CN105219666A

CN105219666A - 用于在微氧条件下生产丁醇的共生菌体系和方法

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Publication number: CN105219666A
Application number: CN201410271504.7A
Authority: CN
Inventors: 张建安; 刘宏娟; 吴鹏飞; 王根宇; B·T·伯雷森; E·梅勒赛特; H·K·科特拉; 周玉杰; 程可可
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2014-06-18
Filing date: 2014-06-18
Publication date: 2016-01-06
Anticipated expiration: 2034-06-18
Also published as: CN105219666B

Abstract

本发明提供一种共生菌体系，其包含产丁醇梭菌和芽孢杆菌，能够在微氧条件下发酵生产丁醇。本发明还提供上述共生菌体系用于微氧条件下生产丁醇的用途。本发明进一步提供一种生产丁醇的方法，其包括在微氧条件下在发酵培养基中培养上述共生菌体系从而进行发酵的步骤。

Description

用于在微氧条件下生产丁醇的共生菌体系和方法

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种可以微氧发酵生产丁醇的共生菌体系及微氧发酵生产丁醇的方法。

背景技术

丁醇是重要的化工原料，主要用作溶剂，同时在医药工业、塑料工业、有机工业、印染等方面也具有广泛用途。

近年来受世界石油资源、价格、环保和全球气候变化的影响，发展生物燃料已成为许多国家提高能源安全、减排温室气体、应对气候变化的重要措施。在生物燃料领域，生物乙醇是被普遍看好的汽油调和组分(生产乙醇汽油)，但是在使用过程中，生物乙醇存在能量密度低，蒸气压较高，腐蚀管道，易吸水而产生分层等缺点，成为制约其发展的瓶颈问题。近年来，丁醇在生物燃料领域的发展潜力超过乙醇。与生物乙醇相比，生物丁醇的能量密度和燃料经济性高，蒸汽压低，与汽油的配伍性好，腐蚀性小，便于管道输送。因此，生物丁醇已成为继生物乙醇后又一新型醇类生物燃料产品。

工业上生产丁醇的方法有化学合成法(例如，羰基合成法和醇醛缩合法)和发酵法(参见化学工业出版社组织编写，中国化工产品大全，北京：化学工业出版社，1998，511-512)：

近年来，随着国际石油价格的剧烈波动以及基于石油资源不可再生性的共识，发酵法生产丙酮、丁醇和乙醇(ABE)的技术重新引起了广泛关注(NiY,SunZH.Recentprogressonindustrialfermentativeproductionofacetone-butanol-ethanolbyClostridiumacetobutylicuminChina.ApplMicrobiolBiotechnol,2009,83(3):415-423；LeeSY,ParkJH,JangSH,etal.FermentativebutanolproductionbyClostridia.BiotechnolBioeng,2008,101(2):209-228)。

发酵法生产丁醇时，因菌种自身生理生化特性，使得发酵培养都维持在严格厌氧条件下，培养基一般处在静止或低速搅拌下进行，在大规模培养时，不利于发酵初期菌体对营养基质的吸收以及传质的进行，特别是在非玉米的合成培养基中菌株难以生长。同时，要采用制氮设备维持发酵的厌氧环境，也增加了固定设备的投资及能耗。

此外，发酵液中的丁醇浓度低以及发酵过程中的丁醇选择性不高也是导致丁醇发酵缺乏经济竞争力的重要原因。传统的丁醇发酵产物中丁醇:丙酮:乙醇均为6:3:1。提高三种成分中主产物丁醇的浓度是降低发酵法制造丁醇成本的手段之一。然而，传统的发酵生产中的丁醇终浓度维持在13-14g/L左右，难于超过这一阈值的原因在于所生成的产物特别是丁醇对产丁醇菌种的毒害作用[Vollherbst-SchneckK,SandsJA,MontenecourtBS.EffectofbutanolonlipidcompositionandfluidityofClostridiumacetobutylicumATCC824.ApplEnvironMicrobiol,1984,47(1):193-194.]。因此，在无法进一步大幅提高发酵产物浓度的情况下，提高发酵过程中作为主发酵产物丁醇生物合成的选择性，减少副产物量来提高丁醇比例，降低能耗成为提升生物丁醇发酵产业经济性和竞争力的重要手段。

发明内容

本发明提供一种共生菌体系，其包含产丁醇梭菌和芽孢杆菌，能够在微氧条件下发酵生产丁醇。

在本发明的共生菌体系中，产丁醇梭菌是丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。

在本发明的共生菌体系中，芽孢杆菌是蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)。

在本发明的优选的实施方式中，产丁醇梭菌是保藏号为CGMCC8071的丙酮丁醇梭菌菌株。

在本发明的优选的实施方式中，芽孢杆菌是保藏号为CGMCC8070的蜡状芽孢杆菌菌株。

本发明提供一种上述共生菌体系用于生产丁醇的用途。

本发明提供一种生产丁醇的方法，其包括在微氧条件下在发酵培养基中培养上述共生菌体系进行发酵的步骤。

在本发明的一种实施方式中，所述生产丁醇的方法包括在发酵培养基中添加中性红。

在本发明优选的生产丁醇的方法中，在发酵开始后0-48小时添加中性红。

在本发明优选的生产丁醇的方法中，发酵培养基中中性红的终浓度为0.05-3g/L。

在本发明的生产丁醇的方法中，发酵培养基为本领域已知的任何合适的培养基，优选地，是玉米发酵培养基或P2半合成培养基。

在本发明的生产丁醇的方法中，发酵时间为36-120小时。

在本发明的生产丁醇的方法中，发酵过程中的通气量为0-1vvm。

在本发明优选的实施方式中，发酵过程中的通气量为0.05-0.5vvm。

在本发明进一步优选的实施方式中，发酵过程中的通气量为0.1vvm。

在本发明的生产丁醇的方法中，发酵在30-40℃的温度下进行。

在本发明的生产丁醇的方法中，发酵过程中的搅拌速度为0-100rpm。

附图说明

图1是菌株TSH2的16SrRNA基因序列高变区的NCBI比对结果；

图2是菌株TSH1的16SrRNA基因序列高变区的NCBI比对结果；

图3是菌株TSH1、TSH2与其它物种16SrRNA基因高变区的进化关系。

发明详述

生物燃料(biofuel)泛指由生物体组成或转化的固体、液体或气体燃料。狭义的生物燃料仅指液体生物燃料，主要包括生物柴油(biodiesel)、生物乙醇和航空生物燃料等。生物丁醇是与生物乙醇相似的生物燃料，可采用与乙醇相似的发酵流程制取。

在发酵法生产生物丁醇所使用的微生物中，一些可以直接利用淀粉进行发酵，无需对原料进行糖化处理，而另一些用于糖质原料的发酵，应用相对受限制。由于上述生产生物丁醇的菌种都是严格厌氧的微生物，因此在发酵的过程中必须保证无氧条件。为此，必须配备制氮设备，这样就增加了投资和能耗。另外，培养基一般处在静止或低速搅拌下进行，在大规模培养时，不利于发酵初期菌体对营养基质的吸收以及传质的进行，特别是在非玉米的合成培养基中菌株难以生长。

在本发明的一个实施方式中，提供一种共生菌体系，其含有产丁醇梭菌和芽孢杆菌，该共生菌体系可以在微氧条件下生长，并产生丁醇。在本发明优选的实施方式中，产丁醇梭菌选自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、Clostridiumsacharoperbutylacetonicum和Clostridiumsaccharobutylicum。在本发明优选的实施方式中，产丁醇梭菌是丙酮丁醇梭菌。在本发明优选的实施方式中，芽孢杆菌是蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)。在本发明更优选的实施方式中，产丁醇梭菌是保藏号为CGMCC8071的丙酮丁醇梭菌菌株。在本发明更优选的实施方式中，芽孢杆菌是保藏号为CGMCC8070的蜡状芽孢杆菌菌株。

丙酮丁醇梭菌是一种属于梭菌属(Clostridium)的革兰氏染色阳性、细胞呈梭状、能产生丙酮和丁醇等溶剂的厌氧芽孢杆菌。蜡状芽孢杆菌则是芽孢杆菌属(Bacillus)中的一种。

在本发明的一些实施方式中，筛选可以在微氧条件下生长，并产生丁醇的共生菌体系。在本发明优选的实施方式中，筛选使用RCM固体培养基、RCM液体培养基、TYA培养基以及任何本领域已知的合适的培养基。在本发明优选的实施方式中，该共生菌体系包含产丁醇梭菌和芽孢杆菌。在本发明更优选的实施方式中，产丁醇梭菌是丙酮丁醇梭菌。在本发明更优选的实施方式中，芽孢杆菌是蜡状芽孢杆菌。在本发明进一步优选的实施方式中，产丁醇梭菌是保藏号为CGMCC8071的丙酮丁醇梭菌菌株。在本发明进一步优选的实施方式中，芽孢杆菌是保藏号为CGMCC8070的蜡状芽孢杆菌菌株。上述两个菌株在微氧条件下共生，并形成产生丁醇的共生菌体系。

在本发明的一些实施方式中，使用本发明的共生菌体系生产丁醇。

在本发明的一些实施方式中，将冻存的本发明的共生菌体系进行复苏，所述复苏使用本领域已知的任何合适的培养基进行。在本发明优选的实施方式中，复苏后的共生菌体系的培养物OD_650nm为3-5。

在本发明的一些实施方式中，将复苏后的共生菌体系的培养物以5-10％(v/v)的接种量接入种子培养基，进行种子培养，从而获得种子。在本发明优选的实施方式中种子培养基是含有65g/L过40目筛的玉米粉的玉米培养基或本领域已知的任何合适的培养基。在本发明优选的实施方式中，种子培养的温度为35-39℃。在本发明优选的实施方式中，种子培养时间为10-24小时。在本发明优选的实施方式中，种子培养为静置培养或摇床培养。在本发明优选的实施方式中，摇床培养中摇床的转速不高于100rpm。

在本发明的一些实施方式中，将获得的种子接入发酵培养基中继续培养从而进行发酵，生产丁醇。在本发明优选的实施方式中，在发酵培养基中添加中性红。在本发明更优选的实施方式中，在发酵开始后0-48小时添加中性红。在本发明进一步优选的实施方式中，培养基中中性红的终浓度为0.05-3g/L。在本发明优选的实施方式中，发酵培养基为玉米发酵培养基、P2半合成培养基或本领域已知的任何合适的培养基。在本发明优选的实施方式中，发酵时间为36-120小时。在本发明优选的实施方式中，发酵过程中的通气量为0-1vvm。在本发明更优选的实施方式中，发酵过程中的通气量为0.05-0.5vvm。在本发明进一步优选的实施方式中，发酵过程中的通气量为0.1vvm。在本发明优选的实施方式中，发酵在30-40℃的温度下进行。在本发明优选的实施方式中，发酵过程中的搅拌速度为0-100rpm。

在发酵生产丁醇的过程中，丙酮丁醇梭菌的选择性不高，副产物丙酮和乙醇的含量较高。因此，提高发酵生产的选择性，即提高产物中丁醇的比例对生产生物丁醇具有重要意义。相比于传统发酵方法，本发明提供的方法可以在微氧条件下生产丁醇，打破传统方法对氧气的严格限制，同时，丁醇在最终发酵产物中所占的比例也有了明显的提高。在本发明一个非限制性实施例中，最终发酵产物中丁醇:丙酮:乙醇＝8:1:1。在本发明另一个非限制性实施例中，丁醇得率达到0.27。

本发明中，术语“发酵”是指生物体对于有机物的某种分解过程。在此处尤其指以微生物分解多糖为单糖，再将单糖进一步分解为更小的分子的过程。

本发明中，术语“共生菌体系”是指两种微生物(例如，两种细菌)形成的体系，这两种微生物之间具有紧密互利关系，一方为另一方提供有利于生存的帮助。

本发明中，术语“丁醇得率”是指所得的丁醇的质量与消耗的葡萄糖的质量的比值。

本发明中丙酮丁醇梭菌菌株TSH1和蜡状芽孢杆菌菌株TSH2于2013年8月26日在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)进行保藏，其保藏号分别为CGMCC8071、CGMCC8070。

表1中列举了在上述本发明的具体实施方式中提及的以及可用于本发明实施例的培养基。

表1：培养基及其成分(单位为g/L，有*标记的组分单位为mL/L)

配制种子培养基和玉米发酵培养基时，将相应质量的玉米粉溶于水中，煮沸50min后，补水定容。表1中缓冲液、维生素液和微量元素液的组成如表2-4所示，溶剂皆为水。

表2：缓冲液的组成

表3：维生素液的组成

表4：微量元素液的组成

实施例

结合下列非限制性实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1：共生菌体系的分离和鉴定

(1)分离

首先从土壤中采集样品，用去离子水制成悬浮液。将悬浮液在85℃下热激处理10min。然后，在TYA培养基上划线分离富集的微生物，在微氧条件下37℃培养48h。挑取上述分离的黄色单菌落共44个，于P2半合成发酵培养基，经过反复微氧培养进行初筛，选择5个微氧条件下生长良好的菌落，以丁醇发酵试验进行复筛。其中一个菌落的培养物能够在微氧条件下稳定生产高浓度丁醇。

(2)16SrRNA基因的鉴定

鉴定筛选到的菌落的16SrRNA基因，进而确定其菌群构成。

以菌落接种RCM液体培养基，提取基因组DNA为模板，使用16SrRNA基因通用引物338F(SEQIDNO:1)和518R(SEQIDNO:2)进行PCR扩增。从DGGE电泳结果得到两条带，分别进行切胶回收，经过PCR、克隆测序，其序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。

将测序结果在美国国立生物技术信息中心(NCBI)进行比对，SEQIDNO:3比对结果如图1所示，其与蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)的16SrRNA基因序列高变区完全一致，将其代表的菌株命名为TSH2。SEQIDNO:4比对结果如图2所示，其与丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的16SrRNA基因序列高变区完全一致，将其代表的菌株命名为TSH1。分离菌株TSH1、TSH2并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其保藏号分别为CGMCC8071、CGMCC8070。还对TSH1、TSH2以及一系列芽孢杆菌和梭菌的进化关系进行了分析，结果如图3所示。

在RCM培养基和TYA培养基上培养TSH1、TSH2及其共生菌体系并观察其性状(结果如表5所示)。

表5：TSH1、TSH2及其共生菌体系在RCM培养基和TYA培养基上培养的性状对比

检测TSH1、TSH2及其共生菌体系在玉米发酵培养基和P2半合成发酵培养基上发酵产生丁醇情况(结果如表6所示)。

表6：TSH1、TSH2及其共生菌体系在玉米发酵培养基和P2半合成发酵培养基上发酵产生丁醇的情况对比

上述结果显示，丙酮丁醇梭菌TSH1在微氧条件下，无论在TYA培养基上或是RCM培养基上均不生长。而共生菌体系可在微氧条件下良好生长，其菌落形态与厌氧条件下菌落形态一致。厌氧条件下(即通氮气或在厌氧培养箱中培养)，丙酮丁醇梭菌TSH1无论在玉米发酵培养基或是P2半合成发酵培养基中均可产生大量丁醇(两种培养基中丁醇浓度分别为9.3g/L和8.8g/L)。但在微氧条件下，丙酮丁醇梭菌TSH1在P2半合成发酵培养基中无法生长，也不产丁醇。在玉米发酵培养基中，由于培养基是半固体状态，是非严格的厌氧环境，能产生少量丁醇(培养基中丁醇浓度为2.0g/L)。而共生菌体系无论是在玉米发酵培养基还是P2半合成发酵培养基中，无论在厌氧或微氧条件下，均可良好生长并产生大量丁醇(厌氧条件下，两种培养基中丁醇浓度分别为9.5g/L和9.3g/L；微氧条件下，两种培养基中丁醇浓度分别为10.2g/L和9.9g/L)。而共生菌体系中的蜡状芽孢杆菌TSH2本身是不产丁醇的，因此丁醇的产生来自于丙酮丁醇梭菌TSH1。这说明，当丙酮丁醇梭菌TSH1与蜡状芽孢杆菌TSH2共生时，可以在微氧条件下生长良好并产生大量丁醇。

实施例2：菌株TSH1和TSH2个体形态特征和生理生化特性的鉴定

(1)蜡状芽孢杆菌菌株TSH2个体形态特征和生理生化特征的鉴定结果如表7、8所示(上述鉴定以购自美国Biolog公司的凤凰全自动微生物鉴定仪(BDPHOENIXTMMSystem)进行)。

表7：TSH2个体形态特征

表8：TSH2生理生化特性

表8中各指标的缩写对照如表9所示。

表9：缩写对照表

(2)丙酮丁醇梭菌TSH1个体形态特征和生理生化特征的鉴定结果如表10、11所示。

表10：TSH1个体形态特征

表11：TSH1生理生化特性

注：+表示结果阳性；-表示阴性结果；+-表示结果可疑。

通过上述结果与已知微生物的形态特征和生理生化特性的对比，表明：TSH2属于蜡状芽孢杆菌，TSH1属于丙酮丁醇梭菌。

实施例3：微氧发酵生产丁醇(1)

A)菌种复苏：将甘油管保藏的共生菌体系在装有10mLRCM培养基的试管中37℃培养24h。

B)种子培养：种子培养采用100mL三角瓶，其中装有60mL种子培养基。将复苏的共生菌体系以5％(v/v)的接种量接入种子培养基。培养温度37℃，静置培养24h，得到种子液。

C)发酵：将种子液以5％(v/v)的接种量加入到100mL摇瓶中的60mL玉米发酵培养基中，在37℃培养，进行发酵，静置培养。

D)添加中性红：在发酵开始时以0.5g/L添加中性红。

E)发酵结果：发酵60h，经高效液相色谱测定，丁醇、丙酮、乙醇总含量15g/L，丁醇10.37g/L，丁醇:丙酮:乙醇＝7:2:1。

实施例4：微氧发酵生产丁醇(2)

C)发酵：将种子液按照7％(v/v)接种量加入到100mL摇瓶中的60mL初始葡萄糖浓度为55g/L的P2半合成发酵培养基中，在37℃培养，进行发酵，静置培养。

D)添加中性红：在发酵开始后36h，以1g/L添加中性红。

E)发酵结果：发酵60h，经高效液相色谱测定，丁醇、丙酮、乙醇总含量19.3g/L，丁醇14.6g/L，丁醇:丙酮:乙醇＝8:1:1，丁醇得率为0.26。

实施例5：微氧发酵生产丁醇(3)

A)菌种复苏：将甘油管保藏的TSH1在装有10mL种子培养基的试管中37℃培养24h，将甘油管保藏的TSH2在装有10mLRCM培养基的试管中37℃培养24h。

B)种子培养：种子培养采用100mL三角瓶，其中装有60mL种子培养基。将复苏的TSH1和TSH2培养物按照1:1的体积比加入种子培养基中：即3ml复苏的TSH1培养物(OD₆₀₀＝1.0～3.0)和3ml复苏的TSH2培养物(OD₆₀₀＝2.0～4.0)同时接入种子培养基。培养温度37℃，静置培养24h，得到种子液。

D)添加中性红：发酵24h添加1.5g/l中性红

E)发酵结果：发酵60h，经高效液相色谱测定，丁醇、丙酮、乙醇总含量15.31g/L，丁醇10.02g/L，丁醇:丙酮:乙醇＝7:2:1，丁醇得率为0.22。

实施例6：微氧发酵生产丁醇(4)

B)种子培养：种子培养采用500mL三角瓶，其中装有300mL种子培养基。将复苏的共生菌体系以5％(v/v)的接种量接入种子培养基。培养温度37℃，静置培养24h，得到种子液。

C)发酵：将种子液按照7％(v/v)接种量加入到5L发酵罐中的3L初始葡萄糖浓度为55g/L的P2半合成发酵培养基中，在37℃培养，进行发酵，在发酵过程中连续通入0.05vvm空气。

D)添加中性红：在发酵开始时，以1g/L添加中性红。

E)发酵结果：发酵60h，经高效液相色谱测定，丁醇、丙酮、乙醇总含量13.2g/L，丁醇10.2g/L，丁醇:丙酮:乙醇＝8:1:1，丁醇得率0.24。

实施例7：微氧发酵生产丁醇(5)

C)发酵：将种子液按照7％(v/v)接种量加入到5L发酵罐中的3L玉米发酵培养基中，在37℃培养，进行发酵，在发酵过程中连续通入0.1vvm空气。

D)添加中性红：在发酵开始时，以1g/L添加中性红。

E)发酵结果：发酵60h，经高效液相色谱测定，丁醇、丙酮、乙醇总含量17.6g/L，丁醇13.4g/L，丁醇:丙酮:乙醇＝7:2:1。

实施例8：微氧发酵生产丁醇(6)

C)发酵：将种子液按照7％(v/v)接种量加入到5L发酵罐中的3L初始葡萄糖浓度为55g/L的P2半合成发酵培养基中，在37℃培养，进行发酵，在发酵过程中连续通入0.5vvm空气，并开启搅拌，转速为50rpm。

D)添加中性红：在发酵开始时，以2g/L添加中性红。

E)发酵结果：丁醇、丙酮、乙醇总含量12.9g/L，丁醇10.3g/L，丁醇:丙酮:乙醇＝8:1:1。丁醇得率0.24。

实施例9：微氧发酵生产丁醇(7)

C)发酵：将种子液按照7％(v/v)接种量加入到5L发酵罐中的3L初始葡萄糖浓度为55g/L的P2半合成发酵培养基中，在37℃培养，进行发酵，在发酵过程中连续通入1.0vvm空气。

D)添加中性红：在发酵48h，以3g/L添加中性红。

E)发酵结果：发酵60h，经高效液相色谱测定，丁醇、丙酮、乙醇总含量10.5g/L，丁醇8.3g/L，丁醇:丙酮:乙醇＝8:1:1。丁醇得率0.24。

实施例10：微氧发酵生产丁醇(8)

C)发酵：将种子液按照7％(v/v)接种量加入到5L发酵罐中的3L初始葡萄糖浓度为55g/L的P2半合成发酵培养基中，在37℃培养，进行发酵，在发酵过程中连续通入0.05vvm空气，并开启搅拌，转速为100rpm。

D)添加中性红：在发酵开始时，以3g/L添加中性红。

E)发酵结果：发酵60h，经高效液相色谱测定，丁醇、丙酮、乙醇总含量14.5g/L，丁醇12.1g/L，丁醇:丙酮:乙醇＝8:1:1。丁醇得率0.27。

Claims

1.一种共生菌体系，其包含产丁醇梭菌和芽孢杆菌，能够在微氧条件下发酵生产丁醇。

2.权利要求1中的共生菌体系，其中所述产丁醇梭菌是丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。

3.权利要求1或2的共生菌体系，其中所述芽孢杆菌是蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)。

4.权利要求1的共生菌体系，其中所述产丁醇梭菌是保藏号为CGMCC8071的丙酮丁醇梭菌菌株。

5.权利要求1的共生菌体系，其中所述芽孢杆菌是保藏号为CGMCC8070的蜡状芽孢杆菌菌株。

6.权利要求1-5任一项的共生菌体系用于在微氧条件下生产丁醇的用途。

7.一种生产丁醇的方法，其包括在微氧条件下在发酵培养基中培养权利要求1-5任一项的共生菌体系从而进行发酵的步骤。

8.权利要求7的方法，其进一步包括在发酵培养基中添加中性红。

9.权利要求8的方法，其中在发酵开始后0-48小时添加中性红。

10.权利要求8或9的方法，其中发酵培养基中中性红的终浓度为0.05-3g/L。

11.权利要求7-10任一项的方法，其中所述发酵培养基为玉米发酵培养基或P2半合成培养基。

12.权利要求7-11任一项的方法，其中发酵时间为36-120小时。

13.权利要求7-12任一项的方法，其中发酵过程中的通气量为0-1vvm。

14.权利要求13的方法，其中发酵过程中的通气量为0.05-0.5vvm。

15.权利要求14的方法，其中发酵过程中的通气量为0.1vvm。

16.权利要求7-15任一项的方法，其中发酵在30-40℃的温度下进行。

17.权利要求7-16任一项的方法，其中发酵过程中的搅拌速度为0-100rpm。