CN114507609B - 一种提高磷脂酶c蛋白产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，该方法为，在诱导表达磷脂酶C的阶段，根据发酵过程中尾气中二氧化碳的含量调整甲醇的流加量和流加速度，以提高磷脂酶C蛋白产量，发酵过程中尾气中二氧化碳的含量控制在1.0％‑4.5％V/V之间。采用本发明的方法，在5KL发酵实验生产线上，能够使磷脂酶C的蛋白产量高出原有恒温恒控制工艺，最多可高出40％，从而降低单位生产成本，节能降耗，有利于实现磷脂酶C的产业化。

Description

一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法
技术领域
本发明涉及一种能提高毕赤酵母表达外源蛋白的方法，特别涉及一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法。
背景技术
在毕赤酵母在甲醇补料培养阶段，常需要通过流加甲醇来诱导AOX1基因的表达，流加量过少的甲醇，不足以保持酵母的诱导强度，造成目标蛋白分泌过少，而过量的甲醇常常会引起对细胞的毒害作用，因此，在保持甲醇酵母诱导和阻止甲醇细胞毒素水平的积累时，需要精准控制甲醇的浓度。
常用的添加方法是，通过尾气分析仪在线监控发酵过程中的RQ参数(即呼吸熵，指同一时间二氧化碳产生量和氧气消耗量的比值)来控制甲醇补料速率的方法，主要方案为：发酵尾气通过尾气分析仪的在线监控，检测尾气中的CO2、O2含量，结合发酵罐内的溶氧电极检测发酵液中的溶解氧、发酵系统通气流量、发酵液重量等原始参数，自动实时计算出当前发酵系统的RQ值，从而确定发酵内部的代谢流方向，进而根据结果调节甲醇流加速率。
在工业产业化生产中，单台尾气分析仪仅能实时监测一台发酵设备的参数，在同时监测4台发酵设备时，需进行轮换监测，从而造成监测空白周期过长，容易造成甲醇流加速率的失衡，造成发酵代谢的异常。而如果每台发酵设备均设置一台尾气分析仪的情况下，会大大增加设备投资。
另外，也有通过甲醇检测控制仪，在发酵期间可以监测和控制发酵液中的甲醇浓度，主要用于科研人员在培养酵母菌时，对外源蛋白表达进行优化。甲醇检测控制仪是一种单机独立控制系统，甲醇电极容易受到环境条件和其它挥发性物质的影响，测量值与实际值会发生偏差，导致发酵液中甲醇偏高或偏低，从而影响菌体的代谢。同时，由于在正常的甲醇流加阶段，由于高密度培养过程中菌体耗氧量极大，为了维持发酵液中的DO值，一般通过控制发酵液中的甲醇含量来控制菌体的活动，从而保持DO值不低于20％。因此，高密度发酵过程中的甲醇浓度常常为临界0值，超出了甲醇电极的敏感区域，造成甲醇电极无法正确检测出发酵液中的甲醇含量，从而容易造成甲醇添加量过大，造成细胞毒害，代谢活动受到较大的损坏。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种能稳定提高毕赤酵母生产磷脂酶C产量的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，其特点是，该方法为，在诱导表达磷脂酶C的阶段，根据发酵过程中尾气中二氧化碳的含量调整甲醇的流加量和流加速度，以提高磷脂酶C蛋白产量，发酵过程中尾气中二氧化碳的含量控制在1.0％-4.5％V/V之间。
本发明所要解决的技术问题还可以根据以下技术方案实现，所述磷脂酶C为采用毕赤酵母诱导表达的磷脂酶C。
本发明所要解决的技术问题还可以根据以下技术方案实现，甲醇的流加时间为发酵培养21h后把发酵液温度调整至24-30℃时。
本发明所要解决的技术问题还可以根据以下技术方案实现，在诱导表达磷脂酶C的阶段，还根据发酵过程中罐重参数来控制甲醇的流加。
本发明所要解决的技术问题还可以根据以下技术方案实现，所述甲醇的流加量为发酵液发酵时每吨发酵液所需的流量为2kg/h-6.5kg/h，甲醇流加速度为每吨发酵液每小时1.0-1.2倍尾气中CO2含量。
本发明所要解决的技术问题还可以根据以下技术方案实现，该方法包括甘油补料培养和甲醇补料培养两个步骤，甲醇补料培养后进入诱导表达磷脂酶C阶段，诱导过程为：
当发酵液温度调整至24-30℃时，开始流加甲醇，流加至21-25h后，依据尾气中CO2含量的实时监测数据，按照每吨发酵液1.1-1.2倍CO2含量的甲醇流速进行流加，最高不超过6.5kg/h，每2h实时调整一次流加量，并进行DO-spike检测，检测甲醇流加是否添加过量；发酵150小时后，制得菌体湿重400g/kg、产量为13.1g/L的磷脂酶C蛋白。
本发明所要解决的技术问题还可以根据以下技术方案实现，所述甘油补料培养的具体过程为，当发酵罐DO值迅速由15％-30％之间上升至60％-70％时，开始按55kg/h-65kg/h的速率补料流加60％-80％浓度的甘油，使DO％＞25，至菌体湿重达到200g/kg以上，温度不变，调整pH逐步上升至5.8，稳定培养1h后，再逐步切换至甲醇补料培养。
本发明所要解决的技术问题还可以根据以下技术方案实现，该方法的具体步骤为，
(1)初期发酵阶段：配置发酵培养基放入5KL发酵罐内，经121℃灭菌30分钟，冷却后用氨水调pH至5.0，接入二级种子液，于初始转速120r/min,通气量3m3/min，初始发酵温度30℃，罐压0.05MPa，进行发酵培养150h，初期发酵通过调整搅拌转速，使DO％在15％-30％之间；
(2)甘油补料培养阶段：当发酵罐DO值迅速由15％-30％之间上升至60％-70％时，开始按55kg/h-65kg/h的速率补料流加60％-80％浓度的甘油，使DO％＞25，至菌体湿重达到200g/kg以上，温度由初始的30℃逐渐降低至24℃，调整pH逐步上升至5.8后稳定培养，在此阶段CO2含量不进行控制；
(3)饥饿培养阶段：甘油补料培养阶段结束后，进行1h的饥饿培养，停止流加；
(4)甲醇补料培养阶段：饥饿培养结束后开始流加甲醇，甲醇的流加量为每吨发酵液1.5kg/h-6.5kg/h，进入诱导表达磷脂酶C阶段，依据尾气中CO2含量的实时监测数据，按照每吨发酵液1.0-1.2倍CO2含量的甲醇流速进行流加，最高不超过6.5kg/h，每2h实时调整一次流加量，并进行DO-spike，检测甲醇流加是否添加过量，60h后温度调整为28℃，发酵总周期150小时，发酵结束后，制得菌体湿重400g/kg，产量为13.1g/L的磷脂酶C蛋白。
与现有技术相比，本发明在24℃-30℃的温度下，通过发酵尾气中CO2含量、罐重参数控制甲醇流加速度来诱导表达蛋白磷脂酶C。采用本发明的方法，在5KL发酵实验生产线上，能够使磷脂酶C的蛋白产量高出原有恒温恒控制工艺，最多可高出40％，从而降低单位生产成本，节能降耗，有利于实现磷脂酶C的产业化。
附图说明
图1为本发明实施例1-6和对比例1-3所获的产品的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳检测图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明所述的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在下述的实例中，使用的培养基配方如下：
YPD平板(g/L)：酵母粉10，胰蛋白胨20，葡萄糖20，琼脂粉20。
YPG-甘油液体培养基(g/L)：酵母粉10，胰蛋白胨20，甘油20
发酵培养基(g/L)：
甘油40，硫酸钙0.93，七水硫酸镁14.9，磷酸二氢钾33.3，硫酸铵9，微量元素4ml；其中
微量元素配方为(g/L)：
五水硫酸铜6，碘化钠0.08，硫酸锰3，钼酸钠0.2，氯化钴0.5，氯化锌20，七水硫酸亚铁65，硼酸0.02ml，浓硫酸5ml
在本发明的下述实例中，采用的检测方法如下：
总蛋白含量测定方法：考马斯亮蓝法
一级摇瓶种子液的制备：
从保藏在-70℃冰箱的甘油管菌悬液中在无菌环境下用接种环接种至灭菌后的YPD平板上划线培养，在30℃的培养箱中培养4天，用接种环接3-4环菌落至含有1LYPG-甘油液体培养基里，在30℃，200rpm摇床里培养18h，检测OD600在16-22之间，得到一级摇瓶种子。
二级种子液制备：
将1L左右的一级摇瓶种子液接入已消毒的含有100L YPG培养基的200L种子罐中进行培养，温度30℃，搅拌转速200rpm，罐压0.05MPa，培养15h，检测OD600在16-22之间，得到二级种子液，移种至5KL发酵罐培养。
实施例1，一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，该方法的具体步骤为，
(1)发酵培养：
配置2000kg发酵培养基放入5KL发酵罐内，其中含有4.35kg/T的微量元素培养基，经121℃灭菌30分钟，冷却后用氨水调pH至5.0，接入二级种子液，于初始转速120r/min,通气量3m3/min，初始发酵温度30℃，罐压0.05MPa，进行发酵培养150h。初期发酵通过调整搅拌转速，使DO％在15％-30％之间。
(2)18-20h为甘油补料培养阶段：当发酵罐DO值迅速由15％-30％之间上升至70％左右时，开始按60kg/h的速率补料流加60％-80％浓度的甘油，其中甘油中含有12kg/T的微量元素培养基，使DO％＞25，至菌体湿重达到200g/kg以上，温度由初始的30℃逐渐降低至24℃，调整pH逐步上升至5.8后稳定培养，在此阶段CO2含量不进行控制。
(3)20-21h为饥饿期：甘油补料培养阶段结束后，进行1h的饥饿培养，停止流加。
(4)21-150h为诱导表达阶段：饥饿培养结束，流加甲醇，进入诱导表达磷脂酶C阶段。流加甲醇的流量为每吨发酵液1.5kg/h–6.5kg/h。60h后将发酵罐的温度调整为28℃。
甲醇的控制策略为：甲醇中含有12kg/T的微量元素培养基，在开始流加甲醇的21h时，依据尾气中CO2含量的实时监测数据，按照每吨发酵液1.0-1.2倍CO2含量的甲醇流速进行流加，最高不超过6.5kg/h，每2h实时调整一次流加量，并进行DO-spike，检测甲醇流加是否添加过量，防止毒害细胞。
发酵总周期150小时，发酵结束后菌体湿重400g/kg，磷脂酶C蛋白产量13.1g/L。其中，所述的磷脂酶C是通过毕赤酵母诱导后表达至发酵液中。
实施例2，实施例1所述的一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，该方法为，将实施例1中的整个过程的温度控制在30℃，其他步骤与实施例1相同；发酵结束后菌体湿重410g/kg，磷脂酶C蛋白产量11.3g/L。
实施例3，实施例1所述的一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，该方法为，将0-18h的温度控制在30℃，18-150h的温度控制在24℃，其他步骤与实施例1相同，发酵总周期150小时，发酵结束后菌体湿重390g/kg，磷脂酶C蛋白产量9.8g/L。
实施例4，实施例1所述的一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，该方法为，将发酵罐的PH值控制在5.0，其他步骤与实施例1相同，发酵总周期150小时，发酵结束后菌体湿重390g/kg，磷脂酶C蛋白产量10.5g/L。
实施例5，实施例1所述的一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，该方法中的甲醇流速全过程高控制培养，具体过程为：甲醇中含有12kg/T的微量元素培养基，在开始流加甲醇的21h至60h，甲醇流量恒定为每吨发酵液2.5kg/h,60h至150h恒定为每吨发酵液5kg/h，每2h根据罐重实时调整一次流加量，并进行DO-spike，检测甲醇流加是否添加过量，防止毒害细胞；
其他步骤与实施例1相同，发酵总周期150小时，发酵结束后菌体湿重380g/kg，磷脂酶C蛋白产量10.1g/L。
实施例6，实施例1所述的一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，该方法中甲醇流速前期高控制、后期中控制培养，具体过程为：甲醇中含有12kg/T的微量元素培养基，在开始流加甲醇的21h至60h，甲醇流量恒定为每吨发酵液3kg/h,60h至150h恒定为每吨发酵液4kg/h，每2h根据罐重实时调整一次流加量，并进行DO-spike，检测甲醇流加是否添加过量，防止毒害细胞；
其他步骤与实施例1相同，发酵总周期150小时，发酵结束后菌体湿重370g/kg，磷脂酶C蛋白产量8.5g/L。
对比例1，一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，该方法中甲醇的控制策略为：依据甲醇电极检测发酵液中甲醇含量对甲醇进行控制补料，具体过程为，
甲醇中含有12kg/T的微量元素培养基，在开始流加甲醇的21h时，依据甲醇电极检测发酵液中的甲醇含量，设定流加甲醇的速度，控制发酵液中甲醇含量设定为2g/L，甲醇流加速度根据发酵液中的检测数值适时调整，并每12小时进行DO-spike，检测甲醇流加是否添加过量，防止过量对细胞造成毒害；
其他的与实施例1相同，发酵总周期150小时，发酵结束后菌体湿重360g/kg，磷脂酶C蛋白产量9.8g/L。
对比例2，一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，该方法中甲醇的添加量为：在开始流加甲醇的21h时，依据尾气中CO2含量的实时监测数据，按照每吨发酵液0.8倍CO2含量的甲醇流速进行流加，其他的与实施例1相同。
对比例3，一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，该方法中甲醇的添加量为：在开始流加甲醇的21h时，依据尾气中CO2含量的实时监测数据，按照每吨发酵液1.4倍CO2含量的甲醇流速进行流加，其他的与实施例1相同。
将上述数据汇总，得到以下实验数据：
各实例中甲醇流速数据：
单位：每吨发酵液每小时添加甲醇公斤数
Figure BDA0002851955300000091
Figure BDA0002851955300000101
各实例的发酵过程数据：
实施例1：
发酵周期(h) 0-18 18-20 21 60 21-150
pH 5 5 5.8 5.8 5.8
T(℃) 30 24 24 28 28
<![CDATA[CO<sub>2</sub>(％)]]> 2.1 2.1 1.8 3.6 5
重量(kg) 2100 2300 2400 3100 3700
湿重(g/kg) 200 230 230 300 400
蛋白(μg/ml) 0 0 0 2.3 13.1
实施例2：(恒温度30℃培养)
发酵周期(h) 0-18 18-20 21 60 21-150
pH 5 5 5.8 5.8 5.8
T(℃) 30 30 30 30 30
<![CDATA[CO<sub>2</sub>(％)]]> 2.1 2.1 1.9 3.7 5.5
重量(kg) 2100 2300 2400 3100 3700
湿重(g/kg) 210 235 235 320 410
蛋白(μg/ml) 0 0 0 2.1 11.3
实施例3：(0-18h温度30℃，18-150h温度24℃)
发酵周期(h) 0-18 18-20 21 60 21-150
pH 5 5 5.8 5.8 5.8
T(℃) 30 24 24 24 24
<![CDATA[CO<sub>2</sub>(％)]]> 2.1 2.1 1.8 3.4 4.7
重量(kg) 2100 2300 2400 3100 3700
湿重(g/kg) 200 230 230 300 390
蛋白(μg/ml) 0 0 0 1.9 9.8
实施例4：(恒pH5.0培养)
Figure BDA0002851955300000102
Figure BDA0002851955300000111
实施例5：(甲醇流速全过程高控制培养)
发酵周期(h) 0-18 18-20 21 60 21-150
pH 5 5 5.8 5.8 5.8
T(℃) 30 24 24 28 28
<![CDATA[CO<sub>2</sub>(％)]]> 2.1 2.1 1.5 3.2 4.5
重量(kg) 2100 2200 2200 3000 3700
湿重(g/kg) 200 220 220 280 380
蛋白(μg/ml) 0 0 0 2 10.1
实施例6：(甲醇流速前期高控制、后期中控制培养)
发酵周期(h) 0-18 18-20 21 60 21-150
pH 5 5 5.8 5.8 5.8
T(℃) 30 24 24 28 28
<![CDATA[CO<sub>2</sub>(％)]]> 2.1 2.1 1.1 3.3 4.5
重量(kg) 2100 2300 2300 3200 3700
湿重(g/kg) 200 215 215 260 370
蛋白(μg/ml) 0 0 0 1.3 8.5
对比例1：(甲醇电极检测控制甲醇流量)
发酵周期(h) 0-18 18-20 21 60 21-150
pH 5 5 5.8 5.8 5.8
T(℃) 30 24 24 28 28
<![CDATA[CO<sub>2</sub>(％)]]> 2.1 2.1 1.8 3.3 4.4
重量(kg) 2100 2200 2400 3090 3800
湿重(g/kg) 200 230 280 360
蛋白(μg/ml) 0 0 0 2 9.8
对比例2：(甲醇流量系数为0.8)
Figure BDA0002851955300000112
Figure BDA0002851955300000121
对比例3：(甲醇流量系数为1.4)
发酵周期(h) 0-18 18-20 21 60 21-150
pH 5 5 5.8 5.8 5.8
T(℃) 30 24 24 28 28
<![CDATA[CO<sub>2</sub>(％)]]> 2.1 2.1 1.7 3.4 5
重量(kg) 2100 2200 2400 3100 3700
湿重(g/kg) 200 230 280 380
蛋白(μg/ml) 0 0 1.9 9.1
综上所述，采用本发明的方法，在5KL发酵实验生产线上，能够使磷脂酶C的蛋白产量高出原有恒温控制工艺，最多可高出40％，从而降低单位生产成本，节能降耗，有利于实现磷脂酶C的产业化。
另外，由于SDS-PAGE电泳是对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法，该方法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的，SDS蛋白复合物的长度与其分子量成正比，蛋白亚基的迁移取决于亚基分子量。因此，将实施例1-6和对比例1-3所获的产品进行蛋白SDS-PAGE凝胶电泳检测。
参照图1，从图谱上可以看出，左起第一列为对照样，表示不同分子量的指示蛋白，从右至左分别为实施例1-6和对比例1-3所获的产品，最上面那个颜色重的表示的是我们的产品，下面有很多细小的不同深度颜色的色带，表示的是杂质，下面的细小色带越少、颜色越浅，表明杂质越少，样品越纯。凝胶电泳的结果表明，采用实施例1生产的产品纯度不低于其它对比例。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，其特征在于：该方法为，在诱导表达磷脂酶C的阶段，根据发酵过程中尾气中二氧化碳的含量调整甲醇的流加量和流加速度，以提高磷脂酶C蛋白产量，发酵过程中尾气中二氧化碳的含量控制在1.0%-4.5%V/V之间；所述甲醇的流加量为每吨发酵液1.5kg/h - 6.5 kg/h，甲醇流加速度为每吨发酵液每小时1.0-1.2倍尾气中CO2含量；所述磷脂酶C为采用毕赤酵母诱导表达的磷脂酶C；
该方法的具体步骤为，
（1）初期发酵阶段：配置发酵培养基放入5KL发酵罐内，经121℃灭菌30分钟，冷却后用氨水调pH至5.0，接入二级种子液，于初始转速120r/min,通气量3m³/min，初始发酵温度30℃，罐压0.05MPa，进行发酵培养150h，初期发酵通过调整搅拌转速，使DO%在15%-30%之间；
（2）甘油补料培养阶段：当发酵罐DO值迅速由15%-30%之间上升至60%-70%时，开始按55kg/h-65kg/h的速率补料流加60%-80%浓度的甘油，使DO%＞25%，至菌体湿重达到200g/kg以上，温度由初始的30℃逐渐降低至24℃，调整pH逐步上升至5.8后稳定培养，在此阶段CO2含量不进行控制；
（3）饥饿培养阶段：甘油补料培养阶段结束后，进行1h的饥饿培养，停止流加；
（4）甲醇补料培养阶段：饥饿培养结束后开始流加甲醇，甲醇的流加量为每吨发酵液1.5kg/h - 6.5 kg/h，依据尾气中CO2含量的实时监测数据，按照每吨发酵液1.0-1.2倍CO2含量的甲醇流速进行流加，最高不超过6.5kg/h，每2h实时调整一次流加量，并进行DO-spike，检测甲醇流加是否添加过量，60h后温度调整为28℃，发酵总周期150小时，发酵结束后，制得菌体湿重400g/kg，产量为13.1g/L的磷脂酶C蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，其特征在于，甲醇的流加时间为发酵培养21h后把发酵液温度调整至24-30℃时。
3.根据权利要求1所述的一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，其特征在于，在诱导表达磷脂酶C的阶段，还根据发酵过程中罐重参数来控制甲醇的流加。
4.根据权利要求1所述的一种提高磷脂酶C蛋白产量的方法，其特征在于，步骤（4）中，甲醇流速控制在每吨每小时发酵液1.1倍的CO2含量。
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