ananatis。

而且，可以通过下述方法赋予棒状杆菌型细菌以L-谷氨酸生产能力：扩增yggB基因(NCgl 1221；NP_600492.Reports small-conductance.[gi：19552490]；WO2006/070944)的方法，和导入编码区中导入了突变的突变型yggB基因的方法。

其它赋予或增加L-谷氨酸生产能力的方法还包括赋予对有机酸类似物、呼吸链抑制剂等的抗性的方法，和赋予对细胞壁合成抑制剂的敏感性的方法。这类方法的实例包括赋予单氟乙酸抗性的方法(特开昭50-113209)、赋予腺嘌呤抗性或胸腺嘧啶抗性的方法(特开昭57-065198)、弱化脲酶的方法(特开昭52-038088)、赋予丙二酸抗性的方法(特开昭52-038088)、赋予针对苯并吡喃酮或萘醌类的抗性的方法(特开昭56-1889)、赋予HOQNO抗性的方法(特开昭56-140895)、赋予α-酮丙二酸抗性的方法(特开昭57-2689)、赋予胍抗性的方法(特开昭56-35981)和赋予青霉素敏感性的方法(特开平4-88994)，等等。

这样的抗性菌株的具体实例包括如下菌株：

黄色短杆菌AJ3949(FERM BP-2632：参照特开昭50-113209)

谷氨酸棒杆菌AJ11628(FERM P-5736；参照特开昭57-065198)

黄色短杆菌AJ11355(FERM P-5007；参照特开昭56-1889号公报)

谷氨酸棒杆菌AJ11368(FERM P-5020；参照特开昭56-1889号公报)

黄色短杆菌AJ11217(FERM P-4318；参照特开昭57-2689号公报)

谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERM P-4319；参照特开昭57-2689号公报)

黄色短杆菌AJ11564(FERM P-5472；参照特开昭56-140895公报)

黄色短杆菌AJ11439(FERM P-5136；参照特开昭56-35981号公报)

谷氨酸棒杆菌H7684(FERM BP-3004；参照特开平04-88994号公报)

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)AJ11426(FERMP-5123；特开平56-048890号公报参照)

谷氨酸棒杆菌AJ11440(FERM P-5137；参照特开平56-048890号公报)

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)AJ11796(FERMP-6402；参照特开平58-158192号公报)。

L-苏氨酸生产菌

用于本发明的L-苏氨酸生产菌的优选实例包括增强了L-苏氨酸生物合成系统酶的属于肠杆菌科的细菌。编码L-苏氨酸生物合成系统酶的基因的实例包括天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、thr操纵子所编码的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)和苏氨酸合酶基因(thrC)。可以导入这些基因中的两种以上。可将L-苏氨酸生物合成系统基因导入苏氨酸分解受阻抑的属于肠杆菌科的细菌中。苏氨酸分解受阻抑的埃希氏菌属细菌的实例包括例如苏氨酸脱氢酶活性缺损的TDH6菌株(特开2001-346578号)等等。

L-苏氨酸生物合成系统酶的酶活性受终产物L-苏氨酸的抑制。因此，为了构建L-苏氨酸生产菌，优选对L-苏氨酸生物合成系统酶进行修饰以使所述酶不受L-苏氨酸的反馈抑制。上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，苏氨酸操纵子形成弱化子(attenuator)结构。苏氨酸操纵子的表达受到培养液中异亮氨酸和苏氨酸的抑制，并且表达受到弱化作用的抑制。可通过去除弱化区中的前导序列或弱化子来实现弱化作用的消除或降低修饰(参照Lynn，S.P.，Burton，W.S.，Donohue，T.J.，Gould，R.M.，Gumport，R.I.，and Gardner，J.F.J.Mol.Biol.194：59-69(1987)；国际公开第02/26993号小册子；国际公开第2005/049808号小册子)。

苏氨酸操纵子上游存在天然启动子，可用非天然(non-native)启动子将其取代(参考WO 98/04715号小册子)。或者，可以构建苏氨酸操纵子使得苏氨酸生物合成的相关的基因的表达受到λ噬菌体的阻遏物(repressor)和启动子的调控(参考欧洲专利第0593792号说明书)。而且，为了对埃希氏菌属细菌进行修饰使其不受L-苏氨酸的反馈抑制，可以通过选择对α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)有抗性的菌株来获得。

对于如上所述经修饰而不受L-苏氨酸的反馈抑制的苏氨酸操纵子而言，优选的是其在宿主微生物中拷贝数增加，或者是其连接于强启动子而使得表达量增加。拷贝数的增加除了通过使用质粒的扩增来实现，还可以通过使用转座子、Mu噬菌体等向染色体上转入苏氨酸操纵子来实现。

此外，对于天冬氨酸激酶III基因(lysC)，优选使用经过修饰而不受L-赖氨酸的反馈抑制的基因。这样的经过修饰而不受反馈抑制的lysC基因可使用美国专利5,932,453中描述的方法来获得。

理想的是，除了L-苏氨酸生物合成系统酶之外，还增强糖酵解系统、TCA循环和呼吸链中涉及的基因、调控这些基因表达的基因、和糖摄取基因。这些在L-苏氨酸生产中有效的基因的实例包括转氢酶基因(pntAB)(欧洲专利733712号说明书)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(pepC)(国际公开95/06114号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(欧洲专利877090号说明书)、棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属细菌的丙酮酸羧化酶基因(国际公开99/18228号小册子、欧洲申请公开1092776号说明书)。

此外，对赋予L-苏氨酸抗性的基因和/或赋予L-高丝氨酸抗性的基因的表达加以强化，或对宿主赋予L-苏氨酸抗性和/或L-高丝氨酸抗性，也是理想的。赋予抗性的基因的实例包括rhtA基因(Res.Microbiol.154：123-135(2003))、rhtB基因(欧洲专利申请公开第0994190号说明书)、rhtC基因(欧洲专利申请公开第1013765号说明书)和yfiK、yeaS基因(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)。此外，关于对宿主赋予L-苏氨酸抗性的方法，可参考欧洲专利申请公开第0994190号说明书、国际公开第90/04636号小册子记载的方法。

L-苏氨酸生产菌的例子包括大肠杆菌VKPM B-3996菌株(参照美国专利第5,175,107号说明书)。该VKPM B-3996菌株在1987年11月19日以登录号VKPM B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms(VKPM)，GNII Genetika)(地址：Russia，117545 Moscow，1 Dorozhny proezd，1)。此外，该VKPM B-3996菌株携带有质粒pVIC40(国际公开第90/04636号小册子)，所述质粒pVIC40是通过将苏氨酸生物合成系统基因(苏氨酸操纵子：thrABC)插入具有链霉素抗性标记的广谱载体质粒pAYC32(参照Chistorerdov，A.Y.，andTsygankov，Y.D.Plasmid，16，161-167(1986))中而获得的。在该pVIC40中，苏氨酸操纵子中的thrA所编码的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I解除了由L-苏氨酸导致的反馈抑制。

此外，大肠杆菌VKPM B-5318株(参照欧洲专利第0593792号说明书)也是合适的L-苏氨酸生产菌的实例。VKPM B-5318菌株在19871990年115月193日以登录号VKPM B-5318保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM)，GNIIGenetika)。该VKPM B-5318菌株是非异亮氨酸营养缺陷型菌株，并且携带如下所述而构建的重组质粒DNA：缺失了天然具有的转录调节区——弱化子区的苏氨酸操纵子(即苏氨酸生物合成相关基因)位于λ噬菌体温度敏感性C1阻遏物、PR启动子和Cro蛋白的N末端部分的下游，并且苏氨酸生物合成相关基因的表达受所述λ噬菌体阻遏物和启动子的调控。

L-精氨酸生产菌

用于衍生本发明的L-精氨酸生产菌的亲本菌株的例子包括但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925)(美国专利申请公布2002/058315 A1)及其带有突变的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamate synthase)的衍生菌株(俄罗斯专利申请No.2001112869)，大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)(EP1170358A1)，引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthetase)的argA基因的精氨酸生产菌株(EP1170361A1)，等等。

用于衍生本发明的L-精氨酸生产菌的亲本菌株的例子包括但不限于编码L-精氨酸生物合成酶的1种以上的基因的表达增强的菌株。这样的基因的实例包括N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶基因(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶基因(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶基因(argD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因(argF)、精氨琥珀酸合成酶基因(argG)、精氨琥珀酸裂合酶基因(argH)和氨甲酰基磷酸合成酶基因(carAB)。

L-组氨酸生产菌

用于衍生本发明的L-组氨酸生产菌的亲本菌株的例子包括但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌24菌株(VKPM B-5945，RU2003677)；大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，RU2119536)；大肠杆菌NRRLB-12116～B-12121(美国专利4,388,405)；大肠杆菌H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(美国专利6,344,347)；大肠杆菌H-9341(FERMBP-6674)(EP1085087)；大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利6,258,554)等等。

用于衍生本发明的L-组氨酸生产菌的亲本菌株的例子还包括如下编码L-组氨酸生物合成系统酶的1种以上的基因的表达增强的菌株。相关基因的实例包括ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)、磷酸核糖基AMP环化水解酶基因(hisI)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶基因(hisIE)、磷酸核糖基亚胺甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸异构酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase)基因(hisA)、酰胺转移酶基因(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶基因(hisC)、组氨醇磷酸酶基因(hisB)、组氨醇脱氢酶基因(hisD)等。

已知hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成系统酶被L-组氨酸所抑制，因此还可以通过向ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)中引入诱导对反馈抑制有抗性的突变来有效地增加产生L-组氨酸的能力(俄罗斯专利2003677和2119536)。

具有L-组氨酸生产能力的菌株具体实例包括大肠杆菌FERM-P 5038和5048，其已经导入了携带编码L-组氨酸生物合成系统酶的DNA的载体(特开昭56-005099号)，导入了氨基酸输送基因rht的大肠杆菌菌株(EP1016710A)，赋予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，俄罗斯专利2119536号)，等等。

L-半胱氨酸生产菌

用于衍生本发明的L-半胱氨酸生产菌的亲本菌株的例子包括但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如用编码反馈抑制抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15(美国专利6,218,168，俄罗斯专利申请2003121601)，具有过表达编码适于向细胞分泌有毒物质的蛋白的基因的大肠杆菌W3110(美国专利5,972,663)，半胱氨酸脱巯基酶(cysteinedesulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(JP11155571A2)；由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控物活性增强的大肠杆菌W3110(WO0127307A1)，等等。

L-丝氨酸生产菌

作为用于衍生本发明的L-丝氨酸生产菌的亲本菌株的例子，可以列举出：磷酸丝氨酸磷酸化酶基因获得了扩增的棒状杆菌型细菌(特开2001-275689、特开平11-253187)，来源于具有偶氮丝氨酸或β-(2-噻吩基)-DL-丙氨酸抗性且具有L-丝氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，且具备解除了抑制的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶的棒状杆菌型细菌(特开平11266881)，具有偶氮丝氨酸或噻吩基丙氨酸抗性且缺失丝氨酸分解能力，且能够生产丝氨酸的棒状杆菌型细菌(特开平10-248588)。

L-天冬氨酸生产菌

L-天冬酰胺可以通过赋予天冬氨酸以氨基来生产(Boehlein，S.K.，Richards，N.G. J.，& Schuster，S.M.(1994a)J.Biol.Chem.269，7450-7457.)。因此，作为属于埃希氏菌属的L-天冬酰胺生产菌，可以列举出L-天冬氨酸生产菌的天冬酰胺合成酶得到增强的大肠杆菌菌株。

下面，示例说明赋予微生物核酸生产能力的方法以及核酸生产菌。

具有核酸生产能力的细菌微生物可以这样获得：对于如上所述的细菌微生物赋予例如嘌呤核苷营养缺陷性、或进一步赋予对嘌呤类似物等药物的抗性(参照特公昭38-23099、特公昭54-17033、特公昭55-45199、特公昭57-14160、特公昭57-41915、特公昭59-42895)。例如，具有营养缺陷性以及药物抗性的芽孢杆菌属细菌，可以使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或EMS(甲磺酸乙酯)等常规的突变处理中使用的突变剂进行处理来获得。

作为生产嘌呤核苷的芽孢杆菌属细菌，可以例举如下。

作为属于芽孢杆菌属的肌苷生产株的具体例子，可以使用枯草芽孢杆菌KMBS16株。该菌株是已知的枯草芽孢杆菌trpC2株(168Marburg)的衍生物，其中引入了编码嘌呤操纵子阻遏物的purR基因的缺损(purR∷spc)、编码琥珀酰-AMP合酶的purA基因的缺损(purA∷erm)、和编码嘌呤核苷磷酸化酶的deoD基因的缺损(deoD∷kan)(特开2004-242610，US2004166575A1)。此外，还可以使用枯草芽孢杆菌菌株AJ3772(FERM P-2555)(特开昭62-014794)等。

作为具有鸟苷生产能力的芽孢杆菌属细菌，可以例举如下：IMP脱氢酶的活性提高了的芽孢杆菌属细菌(特开平3-58787)、将携带嘌呤类似物抗性或德夸菌素(decoyinine)抗性基因的载体导入腺嘌呤营养缺陷性突变株而得到的芽孢杆菌属细菌(特公平4-28357)等。

此外，作为生产嘌呤核苷酸的芽孢杆菌属细菌，可以例举如下。

作为肌苷酸生产菌，已报告有磷酸酶活性减弱的枯草芽孢杆菌肌苷生产菌株(Uchida，K.et al.，Agr.Biol.Chem.，1961，25，804-805、Fujimoto，M.Uchida，K.，Agr.Biol.Chem.，1965，29，249-259)。作为鸟苷酸生产菌，可以例举具有腺嘌呤营养缺陷性，且具有德夸菌素或甲硫氨酸亚砜抗性，并且具有5’-鸟苷酸(鸟苷-5’-单磷酸，以下也称”GMP”)生产能力的芽孢杆菌属的突变株(特公昭56-12438号公报)。

此外，黄苷酸生产菌可以使用在以产氨棒杆菌(Corynebacteriumammmoniagenes)为中心的棒状杆菌型细菌的选育中采用的方法来构建。例如，可以通过获得PRPP酰胺转移酶(amidotransferase)强化株(特开平8-168383)、脂肪族氨基酸抗性株(特开平4-262790)、脱氢脯氨酸抗性株(韩国专利公开公报2003-56490)来构建黄苷酸生产菌。

此外，作为具有嘌呤类物质生产能力的芽孢杆菌属细菌的选育方法，可以例举提高嘌呤核苷和嘌呤核苷酸共享的嘌呤生物合成的相关酶，即嘌呤生物合成酶的细胞内活性的方法。作为所述嘌呤生物合成的相关酶，可以例举磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP合成酶[EC：2.7.6.1])等。

被摄入戊糖磷酸系统的葡萄糖等糖源经代谢生成的分解代谢物的一部分经由核酮糖-5-磷酸转变为核糖-5-磷酸。由生物合成的核糖-5-磷酸出发，生成嘌呤核苷、组氨酸和色氨酸生物合成中不可或缺的前体物质磷酸核糖焦磷酸(PRPP)。具体地，磷酸核糖焦磷酸合成酶将核糖-5-磷酸转变为PRPP。因此，通过进行使得磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性提高的修饰，可以赋予或增加芽孢杆菌属细菌的嘌呤类物质生产能力。

磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性可以采用例如Switzer等的方法(MethodsEnzymol.，1978，51，3-11)、Roth等的方法(Methods Enzymol.，1978，51，12-17)来测定。磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性提高了的芽孢杆菌属细菌可以例如这样构建：如特开2004-242610号公报所述的方法那样，通过使用质粒的方法或在染色体上进行重组的方法等，使编码磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因在芽孢杆菌属细菌中高表达。

另一方面，当生成了嘌呤核苷、组氨酸和色氨酸生物合成中不可或缺的前体物质PRPP时，其一部分会通过嘌呤生物合成的相关酶群转变为嘌呤核苷酸、嘌呤核苷。编码这样的酶群的基因包括例如枯草芽孢杆菌的嘌呤操纵子，具体而言有purEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purD操纵子的基因(Ebbole DJ and Zalkin H，J.Biol.Chem.，1987，262，17，8274-87)(现在也称为purEKBCSQLFMNHD：Bacillus subtilis and Its Closest Relatives，Editor inChief：A.L.Sonenshein，ASM Press，Washington D.C.，2002。Genbank登录号.NC_000964)和大肠杆菌的pur调节子的基因(Escherichia andSalmonella，Second Edition，Editor in Chief：F.C.Neidhardt，ASM Press，Washington D.C.，1996)。

因此，可以也通过增强这些基因的表达来赋予或增加嘌呤类物质生产能力。此外，可在本发明中使用的嘌呤操纵子基因不限于所述这些，还可以利用其它微生物或动植物来源的基因。

作为增加嘌呤操纵子的表达量的方法，可以例举通过使用质粒的方法或重组到染色体上的方法等来在芽孢杆菌属细菌中高表达嘌呤操纵子基因的方法。

作为增加嘌呤操纵子的表达量的第2种方法，可以例举这样的方法：将嘌呤操纵子的天然启动子更换为更强力的启动子，或者将天然启动子的-35、-10区更换为共有序列。

例如，在枯草芽孢杆菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)中，嘌呤操纵子的-35序列为共有序列(TTGACA)，但-10序列为TAAGAT，与共有序列TATAAT不同(Ebbole，D.J.and H.Zalikn，J.Biol.Chem.，1987，262，8274-8287)。因此，通过将-10序列(TAAGAT)改变为共有序列、或者进行修饰使其变为TATAAT、TATGAT或TAAAAT而接近共有序列，可以提高嘌呤操纵子的转录活性。而且，启动子序列的取代可以采用与下述的基因取代相似的方法来进行。

作为增加嘌呤操纵子表达量的第3种方法，可以例举降低嘌呤操纵子的阻遏物的表达量的方法(USP6,284,495号)。

为了降低嘌呤操纵子的阻遏物(嘌呤阻遏物)的表达量，例如可以采用下列方法：通过对芽孢杆菌属细菌进行紫外线照射或使用NTG或EMS等通常突变处理中使用的突变剂进行处理，并选择嘌呤阻遏物的表达量降低的突变株。

此外，除突变处理之外，嘌呤阻遏物的表达量降低的芽孢杆菌属细菌还可以这样获得：例如通过采用基因重组法的同源重组法(Experiments inMolecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory press(1972)；Matsuyama，S.and Mizushima，S.，J.Bacteriol.，1985，162，1196-1202)将染色体上的编码嘌呤阻遏物的基因(purR；GenBank Accession NC_000964)替换成不能正常发挥功能的基因(以下也称“破坏型基因”)。

而且，也可以通过减弱嘌呤类物质向细胞内的摄入来强化嘌呤类物质生产能力。例如，嘌呤核苷向细胞内的摄入可以通过阻断嘌呤核苷向细胞内的摄入的相关反应来减弱。上述嘌呤核苷向细胞内摄入的相关反应包括例如核苷通透酶所催化的反应。

而且，在生产嘌呤核苷时，为了增强嘌呤核苷生产能力，可以降低分解嘌呤类物质的酶的活性。这样的酶可以例举例如嘌呤核苷磷酸化酶。

从PRPP出发通过嘌呤生物合成的相关酶群而生物合成的嘌呤核苷酸经过脱磷酸化转变为嘌呤核苷。为了有效率地蓄积嘌呤核苷，优选降低将嘌呤核苷进一步分解并转变为次黄嘌呤等的嘌呤核苷磷酸化酶的活性。即，理想的是进行修饰，使得以嘌呤核苷(以肌苷为代表)为底物的嘌呤核苷磷酸化酶弱化或者缺损。

嘌呤核苷磷酸化酶活性的降低具体而言可以通过在芽孢杆菌属细菌中破坏编码嘌呤核苷磷酸化酶的deoD基因和pupG基因来实现。本发明的芽孢杆菌属细菌可以是经过修饰而使得如上所述的deoD基因和pupG基因单独或同时破坏的细菌。deoD基因、pupG基因可以利用例如芽孢杆菌属来源的基因(deoD；Genbank登录号.NC_000964，pupG；Genbank登录号.NC_000964)。

此外，为了增强嘌呤类物质生产能力，可以降低琥珀酰-AMP合酶的活性。作为编码琥珀酰-AMP合酶的基因，可以例举purA基因。作为purA基因，可以例举具有以GenBank登录号.NC_000964(编码区域为互补链的碱基号4153460-4155749)登录的碱基序列的基因。

而且，为了增强嘌呤类物质生产能力，可以降低肌苷单磷酸(IMP)脱氢酶的活性。作为编码IMP脱氢酶的基因，可以例举guaB基因。作为guaB基因，可以例举具有以GenBank登录号.NC_000964(编码区域为15913-17376)登录的碱基序列的基因。

此外，作为增强嘌呤类物质生产能力的方法，可以考虑扩增编码具有嘌呤类物质分泌活性的蛋白质的基因。作为这样的基因得到了扩增的细菌，可以例举例如：扩增了rhtA基因的芽孢杆菌属细菌(特开2003-219876)。

此外，关于L-氨基酸生产菌或核酸生产菌或用于其育种的微生物、以及赋予和增强L-氨基酸生产能力和核酸生产能力的方法，在WO2007/125954、WO2005/095627、美国专利公开公报2004-0166575号等中有详细描述，这同样适用于本发明。

此外，本发明不限于如上所述的L-氨基酸和核酸，只要是能够通过利用微生物的发酵法生产的物质，均可适用。

而且，根据目的物质的不同，本发明中使用的微生物与该目的物质的产生相关的蛋白质的活性可以已被提高，或者与该目的物质的分解等相关的蛋白质的活性也可以已被降低。

下面，就赋予微生物异麦芽糖酶活性、或增加微生物的异麦芽糖酶活性的方法进行说明。而且，有些情况下本发明的异麦芽糖酶还可以同时具有麦芽糖酶活性，因此，有些情况下，通过赋予或增加异麦芽糖酶活性，可以赋予或增加麦芽糖酶活性。

对于微生物天然不具有异麦芽糖酶活性的情况，可以通过在该微生物中导入异麦芽糖酶基因来赋予异麦芽糖酶活性。此外，对于微生物具有异麦芽糖酶活性的情况，可以通过导入外源异麦芽糖酶基因、增强内源性异麦芽糖酶基因的拷贝数或对异麦芽糖酶基因的启动子等表达调控序列进行修饰等来增强该基因的表达量，从而增强异麦芽糖酶活性。在本发明中，“导入异麦芽糖酶基因”不仅指对天然不具有异麦芽糖酶活性的微生物导入异麦芽糖酶基因，还包括对具有异麦芽糖酶活性的微生物导入外源异麦芽糖酶基因、以及对具有异麦芽糖酶活性的微生物导入内源性异麦芽糖酶基因来增强内源性异麦芽糖酶基因的表达量。

为了导入异麦芽糖酶基因，例如可以将异麦芽糖酶基因克隆在适当的载体上，并使用所得载体转化宿主微生物。

作为用于转化的载体，可以列举能够在所用的微生物中自主复制的质粒。例如，作为能够在属于肠杆菌科细菌的微生物中自主复制的质粒，可以列举pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29、pTWV228、pTWV229(pHSG、pSTV、pTWV可从TAKARABio公司获得)、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218(pMW可从NIPPON GENE公司获得)等。此外，作为棒状杆菌型细菌用的质粒，可以列举pAM330(特开昭58-67699号公报)、pHM1519(特开昭58-77895号公报)、pSFK6(参照特开2000-262288号公报)、pVK7(美国专利申请公开说明书2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特开昭58-192900号公报)、pCG1(特开昭57-134500号公报)、pCG2(特开昭58-35197号公报)、pCG4、pCG11(特开昭57-183799号公报)、pHK4(特开平5-7491号公报)等。

作为转化方法，可以列举例如：用氯化钙处理受体菌细胞来增加DNA的透过性的方法，该方法已被报道用于大肠杆菌K-12(Mandel，M.and Higa，A.J.Mol.Biol.1970.53：159-162)，或者从处于增殖阶段的细胞制备感受态细胞并向其导入DNA的方法，该方法已被报道用于枯草芽孢杆菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.E..，1997.Gene 1：153-167)。或者，还可以应用将DNA受体菌的细胞制备成容易导入重组DNA的原生质体或原生质球的状态，再将重组DNA导入DNA受体菌的方法，该方法已知用于枯草杆菌、放线菌类和酵母(Chang，S.and Choen，S.N.，1979.Mol.Gen.Genet.168：111-115；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.1978.Nature 274：398-400；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.1978.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1929-1933)。此外，采用电脉冲法(特开平2-207791号公报)也能够进行微生物的转化。

此外，异麦芽糖酶基因的导入可以通过向宿主微生物的染色体上进行导入来实现。为了将异麦芽糖酶基因导入到微生物的染色体上，可以采用使用转座子或Mini-Mu在染色体上进行随机导入的方法(特开平2-109985号公报、US5,882,888、EP805867B1)，或者可以利用染色体DNA上以多拷贝存在的序列作为靶标，通过同源重组来进行。作为染色体DNA上以多拷贝存在的序列，可以利用重复DNA(repetitive DNA)和存在于转座元件端部的反向重复序列。或者，通过使用Red驱动整合法(WO2005/010175)，也可以将目的基因导入到染色体上。此外，通过使用P1噬菌体等噬菌体的转导或者接合转移载体也可以向染色体上导入目的基因。此外，也可以如WO03/040373所记载的，以目的物质生产所不需要的基因作为靶标来导入异麦芽糖酶基因。采用这样的方法可以在靶标序列中导入单拷贝或多拷贝的异麦芽糖酶基因。

所述基因已经转移到染色体上这一事实的确认，可以通过使用具有与目的基因或其一部分互补的序列的探针进行Southern杂交来确认。

只要将拷贝数扩增至1拷贝以上即可，但优选将编码异麦芽糖酶的基因扩增到2拷贝以上、更优选3拷贝以上、更优选5拷贝以上。此外，当导入宿主微生物天然不具有的基因时，只要导入1拷贝以上即可，但优选扩增至2拷贝以上、更优选3拷贝以上、更优选5拷贝以上。

而且，对于异麦芽糖酶基因，如下述地，通过与启动子等表达调节序列的取代、突变相结合，可以使活性最优化。

作为增加异麦芽糖酶基因的表达量的方法，可以列举出通过在染色体DNA上或质粒上将异麦芽糖酶基因的启动子等表达调节序列替换成合适强度的启动子等表达调节序列来增强该基因的表达的方法。例如，thr启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、pL启动子、tac启动子等是已知的常用启动子。此外，也可以使用后述实施例中使用的tac启动子的变体(PtacA启动子、PtacB启动子)。启动子强度的评价方法和强启动子的例子在Goldstein和Doi的论文(Goldstein，M.A.and Doi R.H.1995.Prokaryotic promoters inbiotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1，105-128)等中有记载。

此外，可以如国际公开WO00/18935所描述的那样，通过在基因的启动子区域中导入数个碱基的碱基取代将其修饰成强度合适的启动子。表达调节序列的取代例如可以像使用温度敏感型质粒的基因取代那样进行。作为可以在大肠杆菌或Pantoea ananatis中使用的、具有温度敏感型复制起点的载体，可以列举例如WO 99/03988号国际公开小册子所述的温度敏感型质粒pMAN997或其衍生物等。此外，表达调节序列的取代还可以通过使用线性DNA的方法来进行：利用λ噬菌体的Red重组酶(Red recombinase)的称为“Red驱动整合”(Red-driven integration)的方法(Datsenko，K.A.and Wanner，B.L.，2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97：640-6645)、以及将Red驱动整合法与λ噬菌体来源的切出系统(Cho，E.H.，Gumport，R.I.，Gardner，J.F.J.Bacteriol.184：5200-5203(2002))联合使用的方法(参照WO2005/010175号)等。而且，表达调节序列的修饰可以与如上所述的提高基因的拷贝数的方法联合使用。

而且，已知对核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔序列中，特别是对起始密码子紧邻上游的序列中的数个核苷酸的取代，对mRNA的翻译效率有非常大的影响，可以对这些序列进行修饰来提高翻译量。

在向上述质粒或者染色体上导入目的基因的场合，用于表达这些基因的启动子可以是任何能够在所使用的微生物中发挥功能的启动子，可以是所使用的基因自身的启动子，也可以是经修饰的启动子。也可以通过适宜地选择在使用的微生物中强力地发挥功能的启动子，或者通过使启动子的-35、-10区域与共有序列接近，来调节基因的表达量。

异麦芽糖酶包括存在于细胞内即细胞质中的异麦芽糖酶、以及存在于细胞壁或周质等细胞表层或细胞外的异麦芽糖酶。在本发明中，将该存在于细胞内的异麦芽糖酶称为“细胞内异麦芽糖酶”，将细胞内麦芽糖酶的活性称为“细胞内活性”。此外，将存在于细胞壁或周质等细胞表层或细胞外的异麦芽糖酶统称为“细胞外异麦芽糖酶”，将细胞外麦芽糖酶的活性称为“细胞外活性”。细胞外异麦芽糖酶典型地存在于细胞表层。而且，“表达细胞外异麦芽糖酶”是指：使基于细胞外异麦芽糖酶基因的信息生成的细胞外异麦芽糖酶存在于细胞表层或细胞外。

在本发明中，对异麦芽糖酶活性是否已增强的确认，可以通过对修饰菌株与亲本菌株或非修饰菌株的异麦芽糖酶活性进行比较来进行。如果与亲本菌株或者非修饰菌株相比，修饰菌株的异麦芽糖酶活性提高，则异麦芽糖酶活性增强。此外，在亲本菌株不具有异麦芽糖酶活性的情况下，如果在修饰菌株中能够检测出异麦芽糖酶活性，则异麦芽糖酶活性已增强。此外，理想的是，使异麦芽糖酶活性提高至不阻碍生长的程度。“不阻碍生长”是指：与亲本菌株或者非修饰菌株相比，修饰菌株显示出80％以上、优选90％以上、优选95％以上的生长速度。这里，作为亲本菌株，可以列举出大肠杆菌MG1655株(ATCC No.47076)、以及W3110株(ATCC No.27325)、谷氨酸棒杆菌ATCC13869，ATCC13032等。

通过赋予或增加细胞外异麦芽糖酶活性，可以对微生物赋予异麦芽糖同化能力，或者提高异麦芽糖同化能力。在微生物不具有异麦芽糖酶活性的场合，通过赋予细胞外异麦芽糖酶活性或者赋予细胞内异麦芽糖酶活性以及摄入活性，可以提高异麦芽糖同化能力。在微生物具有异麦芽糖酶活性的场合，通过提高细胞外异麦芽糖酶活性和/或提高细胞内异麦芽糖酶活性和增强摄入活性，可以提高异麦芽糖同化能力。此外，在微生物保持有将异麦芽糖摄入细胞内的活性的场合，赋予或增加活性的可以是细胞内异麦芽糖酶，也可以是细胞外异麦芽糖酶。而且，在微生物具有细胞内异麦芽糖酶活性的场合，通过增强将异麦芽糖摄入细胞内的活性，也可以提高异麦芽糖同化能力。另一方面，当赋予活性的是细胞内异麦芽糖酶、且微生物不具有将异麦芽糖摄入细胞内的活性的情况下，优选赋予细胞内异麦芽糖酶和将异麦芽糖摄入细胞内的活性这两者。在微生物具有细胞内异麦芽糖酶以及摄入到细胞内活性这两者的情况下，通过增强异麦芽糖酶和摄入活性中的任何一个或这两者，可以提高异麦芽糖同化性。

作为异麦芽糖酶基因，可以列举出芽孢杆菌属细菌的异麦芽糖酶基因，更具体地可以列举出例如枯草芽孢杆菌的malL基因(yvdL基因)(BG12421：Genbank Accession No.NP_391336.1)、枯草芽孢杆菌的glvA基因(malA基因)(BG11839：Genbank Accession No.NP_388699.1)。malL基因的碱基序列如SEQ ID NO：13所示，该基因编码的异麦芽糖酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：14所示。glvA基因的碱基序列如SEQ ID NO：39所示，该基因编码的异麦芽糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示。所述基因如果在微生物中表达，则可以产生细胞内异麦芽糖酶。枯草芽孢杆菌的glvA基因编码的异麦芽糖酶不仅具有异麦芽糖酶活性，还具有麦芽糖酶活性。因此，如果使该基因或其同源物在微生物中表达，则会表达出具有异麦芽糖酶活性以及麦芽糖酶活性这两者的蛋白质。当培养基的碳源中包含异麦芽糖和麦芽糖时，可以使用编码这样的具有异麦芽糖酶活性与麦芽糖酶活性二者的异麦芽糖酶的基因。而且，在除了异麦芽糖酶活性外还赋予或增加麦芽糖酶活性的情况下，可以如上文所述地使用glvA基因或其同源物，也可以使用异麦芽糖酶基因和编码不具有异麦芽糖酶活性的麦芽糖酶基因这两者。在本发明中，优选使用编码这样的具有异麦芽糖酶活性和麦芽糖酶活性这两者的异麦芽糖酶的基因。

此外，异麦芽糖酶还可以通过以基于上述序列信息或该微生物的公知基因或蛋白质序列信息制作的寡核苷酸作为引物的PCR方法，或者通过以基于所述序列信息制作的寡核苷酸作为探针的杂交法，从芽孢杆菌属细菌的染色体DNA或染色体DNA文库中获取。在使用芽孢杆菌属细菌的基因时，作为芽孢杆菌属细菌，可以列举出枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)等。作为枯草芽孢杆菌，可以列举出枯草芽孢杆菌168Marburg(ATCC6051)、枯草芽孢杆菌PY79(Plasmid，1984，12，1-9)等；作为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，可以列举出解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)T(ATCC23842)、以及解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)N(ATCC23845)等。此外，作为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，可以列举出短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)GottheilNo.3218(ATCC No.21005)(美国专利第3,616,206号)等。

作为编码其它微生物来源的异麦芽糖酶的基因、例如malL基因的同源物，可以利用编码以下蛋白质的基因。

表1

No.	基因	细菌	功能
				1	ACE77085	芽孢杆菌属菌种ZW2531-1	产寡糖多功能G-淀粉酶
2	YP_077891	地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC 14580	糖苷水解酶家族蛋白
				3	AAG23399	枯草芽孢杆菌	寡-1，6-葡糖苷酶
4	P29093	芽孢杆菌属菌种F5	寡-1，6-葡糖苷酶
				5	ZP_01695723	凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)36D1	α淀粉酶，催化区
6	Q45101	凝结芽孢杆菌	寡-1，6-葡糖苷酶
				7	P29094	热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)	寡-1，6-葡糖苷酶
8	ZP_02914561	地芽孢杆菌属菌种(Geobacillus sp.)WCH70	α淀粉酶催化区
				9	YP_001375945	蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)细胞毒亚种(subsp.cytotoxis)NVH 391-98	α淀粉酶催化区

10	YP_896374	苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Al Hakam株	寡-1，6-葡糖苷酶
				11	P21332	蜡状芽孢杆菌	寡-1，6-葡糖苷酶
12	ZP_02583217	蜡状芽孢杆菌G9842	寡-1，6-葡糖苷酶
				13	ZP_03102374	蜡状芽孢杆菌W	寡-1，6-葡糖苷酶
14	YP_001884389	肉毒梭菌(Clostridiuim botulinum)BEklund 17B株	寡-1，6-葡糖苷酶
				15	YP_001919572	肉毒梭菌E3 AlaskaE43株	寡-1，6-葡糖苷酶
16	BAE45038.	嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)	海藻糖-6-磷酸水解酶
				17	NP_463715	单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)EGD-e	假想蛋白1mo0184
18	YP_001307875.	拜氏梭菌(Clostridiuim beijerinckii)NCIMB 8052	α淀粉酶，催化区
				19	YP_147599	Geobacillus kaustopholus HTA426	α，α-磷酸海藻糖酶

20	NP_693477	伊平屋桥大洋芽孢杆菌(Oceanobacillusiheyensis)HTE831	寡-1，6-葡糖苷酶
				21	YP_796261	短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ATCC367	海藻糖-6-磷酸水解酶
22	YP_001843555	发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)IFO 3956	α-葡糖苷酶
				23	ZP_01114415	Reinekea sp.MED297	寡-1，6-葡糖苷酶

作为编码其它微生物来源的异麦芽糖酶的基因、例如glvA基因的同源物，可以利用编码以下蛋白质的基因。

表2

No.	基因	细菌	功能
				1	RBAM_008360	解淀粉芽孢杆菌FZB42	麦芽糖-6′-磷酸葡糖苷酶
2	BLi00855	地衣芽孢杆菌ATCC 14580	麦芽糖-6′-磷酸葡糖苷酶
				3	CLD_0473	肉毒梭菌B1 Okra株	麦芽糖-6′-磷酸葡糖苷酶
4	CLK_3465	肉毒梭菌A3 str.Loch Maree(LochMaree株)	麦芽糖-6′-磷酸葡糖苷酶
				5	CLI_0351	肉毒梭菌F str.Langeland(Langeland株)	麦芽糖-6′-磷酸葡糖苷酶
6	CLC_0337	肉毒梭菌A str.Hall(Hall株)	麦芽糖-6′-磷酸葡糖苷酶
				7	CBO0278	肉毒梭菌A str.ATCC 3502	麦芽糖-6′-磷酸葡糖苷酶
8	CAC0533	丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC 824	麦芽糖-6′-磷酸葡糖苷酶

9	ECA1847	黑腐果胶杆菌(Pectobacteriumatrosepticum)SCRI1043	6-磷酸-α-葡糖苷酶
				10	ESA_03956 eta	阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)ATCC BAA-894	麦芽糖-6′-磷酸葡糖苷酶
11	EcHS_A3893ecmecfece：	大肠杆菌HS	6-磷酸-α-葡糖苷酶
				12	SDY_4168	痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)Sd197	麦芽糖-6′-磷酸葡糖苷酶

编码异麦芽糖酶的基因可以通过以基于上述序列信息或该微生物的公知基因或蛋白质序列信息制作的寡核苷酸作为引物的PCR方法，或者通过以基于所述序列信息制作的寡核苷酸作为探针的杂交方法，从微生物的染色体DNA或染色体DNA文库中获取。而且，染色体DNA可以采用例如斋藤、三浦的方法(参照Saito，H.and Miura，K.I.1963.Biochem.Biophys.Acta，72，619-629；生物工学実験書，日本生物工学会编，97-98页，培风馆，1992年)等从作为DNA供体的微生物中制备。

malL，glvA基因同源物是指下述基因：所述基因来源于其它芽孢杆菌属细菌，或者来源于其它微生物，或者是天然或人工的突变型基因，其与上述的malL，glvA基因在结构上显示高度类似性，且编码具有异麦芽糖酶活性的蛋白质。malL基因的同源物是指：相对于SEQ ID NO：14、40的氨基酸序列整体，具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更优选98％以上、特别优选99％以上的同源性，且编码具有异麦芽糖酶活性的蛋白质的基因。而且，具有异麦芽糖酶活性这一事实，可以通过在宿主细胞中表达所述基因、并例如采用上述方法考察异麦芽糖酶活性来确认。而且，在本说明书中，“同源性”(homology)”有时指“同一性”(identity)。针对上述同源物进行的有关同源性的描述，也同样适用于其它基因。

此外，本发明中使用的malL，glvA基因不限于野生型基因，也可以是所述基因的变体，即还可以是在不损害所编码的蛋白质的异麦芽糖酶活性的前提下，编码具有在SEQ ID NO：14，40的氨基酸序列中于一个或多个位置上包含一个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加等而得到的序列的蛋白质的突变体或人工修饰体。

这里，所谓“一个或多个”和“一个或数个”，虽然因氨基酸残基的种类或其在蛋白质的立体结构中的位置而异，但具体地是指1～20个、优选1～10个、更优选1～5个、特别优选1～3个。上述突变优选为保守突变，保守突变是没有功能性改变的中性突变，保守突变的代表是保守取代。所谓保守取代，当取代部位为芳族氨基酸时，是指在Phe、Trp、Tyr之间相互取代的突变，当取代部位为疏水性氨基酸时，是指在Leu、Ile、Val之间相互取代的突变，当取代部位为极性氨基酸时，是指在Gln、Asn之间相互取代的突变，当取代部位为碱性氨基酸时，是指在Lys、Arg、His之间相互取代的突变，当取代部位为酸性氨基酸时，是指在Asp、Glu之间相互取代的突变，当取代部位为带有羟基的氨基酸时，是指在Ser、Thr之间进行相互取代的突变。作为保守取代，可以列举出：从Ala到Ser或Thr的取代，从Arg到Gln、His或Lys的取代，从Asn到Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代，从Asp到Asn、Glu或Gln的取代，从Cys到Ser或Ala的取代，从Gln到Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代，从Glu到Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代，从Gly到Pro的取代，从His到Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的取代，从Ile到Leu、Met、Val或Phe的取代，从Leu到Ile、Met、Val或Phe的取代，从Lys到Asn、Glu、Gln、His或Arg的取代，从Met到Ile、Leu、Val或Phe的取代，从Phe到Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代，从Ser到Thr或Ala的取代，从Thr到Ser或Ala的取代，从Trp到Phe或Tyr的取代，从Tyr到His、Phe或Trp的取代，以及从Val到Met、Ile或Leu的取代。此外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还包括因基于携带异麦芽糖酶基因的微生物的个体差异、种间差异等情形而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。

此外，malL，glvA基因还可以是下述DNA，所述DNA与SEQ ID NO：13、39的碱基序列的互补序列或可由所述互补序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有异麦芽糖酶活性的蛋白质。这里，“严格条件”，是指形成所谓特异性杂交体，但不形成非特异性杂交体的条件。具体可以列举出：在与常规Southern杂交的洗涤条件即60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，更优选68℃、0.1×SSC、0.1％SDS相当的盐浓度、温度下，清洗1次更优选2～3次的条件。特别是，“严格条件”优选为具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更优选98％以上、特别优选99％以上的同源性的DNA发生杂交的条件。

此外，细胞外异麦芽糖酶基因可以通过这样进行修饰来获取：使如上所述的异麦芽糖酶基因的编码区域连接编码使蛋白质分泌至细胞表层或细胞外的信号肽的序列，以表达异麦芽糖酶与信号肽的融合蛋白。例如，可以通过使用分泌载体来构建细胞外异麦芽糖酶基因，所述分泌载体具有启动子序列和编码信号肽的序列，能够以可分泌的形式表达插入其下游的DNA序列所编码的蛋白质。作为这样的分泌载体，可以列举实施例中记载的pEZZ18等。此外，作为可在本发明中使用的信号肽，可以列举出实施例中记载的金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)来源的蛋白A等(参照EMBO J.4(4)，1075-1080(1985))。

为了赋予微生物将异麦芽糖摄入细胞内的活性或者增加微生物将异麦芽糖摄入细胞内的活性，例如可以在微生物中导入编码异麦芽糖转运蛋白的基因。此外，在微生物本来就携带异麦芽糖转运蛋白基因的情况下，可以通过增加内源性的异麦芽糖酶基因的拷贝数，或者对异麦芽糖转运蛋白基因的启动子等表达调控序列进行修饰，或者提高异麦芽糖转运蛋白基因的拷贝数等，来增加该基因的表达量，从而增加将异麦芽糖摄入细胞内的活性。而且，在微生物本来就携带异麦芽糖转运蛋白基因的情况下，可以通过导入外源性或内源性的异麦芽糖转运蛋白基因来增强将异麦芽糖摄入细胞内的活性。此外，异麦芽糖转运蛋白基因除了摄入异麦芽糖之外，还可以具有摄入麦芽糖的功能。

异麦芽糖转运蛋白基因的获取、该基因向微生物中的导入以及异麦芽糖转运蛋白基因的表达增强，可以像前文所述的异麦芽糖酶基因那样进行。赋予或增加了将异麦芽糖和/或麦芽糖摄入到细胞内的活性的事实的确认，可以采用例如J Bacteriol.1991 Apr；173(7)：2180-6、J Biol Chem.2006Jun 30；281(26)：17900-8中记载的方法来确认。

作为异麦芽糖转运蛋白基因，优选使用枯草芽孢杆菌的glvC(malP)基因。枯草芽孢杆菌的glvC基因是编码磷酸转移酶系统(Phosphotransferasesystem(PTS))的麦芽糖酶IICB(PTS maltose enzyme IICB)的基因，该酶具有将磷酸烯醇丙酮酸的磷酸基转移至异麦芽糖和/或麦芽糖，将磷酸化的异麦芽糖和/或麦芽糖摄入细胞质(cytoplasm)的活性。

此外，作为其它异麦芽糖转运蛋白基因，可以列举出编码属于变形链球菌(Streptococcus mutans)的多重糖代谢系统的糖转运蛋白MsmE、MsmF、MsmG的各基因、以及酿酒酵母(Saccharomyces cerivisiae)的AGT1基因。关于所述基因将在实施例中详细描述。

所述glvC基因的氨基酸序列示于SEQ ID NO：42，编码它们的基因如SEQ ID NO：41所示(相当于Genbank Accession No.BG11848)。

此外，所述MsmE、MsmF、MsmG的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：16、18、20，编码它们的基因的碱基序列分别如SEQ ID NO：15、17、19所示(分别相当于Genbank Accession No.NP_721287.1、NP_721288.1、NP_721289.1)。AGT1基因的碱基序列以及其所编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：21以及22所示(相当于Genbank Accession No.AAY99642)。

此外，作为编码异麦芽糖转运蛋白的基因，可以使用表3列举的以下基因。

表3

No.	基因	细菌	功能
				1	YP_001420453	解淀粉芽孢杆菌FZB42	磷酸转移酶系统IIC成分葡萄糖/麦芽糖/N-乙酰葡萄糖胺特异性糖转运和代谢
2	YP_078080	地衣芽孢杆菌ATCC 14580	磷酸转移酶系(PTS)麦芽糖特异性酶IICB成分
				3	AAK69555	丙酮丁醇梭菌	PTS_IIB，PTS系统，葡萄糖/蔗糖特异性IIB亚基
4	ZP_0631647	产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)E JGS 1987株	PTS系统麦芽糖特异性eiicb成分
				5	ZP_02638912	产气荚膜梭菌CPE F4969株	PTS系统麦芽糖特异性eiicb成分
6	ZP_02642923	产气荚膜梭菌NCTC 8239	PTS系统麦芽糖特异性eiicb成分
				7	NP_561112	产气荚膜梭菌13株	PTS熊果苷样酶IIBC成分
8	NP_290321	大肠杆菌O157：H7 EDL933	推定PTS成分
				9	YP_001746010	大肠杆菌SMS-3-5	PTS系统，α-葡糖苷特异性IIBC成分
10	ZP_03050141	大肠杆菌E110019	PTS系统，α-葡糖苷特异性IIBC成分

11	NP_561112	产气荚膜梭菌13株	PTS熊果苷样酶IIBC成分
				12	YP_854647	嗜水气单胞菌嗜水亚种(Aeromonas hydrophila subsp.hydrophila)ATCC 7966	PTS系统麦芽糖特异性eiicb成分
13	O06900	死亡梭杆菌(Fusobacteriummortiferum)	PTS系统α-葡糖苷特异性EIICB成分
				14	YP_001143948	杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salnoncida)A449	PTS系统α-葡糖苷特异性EIICB成分
15	ZP_03124405	艰难梭菌(Clostridium difficile)QCD-23m63	PTS系统，IIBC成分
				16	YP_187123	金黄色葡萄球菌金黄亚种(Staphylococcus aureus subsp.aureus)COL	PTS系统，IBC成分
17	YP_001785613	肉毒梭菌A3 Loch Maree亚种	PTS系统，葡萄糖/葡萄糖苷家族IIBC成分

芽孢杆菌属和其它微生物来源的异麦芽糖转运蛋白基因，例如编码所述glvC、MsmE、MsmF、MsmG的各基因以及AGT1基因的同源物，也可以通过以基于上述序列信息或该微生物的公知基因或蛋白质序列信息制作的寡核苷酸作为引物的PCR方法，或者通过以基于所述序列信息制作的寡核苷酸作为探针的杂交方法，从微生物的染色体DNA或染色体DNA文库中获取。对于上述基因同源物，适用针对所述malL基因同源物的描述。此外，关于所述malL，glvA基因的变体的描述，对于异麦芽糖转运蛋白基因也同样适用。

而且可以认为，即使赋予或增加将异麦芽糖摄入细胞内的活性，也不会对微生物的葡萄糖摄入造成实质性影响。

通过在培养基中培养本发明的微生物，在培养物，即微生物细胞内或培养基中生成与微生物的目的物质生产能力对应的目的物质。通过从细胞或培养基收集该目的物质，可以生产目的物质。

所使用的培养基可以是迄今为止在利用微生物的目的物质发酵生产中传统上使用的培养基。即，可以使用包含碳源、氮源、无机离子以及视需要的其它有机成分的常规培养基。碳源优包含异麦芽糖，更优选包含异麦芽糖和葡萄糖，更优选包含异麦芽糖、麦芽糖和葡萄糖。在优选的实施方式中，本发明的微生物在包含葡萄糖和异麦芽糖、或者葡萄糖、异麦芽糖和麦芽糖作为碳源的培养基中，不显示两期生长即所谓二级生长(diauxy)。作为包含异麦芽糖和葡萄糖，或者异麦芽糖、麦芽糖和葡萄糖的碳源，可以列举出例如淀粉的水解物或酶分解物。

作为葡萄糖、异麦芽糖和麦芽糖以外的碳源，可以使用：乳糖、半乳糖等糖类，甘油、山梨糖醇等醇类，富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类等。

在本发明中，当以同化淀粉水解液中作为葡萄糖以外的杂质包含的麦芽糖、异麦芽糖作为目的时，异麦芽糖、麦芽糖分别优选包含全部碳源的0.1～10重量％。

此外，在本发明中，当使用异麦芽糖作为碳源时，优选包含相对于碳源总量的1～50重量％、更优选1～20重量％、更优选1～10重量％的异麦芽糖。此外，优选包含相对于碳源总量的50～99重量％、更优选80～99重量％、更优选90～99重量％的葡萄糖。此外，异麦芽糖对葡萄糖的重量比优选为1∶1～1∶100、更优选1∶5～1∶100、更优选1∶10～1∶100。

此外，在除了异麦芽糖之外还使用麦芽糖作为碳源的情况下，优选包含相对于碳源总量的1～50重量％、更优选1～20重量％、更优选1～10重量％的麦芽糖。此外，优选包含相对于碳源总量的50～99重量％、更优选80～99重量％、更优选90～99重量％的葡萄糖。此外，麦芽糖对葡萄糖的重量比优选为1∶1～1∶100、更优选1∶5～1∶100、更优选1∶10～1∶100。

异麦芽糖、麦芽糖在培养基中的浓度可以通过HPLC来定量。

作为氮源，可以使用硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵盐，大豆水解物等有机氮，氨气，氨水等。

作为有机微量营养源，理想的是，适量含有维生素B1、L-高丝氨酸、L-酪氨酸等需要的物质或酵母提取物等。除此之外，视需要还可以添加少量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。

培养可以视所利用的微生物，采用传统上使用的公知条件来进行。例如，可以在需氧条件下实施16～120小时的培养，培养温度控制在25℃～45℃，培养中的pH控制在5～8。而且，pH调整可以使用无机或有机的酸性或者碱性物质，或者氨气等。

此外，在生产L-赖氨酸等碱性氨基酸时，可以采用下述方法来进行生产，所述方法中采用下述方法进行发酵、并回收目的碱性氨基酸：进行控制使得培养中的pH为6.5～9.0、而培养结束时的培养基的pH为7.2～9.0，并且控制发酵中发酵罐内压力为正，或者，向培养基中供给二氧化碳或含有二氧化碳的混合气体，使得存在培养基中的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子为至少2g/L20mM以上的培养期，并且以所述碳酸氢根离子和/或碳酸根离子作为以碱性氨基酸为主的阳离子的反荷离子(特开2002-65287、US2002-0025564A EP 1813677A)。

在本发明中，当在培养基中中以需氧方式对具有生产碱性氨基酸能力的微生物进行培养时，可以将碳酸根离子或碳酸氢根离子或这两者作为碱性氨基酸的主要反荷离子来使用。作为使培养基中存在作为碱性氨基酸的反荷离子所必要量的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子的方法，已知进行控制使得培养中培养基的pH为6.5～9.0、优选6.5～8.0，培养结束时培养基的pH为7.2～9.0，且进行控制使得发酵中发酵罐内压力为正，或者，向培养基中供给二氧化碳或包含二氧化碳的混合气体的方法(特开2002-65287、美国专利申请公开第20020025564号、EP1813677A)。

在本发明中，可以进行控制使得发酵中发酵罐内的压力为正，和/或向培养基中供给二氧化碳或含二氧化碳的混合气体。在任何一种情况下，均优选使得存在培养基中的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子为优选20mM以上、更优选30mM以上、特别优选40mM以上的培养时期。发酵罐内压力、二氧化碳或含二氧化碳的混合气体的供给量、或限定的进气量，可以通过例如测定培养基中的碳酸氢根离子或碳酸根离子或测定pH、氨浓度来确定。

在本发明的上述实施方式中，进行控制使得培养中培养基的pH为6.0～9.0、优选6.5～8.0，培养结束时培养基的pH为7.2～9.0。根据本发明的上述实施方式，与传统方法相比，可以将为了使培养基中存在作为反荷离子所需量的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子的培养基pH抑制在低水平。当使用氨气控制pH时，为了提高pH，需要供给氨气，氨气可以成为碱性氨基酸的N源。作为培养基中所含的碱性氨基酸以外的阳离子，可以列举出培养基成分来源的K、Na、Mg、Ca等。所述阳离子优选为总阳离子的50％以下。

此外，为了使发酵中发酵罐内压力为正，例如可以使进气压高于排气压。通过使发酵罐内压力为正，发酵产生的二氧化碳溶解在培养液中而生成碳酸氢根离子或碳酸根离子，它们可以作为碱性氨基酸的反荷离子。作为发酵罐内压力，具体地可以例举：以表压(相对于大气压的压差)表示为0.03～0.2MPa、优选0.05～0.15MPa、更优选0.1～0.3MPa。此外，可以通过向培养液中供给二氧化碳或含二氧化碳的混合气体，使二氧化碳溶解在培养液中。而且，可以在向培养液中供给二氧化碳或含二氧化碳的混合气体的同时，进行调节使得发酵罐内压力为正。

为了调节发酵罐内压力为正，例如可以设定进气压高于排气压。此外，在向培养液中供给二氧化碳时，例如可以通入纯二氧化碳或含二氧化碳5体积％以上的混合气体。

而且，使碳酸氢根离子和/或碳酸根离子溶解在培养基中的上述方法可以单独使用，也可以多种组合使用。

在传统方法中，通常在培养基中添加足以充当要生成的碱性氨基酸的反荷阴离子的充分量的硫酸铵、氯化铵，此外还在培养基中添加蛋白等的硫酸分解物或盐酸分解物作为营养成分，它们所赋予的硫酸根离子、氯离子包含在培养基中。因此，弱酸性的碳酸根离子浓度在培养中为极低水平，其单位为ppm。本发明的上述实施方式的特征是：减少所述硫酸根离子、氯离子，使微生物在发酵中释放的二氧化碳在上述发酵环境下溶解在培养基中，以此作为反荷离子。因此，在本发明的上述实施方式中，没有必要在培养基中添加生长所必需的量以上的硫酸根离子、氯离子。优选地，培养开始时向培养基中供给适当量的硫酸铵等，在培养过程中停止供给。或者，可以在保持与培养基中的碳酸根离子或碳酸氢根离子的溶解量之间的平衡的同时，供给硫酸铵等。此外，作为碱性氨基酸的氮源，可以向培养基中供给氨气。氨气可以单独供给到培养基中，也可以作为所述其它气体的一部分一起供给到培养基中。

培养基中所含的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子以外的其它阴离子的浓度，在微生物的生长繁育所必需的量的范围内，以低为佳。作为这样的阴离子，可以列举氯离子、硫酸根离子、磷酸离子、离子化的有机酸以及氢氧化物离子等。所述其它离子的摩尔浓度的合计通常优选为900mM以下、更优选700mM以下、更优选500mM以下、更优选300mM以下、特别优选200mM以下。

在本发明的上述实施方式中，目的之一是削减硫酸根离子和/或氯离子的使用量，培养基中所含的硫酸根离子或氯离子或两者的合计通常为700mM以下、优选500mM以下、更优选300mM以下、更优选200mM以下、特别优选100mM以下。

通常，如果在培养基中添加硫酸铵作为碱性氨基酸的反荷离子源，则硫酸根离子会导致培养液中的二氧化碳释放出来。与此形成对照的是，在本发明的上述实施方式中，由于没有在培养基中添加过剩量的硫酸铵的必要，能够容易地使二氧化碳溶解在发酵液中。

此外，在本发明的上述实施方式中，优选将培养基中的总氨浓度控制在“不阻碍碱性氨基酸的生产”的程度。这样的条件包括例如这样的条件，在该条件下，能够获得与在最适条件下生产碱性氨基酸时的收率和/或生产力的量相比优选50％以上、更优选70％以上、特别优选90％以上的碱性氨基酸蓄积的收率和/或生产力。具体地说，作为培养基中的总氨气浓度，可以例举优选300mM以下、更优选250mM、特别优选200mM以下的浓度。pH升高则氨的解离度降低。未解离的氨比铵离子对菌体的毒性更强。因而，总氨浓度的上限依赖于培养液的pH。即，培养液的pH越高，容许的总氨浓度越低。因此，优选为每个特定pH设定所述“不阻碍碱性氨基酸的生产”的总氨浓度。但是，可以将培养中出现的最高pH所容许的总氨浓度的范围作为整个培养期间的总氨浓度的上限值范围。

另一方面，就作为微生物生长以及碱性物质生产所必需的氮源的总氨浓度而言，没有特殊限制，可以适宜地设定，只要培养中的氨能够持续而不枯竭，不会因氮源不足而导致微生物的目的物质生产力降低即可。例如，可以在培养中随时间测定氨浓度，如果培养基中的氨枯竭，则向培养基中添加少量的氨。对于氨添加时的浓度，没有特殊限制，可以例举例如：以总氨浓度计为优选1mM以上、更优选10mM以上、特别优选20mM以上的浓度。

此外，在L-谷氨酸发酵中，还可以使用已调整至L-谷氨酸会析出的条件的液体培养基，使L-谷氨酸在培养基中培养的同时析出。作为L-谷氨酸析出的条件，可以例举例如pH5.0～4.0、优选pH4.5～4.0、更优选pH4.3～4.0、特别优选pH4.0(欧洲专利申请公开第1078989号说明书)。

而且，在核酸的生产方法中，通过使嘌呤核苷磷酸化酶和磷酸核糖转移酶作用于采用本发明的方法生产的肌苷或鸟苷，可以得到5’-肌苷酸或5’-鸟苷酸。

此外，还可以使磷酸转移酶作用于使用本发明的微生物生产的嘌呤核苷来对其进行磷酸化，来生产嘌呤核苷酸(核苷-5’-磷酸酯)(特开2000-295996)。例如，可以采用下列方法：使用导入了编码大肠杆菌肌苷鸟苷激酶的基因的埃希氏菌属细菌的嘌呤核苷酸生产方法(WO91/08286号小册子)、使用导入了编码乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)肌苷鸟苷激酶的基因的产氨棒杆菌(Corynebacterium ammnoniagenes)的嘌呤核苷酸生产方法(WO96/30501号小册子)。

此外，还可以通过使利用本发明的微生物生产的嘌呤核苷与选自多聚磷酸、苯基磷酸、氨甲酰基磷酸中的磷酸供体、以及具有生成核苷-5’-磷酸酯的能力的微生物或酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)相互作用，来生产嘌呤核苷酸(核苷-5’-磷酸酯)。对于具有生成核苷-5’-磷酸酯能力的微生物没有特殊限制，只要是具有将嘌呤核苷转化为嘌呤核苷酸的能力的微生物即可，例如，可以例举诸如国际公开小册子WO9637603号记载的微生物。

此外，还有诸如特开平07-231793公开的蟑螂埃希氏菌(Escherichiablattae)JCM 1650、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)ATCC 33105、植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)IFO 14939(ATCC 33531)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IFO 3318(ATCC 8724)、土生克雷伯氏菌(Klebsiellaterrigena)IFO 14941(ATCC 33257)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)IFO3168、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)IFO 12010、产气肠杆菌IFO 13534(ATCC 13048)、河生色杆菌(Chromobacterium fluviatile)IAM 13652、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)IFO 12614、拉氏西地西菌(Cedecea lapagei)JCM 1684、Cedecea davisiae JCM 1685、奈氏西地西菌(Cedecea neteri)JCM5909等。

作为酸性磷酸酶，例如可以使用诸如特开2002-000289公开的酸性磷酸酶，更优选可以使用对核苷的亲和性提高的酸性磷酸酶(参照特开平10-201481)或核苷酸酶活性降低的突变型酸性磷酸酶(参照WO9637603)、磷酸酯水解活性降低的突变型酸性磷酸酶(特开2001-245676)等。

还可以通过对利用本发明的微生物生产的嘌呤核苷进行化学磷酸化，来获得嘌呤核苷酸(Bulletin of the Chemical Society of Japan 42，3505)。此外，还可以采用下列方法：利用微生物所具有的ATP再生系统，使本发明的具有XMP生产能力的微生物与XMP氨基化酶(アミナ一ゼ)活性偶联来获得GMP的方法、使其与肌苷激酶偶联来获得IMP的方法(Biosci.Biotech.Biochem.，51，840(1997)，特开昭63-230094)。

就上述嘌呤核苷酸的生产中使用的、采用本发明的方法生产的肌苷或鸟苷或嘌呤核苷而言，可以是经过纯化的，也可以是嘌呤核苷的发酵液或含嘌呤核苷的粗纯化品。

就从培养结束后的培养基液中收集L-氨基酸或/核酸而言，本申请的发明中无需采用特殊方法。在本发明中，收集的L-氨基酸、核酸中，除了目的L-氨基酸、核酸以外，还可以包含微生物菌体、培养基成分、水分以及微生物的代谢副产物。收集到的L-氨基酸或核酸的纯度为50％以上、优选85％以上、特别优选95％以上(US5,431,933，JP1214636B，US4,956,471，US4,777,051，US4946654，US5,840358，US6,238,714，US2005/0025878)。

本发明的L-氨基酸可以通过组合传统公知的离子交换树脂法(Nagai，H.et al.：Separation Science and Technology，39(16)，3691-3710)、膜分离法(特开平9-164323号、特开平9-173792号)、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646)或其它方法来收集。

此外，当目的物质是L-苯丙氨酸时，采用本发明的方法制造的苯丙氨酸例如可以用于制造α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯(也称为“阿斯巴甜(aspartame)”)。可以将上述采用本发明的方法分离出来的L-苯丙氨酸结晶溶解，由所得L-苯丙氨酸和天冬氨酸或其衍生物生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯。作为低级烷基酯，可以例举甲酯、乙酯和丙酯等。

对于由L-苯丙氨酸、以及天冬氨酸或其衍生物来合成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯的方法，没有特殊限制，只要在α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯的合成中使用L-苯丙氨酸或其衍生物即可。例如，α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯可以采用例如下述方法来生产(美国专利第3,786,039号)。将L-苯丙氨酸酯化成L-苯丙氨酸的低级烷基酯。使该L-苯丙氨酸烷基酯与β-羧基被保护而α-羧基被酯化而活化的L-天冬氨酸衍生物反应。作为所述衍生物，可以例举N-酰基-L-天冬氨酸酐，例如N-甲酰基-L-天冬氨酸酐、N-苄氧羰基-L-天冬氨酸酐、或N-对甲氧基苄氧羰基-L-天冬氨酸酐。通过该缩合反应，可以得到N-酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸和N-酰基-β-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的混合物。如果在37℃的酸解离常数为10-4以下的有机酸的存在下进行该缩合反应，则α-异构体/β-异构体的比例提高(特开昭51-113841)。然后，从混合物中分离出N-酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸，并进行氢化，从而得到α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸。

此外，从L-苯丙氨酸和L-天冬氨酸-α，β-二酯出发，使用具有催化L-苯丙氨酸不亲核进攻L-天冬氨酸-α，β-二酯的β-酯位点而是亲核进攻α-酯位点的反应的能力的酶或含酶物质，生成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯，并由所得的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-酯，可以简便且高收率地生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-酯(WO2004/065610)。

而且，已经公开了使用鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)来源的肽合成酶的突变体合成二肽的技术，利用该技术可以生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(WO2006/075486)。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行具体说明。在以下的实施例中，试剂如无特别指定，使用的均为和光纯药或Nakalai Tesque公司制造的产品。各实施例中使用的培养基的组成如以下所示。

〔L培养基〕

细菌用胰蛋白胨(Difco公司制造)10g/L、酵母提取物(Difco公司制造)5g/L、NaCl 5g/L。120℃蒸气灭菌20分钟。

〔L琼脂培养基〕

L培养基，细菌琼脂粉(Difco公司制造)15g/L。120℃蒸气灭菌20分钟。

〔氨基酸生产培养基〕

(NH₄)₂SO₄ 20g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgSO₄·7H₂O 1g/L、FeSO₄·7H₂O10mg/L、MnSO₄·5H₂O 10mg/L、酵母提取物(Becton，Dickinson公司制造)2g/L、糖(葡萄糖、异麦芽糖或它们的适当比例的混合物)40g/L、L-酪氨酸100mg/L、CaCO₃(日本药典)30g/L、链霉素50mg/L、或氨苄青霉素50mg/L。糖、MgSO₄·7H₂O、CaCO₃、抗生素单独灭菌。将其它成分混合起来，用KOH调整pH至7.0。115℃高压蒸汽灭菌10分钟。CaCO₃ 180℃干热灭菌2天。链霉素过滤除菌。氨苄青霉素溶于70％乙醇。

〔PCR反应〕

使用的酶是宝酒造(株)制的Pyrobest DNA聚合酶或东洋纺织(株)制的KOD DNA聚合酶，PCR反应按该酶的附带操作规程进行，反应结束后进行凝胶过滤，以除去残留的引物。所使用的柱是Amersham Pharmacia Biotech公司制造的MicrospinTM S-400HR柱，按柱附带的规程的方法进行。

〔连接反应/平滑末端化-磷酸化(Blunting-kination)反应〕

使用TAKARA Bio(株)的Ligation kit ver.2或BKL试剂盒，按该试剂盒附带的规程的方法进行。

〔大肠杆菌的转化〕

使用连接反应液或者质粒DNA，按照Hanahan等的方法(Hanahan，D.1983.Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.J.Mol.Biol.，166，557-580)转化大肠杆菌。

〔实施例1〕异麦芽糖菌体外表达株的氨基酸生产

<1>malL基因的克隆

将枯草芽孢杆菌Marburg 168株(BGSC1A1株，从Bacillus Genetic StockCenter获得)的菌落接种至L培养基5ml中，震荡培养过夜，从所得培养液使用Promega公司的Wizard Genomic DNA Purification kit制备染色体DNA。以该染色体DNA为模板，实施PCR反应。所使用的2个引物的序列如下所示。

〔引物-1〕

5’-GAGAATTCAATGAGTGAATGGTGGAAAGAAGCTGTCG-3’(SEQID NO：1)

〔引物-2〕

5’-CGAGAAAATGATATTCTGCAGTATCTGTTATCACTCCGTC-3’(SEQID NO：2)

SEQ ID NO：1的碱基序号3～8为EcoRI位点，SEQ ID NO：2的碱基序号16～21为PstI位点。

将所得PCR产物用限制酶EcoRI和PstI处理，并与同样用限制酶处理的分泌载体pEZZ18(Amersham Pharmacia Biotech)连接。所述pEZZ18具有pBR322和f1噬菌体的复制起始位点，在lacZα的上游存在多克隆位点，而且在该多克隆位点的上游存在分泌所必需的金黄色葡萄球菌来源的蛋白A(ProteinA)的信号序列以及2个IgG结合区域(ZZ区域)。插入到ZZ区域下游的基因以与信号序列和ZZ区域融合的融合蛋白质的形式表达，该融合蛋白质被分泌到大肠杆菌菌体外后，通过利用ZZ区域的亲和层析可以容易地将其纯化。将所述PCR产物连接到pEZZ18中，使得malL基因所编码的异麦芽糖分解酶能够与蛋白A的信号序列以及其下游的IgG结合区域(Z区域)一起形成融合蛋白质。

使用连接反应液转化大肠杆菌JM109。在含50μg/ml氨苄青霉素、0.2mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)和40μg/ml的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的L琼脂培养基上选择转化体。从转化体抽提质粒，确认了目的片段的插入。将该质粒命名为pEZZmalL。

<2>载体质粒pRS的构建

以质粒pVIC40(WO90/04636)为模板DNA，用以下所示的2个寡核苷酸作为引物，实施了PCR反应。

pVIC40是在具有链霉素抗性基因的RSF1010来源载体中插入包含突变thrA基因的thrA*BC操纵子而得到的质粒，该质粒可以从携带该质粒的大肠杆菌VKPM B-3996株制备。B-3996株于1987年4月7日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(1 Dorozhny proezd.，1 Moscow 117545，Russia)，保藏号B-3996。

〔引物-3〕

5’-GCGCGAATTCCAACGGGCAATATGTCTCTG-3’(SEQ ID NO：3)

〔引物-4〕

5’-GCGCCAATTGGATGTACCGCCGAACTTCAA-3’(SEQ ID NO：4)

将所得PCR产物用限制酶EcoRI和MunI处理。另一方面，将pVIC40用限制酶EcoRI消化，选择消化DNA片段中最长的DNA片段，将其与上述的PCR片段相连接。使用连接反应液转化大肠杆菌JM109。在含50μg/ml链霉素的L琼脂培养基上获得转化体。以从转化株制备的质粒作为模板，使用上述引物-3和下述引物-5进行PCR反应，选择能够检出约270bp的条带的质粒，将其命名为pRS。pRS具有从pVIC40中除去thrABC操纵子而成的结构。

〔引物-5〕

5’-CAGTTTTCTGATGAAGCGCG-3’(SEQ ID NO：5)

<3>含lacZα基因的质粒pRSL的构建

以pSTV29(宝酒造(株))为模板，以如下所示的2个寡核苷酸作为引物，实施了PCR反应。pSTV29为包含lacZ基因的低拷贝数的质粒。

〔引物-6〕

5’-CCAATACGCAAACCGCCTCTCC-3’(SEQ ID NO：6)

〔引物-7〕

5’-CAAATGTAGCACCTGAAG-3’(SEQ ID NO：7)

将所得lacZα片段与将pRS用限制酶PstI消化并进行平滑末端化而得到的片段连接起来。使用连接反应液转化大肠杆菌JM109。在含50μg/ml的潮霉素、0.2mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)和40μg/ml的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的L琼脂培养基上选择转化体。从转化体抽提质粒，确认了目的片段的插入。将该质粒命名为pRSL。

<4>将malL基因插入pRSL

以pEZZmalL为模板DNA，使用下述的引物通过PCR法扩增了具有蛋白A的信号序列的malL基因片段。

〔引物-8〕

5’-CATTAGGCACCCCAAGCTTTACACTTTATGCTTCC-3’(SEQ ID NO：8)

〔引物-9〕

5’-GACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGG-3’(SEQ ID NO：9)

SEQ ID NO：8、9的碱基序号14～19为HindIII位点。

将所得PCR产物用限制酶HindIII处理，并与同样用HindIII处理的载体pRSL相连接。使用连接反应液转化大肠杆菌JM109。在含有50μg/ml的链霉素(Sm)、0.2mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)和40μg/ml的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的L琼脂培养基上选择转化体。从转化体抽提质粒，确认了目的片段的插入。将该质粒命名为pRSLmalL。

<5>氨基酸生产培养评价

在氨基酸生产菌中导入pRSLmalL，对异麦芽糖同化性以及氨基酸生产力进行了考察。

作为L-苯丙氨酸生产菌，使用了在大肠杆菌W3110(tyrA)(参照欧洲专利公开第488424号公报)中导入质粒pMW118或pMGAL1(特开平5-344881)而得到的菌株。此外，作为L-赖氨酸生产菌，使用了大肠杆菌WC196ΔcadAΔldcC(也称“WC196LC”)((WO2006/078039)。用pRSLmalL转化了所述菌株。

所述W3110(tyrA)株可通过在大肠杆菌W3110(tyrA)/pHATerm中使质粒pHATerm脱落而获得。W3110(tyrA)/pHATerm株被命名为AJ12662株，于1991年11月16日国际保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、

305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM BP-3653(WO01/053459)。

此外，pMGAL1具有编码已解除反馈抑制的埃希氏菌属来源的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶的基因、以及已解除反馈抑制的埃希氏菌属来源的分支酸变位酶-预苯酸脱水酶(特开平5-344881号)。

将所得的各转化体接种到含抗生素(对于pRSL或pRSLmalL携带株为50μg/ml的链霉素，对于pMW118或pMGAL1携带株为50μg/ml的氨苄青霉素)的L培养基5ml中，37℃震荡培养过夜后，将50μl培养液涂布在与上述相同的L琼脂培养基上，于37℃培养过夜。在500ml容量的坂口烧瓶中加入以葡萄糖和异麦芽糖的混合物为碳源的氨基酸生产培养基20ml，刮取相当于1/8个平板的前述琼脂培养基上生长出的菌体，接种在所述坂口烧瓶中。初始葡萄糖、异麦芽糖浓度分别为36g/L、6.6g/L。培养24小时后，对各氨基酸浓度以及残留葡萄糖和异麦芽糖进行了定量。作为对照，使用了在大肠杆菌W3110(tyrA)/pMW118或W3110(tyrA)/pMGAL1或WC196LC中导入pRSL而得到的转化体。结果如表4所示。

表4氨基酸生产培养

-：未测定

在将载体pRSL导入大肠杆菌W3110(tyrA)/pMW118或W3110(tyrA)/pMGAL1的情况下，异麦芽糖未被同化；与此相对照的是，在导入pRSLmalL的情况下，经过同样的培养时间异麦芽糖被同化。相似地，在将pRSL导入大肠杆菌WC196LC的情况下，异麦芽糖未被同化；与此相对照的是，在导入pRSLmalL的情况下，经过同样的培养时间异麦芽糖基本上全部被同化。可知将导入pRSLmalL的菌株进一步延长培养至42小时，异麦芽糖完全被消耗。由以上事实可以判明，导入malL基因诱导了异麦芽糖同化。

此外，对于任何一个菌株而言，malL基因的导入均带来了L-苯丙氨酸或L-赖氨酸生产量的增加。

〔实施例2〕表达菌体内异麦芽糖酶以及异麦芽糖转运蛋白的菌株的构建

<1>malL基因菌体内表达用质粒的构建

为了在大肠杆菌MG1655株内表达异麦芽糖水解酶(异麦芽糖酶)，构建枯草芽孢杆菌来源的malL基因表达质粒。

<1-1>包含lacZ基因的质粒pRSL12的构建

以pHSG399(宝酒造(株)产)为模板，以如下所示的2个寡核苷酸作为引物，实施了PCR反应。

〔引物-6〕

5’-CCAATACGCAAACCGCCTCTCC-3’(SEQ ID NO：6)

〔引物-10〕

5’-AGTCAGTGAGCGAGGAAG-3’(SEQ ID NO：10)

将所得片段与事先用限制酶PstI消化并经过了平滑末端化的pRS片段相连接。使用连接反应液转化大肠杆菌JM109。在含50μg/ml的链霉素、0.2mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)和40μg/ml的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的L琼脂培养基上选择转化体。从转化体抽提质粒，确认目的片段的插入。将该质粒命名为pRSL12。

<1-2>在菌体内表达malL基因的质粒pRSL12malL(self)的构建

在L培养基5ml中接种枯草芽孢杆菌Marburg168株(BGSC1A1株，从Bacillus Genetic Stock Center获得)的菌落，震荡培养过夜，使用Promega公司的Wizard Genomic DNA Purification kit从培养液制备染色体DNA。以该染色体DNA为模板，以如下所示的2个寡核苷酸作为引物，实施PCR反应，通过PCR法扩增含malL基因自身的启动子区域的malL基因片段。

〔引物-11〕

5’-GGCTGGCAATCGTTCAAAGCTTTGCAGGCATGCGC-3’(SEQ IDNO：11)

〔引物-12〕

5’-CGAGAAAATGATATTCTGCAGTATCTGTTATCACTCCGTC-3’(SEQ ID NO：12)

将所得PCR产物用限制酶HindIII和PstI处理，并与同样用限制酶处理的载体pRSL12相连接。使用连接反应液转化大肠杆菌JM 109。在含50μg/ml的链霉素(Sm)、0.2mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)和40μg/ml的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的L琼脂培养基上选择转化体。从转化体抽提质粒，确认了目的片段的插入。将该质粒命名为pRSL 12malL(self)。

<2>变形链球菌来源的异麦芽糖转运蛋白表达质粒的构建

变形链球菌具有编码被称作多重糖代谢系统(multiple sugar metabolismsystem)的蛋白群的基因群，所述蛋白群与蜜二糖、异麦芽糖、棉子糖等各种糖的同化相关(Tao，L.，et al.，INFECTIONAND IMMUNITY.1993，61，1121)。多重糖代谢系统由包含msmR(激活剂)、aga(α-半乳糖苷酶)、msmE(糖结合蛋白)、msmF(膜蛋白)、msmG(膜蛋白)、gtfA(蔗糖磷酸化酶)、msmK(ATP结合蛋白)、dexB(葡聚糖葡糖苷酶)等一系列基因的操纵子所编码。

为了将异麦芽糖摄取到大肠杆菌菌体内，制作表达多重糖代谢系统的糖转运蛋白(sugar transporter)MsmE、MsmF、MsmG的质粒。基于论文(Russell，R.R.B.，et al.，The Journal ofBiological Chemistry.1992，7，4631)所记载的变形链球菌多重糖代谢系统的序列信息，设计从染色体DNA扩增编码MsmE、MsmF、MsmG的区域的引物。使用设计的引物，以从变形链球菌抽提的染色体DNA为模板，进行PCR反应。

染色体DNA可以使用Bacterial Genomic DNA purification kit(Edge BioSystem公司制造)来获取。PCR反应中使用pyrobest DNA聚合酶(TAKARA Bio公司制造)，将96℃20秒、65℃20秒、72℃3分钟的反应进行25个循环。对PCR产物进行末端平滑化，再进行磷酸化。将所得DNA片段用限制酶SmaI消化，并将其与经碱性磷酸酶处理的质粒载体pMW119(NIPPON GENE公司制造)或pTWV229(TAKARA Bio公司制造)相连接，从而构建表达异麦芽糖转运蛋白的质粒pMW119-Smsm以及pTWV229-Smsm。

<3>酿酒酵母来源异麦芽糖转运蛋白表达质粒的构建

酿酒酵母的AGT1基因编码将麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖等各种α-糖苷输送至菌体内的Agtlp蛋白质(Han，E.K.，et al.，Molecular Microbiology.1995，17，1093.)。为了将异麦芽糖摄入到大肠杆菌菌体内，构建表达AGT1基因的质粒。基于酿酒酵母AGT1基因的序列信息(GenBank/L47346)，设计从染色体DNA扩增AGT1基因的引物。使用所述引物，以酿酒酵母的染色体DNA为模板进行PCR。染色体DNA可以使用Bacterial Genomic DNApurification kit(Edge Bio System公司制造)来获取。PCR是使用pyrobest DNA聚合酶(TAKARA Bio公司制造)，将96℃20秒、65℃20秒、72℃2分的反应进行25个循环。将PCR产物进行末端平滑化，再进行末端磷酸化。将该DNA用限制酶SmaI消化，并将其连接到碱性磷酸酶处理的载体pMW119(NIPPON GENE公司制造)或pTWV229(TAKARA Bio公司制造)中，从而构建表达Agtlp的质粒pMW119-AGT1以及pTWV229-AGT1。

<4>对大肠杆菌K12株MG1655赋予异麦芽糖同化能力

对于在细胞内表达异麦芽糖酶的情况，异麦芽糖同化除了需要异麦芽糖酶之外，还必须要有异麦芽糖转运蛋白。因此，可以通过使大肠杆菌K12株MG1655同时携带上述pRSL12malL(self)和pMW119-Smsm或pTWV229-Smsm，来制作同化异麦芽糖的菌株。相似地，可以通过使大肠杆菌K12株MG1655同时携带上述pRSL12malL(self)和pMW119-AGT1或pTWV229-AGT1，来制作同化异麦芽糖的菌株。

制作大肠杆菌K12株MG1655的感受态细胞，用pRSL12malL(self)和pMW119-Smsm或pTWV229-Smsm进行转化。相似地，将K12株MG1655用pRSL12malL(self)和pMW119-AGT1或pTWV229-AGT1进行转化。将转化株在含抗生素链霉素50μg/ml和氨苄青霉素100μg/ml的L琼脂培养基上进行培养，选择转化体。所得转化体表达异麦芽糖酶和异麦芽糖转运蛋白，具有异麦芽糖同化能力。

通过对如上述地获得的具有异麦芽糖同化性的菌株赋予氨基酸等目的物质的生产能力，可以获得可从含异麦芽糖的原料生产目的物质的菌株。此外，通过对具有目的物质生产能力的菌株如上述地赋予异麦芽糖同化能力，也能够获得从含异麦芽糖的原料生产目的物质的菌株。

〔实施例3〕通过导入glvA和glvC基因来导入异麦芽糖/麦芽糖摄入系统和异麦芽糖酶/麦芽糖酶基因

glvA以及glvC基因的导入使用了以下的tac启动子的变体进行表达。

〔Tac启动子的序列〕

5′-ccctgTTGACAattaatcatcggctcgTATAATgtgtggaatcg-3′(SEQ ID NO：32)

〔PTacA启动子的序列〕

5′-ccctgTTGACAattaatcatcggctcgAATAATgtgtggaatcg-3′(SEQ ID NO：33)

〔PtacB启动子的序列〕

5′-ccctgTTGGAAttaatcatcggctcgTATAATgtgtggaatcg-3′(SEQ ID NO：43)

<1>glvA基因的克隆

在L培养基5ml中接种枯草芽孢杆菌Marburg 168株(ATCC6051)的菌落，震荡培养过夜，从所得培养液使用Promega公司的Wizard Genomic DNAPurification kit制备了染色体DNA。以该染色体DNA为模板，实施了PCR反应。所使用的2个引物的序列如下。

〔引物-23〕

5’-AGAAATTTCCCGCTCTATGG-3’(SEQ ID NO：23)

〔引物-24〕

5’-TGTAGTGCTGATTGATCAGTTC-3’(SEQ ID NO：24)

对于所得PCR产物，使用TAKARA Bio(株)的BKL试剂盒进行平滑末端化-磷酸化处理，并与用限制酶SmaI处理的TAKARA Bio(株)的pTWV229载体进行连接。

使用连接反应液转化大肠杆菌JM109。在含100μg/ml的氨苄青霉素的L琼脂培养基上选择转化体。从转化体抽提质粒，确认了目的片段的插入。将该质粒命名为pTWV229-self-glvA-Fw。该质粒中，相对于pTWV229上存在的lac启动子，正向插入了glvA基因。

<2>载体质粒pMW219-ΔPlac的构建

为了在使载体质粒pMW219上存在的lac启动子对glvC基因转录的影响极小化的条件下表达glvC基因，缺损了载体质粒pMW219的lac启动子部位。将载体质粒pMW219用限制酶HindIII处理，通过乙醇沉淀进行了纯化。进一步使用限制酶PstI进行处理后，使用引物25和26实施了PCR反应。

〔引物-25〕

5’-GCCaagcttGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGG-3’(SEQ ID NO：25)

〔引物-26〕

5’-CCCaagcttGCTAACTCACATTAATTGCGTTG-3’(SEQ ID NO：26)

小写字母为HindIII识别位点。

将所得PCR产物用HindIII进行处理后，将DNA的末端连接起来(自身连接)。

使用连接反应液转化大肠杆菌JM109。在含50μg/ml的卡那霉素的L琼脂培养基上选择转化体。从转化体抽提质粒，确认了其具有目的结构。将该质粒命名为pMW219-ΔPlac。该载体质粒具有存在于pMW219上的lac启动子部位发生缺损的结构。

<3>glvC基因的克隆

在L培养基5ml中接种枯草芽孢杆菌Marburg 168株(ATCC6051)的菌落，震荡培养过夜，从所得培养液使用Promega公司的Wizard Genomic DNAPurification kit制备了染色体DNA。以该染色体DNA作为模板实施PCR反应。所使用的2个引物的序列如下。

〔引物-27〕

5’-CAATTTCACACAAGGAGACTGCCATGATGCAAAAAATTCAGCG-3’(SEQ ID NO：27)

〔引物-28〕

5’-CCCAAGCTTCCCCTTTTTACTCGATTGTCTC-3’(SEQ ID NO：28)

将所得PCR产物用苯酚-氯仿抽提，并通过乙醇沉淀进行纯化。以所得DNA片段为模板，使用引物29(SEQ ID NO：29)和引物30(SEQ ID NO：30)实施PCR反应。此时，使少量的引物31共存来实施PCR反应。

〔引物-29〕

5’-CCCAAGCTTCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGAATAATGTGTGGAATCGTGAGCGGATAACAATTTCACACAAGGAG-3’(SEQ ID NO：29)

〔引物-30〕

5’-CCCAAGCTTCCCCTTTTTACTCGATTGTCTC-3’(SEQ ID NO：30)

〔引物-31〕

5’-CGAATAATGTGTGGAATCGTGAGCGGATAACAATTTCACACAAGGAGACTGCCATGATGCAAAAAATTCAGCGCTTTGGA-3’(SEQ ID NO：31)

对于所得PCR产物，使用琼脂糖凝胶进行电泳，使用QIAGEN(株)公司制造的QIAquick Gel Extraction kit来纯化目的DNA片段。对纯化的DNA片段进行平滑末端化-磷酸化处理，并将其与用限制酶SmaI处理的pMW219-ΔPlac载体相连接。

使用连接反应液转化大肠杆菌JM109。在含50μg/ml的卡那霉素的L琼脂培养基上选择转化体。从转化体抽提质粒，确认了目的片段的插入。将该质粒命名为pMW219-ΔPlac-PtacA-glvC。该质粒中，相对于pMW219-ΔPlac的缺损的Plac(lac启动子)，反向地携带着glvC基因。

<4>glvA以及glvC表达株的异麦芽糖同化能力的评价

制作了在大肠杆菌K12 MG1655株中导入pTWV229-self-glvA-Fw以及pMW219-ΔPlac-PtacA-glvC而得到的菌株。将该菌株命名为glvA+glvC/MG1655株。作为本实验的对照株，制作了在大肠杆菌K12MG1655株中导入pTWV229以及pMW219-ΔPlac而得到的菌株。将该菌株命名为pTWV229+pMW219-ΔPlac/MG 1655株。

使对照株(pTWV229+pMW219-ΔPlac/MG1655株)以及glvA+glvC/MG1655株于在M9极限培养基中添加0.2％的异麦芽糖而得到的培养基(M9-iMal培养基)中生长，通过OD测定对生长情况进行了跟踪(图1)。由图1可知，glvA+glvC/MG1655株中可以观察到在对照株中无法观察到的良好的生长。即，可知：通过在大肠杆菌K12 MG1655株内表达glvA以及glvC基因，能够赋予异麦芽糖同化能力。

[M9培养基]

MgSO₄·7H₂O 0.247g/L

CaCl₂·2H₂O 0.0147g/L

Na₂HPO₄·12H₂O 15.1g/L

KH₂PO₄ 3g/L

NaCl 0.5g/L

NH₄Cl 1.0g/L

用NaOH调整至pH6.8，在M9-iMal培养基中，添加有2.0g/L量的异麦芽糖作为碳源，而在M9-Glc+iMal培养基中，添加有0.2g/L量的葡萄糖、1.8g/L量的异麦芽糖作为碳源，并进行了滤器灭菌。而且，异麦芽糖是使用Nakalai公司制造的75％异麦芽糖溶液添加至上述的量。此外，培养前，分别以100μg/ml和50μg/ml的浓度添加了氨苄青霉素和卡那霉素。

使对照株(pTWV229+pMW219-ΔPlac/MG1655株)以及glvA+glvC/MG1655株于在M9极限培养基中添加葡萄糖0.02％、异麦芽糖0.18％而得到的培养基(M9-Glc+iMal培养基)中生长，通过OD测定对其生长情况进行了跟踪(图2)。由图2可知，对照株在OD为约0.2的时间点上停止了生长，而与此相对照的是，glvA+glvC/MG1655株显示了良好的生长繁育，而未显示二阶段增殖。因为没有确认到二阶段增殖，所以可知glvA+glvC/MG1655株同时同化葡萄糖和异麦芽糖。

〔实施例4〕利用异麦芽糖同化能力赋予株进行氨基酸生产

<1>glvC基因的克隆

在L培养基5ml中接种枯草芽孢杆菌Marburg 168株(ATCC6051)的菌落，震荡培养过夜，从所得培养液使用Promega公司的Wizard GenomicDNAPurification kit制备了染色体DNA。以该染色体DNA作为模板实施PCR反应。所使用的2个引物的序列如下。

〔引物-34〕

5’-GAATCGTGAGCGGATAACAATTTCACACAAGGAGACTGCCATGATGCAAAAAATTCAGCGCTTTGGAAGCGCGATGTTTG-3’(SEQ ID NO：34)

〔引物-35〕

5’-TGACGGCAAACGAAAACCCTCC-3’(SEQ ID NO：35)

对于所得PCR产物，使用琼脂糖凝胶进行电泳，使用QIAGEN(株)公司制造的QIAquick Gel Extraction kit纯化目的DNA片段。以纯化的DNA片段为模板，使用引物36和引物37进行PCR反应。此时，使少量的引物38共存来实施PCR反应。

〔引物-36〕

5’-GCtctagaGCCCCTGTTGGAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTG-3’(SEQ ID NO：36)

〔引物-37〕

5’-GCtctagaGCTGACGGCAAACGAAAACCCTCCCGAAAAGG-3’(SEQ IDNO：37)

小写字母表示XbaI识别位点。

〔引物-38〕

5’-CCCTGTTGGAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATCGTGAGCGGATAACAATTTCACACAAGGAGACTGCC-3’(SEQ ID NO：38)

对于所得的PCR产物，使用Wizard PCR Preps DNA purificationsystem(Promega公司制造)进行纯化，并用限制酶XbaI进行了处理。然后，将其与同样用限制酶XbaI进行了处理的pMW219-ΔPlac相连接。

使用连接反应液转化了大肠杆菌JM109。在含50μg/ml卡那霉素的L琼脂培养基上选择了转化体。从转化体抽提质粒，确认了目的片段的插入。将该质粒命名为pMW219-ΔPlac-PtacB-glvC-Rv。该质粒中，相对于pMW219-ΔPlac的缺损的Plac(lac启动子)，反向携带了glvC基因。

<3>氨基酸生产培养评价

作为L-赖氨酸生产菌，使用了大肠杆菌WC196ΔcadAΔldcC(也称WC196LC)(参照WO2006/078039)。将上述菌株用pCABD2(WO95/16042)、pTWV229-self-glvA-Fw和pMW219-ΔPlac-PtacB-glvC-Rv进行了转化。将所得转化体命名为pCABD2+glvA+glvC/WC196LC。作为本实验的对照株，制作了在WC196LC中导入pCABD2(WO95/16042)、pTWV229和pMW219-ΔPlac而得到的菌株。将所得转化体命名为pCABD2+pTWV229+pMW219-ΔPlac/WC196LC。

将上述制作的菌株在含20mg/L链霉素、100mg/L氨苄青霉素以及50mg/L卡那霉素的L培养基中于37℃培养至OD600为约0.6后，加入与培养液等量的40％甘油溶液进行搅拌。然后按适当量分装，并于-80℃保存，作为甘油保存液。

使对照株以及pCABD2+glvA+glvC/WC196LC的甘油保存液融化，取500μL均匀涂布在含20mg/L链霉素、100mg/L氨苄青霉素以及50mg/L卡那霉素的L平板上，37℃培养24小时。从所得平板刮取菌体，将其悬浮在如下所示的L-赖氨酸生产培养基(MS-Glc+iMal培养基)中，调整成OD＝15。取该菌体液1mL，将其接种在装有含20mg/L链霉素、100mg/L氨苄青霉素以及50mg/L卡那霉素的以下所示的L-赖氨酸生产培养基(MS-Glc+iMal培养基)19mL的500mL容量坂口烧瓶中，在往复震荡培养装置中于37℃进行培养。作为L-赖氨酸生产培养基，使用以葡萄糖和异麦芽糖作为糖源的MS-Glc+iMal培养基。对培养中以及培养结束后的培养基中蓄积的L-赖氨酸、以及残留的葡萄糖和异麦芽糖的量进行了定量。各培养时间的L-赖氨酸对葡萄糖收率、残留葡萄糖和异麦芽糖如表5所示。

[L-赖氨酸生产培养基(MS-Glc+iMal培养基)]

葡萄糖 17.8g/L

异麦芽糖 3.3g/L

(NH₄)₂SO₄ 24g/L

KH₂PO₄ 1.0g/L

MgSO₄·7H₂O 1.0g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·7H₂O 0.08g/L

酵母提取物 2.0g/L

L-异亮氨酸 0.1g/L

CaCO₃(日本药典) 50g/L

用KOH调整至pH7.0，115℃高压灭菌10分钟。但是，将葡萄糖、异麦芽糖以及MgSO₄·7H₂O混合在一起，并与其它成分分开实施高压灭菌。CaCO₃进行干热灭菌后再添加。

表5氨基酸生产培养的结果

Lys(g/L)	3.5	6.1	5.8	7.4	7.8
						初始Glc浓度(g/L)	17.9	17.9	17.9	17.9	17.9
残留Glc浓度(g/L)	6.7	0.0	4.9	0.8	0.0
						初始iMal浓度(g/L)	3.3	3.3	3.3	3.3	3.3
残留iMal浓度(g/L)	3.3	3.2	0.0	0.0	0.0

在向WC196LC中导入了pCABD2以及载体pTWV229和pMW219-ΔPlac的情况下，异麦芽糖未被同化；与此相对的是，在导入了glvA和glvC表达质粒的情况下，葡萄糖和异麦芽糖同时被同化了。而且，通过导入glvA和glvC表达质粒，L-赖氨酸蓄积增加，对葡萄糖收率提高。

接着，将pCABD2+glvA+glvC/WC196LC株在以葡萄糖、麦芽糖以及异麦芽糖为糖源的培养基中进行了培养。使pCABD2+glvA+glvC/WC196LC的甘油保存液融化，取500μL均匀涂布在含20mg/L链霉素、100mg/L氨苄青霉素以及50mg/L卡那霉素的L平板上，37℃培养24小时。从所得平板上刮取菌体，将其悬浮在以下所示的L-赖氨酸生产培养基(MS-Glc+Mal+iMal培养基)中，调整成OD＝15。取该菌体液1mL，将其接种到装有含20mg/L链霉素、100mg/L氨苄青霉素以及50mg/L卡那霉素的以下所示的L-赖氨酸生产培养基(MS-Glc+Mal+iMal培养基)19mL的500mL容量坂口烧瓶中，在往复震荡培养装置中于37℃进行培养。作为L-赖氨酸生产培养基，使用了以葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖作为糖源的MS-Glc+Mal+iMal培养基。对培养中以及培养结束后的培养基中蓄积的L-赖氨酸以及残留的葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖的量进行了定量。各培养时间的L-赖氨酸对葡萄糖收率、残留葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖如表6所示。

[L-赖氨酸生产培养基]

葡萄糖 17.8g/L

异麦芽糖 3.3g/L

麦芽糖 3.3g/L

(NH₄)₂SO₄ 24g/L

KH₂PO₄ 1.0g/L

MgSO₄·7H₂O 1.0g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·7H₂O 0.08g/L

酵母提取物 2.0g/L

L-异亮氨酸 0.1g/L

CaCO₃(日本药典) 50g/L

用KOH调整至pH7.0，115℃高压灭菌10分钟。但是，将葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖以及MgSO₄·7H₂O混合在一起，并与其它成分分开实施高压灭菌。CaCO₃进行干热灭菌后再添加。

表6 MS-Glc+Mal+iMal培养基中的氨基酸生产培养的结果

在向WC 196LC导入pCABD2以及glvA和glvC表达质粒的情况下，同时同化了葡萄糖以及麦芽糖和异麦芽糖。而且，通过导入glvA和glvC表达质粒，L-赖氨酸蓄积增加，对葡萄糖收率提高。

工业实用性

根据本发明，能够以异麦芽糖和/或麦芽糖作为原料，采用发酵法利用微生物来进行物质生产。在优选的实施方式中，即使对于本来不能同化异麦芽糖和/或异麦芽糖的微生物，也能够通过本发明赋予异麦芽糖和/或异麦芽糖同化能力。