CN104450756A - 一种高效表达磷脂酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效表达磷脂酶的方法，属于酶工程技术领域。本发明将SEQ ID NO.1所示的编码磷脂酶A1基因以毕赤酵母为宿主进行重组表达，在3L罐上诱导120h后酶活达力可到6000U/ml，可用于磷脂酶的工业化生产。所述磷脂酶A1可用于粮油脱胶，降低磷含量。

Description

一种高效表达磷脂酶的方法

技术领域

本发明涉及一种高效表达磷脂酶的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

磷脂酶A1属于水解酶，可专一水解天然磷脂Sn-1位酰基，得到Sn-2酰基溶血磷脂和游离脂肪酸。磷脂酶A1已被应用于食品、医药、饲料和皮革等领域，尤其是在粮油脱胶方面的应用前景广阔。同传统的脱胶方法相比，酶法脱胶可大大节约化学物质的消耗量，几乎不产生废水，是一种经济节约、高效稳定、绿色环保的具有国际领先水平的油脂脱胶方法。

最早将磷脂酶A1应用于油脂脱胶工业的是德国Lurgi公司，此酶来源于猪的胰脏，称为“EnzyMax process”，但是这种酶具有诸多缺点，如必须以钙离子为激活剂，应用时需向反应体系中添加一定量的钙离子；且该酶来源有限，价格比较昂贵。随着研究的继续深入，人们逐渐将微生物来源的磷脂酶应用于油脂脱胶。微生物来源的磷脂酶相继在德国、美国等较大油脂公司得到了生产与应用，均获得了较好的效果。目前已实现工业化生产的磷脂酶A1产品仅有丹麦诺维信公司的“Lecitase Novo”和“LecitaseUltra”。磷脂酶A1应用于脱胶方面会有更大的发展前景。

国内关于磷脂酶A1的研究主要集中于直接筛选野生菌，通过发酵优化提高表达水平，或将原核来源的磷脂酶A1基因在大肠杆菌表达系统进行表达。司武阳等从富油土壤中初步筛选出生产磷脂酶Al的菌株，并从碳源、氮源、复合碳源、金属离子等几个方面对菌株产酶的发酵条件进行了优化，最高酶活达到18.68U/mL。付建红等从新疆天山一号冰川冻土中筛选到一株产低温碱性磷脂酶A1的菌株，经摇瓶优化，磷脂酶A1活力最高达17.5U/mL。王金梅等采用以磷脂为唯一碳源的限制性培养基，从富油土样中筛选得到一株磷脂酶活性较高的菌株，利用该菌株生产的磷脂酶进行豆油脱胶研究，使得脱胶油中磷脂的去除率高达75.6％。国外用于食品级磷脂酶生产的安全菌株主要包括米曲霉和黑曲霉等，1988年，MichaelGivskova等从液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)基因组中克隆获得磷脂酶A1基因，并在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行异源表达，其酶活不到1U/mL。1997年，KAGrant等将大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)来源的磷脂酶A基因在大肠杆菌宿主表达，胞内酶活达到70U/mg。2000年，M Hartmann等使用随机化学突变、单细胞融合以及基因杂交技术，筛选出4株嗜热四膜虫属(Tetrahymena thermophila)突变株，其磷脂酶A1酶活最高达到35.2±2.6U/mL。最后延晋雷等克隆了液化沙雷氏菌磷脂酶A1的编码基因，并在大肠杆菌中表达，重组菌胞外磷脂酶A1酶活达到128.7U/mL。目前国内外上罐的最高酶活为3500U/mL。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种编码磷脂酶A1的基因，其碱基序列如SEQID NO.1所示。

重组表达所述编码磷脂酶A1的基因，能够得到高活力的磷脂酶。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种高效表达所述磷脂酶A1的方法，是将SEQID NO.1所示的基因序列与毕赤酵母表达载体连接，然后将重组表达载体转化入毕赤酵母中，发酵培养重组菌获得磷脂酶A1。

在本发明的一种实施方式中，将SEQ ID NO.1所示的基因序列与毕赤酵母表达载体pPIC9K或pPICZα连接，获得重组质粒，然后将重组表达质粒转化入毕赤酵母中，发酵培养重组菌获得磷脂酶A1。

在本发明的一种实施方式中，将重组菌活化后，接入装液量30-40％发酵罐，以氨水控制pH值为5-6，培养温度28-30℃，溶氧维持在30％左右，当甘油耗尽、溶氧迅速上升，开始流加甘油补料液，当菌体浓度达到OD₆₀₀＝95-105时，停止补料；保持基质匮乏状态约1h后，开始诱导阶段，设置诱导温度28-30℃，添加0.3-0.5％甲醇，待重组菌适应甲醇，溶氧开始下降后，维持甲醇浓度0.3-0.5％，诱导磷脂酶A1表达。

在本发明的一种实施方式中，将重组菌活化后，接入装液量0.9L的3L发酵罐，以25％氨水控制pH5，培养温度30℃，通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶氧维持在30％左右，当溶氧迅速上升，表明培养基中的甘油已经耗尽，开始流加50％的甘油补料液，当菌体浓度达到OD₆₀₀＝100时，停止补料，保持基质匮乏状态约1h后，开始诱导阶段，设置诱导温度28℃，添加0.5％甲醇，待重组菌适应甲醇，溶氧开始下降后，通过甲醇电极维持甲醇浓度0.5％，诱导磷脂酶A1表达。

在本发明的一种实施方式中，发酵培养基含有硫酸钙0.9-1.0g/L，硫酸镁7-8g/L，氢氧化钾4-5g/L，硫酸钾18-20g/L，甘油30-35g/L，磷酸25-28ml/L，CuSO₄·5H₂O 6-7g/L，KI0.08-1.0g/L，MnSO₄·H₂O 3g/L，Na₂MoO₃·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃0.02g/L，CoCl₂0.5g/L，ZnCl₂20g/L，FeSO₄·7H₂O 65-68g/L，生物素0.2g/L，H₂SO₄5-6g/L。

在本发明的一种实施方式中，发酵培养基的组成为：硫酸钙0.939g/L，硫酸镁7.27g/L，氢氧化钾4.13g/L，硫酸钾18.2g/L，甘油30g/L，磷酸26.7ml/L，CuSO₄·5H₂O 6g/L，KI 0.08g/L，MnSO₄·H₂O 3g/L，Na₂MoO₃·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃0.02g/L，CoCl₂0.5g/L，ZnCl₂20g/L，FeSO₄·7H₂O 65g/L，生物素0.2g/L，H₂SO₄5.0g/L。

本发明要解决的另一个技术问题是提供磷脂酶A1应用于粮油脱胶，经过酶处理后，磷含量能够降低到10ppm以下，符合国家食用油食品安全的标准。该酶法脱胶具有高效、绿色环保等优点。

附图说明

图1为重组菌P.pastoris 3L罐中发酵上清液的SDS-PAGE分析，其中12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h为重组菌P.pastoris在3L罐里不同诱导时间的发酵上清液，Maker为蛋白分子量标准。

具体实施方式

本发明未注明的实验方法如酵母感受态的制备及其电转化，发酵培养基配方见Invitrogen公司的毕氏酵母操作手册。

种子培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L

发酵培养基：硫酸钙0.939g/L，硫酸镁7.27g/L，氢氧化钾4.13g/L，硫酸钾18.2g/L，甘油30g/L，磷酸26.7ml/L，金属离子PTM溶液(g/L)：CuSO₄·5H₂O 6，KI 0.08，MnSO₄·H₂O3，Na₂MoO₃·2H₂O 0.2，H₃BO₃0.02，CoCl₂0.5，ZnCl₂20，FeSO₄·7H₂O 65，生物素0.2，H₂SO₄5.0。

实施例1:磷脂酶A1在毕赤酵母中的克隆表达和发酵过程。

将PCR扩增得到的编码磷脂酶A1的DNA片段纯化后和质粒pPIC9K用EcoRI/NotI酶切，然后连接得到pPIC9K-PLA1，酶切验证质粒片段大小正确后进行基因测序，重组质粒SacI酶切线性化后转化进毕赤酵母P.pastoris细胞中挑取在MD平板上长出的转化子，点种于YPD/G418平板筛选多拷贝转化子，G418浓度筛选梯度依次为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL重组子命名为P.pastorisKM71/pPIC9K-PLA1。

实施例2:重组P.pastoris KM71/pPIC9K-PLA1菌株3L罐发酵培养。

吸取200μl的甘油管菌液接种于装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，30℃，200r/min培养24h，将上述培养液接入装液量为0.9L的3L发酵罐，以25％氨水控制pH5，培养温度30℃，通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶氧维持在30％左右，当溶氧迅速上升，表明培养基中的甘油已经耗尽，开始流加体积比为50％甘油补料液，当菌体浓度达到OD₆₀₀＝100时，停止补料，保持基质匮乏状态约1h后，开始诱导阶段，设置诱导温度28℃，添加装液量0.5％体积甲醇，待重组P.pastorisKM71适应甲醇，溶氧开始下降后，通过甲醇电极(FC2002,华东理工大学)维持甲醇浓度0.5％，诱导磷脂酶A1表达，诱导120h后，蛋白含量为6.5mg/mL，酶活最高达到6000U/mL。图1为重组菌P.pastoris KM713L罐里发酵上清液的SDS-PAGE分析。

酶活力测定方法：2个作为空白瓶，2个作为样品瓶，各加底物溶液10mL于100mL的具塞三角瓶中，再于空白瓶中加入95％乙醇10mL，于55度的水浴中预热5min，然后在各瓶中加入酶液预定稀释倍数的稀释液200μL(用缓冲液稀释一般稀释倍数为100倍或者200倍)，立即混匀计时，反应5min，于样品瓶中立即补加95％乙醇10mL终止反应，然后每个三角瓶各滴加酚酞试剂，一般滴100μL左右，然后于自动滴定仪下用0.02MNaOH标准溶液滴定，观察颜色，确定空白颜色变色临界点为滴定的终点，将样品瓶与空白瓶的颜色变色后一致，计算标准碱液平均消耗量。磷脂酶酶活力定义为：在特定条件下1min水解磷脂产生1微摩尔(μmol)游离脂肪酸所需的酶量即为一个磷脂酶活力单位(U)。其磷脂酶活力表示为每ml酶液所测得的磷脂酶活力单位，即U/mL。

实施例3:重组磷脂酶A1应用于大豆油原油酶促脱胶，按照GB/T 5537-2008测量磷的含量。

取大豆油100g于250mL锥形瓶中，水浴加热至80℃，然后加入45％柠檬酸120μL，接着1000rpm匀质1min，80℃水浴，500rpm搅拌20min，冷却到55℃，待冷却后加4％氢氧化钠溶液调至pH5.0，加入2mL超纯水，然后加入100μL酶液，进行反应，55℃，500rpm，搅拌不同的时间进行取样，然后将样品在90℃保温15min，接着离心取上清液油料，油料中的磷脂经灼烧成为五氧化二磷，被热盐酸变成磷酸，遇到钼酸钠生成磷钼酸钠，用硫酸联氨还原成钼蓝，用分光光度计在波长650nm，测定钼蓝的吸光度从而测磷含量。

初始原油的磷含量为225ppm，对不同的温度时间进行实验，得到的结果如下：加酶量为2.5U/g，取不同时间的油样，测定，结果发现：在温度为55℃，5h后磷含量降低到10ppm以下，在温度为60℃，分别取不同时间的样，4h后磷含量降低到10ppm以下，符合国家食用油食品安全的标准。磷脂酶A1在粮油脱胶方面的应用有很大的潜力，可以应用于工业上。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种编码磷脂酶A1的基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种高效表达所述磷脂酶A1的方法，其特征在于，是将SEQ ID NO.1所示的基因序列与表达载体连接，然后将重组表达载体转化入毕赤酵母中，发酵培养重组菌获得磷脂酶A1。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表达载体是pPIC9K或pPICZα。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将重组菌活化后，接入装液量30-40％发酵罐，以氨水控制pH值为5-6，培养温度28-30℃，溶氧维持在30％左右，当甘油耗尽、溶氧迅速上升，开始流加甘油补料液，当菌体浓度达到OD₆₀₀＝95-105时，停止补料；保持基质匮乏状态约1h后，开始诱导阶段，设置诱导温度28-30℃，添加0.3-0.5％甲醇，待重组菌适应甲醇，溶氧开始下降后，维持甲醇浓度0.3-0.5％，诱导磷脂酶A1表达。

5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，将重组菌活化后，接入装液量0.9L的3L发酵罐，以25％氨水控制pH5，培养温度30℃，通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶氧维持在30％左右，当溶氧迅速上升，表明培养基中的甘油已经耗尽，开始流加50％的甘油补料液，当菌体浓度达到OD₆₀₀＝100时，停止补料，保持基质匮乏状态约1h后，开始诱导阶段，设置诱导温度28℃，添加0.5％甲醇，待重组菌适应甲醇，溶氧开始下降后，通过甲醇电极维持甲醇浓度0.5％，诱导磷脂酶A1表达。

6.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，发酵培养基含有硫酸钙0.9-1.0g/L，硫酸镁7-8g/L，氢氧化钾4-5g/L，硫酸钾18-20g/L，甘油30-35g/L，磷酸25-28ml/L，CuSO₄·5H₂O 6-7g/L，KI 0.08-1.0g/L，MnSO₄·H₂O 3g/L，Na₂MoO₃·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃ 0.02g/L，CoCl₂ 0.5g/L，ZnCl₂ 20g/L，FeSO₄·7H₂O 65-68g/L，生物素0.2g/L，H₂SO₄ 5-6g/L。

7.携带权利要求1所述基因的转化体。

8.权利要求1所述基因编码的磷脂酶A1。

9.权利要求8所述磷脂酶A1在油脂脱胶中的应用。

10.权利要求7所述转化体在油脂脱胶中的应用。