CN104560910A - 提高毕赤酵母发酵产磷脂酶c产量的培养基及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种发酵培养基，该发酵培养基中Mg2+含量为1.5-4.6g/l。使用本发明提供的发酵培养基培养表达磷脂酶C的毕赤酵母，发酵过程中的蛋白酶含量得到有效抑制，目的蛋白磷脂酶C的产酶时间被有效延长，且稳定性得到大幅提高，最终获得发酵液中的磷脂酶C的酶活得到较大提高，甚至可提高4倍以上。
Description
技术领域
本发明涉及磷脂酶C制备领域，具体的，涉及一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的培养基及方法。
背景技术
磷脂酶C（phospholipase C，简称PLC）是一类可催化水解磷脂C3的磷脂酰键的水解酶。其水解产物甘油二酯是一种生理活性物质，在细胞信号传导途径上起着第二信使的作用，能激活蛋白激酶C（PKC）而引起细胞增殖、分化、收缩、分泌和代谢等功能变化，此外还具有明显的抗血小板粘附、聚集等功能，对抗血小板新型药物及抗静脉血栓医疗方面的研究意义重大。随着对PLC研究的深入及工业发展的需求，PLC的应用价值已经从药品生产延伸到油脂精炼、食品加工、磷脂改性等领域，如：植物油脱胶，面包改性等。而最近PLC作为一种新型食品添加剂势必会推动PLC的广泛应用和研究。
国外对微生物磷脂酶C的研究起源于20世纪60年代，迄今已有多种微生物来源磷脂酶C的基因序列、蛋白结构及催化机理公布于众。产磷脂酶的细菌中Bacillus cereus、C.bifermentants、C.perfringens、L.monocytogenes、P.aeruginosa、B.thuringiensis来源磷脂酶C的基因已经克隆并对其底物特异性及酶学性质等进行了较为深入的研究。其中，B.cereus来源的PLC是一种分子量为23000KD的胞外酶,含有2个锌离子，是一种锌离子依赖型的单金属酶，其酶活和稳定性都依赖于锌离子（Clive little.Effect of some divalent metal cations on phopholipase C from Bacillus cereus.Acta Chemica Scandinavica B35(1981)39-44）。此外，还有研究者发现(Clive little and anne-brit otnass.The metal ion dependence of phospholipase C from bacillus cereus.Biochimica et Biophysica Acta,391(1975)326-333.Abramo C.Ottolenghi.Phospholipase C from bacillus cereus A zinc requiring metalloenzyme.Biochim.Biophys.Acta.106(1965),510-518.Clive little and sissel johansen.Unfolding and refolding of phospholipase C from Bacillus cereus in solutions of guanidinium chloride.Biochem.J.(1979)179,509-514.Anne-Brit otnaess,Clive little,knut sletten,et al.Some characteristics of phospholipase c from bacillus cereus.Eur.J.Biochem.79,459-468(1977))：B.cereus来源的PLC中一个锌离子与酶蛋白紧密结合，另一个比较松散，容易被其他二价金属离子取代，从而造成酶活降低或失活。目前，B.cereus来源的PLC在毕赤酵母中表达的研究比较少，目前主要有Kook等(Kook-Hwa Seo&Jong Rhee.High level expression of recombinant phopholipase C from Bacillus cereus in Pichia pastoris and its characterization.Biotechnology Letters26:1475-1479,2004)将B.cereus来源的PLC基因在毕赤酵母（P.pastoris）进行表达，摇瓶水平上检测了酶活。美国Verenium公司将包括B.cereus来源在内的任何来源的PLC基因在毕赤酵母中的表达都做了保护，并提出了“高的共喂料速率”策略（CN101558154A）。
目前，巴斯德毕赤酵母表达体统在国内外的应用非常广泛，迄今已有500多种外源蛋白在毕赤酵母中获得成功表达(Sue Macauley-Patrick,Mariana L.Fazenda,Brian McNeil and Linda M.Harvey.Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system[J].Yeast,2005,22：249—270.)。通常外源蛋白在毕赤酵母中表达所用培养基及调控策略都基本都采用Invitrogen公司的操作手册上培养基及调控方式，即：基础盐培养基主要包括硫酸钙，硫酸钾，硫酸镁，甘油等。调控方式分甘油长菌体，和甲醇诱导产外源蛋白阶段。最近，部分学者认为，Invitrogen公司提供的培养基配方中基础盐浓度过高，导致培养基总渗透压过高，致使菌体过早死亡，释放大量蛋白酶，是造成毕赤酵母表达外源蛋白过程中外源目的蛋白降解的主要原因。如：Surribas等(Surribas A,Stahn R,Montesinos J L,et al.Production of a Rhizopus oryzae lipase from Pichia pastoris using alternative operational strategies.Journal of Biotechnology,2007,130(3):291-299)将基础盐浓度降至原来的1/4时，菌体死亡率大大下降。Zhao等(Zhao H L,Xue C,Wang Y,et al.Increasing the cell viability and heterologous protein expression of Pichia pastoris mutant deficient in PMR1gene by culture condition optimization.Appl Microbiol Biotechnol,2008,81(2):235-241)将基础盐浓度降至原来的1/4时，诱导前后菌体死亡率分别降低 83.3%和48.6%～59.2%,蛋白表达量提高92%。
发明内容
发明人在研究中，意外发现在使用毕赤酵母表达蜡状芽孢杆菌（B.cereus）来源的PLC时，控制培养基中的Mg2+含量为1.5-4.6g/l，发酵过程中的蛋白酶含量得到有效抑制，目的蛋白磷脂酶C的产酶时间被有效延长，且稳定性得到大幅提高，最终获得发酵液中的PLC的酶活得到较大提高，甚至可提高4倍以上。
因此，本发明的一个目的在于，提供一种用于毕赤酵母表达PLC的发酵培养基。
本发明提供的发酵培养基，其中Mg2+含量为1.5-4.6g/l。
在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基中，Mg2+含量为2.3-4.6g/l，优选为2.3～3.4g/L。
在本发明的一个实施例中，所述Mg2+来源于无机盐、有机盐或其组合。
在本发明的一个实施例中，所述Mg2+来源于MgSO4，MgSO4.7H2O，MgCl2，MgCO3，Mg(HCO3)2，Mg(GH3COO)2·4H2O中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30～50g/L甘油，0.6～1.2g/L CaSO4，10～20g/L K2SO4，6～12g/L(NH4)2SO4，0.1～0.2ml/L消泡剂，20-30g/L六偏磷酸钠，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，发酵培养基中还包含：
30-50g/L甘油，15-30ml/L磷酸,0.6-1.2g/L CaSO4,15-20g/L K2SO4，3-5g/LKOH，0.1～0.2ml/L消泡剂，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述微量元素浓缩溶液为PTM微量元素浓缩溶液。在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为PTM1微量元素浓缩溶液或PTM4微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为：5.99g/L CuSO45H2O，8ml/L1%NaI，3.0g/L MnSO4H2O，0.2g/L Na2Mo4.(H2O)2，0.5g/L CoCl2(H2O)6，20.04g/L ZnCl2(H2O)5，65.05g/L FeSO4.(H2O)7，800μL/L 2.5%H3BO3，19.2ml/L浓硫酸，0.4g/L生物素。
在本发明的一个实施例中，使用的消泡剂为聚醚类消泡剂、高碳醇、硅类中的一种或多种。
本发明还提供了一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的发酵培养基，该发酵培养基通过将常规培养基中Mg2+调节至1.5-4.6g/l而获得。
在本发明的一个实施例中，在所述发酵培养基中，Mg2+含量为2.3～4.6g/l，在本发明的一个实施例中，在所述发酵培养基中，Mg2+含量为2.3～3.4g/L。
在本发明的一个实施例中，所述Mg2+来源于无机盐、有机盐或其组合。
在本发明的一个实施例中，所述Mg2+来源于MgSO4，MgSO4.7H2O，MgCl2，MgCO3，Mg(HCO3)2，Mg(GH3COO)2·4H2O中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，所述常规培养基为用于毕赤酵母发酵的培养基。在本发明的一个的实施例中，使用的培养基为基础盐培养基或改良培养基，在一个优选的实施例中，使用的基础盐培养基为FM21或BSM，在另一个优选的实施例中，使用的培养基为FM21或BSM的改良培养基。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30～50g/L甘油，0.6～1.2g/L CaSO4，10～20g/L K2SO4，6～12g/L(NH4)2SO4，0.1～0.2ml/L消泡剂，20-30g/L六偏磷酸钠，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30-50g/L甘油，15-30ml/L磷酸,0.6-1.2g/L CaSO4,15-20g/L K2SO4，3-5g/LKOH，0.1～0.2ml/L消泡剂，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述微量元素浓缩溶液为PTM微量元素浓缩溶液。在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为PTM1微量元素浓缩溶液或PTM4微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施例中，所述PTM微量元素浓缩溶液为：5.99g/L CuSO45H2O，8ml/L1%NaI，3.0g/L MnSO4H2O，0.2g/L Na2Mo4.(H2O)2，0.5g/LCoCl2(H2O)6，20.04g/L ZnCl2(H2O)5，65.05g/L FeSO4.(H2O)7，800μL/L2.5%H3BO3，19.2ml/L浓硫酸，0.4g/L生物素。
在本发明的一个实施例中，使用的消泡剂为聚醚类消泡剂、高碳醇、硅类 中的一种或多种。
本发明还提供了一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的发酵培养基，其中MgSO4含量为7.3～23g/L。
在本发明的一个实施例中，在所述发酵培养基中，MgSO4含量为11.4-23g/L，优选为11.4-17g/L。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30～50g/L甘油，0.6～1.2g/L CaSO4，10～20g/L K2SO4，6～12g/L(NH4)2SO4，0.1～0.2ml/L消泡剂，20-30g/L六偏磷酸钠，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30-50g/L甘油，15-30ml/L磷酸,0.6-1.2g/L CaSO4,15-20g/L K2SO4，3-5g/LKOH，0.1～0.2ml/L消泡剂，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述微量元素浓缩溶液为PTM微量元素浓缩溶液。在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为PTM1微量元素浓缩溶液或PTM4微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为：5.99g/LCuSO45H2O，8ml/L1%NaI，3.0g/L MnSO4H2O，0.2g/L Na2Mo4.(H2O)2，0.5g/L CoCl2(H2O)6，20.04g/L ZnCl2(H2O)5，65.05g/L FeSO4.(H2O)7，800μL/L2.5%H3BO3，19.2ml/L浓硫酸，0.4g/L生物素。
在本发明的一个实施例中，使用的消泡剂为聚醚类消泡剂、高碳醇、硅类中的一种或多种。
本发明还提供了一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的发酵培养基，该发酵培养基通过将常规培养基中MgSO4含量调节至7.3～23g/L而获得。
在本发明的一个实施例中，该发酵培养基通过将常规培养基中MgSO4含量调节至11.4-23g/L，优选为11.4-17g/L而获得。
在本发明的一个实施例中，所述常规培养基为用于毕赤酵母发酵的培养基。在本发明的一个的实施例中，使用的培养基为基础盐培养基或改良培养基，在一个优选的实施例中，使用的基础盐培养基为FM21或BSM，在另一个优选的实施例中，使用的培养基为FM21或BSM的改良培养基。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30～50g/L甘油，0.6～1.2g/L CaSO4，10～20g/L K2SO4，6～12g/L(NH4)2SO4，0.1～0.2ml/L消泡剂，20-30g/L六偏磷酸钠，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30-50g/L甘油，15-30ml/L磷酸,0.6-1.2g/L CaSO4,15-20g/L K2SO4，3-5g/LKOH，0.1～0.2ml/L消泡剂，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述微量元素浓缩溶液为PTM微量元素浓缩溶液。在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为PTM1微量元素浓缩溶液或PTM4微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为：5.99g/L CuSO45H2O，8ml/L1%NaI，3.0g/L MnSO4H2O，0.2g/L Na2Mo4.(H2O)2，0.5g/L CoCl2(H2O)6，20.04g/L ZnCl2(H2O)5，65.05g/L FeSO4.(H2O)7，800μL/L2.5%H3BO3，19.2ml/L浓硫酸，0.4g/L生物素。
在本发明的一个实施例中，使用的消泡剂为聚醚类消泡剂、高碳醇、硅类中的一种或多种。
本发明还提供了一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的方法。
本发明提供的提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量方法为使用前述的发酵培养基培养所述毕赤酵母菌株。
附图说明
图1-1和图1-2为镁离子对毕赤酵母产PLC活力的影响。
图2-1为实施例1中发酵液（10倍稀释）的电泳检测结果，其中，泳道1为marker，泳道2-4分别为培养78h，90h和100h的检测结果。
图2-2为实施例2中发酵液（10倍稀释）的电泳检测结果，其中，泳道1为marker，泳道2-4分别为培养78h，96h和114h的检测结果。
图2-3为实施例4中发酵液（10倍稀释）的电泳检测结果，其中，泳道2-4分别为培养66h，78h和96h的检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
在本发明中，如果没有特别的说明，百分数（％）或者份都指相对于组合物的重量百分数或者重量份。
在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100％。
在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量份。
在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。
在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。
在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。
如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。
如果没有特别指出，本发明所述的百分数（包括重量百分数）的基准都是所述组合物的总重量。
本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例 如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4、和2－5。
在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。
在本文中，除非另有说明，各反应都在常温常压下进行。
在本文中，除非另有说明，各个反应步骤可以顺序进行，也可以不按顺序进行。例如，各个反应步骤之间可以包含其他步骤，而且反应步骤之间也可以调换顺序。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
发明人在研究表达PLC的毕赤酵母时，意外发现在培养毕赤酵母表达菌株，当培养基中的Mg2+含量为1.5-4.6g/l时，目标酶PLC的产酶时间被有效延长，而且目的蛋白的稳定性得到提高，不容易被降解，最终获得发酵液中的PLC的酶活得到较大提高，甚至可提高4倍以上。
培养基
本发明提供的一种用于毕赤酵母表达PLC的发酵培养基，其中Mg2+含量为1.5-4.6g/l。
在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基中，Mg2+含量为2.3～4.6g/l，在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基中，Mg2+含量为2.3～3.4g/L。
在本发明的一个实施方案中，所述发酵培养基中，Mg2+含量为1.5g/l，1.6g/l，1.7g/l，1.8g/l，1.9g/l，2.0g/l，2.1g/l，2.2g/l，2.3g/l，2.4g/l，2.5g/l，2.6g/l，2.7g/l，2.8g/l，2.9g/l，3.0g/l，3.1g/l，3.2g/l，3.3g/l，3.4g/l，3.5g/l，3.6g/l，3.7g/l，3.8g/l，3.9g/l，4.0g/l，4.1g/l，4.2g/l，4.3g/l，4.4g/l，4.5g/l，或4.6g/l。
在本发明的一个实施例中，所述Mg2+来源于无机盐、有机盐或其组合。
在本发明中，可使用的提供Mg2+的无机盐或有机盐为本领域的技术人员所熟知，在制备培养基时，可根据本领域的公知常识或需要进行选择。在本发明的一个实施例中，所述Mg2+来源于MgSO4，MgSO4.7H2O，MgCl2，MgCO3，Mg(HCO3)2，Mg(GH3COO)2·4H2O中的一种或多种。
可用于毕赤酵母发酵的培养基，是本领域的公知常识，对于本领域的技术人员而言，也是清楚的。在本发明中，使用的发酵培养基的其他组分，可根据现有技术进行组合和调整，例如可以包括但不限于使用基础盐培养基（包括但不限于FM21、BSM）及其改良培养基。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30～50g/L甘油，0.6～1.2g/L CaSO4，10～20g/L K2SO4，6～12g/L(NH4)2SO4，0.1～0.2ml/L消泡剂，20-30g/L六偏磷酸钠，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30-50g/L甘油，15-30ml/L磷酸,0.6-1.2g/L CaSO4,15-20g/L K2SO4，3-5g/LKOH，0.1～0.2ml/L消泡剂，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述微量元素浓缩溶液为PTM微量元素浓缩溶液。在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为PTM1微量元素浓缩溶液或PTM4微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为：5.99g/L CuSO45H2O，8ml/L1%NaI，3.0g/L MnSO4H2O，0.2g/L Na2Mo4.(H2O)2，0.5g/L CoCl2(H2O)6，20.04g/L ZnCl2(H2O)5，65.05g/L FeSO4.(H2O)7，800μL/L2.5%H3BO3，19.2ml/L浓硫酸，0.4g/L生物素。
本发明还提供了一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的发酵培养基，该发酵培养基通过将常规培养基中Mg2+调节至1.5-4.6g/l而获得。
在本发明的一个实施例中，在所述发酵培养基中，Mg2+调节至2.3-4.6g/l，在本发明的一个实施例中，在所述发酵培养基中，Mg2+调节至2.3～3.4g/L。
在本发明的一个实施方案中，所述发酵培养基中，Mg2+调节至1.5g/l，1.6g/l，1.7g/l，1.8g/l，1.9g/l，2.0g/l，2.1g/l，2.2g/l，2.3g/l，2.4g/l，2.5g/l，2.6g/l，2.7g/l，2.8g/l，2.9g/l，3.0g/l，3.1g/l，3.2g/l，3.3g/l，3.4g/l，3.5g/l，3.6g/l，3.7g/l，3.8g/l，3.9g/l，4.0g/l，4.1g/l，4.2g/l，4.3g/l，4.4g/l，4.5g/l，或4.6g/l。
在本发明的一个实施例中，所述Mg2+来源于无机盐、有机盐或其组合。
在本发明中，可使用的提供Mg2+的无机盐或有机盐为本领域的技术人员所熟知，在制备培养基时，可根据本领域的公知常识或需要进行选择。在本发明 的一个实施例中，所述Mg2+来源于MgSO4，MgSO4.7H2O，MgCl2，MgCO3，Mg(HCO3)2，Mg(GH3COO)2·4H2O中的一种或多种。
可用于毕赤酵母发酵的培养基，是本领域的公知常识，对于本领域的技术人员而言，也是清楚的。在本发明中，使用的发酵培养基的其他组分，可根据现有技术进行组合和调整，例如可以包括但不限于使用基础盐培养基（包括但不限于FM21、BSM）及其改良培养基。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30～50g/L甘油，0.6～1.2g/L CaSO4，10～20g/L K2SO4，6～12g/L(NH4)2SO4，0.1～0.2ml/L消泡剂，20-30g/L六偏磷酸钠，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30-50g/L甘油，15-30ml/L磷酸,0.6-1.2g/L CaSO4,15-20g/L K2SO4，3-5g/LKOH，0.1～0.2ml/L消泡剂，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述微量元素浓缩溶液为PTM微量元素浓缩溶液。在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为PTM1微量元素浓缩溶液或PTM4微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为：5.99g/L CuSO45H2O，8ml/L1%NaI，3.0g/L MnSO4H2O，0.2g/L Na2Mo4.(H2O)2，0.5g/L CoCl2(H2O)6，20.04g/L ZnCl2(H2O)5，65.05g/L FeSO4.(H2O)7，800μL/L2.5%H3BO3，19.2ml/L浓硫酸，0.4g/L生物素。
本发明还提供了一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的发酵培养基，其中MgSO4含量为7.3～23g/L。
在本发明的一个实施例中，在所述发酵培养基中，MgSO4含量为11.4-23g/L，在本发明的一个实施例中，在所述发酵培养基中，MgSO4含量为11.4-17g/L。
在本发明的一个实施例中，在所述发酵培养基中，MgSO4含量为7.3g/l，7.4g/l，7.5g/l，7.6g/l，7.7g/l，7.8g/l，7.9g/l，8g/l，8.1g/l，8.2g/l，8.3g/l，8.4g/l，8.5g/l，8.6g/l，8.7g/l，8.8g/l，8.9g/l，9g/l，9.1g/l，9.2g/l，9.3g/l，9.4g/l，9.5g/l，9.6g/l，9.7g/l，9.8g/l，9.9g/l，10g/l，10.1g/l，10.2g/l，10.3g/l，10.4g/l，10.5g/l， 10.6g/l，10.7g/l，10.8g/l，10.9g/l，11g/l，11.1g/l，11.2g/l，11.3g/l，11.4g/l，11.5g/l，11.6g/l，11.7g/l，11.8g/l，11.9g/l，12g/l，12.1g/l，12.2g/l，12.3g/l，12.4g/l，12.5g/l，12.6g/l，12.7g/l，12.8g/l，12.9g/l，13g/l，13.1g/l，13.2g/l，13.3g/l，13.4g/l，13.5g/l，13.6g/l，13.7g/l，13.8g/l，13.9g/l，14g/l，14.1g/l，14.2g/l，14.3g/l，14.4g/l，14.5g/l，14.6g/l，14.7g/l，14.8g/l，14.9g/l，15g/l，15.1g/l，15.2g/l，15.3g/l，15.4g/l，15.5g/l，15.6g/l，15.7g/l，15.8g/l，15.9g/l，16g/l，16.1g/l，16.2g/l，16.3g/l，16.4g/l，16.5g/l，16.6g/l，16.7g/l，16.8g/l，16.9g/l，17g/l，17.1g/l，17.2g/l，17.3g/l，17.4g/l，17.5g/l，17.6g/l，17.7g/l，17.8g/l，17.9g/l，18g/l，18.1g/l，18.2g/l，18.3g/l，18.4g/l，18.5g/l，18.6g/l，18.7g/l，18.8g/l，18.9g/l，19g/l，19.1g/l，19.2g/l，19.3g/l，19.4g/l，19.5g/l，19.6g/l，19.7g/l，19.8g/l，19.9g/l，20g/l，20.1g/l，20.2g/l，20.3g/l，20.4g/l，20.5g/l，20.6g/l，20.7g/l，20.8g/l，20.9g/l，21g/l，21.1g/l，21.2g/l，21.3g/l，21.4g/l，21.5g/l，21.6g/l，21.7g/l，21.8g/l，21.9g/l，22g/l，22.1g/l，22.2g/l，22.3g/l，22.4g/l，22.5g/l，22.6g/l，22.7g/l，22.8g/l，22.9g/l，或23g/l。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30～50g/L甘油，0.6～1.2g/L CaSO4，10～20g/L K2SO4，6～12g/L(NH4)2SO4，0.1～0.2ml/L消泡剂，20-30g/L六偏磷酸钠，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30-50g/L甘油，15-30ml/L磷酸,0.6-1.2g/L CaSO4,15-20g/L K2SO4，3-5g/LKOH，0.1～0.2ml/L消泡剂，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述微量元素浓缩溶液为PTM微量元素浓缩溶液。在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为PTM1微量元素浓缩溶液或PTM4微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为：5.99g/L CuSO45H2O，8ml/L1%NaI，3.0g/L MnSO4H2O，0.2g/L Na2Mo4.(H2O)2，0.5g/L CoCl2(H2O)6，20.04g/L ZnCl2(H2O)5，65.05g/L FeSO4.(H2O)7，800μL/L2.5%H3BO3，19.2ml/L浓硫酸，0.4g/L生物素。
本发明还提供了一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的发酵培养基，该 发酵培养基通过将常规培养基中MgSO4含量调节至7.3～23g/L而获得。
在本发明的一个实施例中，该发酵培养基通过将常规培养基中MgSO4含量调节至11.4-23g/L而获得。在本发明的一个实施例中，该发酵培养基通过将常规培养基中MgSO4含量调节至11.4-17g/L而获得。
在本发明的一个实施例中，在所述发酵培养基中，MgSO4含量调节至7.3g/l，7.4g/l，7.5g/l，7.6g/l，7.7g/l，7.8g/l，7.9g/l，8g/l，8.1g/l，8.2g/l，8.3g/l，8.4g/l，8.5g/l，8.6g/l，8.7g/l，8.8g/l，8.9g/l，9g/l，9.1g/l，9.2g/l，9.3g/l，9.4g/l，9.5g/l，9.6g/l，9.7g/l，9.8g/l，9.9g/l，10g/l，10.1g/l，10.2g/l，10.3g/l，10.4g/l，10.5g/l，10.6g/l，10.7g/l，10.8g/l，10.9g/l，11g/l，11.1g/l，11.2g/l，11.3g/l，11.4g/l，11.5g/l，11.6g/l，11.7g/l，11.8g/l，11.9g/l，12g/l，12.1g/l，12.2g/l，12.3g/l，12.4g/l，12.5g/l，12.6g/l，12.7g/l，12.8g/l，12.9g/l，13g/l，13.1g/l，13.2g/l，13.3g/l，13.4g/l，13.5g/l，13.6g/l，13.7g/l，13.8g/l，13.9g/l，14g/l，14.1g/l，14.2g/l，14.3g/l，14.4g/l，14.5g/l，14.6g/l，14.7g/l，14.8g/l，14.9g/l，15g/l，15.1g/l，15.2g/l，15.3g/l，15.4g/l，15.5g/l，15.6g/l，15.7g/l，15.8g/l，15.9g/l，16g/l，16.1g/l，16.2g/l，16.3g/l，16.4g/l，16.5g/l，16.6g/l，16.7g/l，16.8g/l，16.9g/l，17g/l，17.1g/l，17.2g/l，17.3g/l，17.4g/l，17.5g/l，17.6g/l，17.7g/l，17.8g/l，17.9g/l，18g/l，18.1g/l，18.2g/l，18.3g/l，18.4g/l，18.5g/l，18.6g/l，18.7g/l，18.8g/l，18.9g/l，19g/l，19.1g/l，19.2g/l，19.3g/l，19.4g/l，19.5g/l，19.6g/l，19.7g/l，19.8g/l，19.9g/l，20g/l，20.1g/l，20.2g/l，20.3g/l，20.4g/l，20.5g/l，20.6g/l，20.7g/l，20.8g/l，20.9g/l，21g/l，21.1g/l，21.2g/l，21.3g/l，21.4g/l，21.5g/l，21.6g/l，21.7g/l，21.8g/l，21.9g/l，22g/l，22.1g/l，22.2g/l，22.3g/l，22.4g/l，22.5g/l，22.6g/l，22.7g/l，22.8g/l，22.9g/l，或23g/l。
可用于毕赤酵母发酵的培养基，是本领域的公知常识，对于本领域的技术人员而言，也是清楚的。在本发明中，使用的发酵培养基的其他组分，可根据现有技术进行组合和调整，例如可以包括但不限于使用基础盐培养基（包括但不限于FM21、BSM）及其改良培养基。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30～50g/L甘油，0.6～1.2g/L CaSO4，10～20g/L K2SO4，6～12g/L(NH4)2SO4， 0.1～0.2ml/L消泡剂，20-30g/L六偏磷酸钠，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
30-50g/L甘油，15-30ml/L磷酸,0.6-1.2g/L CaSO4,15-20g/L K2SO4，3-5g/LKOH，0.1～0.2ml/L消泡剂，3～5ml/L微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述微量元素浓缩溶液为PTM微量元素浓缩溶液。在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为PTM1微量元素浓缩溶液或PTM4微量元素浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为：5.99g/L CuSO45H2O，8ml/L1%NaI，3.0g/L MnSO4H2O，0.2g/L Na2Mo4.(H2O)2，0.5g/L CoCl2(H2O)6，20.04g/L ZnCl2(H2O)5，65.05g/L FeSO4.(H2O)7，800μL/L2.5%H3BO3，19.2ml/L浓硫酸，0.4g/L生物素。
本领域的技术人员清楚，基础盐培养基FM21由Invitrogen公司提供，基础盐培养基（BSM）为伦敦大学学院（University college London，UCL）提供，FM21和BSM的配方为本领域的技术人员所公知。本领域的技术人员在上述配方基础上，也进行过大量改良，获得了改良培养基，其具体配方在文献中均有所报道，已为本领域的技术人员所熟知，改良的方法也为本领域的技术人员所熟知。
可用于培养基（例如用于毕赤酵母发酵的培养基）的消泡剂，是本领域的公知常识，对于本领域的技术人员而言，也是清楚的；可在本发明中使用的消泡剂对本领域的技术人员而言是清楚的。在本发明的一个实施例中，使用的消泡剂为聚醚类消泡剂、高碳醇、硅类中的一种或多种。在本发明中，聚醚类消泡剂可包括但不限于：a.GP型消泡剂、b.GPE型消泡剂，即泡敌、c.GPES型消泡剂；高碳醇可包括但不限于：C7～C9醇、C12～C22的高碳醇、苯乙醇油酸酯、苯乙酸月桂醇酯等；硅类可包括但不限于：聚二甲基硅氧烷，也称二甲基硅油等，聚醚改性硅及聚硅氧烷消泡剂。
发酵方法
本发明提供的发酵方法为使用本发明所提供的发酵培养基发酵培养毕赤 酵母菌株。
在本发明中，所使用的菌株为毕赤酵母，具体而言，可包括但不限于：毕赤酵母GS115，毕赤酵母X-33，毕赤酵母KM71。
在进行发酵培养时，具体使用的发酵工艺、具体参数等，均为本领域的技术人员所熟知。对于本领域的技术人员而言，在对毕赤酵母进行发酵培养时，既可以采用一步发酵的方式，也可以采用分步发酵的方式。在本发明的一个具体实施方式中，发酵培养采用三步发酵法，具体而言，该方法包括甘油分批培养阶段，甘油补料分批培养阶段和甲醇补料分批诱导表达阶段。
实施例
在本发明的下述实施例中，
菌株来源：构建的重组菌为表达了PLC的重组毕赤酵母，该重组的毕赤酵母构建方法按照常规的毕赤酵母表达手册操作完成，其中：
宿主菌为毕赤酵母GS115菌株，购自invitrogen公司；
原始载体为pAO815质粒，购自invitrogen公司；
表达的基因：源于Bacillus cereus的PLC基因。
种子制备及发酵方法
从新鲜YDP平板上挑取一单菌落到种子培养基中，28-30℃，200-220r/min培养20-24小时后，接种于装有3L分批发酵培养基的7.5L发酵罐中进行分批培养（用氨水调pH至5.5左右）。当甘油耗尽后（DO陡然上升至80%以上），流加补料生长培养基（流加速率维持溶氧大于20%）。当细胞湿重为200-220g/L时停止补料。甘油耗尽后，流加甲醇诱导发酵产磷脂酶，通过调节转速、罐压、空气流量及甲醇速度使DO大于20%，发酵周期120小时左右。
PLC活力分析采用pNPPC法，具体过程如下：
1，试剂配制：
1mmol/L对硝基苯酚（pNP）溶液：称取0.01391g对硝基苯酚(pNP)，溶于100ml无菌水中配成。
底物缓冲液：0.1M硼酸-硼酸钠缓冲液(pH7.6)，1%Triton-X-100，1mM CaCl2。
反应缓冲液：0.1M硼酸-硼酸钠缓冲液(pH7.6)，20mM pNPPC（对硝基苯酚磷酸胆碱酯），1%Triton-X-100，1mM CaCl2。
2，磷脂酶活力测定标准曲线的绘制
各种试剂的加量见下表
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 1.0mmol/LpNP(μl) | 0 | 7.5 | 15 | 22.5 | 30.5 | 37.5 | 45 | 52.5 |
| ddH2O(μl) | 62.5 | 55 | 47.5 | 40 | 32.5 | 25 | 17.5 | 10 |
| 底物缓冲液(μl) | 562.5 | 562.5 | 562.5 | 562.5 | 562.5 | 562.5 | 562.5 | 562.5 |
| pNP总量(μmol) | 0 | 0.0075 | 0.015 | 0.0225 | 0.03 | 0.0375 | 0.045 | 0.0525 |
以上各种溶液混合后，在37℃处理15分钟，加500μl0.5N的NaOH混匀，在410nm测定吸光度。以吸光值为横坐标，pNP浓度为纵坐标作图，获得pNP-吸光度标准曲线，经拟合，获得拟合方程，y=0.0596x-0.0002，R2=0.9996。
3，测试方法：
取两支干净的试管，其中一个做样品管，一个做空白对照管。每个试管中加入600ul反应缓冲液，样品管中加入25ul待测酶液，空白管不加，样品和空白同时放在37℃恒温水域中反应15min，各加500ul0.5N的NaOH终止反应，空白管中补加25ul待测酶液，410nm测定吸光度，用空白管校正零点。
磷脂酶酶活力单位定义为：每分钟催化底物释放出1μmol磷酸胆碱的酶量为1个磷脂酶活力单位（U）。
酶活计算如下：
A:样品吸光度值； K：标准曲线斜率
Vt:反应总体积（ml）； Vo:加酶量（ml）
t:反应时间（h）。
培养基：
种子培养基（YPD-甘油）：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨,20g/L甘油。121℃，灭菌20min。
发酵培养基1（基础盐培养基BSM及其改良培养基）：MgSO4根据需求变化，30～50g/L甘油，0.6～1.2g/L CaSO4，10～20g/L K2SO4，6～12g/L(NH4)2SO4，0.1～0.2ml/L消泡剂，20-30g/L六偏磷酸钠，3～5ml/L PTM微量元素浓缩溶液，具体的，
发酵培养基1-1：MgSO4根据需求变化，50g/L甘油，0.9g/L CaSO4，14.67g/L K2SO4，9g/L(NH4)2SO4，0.125ml/L消泡剂，25g/L六偏磷酸钠，4ml/L PTM微量元素浓缩溶液；
发酵培养基1-2：MgSO4根据需求变化，40g/L甘油，0.6g/L CaSO4，10g/L K2SO4，6g/L(NH4)2SO4，0.1ml/L消泡剂，20g/L六偏磷酸钠，3ml/L PTM微量元素浓缩溶液；
发酵培养基1-3：MgSO4根据需求变化，30g/L甘油，1.2g/L CaSO4，20g/L K2SO4，12g/L(NH4)2SO4，0.2ml/L消泡剂，30g/L六偏磷酸钠，5ml/L PTM微量元素浓缩溶液。
发酵培养基2（基础盐培养基FM21及其改良培养基）：MgSO4根据需求变化，30-50g/L甘油，15-30ml/L磷酸,0.6-1.2g/L CaSO4,15-20g/L K2SO4，3-5g/LKOH，0.1～0.2ml/L消泡剂，3～5ml/L PTM微量元素浓缩溶液，具体的，
发酵培养基2-1：MgSO4根据需求变化，40g/L甘油，26.7ml/L磷酸（85%），0.93g/L CaSO4，18.2g/L K2SO4，4.13g/LKOH，0.1ml/L消泡剂，4ml/L PTM微量元素浓缩溶液；
发酵培养基2-2：MgSO4根据需求变化，30g/L甘油，15ml/L磷酸,0.6g/L CaSO4,15g/L K2SO4，3g/LKOH，0.1ml/L消泡剂，3ml/L PTM微量元素浓缩溶液；
发酵培养基2-3：MgSO4根据需求变化，50g/L甘油，30ml/L磷酸,1.2g/L CaSO4,20g/L K2SO4，5g/LKOH，0.2ml/L消泡剂，5ml/L PTM微量元素浓缩溶液。
其中使用的消泡剂为乳化硅油；产品型号：XP-M-130，购自南京华兴消泡剂有限公司。
PTM微量元素浓缩溶液：5.99g/L CuSO45H2O，8ml/L1%NaI，3.0g/L MnSO4H2O，0.2g/L Na2Mo4.(H2O)2，0.5g/L CoCl2(H2O)6，20.04g/L ZnCl2(H2O)5，65.05g/L FeSO4.(H2O)7，800μL/L2.5%H3BO3，19.2ml/L浓硫酸，0.4g/L生物素。0.2μm膜过滤灭菌。
甘油补料培养基：甘油50%，4.35ml/L PTM微量元素浓缩溶液。
甲醇补料培养基：甲醇100%，4.35ml/L PTM微量元素浓缩溶液。
实施例1、菌株制备
本实验采用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）新型真核表达系统，依据毕赤酵母表达系统密码子的偏嗜性，以人工合成的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）磷脂酶C的PLC成熟核苷酸（序列如SEQ ID No：1所示）为模板，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增出PLC基因。将目的片段与表达载体pAO815质粒连接，得到重组表达质粒pA0815-PLC，构建含单拷贝PLC的重组表达质粒pAO815-PLC，然后将pAO815-PLC转化毕赤酵母工程菌GS115，通过组氨酸（His）营养缺陷型筛选出具有重组的酵母菌GS115-pAO815-PLC。具体过程参考：Invitrogen公司发布的毕赤酵母表达手册。
实施例2、
2.1、种子液制备：
将保藏于-80℃冰箱的重组的酵母菌GS115-pAO815-PLC划线于YPD平板，30℃恒温培养2d。挑取一环菌落接种到装有30ml YPD-甘油液体培养基的250ml带挡板的三角瓶中，30℃，200rpm培养20-24h，即得到种子液，用于6.7L发酵罐的接种。
2.2、发酵培养
在6.7L发酵罐（瑞士比欧RALF-duett6.7L）培养重组毕赤酵母及采用甲 醇诱导表达磷脂酶C，表达策略采用三步发酵法：即甘油分批培养阶段，甘油补料分批培养阶段和甲醇补料分批诱导表达阶段。
（1）：甘油分批培养阶段扩增菌体
以2%的接种量，将上述种子液泵入已灭菌的装有3L发酵培养基1-1（其中MgSO4。77H2O含量为23.34g/L）的6.7L发酵罐中，设定初始发酵参数：搅拌转速500r/min、通气量2L/min、罐压0.05MPa，温度30℃，pH为5.0，开始发酵罐培养，通过调节搅拌速度、通气量、罐压等措施使DO维持在20-35%左右。当DO陡然上升大于80%时，说明培养基中甘油已消耗完，由此开始转入甘油补料分批阶段以进一步提高菌体密度，该培养阶段为24h。
(2)：甘油补料分批培养阶段以进一步扩增菌体
流加50%甘油补料培养基到发酵罐中，控制甘油补料培养基的流加速率使DO维持在20-30%，过程中每隔1-2h取样，测定发酵液中酵母菌体湿重，当湿重达到200-220/L，停止甘油流加，至DO上升至80%以上，继续维持“甘油饥饿”状态1h，转入甲醇诱导表达阶段，该培养阶段为4～6h。
（3）：甲醇补料培养基分批诱导表达磷脂酶C阶段，即诱导表达期
先将菌体生长最适温度30℃，调为PLC最适表达温度28℃，同时将菌体生长最适pH5.0,调为诱导表达最适pH6.0，待稳定后，开始甲醇诱导，过程如下：
先手动加几滴甲醇补料培养基，DO快速下降，待DO反升至80%以上，再手动滴加甲醇补料培养基。反复三次后，当DO再次上升到80%以上，开始流加甲醇补料培养基，初始以2ml/h/L维持2小时，随后调节甲醇补料培养基流速为3ml/h/L维持2小时，随后为5ml/h/L维持2小时，最后调为7.5ml/h/L至发酵结束。过程中通过调节转速，通风，罐压等使DO维持在20-30%。
在诱导表达期中，间隔6小时取样，检测菌体湿重（如图1-2所示），磷脂酶活力（如图1-1所示），蛋白酶活力，总蛋白含量，SDS电泳测试过程中目的蛋白降解情况。待磷脂酶活力不变或下降即为发酵终点，发现诱导表达67h后达到发酵终点，该诱导表达期为67h。
其中，发酵终点的磷脂酶活力，蛋白酶活力，总蛋白含量的检测结果如表1所示，培养78h、90h和100h的发酵液（10倍稀释）的SDS电泳检测的结果如图2-1所示。
实施例3、
采用发酵培养基1-1，其中MgSO4。77H2O含量为35g/L，其余均与实施例2相同，结果显示，诱导表达83h后达到发酵终点，诱导表达期为83h。
发酵过程中的菌体湿重检测结果如图1-2所示，磷脂酶活力检测结果如图1-1所示，发酵终点的磷脂酶活力，蛋白酶活力，总蛋白含量的检测结果如表1所示，培养78h、96h和114h的发酵液（10倍稀释）的SDS电泳结果如图2-2所示。
实施例4、
采用发酵培养基1-1，其中MgSO4。77H2O含量为46.68g/L，其余均与实施例2相同，结果显示，诱导表达82h后达到发酵终点，即诱导表达期为82h。
发酵过程中的菌体湿重检测结果如图1-2所示，磷脂酶活力检测结果如图1-1所示，发酵终点的磷脂酶活力，蛋白酶活力，总蛋白含量的检测结果如表1所示。
实施例5
采用发酵培养基1-1，其中MgSO4。7H2O含量为11.67g/L，其余均与实施例2相同，结果显示，诱导表达48h后达到发酵终点，即诱导表达期为48h。
发酵过程中的菌体湿重检测结果如图1-2所示，磷脂酶活力检测结果如图1-1所示，发酵终点的磷脂酶活力，蛋白酶活力，总蛋白含量的检测结果如表1所示。培养66h、78h和96h的发酵液（10倍稀释）的SDS电泳结果如图2-3所示。
表1、发酵液检测结果
根据图1-1和表1结果，当发酵培养基中镁离子的浓度较低时，如Mg2+为1.1g/L左右时，发酵过程中蛋白酶浓度较高，目标产物降解比较严重，诱导期较短，同时PLC酶活及总蛋白含量都比较低；而增加发酵培养基中镁离子浓度，发酵过程中蛋白酶一直低于检测线，因此诱导周期延长，至发酵结束时，PLC酶活及总蛋白含量都明显增加；但发酵培养基中镁离子浓度过高时，虽然发酵过程中蛋白酶含量低于检测线，目标产物也降解不明显，但PLC酶活及总蛋白含量开始降低，可能是过高的渗透压影响菌体表达目标产物。
图1-1结果显示：发酵培养基中镁离子浓度对菌体表达目标产物的速率及产量影响都比较大。当镁离子浓度超过一定浓度，对酶活有根本提升。
图1-2结果显示：发酵培养基中镁离子的浓度虽然对菌体表达目标产物影响较大，但对菌体自身的生长速率及最终菌体量并无明显影响。
图2-1结果显示：在整个发酵过程中，小肽的条带未随发酵时间的延长出现颜色加深或条带加粗的现象，结合目标条带的颜色的变化，说明在本实验过程中，目标产物磷脂酶C的蛋白含量未出现明显降解。该结果与本实验目标产物诱导过程中蛋白酶含量一直低于检测线下相符。总之，该实验的结果表明：镁离子含量超过一定浓度时，发酵液中蛋白酶含量低于检测线，说明：镁离子对蛋白酶的产生有一定抑制作用。
图2-2结果显示：随着发酵时间延长，小肽条带并未出现明显变粗变深，而目标条带的颜色却越来越粗，且颜色加深，说明在该实验过程中，目标产物磷脂酶C未被蛋白酶降解，该现象与蛋白酶检测结果比较一致。
图2-3结果显示：随着发酵时间的延长，小肽（14.3kDa）条带逐渐加深加粗，而目标产物磷脂酶C的条带（约32kDa）却逐渐变细变浅，说明目标产物的生成速率小于蛋白酶降解目标产物的速率，而蛋白酶检测结果也显示该实验过程中，蛋白酶活力一直比较高。本实验中出现的目标产物被蛋白酶降解的问题是重组毕赤酵母表达外源蛋白过程中出现的常见问题之一，而尽管学者研究提出了众多的解决方法，如：采用蛋白酶缺失的毕赤酵母作为表达载体、发酵过 程中加酪氨酸等蛋白类物质供蛋白酶降解，从而减少目标产物的损失、调节pH等方法，但都只能部分缓解，并不能根本解决。而发酵液中蛋白酶的存在不仅在发酵过程中降解目标产物，而且对后期提取过程中酶活的稳定性影响非常大。
实施例6-13
采用发酵培养基1-2，按实施例2的方案，进行发酵培养，其中MgSO4。7H2O含量分别为23.34g/L（实施例6）、35g/L（实施例7）、46.68g/L（实施例8）、11.67g/L（实施例9）。
结果显示，与实施例9相比，实施例6-8的甲醇诱导期明显延长，发酵终点的发酵液中的PLC酶活明显提高，发酵液中总蛋白含量也明显提高，发酵液中蛋白酶含量明显下降；在发酵过程中，实施例9在不同时期蛋白降解严重，而实施例6-8的蛋白降解不明显。
采用发酵培养基1-3，按实施例2的方案，进行发酵培养，其中Mg O4。7H2O含量分别为23.34g/L（实施例10）、35g/L（实施例11）、46.68g/L（实施例12）、11.67g/L（实施例13）。
结果显示，与实施例13相比，实施例10-12的甲醇诱导期明显延长，发酵终点的发酵液中的PLC酶活明显提高，发酵液中总蛋白含量也明显提高，发酵液中蛋白酶含量明显下降；在发酵过程中，实施例13在不同时期蛋白降解严重，而实施例10-12的蛋白降解不明显。
实施例14-25、
采用发酵培养基2-1、2-2和2-3，按实施例2的方案，分别进行发酵培养，其中MgSO4。7H2O含量分别为23.34g/L、35g/L、46.68g/L、11.67g/L，具体如表2所示。
表2
| 培养基 | MgSO4。7H2O含量（g/L） | |
| 实施例14 | 发酵培养基2-1 | 23.34 |
| 实施例15 | 发酵培养基2-1 | 35 |
[0203]
| 实施例16 | 发酵培养基2-1 | 46.68 |
| 实施例17 | 发酵培养基2-1 | 11.67 |
| 实施例18 | 发酵培养基2-2 | 23.34 |
| 实施例19 | 发酵培养基2-2 | 35 |
| 实施例20 | 发酵培养基2-2 | 46.68 |
| 实施例21 | 发酵培养基2-2 | 11.67 |
| 实施例22 | 发酵培养基2-3 | 23.34 |
| 实施例23 | 发酵培养基2-3 | 35 |
| 实施例24 | 发酵培养基2-3 | 46.68 |
| 实施例25 | 发酵培养基2-3 | 11.67 |
结果显示，与MgSO4。7H2O含量为11.67g/L的实施例（实施例17、21、25）相比，MgSO4。7H2O含量更高的实施例（实施例14-16、18-20、22-24）的甲醇诱导期明显延长，发酵终点的发酵液中的PLC酶活明显提高，发酵液中总蛋白含量也明显提高，发酵液中蛋白酶含量明显下降；在发酵过程中，MgSO4。7H2O含量为11.67g/L的实施例（实施例17、21、25）在不同时期蛋白降解严重，而MgSO4。7H2O含量更高的实施例（实施例14-16、18-20、22-24）的蛋白降解不明显。
经与实施例2-5比较发现，实施例14-25的发酵时间（甲醇诱导期）与相同MgSO4.7H2O含量的发酵培养基1-1的结果无明显差异，例如，实施例14的发酵时间可达98小时（甲醇诱导期为68小时），酶活为16.8U/ml，与使用相同MgSO4.7H2O含量的发酵培养基1-1（实施例2）的结果无明显差异。
根据上述实验结果，在使用毕赤酵母表达PLC时，在常规用于毕赤酵母发酵的发酵培养基中，控制其中的MgSO4.7H2O的含量为15～50g/L（即MgSO4的含量为约7.3～23g/L），可以明显延长其诱导产酶期，明显提高发酵液的PLC酶活，和/或减少目的蛋白的降解。
实施例26-31、
为进一步考察其关键因素，分别使用MgCl2和Na2SO4代替实施例2-4中的部分MgSO4.7H2O，培养基中其余组分及含量与实施例2-4中相同，其中，MgSO4.7H2O、MgCl2和Na2SO4用量及培养基中Mg2+和SO42-含量如表3所示。
表3、实施例26-31的培养基中MgSO4.7H2O、MgCl2和Na2SO4用量及培养基中Mg2+和SO42-含量
| MgSO4.7H2O | MgCl2 | Na2SO4 | Mg2+ | SO42- | |
| 实施例26 | 11.67g/L | 4.75g/L | 0g/L | 2.3g/L | 4.6g/L |
| 实施例27 | 11.67g/L | 9.1g/L | 0g/L | 3.4g/L | 4.6g/L |
| 实施例28 | 11.67g/L | 13.9g/L | 0g/L | 4.6g/L | 4.6g/L |
| 实施例29 | 11.67g/L | 0g/L | 6.7g/L | 1.1g/L | 9.1g/L |
| 实施例30 | 11.67g/L | 0g/L | 13.5g/L | 1.1g/L | 13.7g/L |
| 实施例31 | 11.67g/L | 0g/L | 20.1g/L | 1.1g/L | 18.2g/L |
按实施例2的方案，分别进行培养和检测，结果显示：实施例26-28（即提高Mg2+含量）的效果明显优于实施例5的效果（PLC的产酶时间被有效延长，而且目的蛋白的稳定性得到提高，最终获得发酵液中的PLC的酶活得到较大提高），而实施例29-31（即提高SO42-含量）其效果与实施例5的效果无明显区别。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中Mg2+含量为1.5-4.6g/l。
2.一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基通过将常规培养基中Mg2+调节至1.5-4.6g/l而获得。
3.如权利要求1或2所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中，Mg2+含量为2.3～4.6g/l，优选为2.3～3.4g/L。
4.如权利要求1-3中任一项所述是发酵培养基，其特征在于，所述Mg2+来源于无机盐、有机盐或其组合，优选的，所述Mg2+来源于MgSO4，MgSO4.7H2O，MgCl2，MgCO3，Mg(HCO3)2，Mg(GH3COO)2·4H2O中的一种或多种。
5.一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中MgSO4含量为7.3～23g/L，优选为11.4-23g/L，更优选为11.4-17g/L。
6.一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基通过将常规培养基中MgSO4含量调节至7.3～23g/L，优选为11.4-23g/L，更优选为11.4-17g/L而获得。
7.如权利要求2-4、和6中任一项所述的发酵培养基，其特征在于，所述常规培养基为用于毕赤酵母发酵的培养基，优选为基础盐培养基或其改良培养基，优选的基础盐培养基为FM21或BSM。
8.如权利要求1-6中任一项所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中还包含：
30～50g/L甘油，0.6～1.2g/L CaSO4，10～20g/L K2SO4，6～12g/L(NH4)2SO4，0.1～0.2ml/L消泡剂，20-30g/L六偏磷酸钠，3～5ml/L微量元素浓缩溶液；或
30-50g/L甘油，15-30ml/L磷酸,0.6-1.2g/L CaSO4,15-20g/L K2SO4，3-5g/LKOH，0.1～0.2ml/L消泡剂，3～5ml/L微量元素浓缩溶液；
优选的，所述微量元素浓缩溶液为PTM微量元素浓缩溶液。
9.一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的方法，其特征在于，所述方法为控制用于毕赤酵母发酵的培养基中Mg2+为1.5-4.6g/l，优选为2.3～4.6g/l，更优选为，优选为2.3～3.4g/L。
10.一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1-9中任一项所述的发酵培养基培养所述毕赤酵母。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106916911A (zh) * | 2015-12-28 | 2017-07-04 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | Muts型重组毕赤酵母的发酵控制工艺 |
| CN109957520A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-07-02 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 外源基因表达用毕赤酵母菌株 |
| CN110862934A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-03-06 | 扬中酵诚生物技术研究有限公司 | 毕赤酵母高密度培养基及其制作工艺 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6284517B1 (en) * | 1999-05-28 | 2001-09-04 | Lawrence Restaino | Plating media for the presumptive identification of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis |
| CN101558154A (zh) * | 2006-09-21 | 2009-10-14 | 维莱尼姆公司 | 磷脂酶、编码它们的核酸及其制备和应用方法 |
| CN101570771A (zh) * | 2009-06-09 | 2009-11-04 | 华东理工大学 | 一种毕赤酵母基因工程菌发酵生产s-腺苷甲硫氨酸的方法 |
| CN102206616A (zh) * | 2011-01-20 | 2011-10-05 | 江南大学 | 蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶c的方法 |
| CN102807997A (zh) * | 2012-08-29 | 2012-12-05 | 太仓同济化工原料厂 | 一种利用树干毕赤酵母发酵戊糖己糖混合糖制备乙醇的方法 |
| CN103333912A (zh) * | 2013-06-19 | 2013-10-02 | 中国农业科学院饲料研究所 | 在Pichia pastoris中组成型表达菌丝霉素衍生物MP1102的方法 |
-
2013
- 2013-10-16 CN CN201310485354.5A patent/CN104560910B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6284517B1 (en) * | 1999-05-28 | 2001-09-04 | Lawrence Restaino | Plating media for the presumptive identification of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis |
| CN101558154A (zh) * | 2006-09-21 | 2009-10-14 | 维莱尼姆公司 | 磷脂酶、编码它们的核酸及其制备和应用方法 |
| CN101570771A (zh) * | 2009-06-09 | 2009-11-04 | 华东理工大学 | 一种毕赤酵母基因工程菌发酵生产s-腺苷甲硫氨酸的方法 |
| CN102206616A (zh) * | 2011-01-20 | 2011-10-05 | 江南大学 | 蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶c的方法 |
| CN102807997A (zh) * | 2012-08-29 | 2012-12-05 | 太仓同济化工原料厂 | 一种利用树干毕赤酵母发酵戊糖己糖混合糖制备乙醇的方法 |
| CN103333912A (zh) * | 2013-06-19 | 2013-10-02 | 中国农业科学院饲料研究所 | 在Pichia pastoris中组成型表达菌丝霉素衍生物MP1102的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KOOK-HWA SEO&JONG RHEE: "High level expression of recombinant phopholipase C from Bacillus cereus in Pichia pastoris and its characterization", 《BIOTECHNOLOGY LETTERS》 * |
| 刘菲菲: "微生物产磷脂酶C的筛选、发酵优化及重组表达", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106916911A (zh) * | 2015-12-28 | 2017-07-04 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | Muts型重组毕赤酵母的发酵控制工艺 |
| CN106916911B (zh) * | 2015-12-28 | 2021-06-29 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | Muts型重组毕赤酵母的发酵控制工艺 |
| CN109957520A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-07-02 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 外源基因表达用毕赤酵母菌株 |
| CN109957520B (zh) * | 2017-12-25 | 2022-12-09 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 外源基因表达用毕赤酵母菌株 |
| CN110862934A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-03-06 | 扬中酵诚生物技术研究有限公司 | 毕赤酵母高密度培养基及其制作工艺 |
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