CN105802934B - 一种磷脂酶c的保藏方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种保藏磷脂酶C的方法，在该保藏方法下磷脂酶C具备良好的酶活稳定性。本发明的磷脂酶C保藏方法用在磷脂酶C的实际应用过程中，可以降低生产能耗，同时避免磷脂酶C活力的损失。

Description

一种磷脂酶C的保藏方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种磷脂酶C的保藏方法。

背景技术

磷脂酶具备水解一个或多个甘油磷脂酯键的能力，它代表着一类脂肪酶、酰基水解酶和磷酸酯酶。磷脂酶根据该酶在磷脂分子上作用位点的不同，可以分为磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)(图1)。

磷脂酶C(Phospholipase C，简称PLC)，是一种能够水解甘油磷脂C3位点磷脂酰键生成甘油二酯和磷酸胆碱、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺等的脂类水解酶。磷脂酶C广泛存在于动植物和微生物中，动植物来源PLC一般位于细胞膜上，结构较为复杂，属于内源性磷脂酶C，难以分离。微生物来源的磷脂酶C结构一般较为简单，这些酶已经从各种微生物中分离得到，细菌来源的较多包括产气荚膜梭菌Clostridium perfringens[1]、双酶梭菌C.bifermentans、Burkholderia pseudomallei、Bacillus cereus、蕈状芽孢杆菌Bacillusmycoiddes、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis、单核细胞增多性李斯特氏菌Listeria monocytogenes、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、荧光假单胞菌P.fluorescens、葡萄球菌Straphylococus aureus、鲍氏不动杆菌Acinetobacterbaumannii、链霉菌Streptomyces clavuligerus、伯克氏菌属Burkholderi等等。来自放线菌的有八丈岛链霉菌Streptomyces hachijyoensis等。还有来自酵母菌的白色念珠菌Candia albicans[2]、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae[3]等。

目前，磷脂酶主要应用于酶法脱胶。在制造大豆、菜籽等食用油时，未经精炼的毛油主要含有甘油三酯、磷脂、甾醇、生育酚、游离脂肪酸、痕量金属以及其它微量化合物的复杂混合物。其中磷脂会造成色泽及口味变差、保质期变短并且影响后续的精炼效果。目前，主要的脱胶方式有水化脱胶、深度脱胶和酶法脱胶。酶法脱胶由于条件温和、无污染、油耗低，越来越受到人们的青睐。

磷脂酶C制剂一般在4℃条件下保藏，但在酶法脱胶的实际应用中，磷脂酶C常被置于单独的储罐中备用，由于环境温度相对较高，如果制冷保藏会产生较大的能耗，如果不制冷磷脂酶C的活力损失又很难避免。这就使开发一种经济有效的磷脂酶C保藏方法显得很有必要。

发明内容

本发明的第一方面在于，提供一种磷脂酶C的保藏方法，该方法为将磷脂酶C置于38-42℃条件下保藏。

在本发明的一个实施方案中，磷脂酶C在39-41℃下保藏。

在本发明的一个实施方案中，磷脂酶C在40℃下保藏。

在本发明的一个实施方案中，磷脂酶C来源于蜡样芽孢杆菌。

在本发明的一个实施方案中，磷脂酶C为液态制剂。

在本发明的一个实施方案中，磷脂酶C的保藏体系为弱酸缓冲液体系；所述弱酸缓冲液选自醋酸缓冲液(pH 5.0-6.5)、磷酸缓冲液(pH 5.5-6.5)等的一种或多种。

在本发明的一个实施方案中，磷脂酶C的保藏体系pH为5.0-6.5。

在本发明的一个实施方案中，磷脂酶C保藏体系为：弱酸缓冲液，其中还含有0.1-0.3wt％山梨酸钾、30-50wt％甘油和0.02-0.05wt％硫酸锌。

本发明的第二方面在于，提供一种本发明方法用于保藏磷脂酶C的用途。

本发明提供的磷脂酶C保藏方法，磷脂酶C的酶活稳定性显著提高，为磷脂酶C的工业应用提供基础。本发明提供的方法用在磷脂酶C的实际应用过程中，不仅可以降低生产能耗，也可避免磷脂酶C活力的损失。

附图说明

图1是不同磷脂酶在磷脂分子上作用位点示意图。

具体实施方式

本发明提供一种磷脂酶C的保藏方法，该方法为将磷脂酶C置于38-42℃条件下保藏。

在本发明的一个实施方案中，磷脂酶C在39-41℃下保藏。

在本发明的一个实施方案中，磷脂酶C在40℃下保藏。

在本发明的一个实施方案中，磷脂酶C来源于蜡样芽孢杆菌。

在本发明的一个实施方案中，磷脂酶C为液态制剂。

在本发明的一个实施方案中，磷脂酶C的保藏体系为弱酸缓冲液体系。应当理解的是，本发明中磷脂酶C的保藏体系不影响本发明的效果，仅为维持磷脂酶C的构象稳定及防腐，使用本领域常规的磷脂酶C保藏体系都可以达到本发明的效果。

在本发明的一个实施方案中，所述弱酸缓冲液选自：醋酸缓冲液(pH 5.0-6.5)、磷酸缓冲液(pH 5.5-6.5)等的一种或多种。

在本发明的一个实施方案中，磷脂酶C的保藏体系pH为5.0-6.5。

在本发明的一个实施方案中，磷脂酶C保藏体系为：弱酸缓冲液，其中还含有0.1-0.3wt％山梨酸钾、30-50wt％甘油和0.02-0.05wt％硫酸锌。

本发明中使用的磷脂酶C酶活检测方法为pNPPC法：

取两支干净的试管，其中一个做样品管，一个做空白对照管。每个试管中加入600ul对硝基苯酚磷酸胆碱(pNPPC)反应缓冲液(配方：0.1M硼酸-硼酸钠缓冲液(pH 7.6)，20mM pNPPC，1％TritonX-100，1mM CaCl2)，样品管加入25ul待测酶液，空白管不加，样品和空白同时放在37℃恒温水浴中反应15min，各加500ul 0.5mol/L的NaOH溶液终止反应，空白管中补加25ul待测酶液，410nm测定吸光度，用空白管校正零点。

酶活定义及计算公式

酶活力单位定义为：每分钟催化底物pNPPC释放出1μmol磷酸肌醇的酶量为1个酶活力单位(U)。

酶活计算：

其中，A：样品吸光度值K：标准曲线斜率

Vt：反应总体积(ml)Vo：加酶量(ml)

t：反应时间(h)

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1、磷脂酶C的准备

1.工程菌构建

出发菌株为毕赤酵母SMD1168(购自Invitrogen公司)，按照毕赤酵母表达手册(Pichia Expression Kit，Invitrogen)，转入蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的磷脂酶C基因(GENBANK WP_000731010)，构建工程菌作为生产菌株。

2.磷脂酶C的发酵

其中使用的培养基和溶液组成如下：

种子摇瓶培养基：酵母膏(10g/L)、胰蛋白胨(20g/L)、甘油(20g/L)。

发酵基础培养基：甘油(50g/L)、硫酸钙(0.9g/L)、硫酸钾(14.67g/L)、硫酸镁(11.67g/L)、硫酸铵(9g/L)。

微量元素PTM1溶液：CuSO4·5H2O(6.0g/L)、NaI(0.08g/L)、MnSO4·H2O(3.0g/L)、Na2Mo4·2H2O(0.2g/L)、ZnCl2·5H2O(20.04g/L)、FeSO4·7H2O(65.05g/L)、H3BO3(0.02g/L)、H2SO4(19.2ml/L)、生物素(0.4g/L)。

重组毕赤酵母生产菌株在种子摇瓶培养基中30℃培养20h，然后按接种量1％接种于含六偏磷酸钠(25g/L)和微量元素PTM1溶液(4ml/L)的基础培养基中。菌种经过一段适应期后进入指数生长期，自动流加浓氨水控制pH5.5，当发酵培养基中的甘油耗尽后，此时DO陡然上升，开始流加含12ml/L PTM1的500g/L的甘油补料液，温度控制在30℃。

当细胞湿重达到220-250g/L后，停止甘油补加，然后补入含12ml/L PTM1甲醇诱导培养液，在初始的0-6h内控制发酵液DO为20-60％，待菌体适应甲醇后，维持DO20％左右，继续培养2-5天，温度控制在28℃。

3.磷脂酶C的提取制备

在4℃，经8000rpm离心20min后，收集上清液；

将收集到的上清液进行微滤澄清处理，所选用的微滤膜孔径为0.2μm，室温下操作，压力0.1MPa，透出液流速40-45ml/min，收集透出澄清液；

选用10kDa的超滤膜将澄清液浓缩至原体积10％，透出液流速30-35ml/min，压力0.1MPa；

用20mM醋酸缓冲液(pH 5.5)对浓缩液进行置换，透出液流速30-35ml/min，压力0.1MPa，获得置换后酶液；

向置换后酶液中加入0.1wt％山梨酸钾、35wt％甘油和0.03wt％硫酸锌，酶活控制在150U/ml左右，蛋白含量为40mg/ml，得到磷脂酶C液态制剂。

实施例2、40℃保藏磷脂酶C

将实施例1获得的磷脂酶C制剂置于40℃条件下保藏，每5天取出样品检测其剩余酶活。检测结果见表1。

表1

结果显示，在40℃下保藏磷脂酶C，磷脂酶C在保藏40天内酶活基本维持不变，说明在40℃下保藏，磷脂酶C具备良好的保藏稳定性。

实施例3、38℃保藏磷脂酶C

将实施例1获得的磷脂酶C制剂置于38℃条件下保藏，每5天取出样品检测其剩余酶活。检测结果见表2。

表2

结果显示，在38℃下保藏磷脂酶C，磷脂酶C在保藏30天内酶活基本维持不变，说明在38℃下保藏，磷脂酶C具备良好的保藏稳定性。

实施例4、42℃保藏磷脂酶C

将实施例1获得的磷脂酶C制剂置于42℃条件下保藏，每5天取出样品检测其剩余酶活。检测结果见表3。

表3

42℃保藏天数d	0	5	10	15	20	25	30
								剩余酶活百分比％	100	97	93	94	91	92	90

结果显示，在42℃下保藏磷脂酶C，磷脂酶C在保藏30天内酶活基本维持不变，说明在42℃下保藏，磷脂酶C具备良好的保藏稳定性。

实施例5、30℃保藏磷脂酶C

将实施例1获得的磷脂酶C制剂置于30℃条件下保藏，每5天取出样品检测其剩余酶活。检测结果见表4。

表4

30℃保藏天数d	0	5	10	15	20	25	40
								剩余酶活百分比％	100	101	90	78	72	63	46

结果显示，在30℃下保藏磷脂酶C，磷脂酶C活性15天后显著下降。

实施例6、50℃保藏磷脂酶C

将实施例1获得的磷脂酶C制剂置于50℃条件下保藏，每一小时取出样品检测其剩余酶活。检测结果见表5。

表5

50℃保藏时间h	0	1	2	3	4	5
							剩余酶活百分比％	100	100	99	101	88	49

结果显示，在50℃下保藏磷脂酶C，磷脂酶C活性在保藏5小时后就显著下降。

实施例7、35℃保藏磷脂酶C

将实施例1获得的磷脂酶C制剂置于35℃条件下保藏，每5天取出样品检测其剩余酶活。检测结果见表6。

表6

35℃保藏时间d	0	5	10	15	20
						剩余酶活百分比％	100	89	78	58	46

结果显示，在35℃下保藏磷脂酶C，磷脂酶C活性10天后显著下降。

实施例8、45℃保藏磷脂酶C

将实施例1获得的磷脂酶C制剂置于45℃条件下保藏，每5天取出样品检测其剩余酶活。检测结果见表7。

表7

45℃保藏时间d	0	5	10	15
					剩余酶活百分比％	100	56	32	12

结果显示，在45℃下保藏磷脂酶C，磷脂酶C活性5天后显著下降。

以上实施例结果表明，在38-42℃条件下保藏磷脂酶C，磷脂酶C具有很好的酶活稳定性。

Claims (8)

1.一种磷脂酶C的保藏方法，其特征在于，磷脂酶C在38-42℃下保藏，所述磷脂酶C为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的磷脂酶C，其基因如GENBANK WP_000731010所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，磷脂酶C在39-41℃下保藏。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，磷脂酶C在40℃下保藏。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂酶C为液态制剂。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂酶C的保藏体系为弱酸缓冲液体系。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂酶C的保藏体系选自：醋酸缓冲液、磷酸缓冲液的一种或几种。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂酶C保藏体系pH为5.0-6.5。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂酶C保藏体系为弱酸缓冲液，其中还含有0.1-0.3wt％山梨酸钾、30-50wt％甘油和0.02-0.05wt％硫酸锌。

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