CN1408872A - 一种重组人角质细胞生长因子的质粒载体、其宿主及制备重组人角质细胞生长因子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组人角质细胞生长因子或其等位变异体的质粒载体、其大肠杆菌宿主及重组人角质细胞生长因子的制备方法。该重组质粒载体含有：重组的人KGF或KGF衍生序列，与编码KGF的基因相连接的编码lacZ酶N端17个氨基酸的一个顺反子，噬菌体P_L启动子。本发明构建的质粒载体可在大肠杆菌中高效表达人KGF。

Description

一种重组人角质细胞生长因子的质粒载体、其宿主 及制备重组人角质细胞生长因子的方法

技术领域

本发明涉及一种重组人角质细胞生长因子或其等位变异体的质粒载体，具体地说涉及一种重组人角质细胞生长因子及其变异体的双顺反子表达质粒。

本发明还涉及由本发明质粒转化的宿主细胞。

本发明还涉及制备重组人角质细胞生长因子及其变异体的方法。

背景技术

角质细胞生长因子(KGF)是目前已知的最强的促使源于间充质组织的非成纤维上皮细胞(特别是角质细胞)增殖的效应物。KGFmRNA的组织学分布有其特殊性：来自胚胎、新生儿和成人皮上组织的几种基质成纤维细胞系中有KGFmRNA的表达，在人肾脏、胃肠道中也有表达，而在胶质细胞、肺、脑、和各种上皮细胞(包括鳞状细胞癌、永生的支气管上皮细胞，永生的角质细胞和原代角质细胞培养物)中未检测到KGFmRNA。KGFmRNA的这种组织学分布提示KGF在真皮中产生而不在皮下。KGF对连续的小鼠细胞系BALB/MK细胞具有促有丝分裂作用，角蛋白和filagrim基因的表达也证实KGF影响角质细胞的分化和成熟，这些证据证明KGF作用于角质细胞，影响角质细胞的分化和成熟(Rubin etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：802-806(1989)；Finch etal.，science，245：752-755(1989)；Marchese etal.，J.Cell.Phys.144：326-332(1990))。KGF除对角质细胞有刺激作用外，对非角质细胞上皮细胞也有刺激作用：在体内，KGF诱导正常皮肤附属结构(如皮质细胞和毛囊细胞)，肝脏细胞(如肝细胞)和呼吸性膜上皮细胞(如II型肺细胞)的增生和分化，刺激肠黏膜细胞(如胃腺小肠腺产黏蛋白的杯状细胞，结肠的隐窝细胞和肠道内的其它上皮细胞)的增生和生长(公开的PCT专利申请WO94/23032)。

KGF在皮肤损伤后的组织修复过程中起重要作用。在伤口愈合时，KGFmRNA在基底角质细胞中的诱生160倍，而aFGF、bFGF和FGF-5仅诱生2到10倍，而FGF-3、FGF-4、FGF-6无论是在正常的还是在损伤的皮肤中都没有表达。在一猪的皮肤损伤模型上，KGF能显著促进皮肤再生。

KGF的变异体，这些变异体如N端缺失23个氨基酸的KGF，具有天然KGF的生物学活性，其生物学活性甚至比天然的KGF还高，在专利US patent5843883中做了详尽的描述。

基于KGF的生物学作用，KGF可望应用于治疗或预防放化疗引起的消化道损伤，以及其他形式的消化道黏膜病损及其他疾病。

目前制备KGF的方法是采用基因工程方法。公开的PCT专利申请WO90/108771描述了从人胚胎成纤维的细胞条件培养基中纯化KGF，分离的多肽之部分氨基酸测序，该基因的克隆及在细菌细胞中表达以得到重组的具生物学活性的KGF。公开的PCT专利申请WO96/11951描述了KGF蛋白的新型类似物，以及这些新型类似物基因的克隆及在大肠杆菌(E.coli)中的表达。

在大肠杆菌中表达人KGF及其变异体，因表达产物对大肠杆菌有毒性(Ron et al，J.Biol.Chem.268(4)：2984-2988)，表达出的KGF及其变异体在菌体中累积不多，且必须通过严格控制基础表达来控制杂菌的产生从而获得表达。Ron等用T7启动子表达KGF及其变异体，用BL21(DE3)pLysE菌株作为宿主菌以降低基础表达。相对其它的启动子，T7启动子启动转录的能力最强，而且BL21(DE3)宿主菌对毒性蛋白的耐受性也比较好，BL21(DE3)还是一种蛋白酶缺陷型菌株，但所获得的KGF或KGF变异体的表达量也只占总蛋白的2％以下(Ron et al，J.Biol.Chem.268(4)：2984-2988)。US patent9513075中描述的表达方法用的是低基础表达的P_L启动子，所用的表达质粒在低温(30℃)培养时拷贝数非常低，从而进一步降低了基础表达。US patent5707805描述了用trk启动子表达KGF，这种启动子的基础表达相对较高，但所用的表达质粒pKK233-2是一种低拷贝数的质粒从而在一定程度上降低了基础表达。

发明内容

本发明提供了一种含有重组人角质细胞生长因子基因或其等位变异体的质粒载体，该重组质粒载体含有：重组的人KGF或KGF衍生序列，与编码KGF的基因相连接的编码lacZ酶N端17个氨基酸的一个顺反子，噬菌体P_L启动子。在本发明的一个较佳实施方案中，该重组质粒含有用PCR方法从中国人包皮组织中得到的KGF cDNA。

本发明的另一目的是提供了由上述的表达重组人KGF或其变异体的重组质粒所转化大肠杆菌宿主细胞。

本发明的再一目的是提供一种利用铜离子在大肠杆菌中表达重组人KGF或其变异体的方法，该方法包括：在含有1-10mM的培养基中培养能够表达人KGF或其变异体的大肠杆菌菌株，表达出的KGF或其变异体以可溶性形式存在，分离纯化表达产物，得到重组KGF或其变异体蛋白。在一个较佳例子中，该大肠杆菌菌株为GI724/pLacKGF。

根据本发明的一方面，本发明提供的表达质粒是在invitrogen公司的pTrxFus表达系统的基础上构建的，invitrogen公司的pTrxFus表达系统具有低基础表达的特性，这种特性由两方面决定：一方面此表达系统使用的是低基础表达的P_L启动子，另一方面在未诱导表达时菌体在低温(30℃)培养，表达质粒的拷贝数较低，降低了基础表达。在此基础上我们作了改进，引入双顺反子表达方法。双顺反子表达方法就是在编码目的蛋白的基因之前引入另一易于表达的编码较短氨基酸序列的(一般在20个氨基酸以内)一段DNA序列，从而克服目的基因内不利的二级结构对翻译起始的影响，获得目的基因的有效表达。有多种方法克服翻译起始区不利二级结构对翻译的影响，比如通过对翻译起始区内的序列进行改造，但这种改造依赖于不太精确的计算机mRNA二级结构预测，因此改造结果难以预料，而双顺反子表达方法是一种比较有效的方法，其原理在于前导顺反子的有效翻译能打开后续顺反子内的不利二级结构。所以本发明提供的表达质粒pLacKGF不仅可用于表达KGF及其变异体，在表达质粒内导入其它基因也可用于表达其它的蛋白。

根据本发明的另一方面，适用于本发明的宿主细胞为大肠杆菌，优选为大肠杆菌GI724和GI698菌株。表达质粒的转化可采用常规的方法，用pLacKGF转化GI724，经反复筛选，获得高表达的稳定的菌株。

根据本发明的又一方面，在通过表达载体制备重组人角质细胞生长因子的方法中，因表达的KGF或其变异体对大肠杆菌有毒，如克服这种毒性，对表达将更有利。在培养基中加入适当浓度的铜离子有助于某些重组蛋白的表达，在US patent 5523215中对此作了详尽描述，但在此专利中重组蛋白都以包涵体形式存在，重组蛋白至少要有一个以上的半胱氨酸，而且培养基必须高度通气及富氧化。铜离子在重组变性蛋白的复性中常用做氧化剂，因此此篇专利中在培养基中加入铜离子提高了培养基的氧化能力，间接提高细胞内的氧化性，有利于表达的蛋白之间形成分子间二硫键从而形成包涵体。本发明在培养基中加入铜离子有利于KGF及其变异体的表达，但表达的KGF及其变异体是以可溶性形式存在，而不是以不可溶的包涵体形式存在，与USpatent 5523215中的描述不同，铜离子起作用的机理与US patent 5523215中的机理并不相同，可能与其增强细胞色素酶的活性，提高细胞代谢能力有关。加入铜离子后，细菌的生长速率提高，诱导时至细菌生长停滞时这一段时间间隔延长，最终的表达量和细菌得率都比未加铜离子的高。在实施例四中比较了在培养基中加铜离子与不加铜离子得到的结果。铜离子的这种作用可能也有助于在大肠杆菌中表达其它对大肠杆菌有毒性的外源蛋白。

可用多种方法使转化表达载体的菌株GI724/pLacKGF或GI698/pLacKGF表达KGF，在本发明的一个优选方案中培养基(特别是诱导前的培养基)用甘油作碳源。在invitrogen公司的说明书中建议用葡萄糖作碳源，US patent5760189中描述的用类似的表达体系制备重组IL-11的方法中也用葡萄糖作碳源，在我们的实验中发现用此套表达体系不利于表达KGF及其变异体。在实施例四中作了具体描述。

表达KGF及其变异体以可溶性形式存在，随后的纯化工艺设计充分利用了KGF的特性：KGF能结合肝素，而且是一极碱性蛋白，在本发明的一个优选实施方案中给出了一种用肝素亲和层析柱和SP柱纯化KGF的方法，实施例五中纯化方法二给出一种用两步阳离子柱纯化KGF的方法，结合凝胶过滤层析等方法最终得到的KGF纯度大于95％。

附图的简要说明

图1示出本发明的一个实施例中表达KGF的重组质粒pLacKGF的图谱。标明了成熟KGF的编码序列，复制子ColE1，氨苄青霉素抗性(Amp^R)的bla基因，P_L启动子，term转录终止子，前导顺反子Lac的元件：ATG＝ATG起始密码子，RBS＝核糖体结合位点，Leader＝编码MTMITNSSSVPGDPLEI的序列(SEQ ID NO.2)，TAA＝TAA翻译终止密码子。

图2示出本发明的一个实施例中构建的重组质粒pLacKGF中的双顺反子片段的核苷酸序列及相应的氨基酸序列。

图3示出本发明的另一实施例中表达ΔN23 KGF的重组质粒pLacΔN23KGF的图谱。图谱中所有元件的说明除用ΔN23 KGF(SEQ ID No.3)代替KGF外，其它均于图1中描述的相同。发明的详细描述

以下通过实施例来进一步阐述本发明，实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照厂商所建议的条件。实施例一表达人KGF的重组质粒pLacKGF的构建1中国人角质细胞生长因子cDNA的克隆

取行包皮切割病人手术后的包皮组织，按invitrogen公司动物细胞总RNA提取试剂盒操作说明提取包皮组织的总RNA，以KGFP1(5’TAAGAAGGAGATATACATATGTGCAAT GACATGACTCCAGAGCA)和KGFP2(5’GAGTCGACTTAAGTTATTGCCATAGGAAGA AA)为引物，按Pharmacia公司的RT-PCR试剂盒的操作说明，进行RT-PCR扩增。将扩增产物(500bp左右)与大连宝生物公司的T克隆载体pMD18-T连接，用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α，挑取白色菌落进行鉴定。

挑取白色菌落，用RV-M(5’AGCGGATAACAATTTCACACAGG)和KGFP2为引物进行PCR鉴定，挑取能扩增出500bp左右片段的菌落，过夜培养后，以常规快速质粒提取法提取质粒，用NdeI和SalI双酶切鉴定，挑取能酶切出500bp片段的质粒，命名为pMD18KGF，以M13-47(5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)为引物进行全自动序列测定，测序结果表明克隆到的KGF cDNA序列正确。2表达人KGF的重组质粒pLacKGF的构建

以pMD18KGF为模板，以RV-M和KGFP2为引物进行PCR扩增，将扩增得到的500bp左右产物用Sal I酶切后备用。Invitrogen公司出售的质粒pTrxFus，经Nde I酶切后用Klenow酶补平，最后用Sal I酶切，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，电泳分离出360bp左右片段和3.4kbp左右片段，用invitrogen公司的凝胶回收试剂盒回收3.4kbp左右片段，将其与上述经Sal I酶切的PCR产物连接，转化大肠杆菌GI724(购自Invitrogen公司)，以KGFP1和KGFP2为引物用PCR法筛选菌落，阳性菌落培养后提取质粒，再用Nde I和Sal I双酶切鉴定，鉴定正确的质粒以TrxR(5’TGTAAAACGACGGCCAGTGC)为引物进行全序列测定，测序结果证实重组质粒pLacKGF具有如下特征：在原pTrxFus质粒的Nde I位点和Sal I位点间插入了SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1组成的SEQ ID NO.4的序列。

在SEQ ID NO.4序列中，原Nde I位点CATATG突变为CATATA(1-6nt)，第37碱基至第87碱基为编码第一顺反子的序列(编码17个氨基酸：MTMITNSSSVPGDPLEI)，在此顺反子之前有一核糖体结合位点AGGA(26nt-29nt)，在此顺反子之后为终止密码子TAA，随后是另一核糖体结合位点GAAGGAGA(91nt-98nt)，接着第106nt至第600nt编码KGF蛋白，在终止密码子TAA后是Sal I酶切位点。

实施例二表达人KGF变异体ΔN23 KGF的重组质粒pLacΔN23 KGF的构建

以KGFP3(5’GCACATATGAGTTATGATTACATG)和KGFP2为引物，质粒pMD18KGF为模板进行PCR扩增，扩增产物用Nde I和Sal I双酶切后备用。将pLacKGF用Nde I和Sal I双酶切，回收酶切得到的3.4kbp左右片段，与上述经酶切的PCR扩增产物连接，转化入GI724，以KGFP3和KGFP2为引物用PCR法筛选菌落，阳性菌落培养后提取质粒，再用Nde I和Sal I双酶切鉴定，鉴定正确的质粒以TrxR(5’TGTAAAACGACGGCCAGTGC)为引物进行全序列测定，测序结果正确(SEQ ID NO.3)。

实施例三工程菌的建立

选用大肠杆菌GI724为宿主菌，用氯化钙法制备感受态细胞，将pLacKGF转化入感受态细胞，涂在含100ug/ml氨苄青霉素的M9CA(1×M9，2％Caseinhydrolysate，1％glyceroin，1.5％agrose)平板上，重组菌落用含100ug/ml氨苄青霉素的M9CA培养基在30℃培养，经筛选后建立表达人KGF的工程菌GI724/pLacKGF，原始菌种用含15％甘油的M9CA培养基保存于-70℃，工程菌在含氨苄青霉素的M9CA平板上生长呈典型的大肠杆菌菌落特征，此工程菌每传20代作一次图谱分析，结果与原始菌种一致。实施例四发酵种子菌培养：

保存的GI724/pLacKGF菌株接种入250ml含100ug/ml氨苄青霉素的M9CA培养基，在1升摇瓶中于30℃培养15小时左右，接种入3升发酵培养基中。7升发酵罐培养：

发酵培养基(3升)：

            Na2HPO4·7H2O                    18g

            KH2PO4                           9g

            Na2SO4                           2g

            KCl                              1.5g

            酸水解干酪素                     30g

            甘油                             15ml

            MgSO4                            1.8g

            CaCl2                            0.054g

            ZnCl2                            0.02g

            Trace metal                      5ml

            复合维生素液                     2 ml

            氨苄青霉素                       3g

Trace metal(1 liter)：

                Citric acid                      5g

                CoCl2·6H2O                      2g

                MnCl2·4H2O                      12g

                CuSO4·5H2O                      1.85g

            H3BO3                                 2.5g

            (NH4)6Mo7O24·4H2O                    1.32g

            FeCl3·6H2O                           3.4g

复合维生素液(1升)：

            维生素B1                              20g

            维生素B12                             200mg

            维生素B6                              2.5g

            维生素B2                              1.0g

            生物素                                12.5mg

发酵参数：培养温度30℃，pH控制在6.8-7.2，灌压为常压，通气量2vvm，溶解氧通过控制搅拌速率或通纯氧控制在10％以上。

当培养至菌密度为OD660＝4左右时(大约在接种后4.5小时)，加入诱导物(1克色氨酸)和30毫升100mM CuCl2，生温至36℃，继续培养，根据养分消耗情况补充酸水解干酪素、甘油和酵母抽提物，直至菌体生长停滞，大约在诱导后5小时，终发酵菌密度在OD660＝20左右，离心收集菌体，冻存于-70℃保存备用。

在另一实验中，在诱导时不加入铜离子，发酵结果与加铜离子的实验比较如表1：

            表1铜离子对发酵的影响

	诱导时加入Cu++	诱导时不加入Cu++
			诱导时菌密度OD660	3.5	4.0
诱导后最高生长速率μ	0.5	0.4
			诱导时至生长停滞时的时间(h)	5	3
终发酵菌密度OD660	22	12
			表达量	2-3％	＜1.5％

由上表可见，在诱导的同时加入铜离子，提高了生长速率，延长了出现生长停滞的时间，提高了终发酵菌密度，提高了表达量，从而提高了表达产量。为避免较高密度发酵时参数不易控制，此两项实验我们有意在低菌密度诱导以使结果容易进行比较。将诱导时间推后，在菌密度为6左右诱导，终发酵菌密度为40，表达量在2-3％。

在另一实验中，我们用葡萄糖代替甘油作为碳源，起始培养基中含0.2％葡萄糖，0.2％酸水解干酪素，0.2％酵母抽提物，培养至菌密度为OD660＝5左右时(还未诱导)菌体生长停滞，说明用葡萄糖作碳源对于本表达系统是不利的，可能提高了基础表达的量，从而导致菌体死亡。因此用本表达方法制备KGF及其变异体，最好用甘油作为培养基中的碳源。实施例五重组KGF的制备

纯化方案一

菌体按10％的量悬浮于裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，2mM EDTA，200mMNaCl，pH7.5)，冰浴下超声破碎，破碎液用9000g离心力离心30分钟除去细胞残渣，取出上清作为粗样作以下纯化。

肝素亲和层析柱用缓冲液A1(10mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH7.5)预先平衡好，将上述粗样过此柱，然后用缓冲液A1冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后以缓冲液A1为流动相加0-1N NaCl梯度进行梯度洗脱，分部收集洗脱液，用12％SDS-PAGE证实含目的蛋白的各分部收集样品(这些样品集中在0.5N NaCl洗脱峰处)，合并这些收集样品，用稀释液(50mMphosphate，pH6.8)稀释至电导约为0.2，过SP柱，SP柱预先用缓冲液A2(50mMNaPO4，200mM NaCl，pH6.8)平衡好，然后以缓冲液A2为流动相加0-0.5NNaCl梯度进行梯度洗脱，分部收集，用12％SDS-PAGE证实含目的蛋白的各分部收集样品(这些分部收集样品大概集中在0.45N NaCl洗脱峰处)，合并这些收集样品并用截留分子量为10,000的膜片进行超滤浓缩。

上述浓缩液上样至Sephacryl S-200柱，柱子预先用平衡液(20mM NaPO4，150mM NaCl，Ph7.2)平衡好，待样品完全进入胶中后，用平衡液从此凝胶过滤介质中洗脱出蛋白质，回收那些含目的蛋白的收集液。

纯化方案二

菌体按10％的量悬浮于裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，2mM EDTA，200mMNaCl，pH7.5)，冰浴下超声破碎，破碎液用9000g离心力离心30分钟除去细胞残渣，取出上清作为粗样作以下纯化。

粗样上样至SP柱，SP柱预先用缓冲液A3(20mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH7.5)平衡好，然后用缓冲液A3冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后作阶段梯度洗脱，先用缓冲液A4(20mM Tris-HCl，400mM NaCl，pH7.5)洗脱，后用缓冲液A5(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.5)洗脱(SDS-PAGE证实目的蛋白在此梯度被洗脱出来)。分部收集洗脱液，用12％SDS-PAGE证实含目的蛋白的各分部收集样品，合并这些收集样品，加入等体积的去离子水，然后上样至另一SP柱，次柱预先用缓冲液A6(50mM NaPO4，350mMNaCl，pH6.8)平衡好，然后以缓冲液A6为流动相加0-0.3N NaCl梯度进行梯度洗脱，分部收集，用12％SDS-PAGE证实含目的蛋白的各分部收集样品，合并这些收集样品并用截留分子量为10,000的膜片进行超滤浓缩。

上述浓缩液上样至Sephacryl S-200柱，柱子预先用平衡液(20mM NaPO4，150mM NaCl，Ph7.2)平衡好，待样品完全进入胶中后，用平衡液从此凝胶过滤介质中洗脱出蛋白质，回收那些含目的蛋白的收集液。

纯化得到的重组KGF蛋白，纯度都大于95％，采用BALB/MK角质细胞株进行体外生物学活性测定，两种纯化方法所得的KGF蛋白的活性没有明显差别，ED50在3ng/ml左右，与Ron等报道的相似(Ron et al，J.Biol.Chem.268(4)：2984-2988)。Ron等得到的纯化产物中有一免疫印迹(Westernblotting)呈阳性的片段(用抗完整KGF的抗体)，SDS-PAGE分子量为16-17KD(而另一免疫印迹阳性片段的SDS-PAGE分子量为21KD)，具同样生物学活性。此片段用抗KGF33-44氨基酸抗体做免疫印迹呈阴性，提示此片段为重组KGF的降解产物。但这种现象在我们的实验中并不存在，用购自SantCruze公司的抗完整人KGF抗体所做的免疫印迹显示：无论是表达总菌体、纯化过程中的中间样品，还是终纯化产物，免疫印迹方法只检测到一个条带，此条带的分子量在常规的SDS-PAGE凝胶电泳上为21KD，而不是理论上的18KD，这种现象与Ron等的报道一致。实施例六重组KGF蛋白的体外生物学活性测定

BALB/MK角质细胞在培养基(50％Eagle’s low-Ca2+MEM，50％Ham’sF-12 medium，5ug/ml转铁蛋白，5ng/ml亚硒酸钠，0.0005％HAS，0.005％吐温20)中于37℃培养，维持培养箱中CO2在10％，湿度在99％。以5×103个细胞每孔接种入用1ug/cm2 fibronectin预处理的12孔培养板上，加1ml培养基进行培养，每隔2天更换培养基。八天后，KGF蛋白样品(用含2％胶原的PBS溶液稀释)加入培养基中，继续培养17个小时，更换培养基，洗涤一次，然后加入1ml含25μCi[3H]thymidine的培养基，继续培养6个小时。然后去处培养基，洗涤，用1ml 0.1％SDS在37℃溶解一个小时，在4℃以12000rpm离心10分钟，取上清，加入1ml预冷的200mg/ml三氯乙酸，混匀，冰浴30分钟，在4℃以12000rpm离心10分钟，去除上清，沉淀用1ml 1N NaOH溶解，然后用液闪仪测定放射强度。用本方法测定我们纯化到的KGF蛋白，ED50在3ng/ml左右，与Ron等报道的相似(Ron et al，J.Biol.Chem.268(4)：2984-2988)。活性测定结果见表2。

表2重组KGF蛋白对BALB/MK角质细胞的有丝分裂原活性

处  理                             [³H]-胸腺嘧啶掺入量cpm

对  照                             216±60

rKGF(1ng/ml)                       5817±1153

rKGF(5ng/ml)                       13659±2036

rKGF(10ng/ml)                      24873±3984

rKGF(50ng/ml)                      21000±4025

以上对本发明较佳实施例的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明的范围。

                        SEQUENCE LISTING<110>上海汉殷药业有限公司

 昆明博赛科技有限公司<120>一种重组人角质细胞生长因子的质粒载体、其宿主及制备重组人角质细胞生长因子的方法<130>PI011118<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>489<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>misc_feature<223>编码人成熟角质细胞生长因子<400>1tgcaatgaca tgactccaga gcaaatggct acaaatgtga actgttccag ccctgagcga    60cacacaagaa gttatgatta catggaagga ggggatataa gagtgagaag actcttctgt    120cgaacacagt ggtacctgag gatcgataaa agaggcaaag taaaagggac ccaagagatg    180aagaataatt acaatatcat ggaaatcagg acagtggcag ttggaattgt ggcaatcaaa    240ggggtggaaa gtgaattcta tcttgcaatg aacaaggaag gaaaactcta tgcaaagaaa    300gaatgcaatg aagattgtaa cttcaaagaa ctaattctgg aaaaccatta caacacatat    360gcatcagcta aatggacaca caacggaggg gaaatgtttg ttgccttaaa tcaaaagggg    420attcctgtaa gaggaaaaaa aacgaagaaa gaacaaaaaa cagcccactt tcttcctatg    480gcaataact                                                            489<210>2<211>104<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>前导顺反子<400>2tagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgaat tcgagctcgg    60tacccgggga tcctctagag atttaagaag gagatataca tatg                     104<210>3<211>420<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>misc_feature<223>编码人氨基端缺失23个氨基酸的角质细胞生长因子ΔN23 KGF<400>3agttatgatt acatggaagg aggggatata agagtgagaa gactcttctg tcgaacacag    60tggtacctga ggatcgataa aagaggcaaa gtaaaaggga cccaagagat gaagaataat    120tacaatatca tggaaatcag gacagtggca gttggaattg tggcaatcaa aggggtggaa    180agtgaattct atcttgcaat gaacaaggaa ggaaaactct atgcaaagaa agaatgcaat    240gaagattgta acttcaaaga actaattctg gaaaaccatt acaacacata tgcatcagct    300aaatggacac acaacggagg ggaaatgttt gttgccttaa atcaaaaggg gattcctgta    360agaggaaaaa aaacgaagaa agaacaaaaa acagcccact ttcttcctat ggcaataact    420<210>4<211>606<212>DNA<213>人工序列<220><221>mutation<222>(6)..(6)<223>G to A<220><221>RBS<222>(26)..(29)<223><220><221>RBS<222>(91)..(98)<223><220><221>CDS<222>(37)..(87)<223>顺反子<220><221>CDS<222>(106)..(600)<223>编码人角质细胞生长因子<400>4catatagcgg ataacaattt cacacaggaa acagct atg acc atg att acg aat    54

                                    Met Thr Met Ile Thr Asn

                                     1                5tcg agc tcg gta ccc ggg gat cct cta gag att taagaaggag atatacat    105Ser Ser Ser Val Pro Gly Asp Pro Leu Glu Ile

        10                   15atg tgc aat gac atg act cca gag caa atg gct aca aat gtg aac tgt    153Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys

     20                  25                  30tcc agc cct gag cga cac aca aga agt tat gat tac atg gaa gga ggg    201Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

35                   40                 45gat ata aga gtg aga aga ctc ttc tgt cga aca cag tgg tac ctg agg    249Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg50               55                     60                  65atc gat aaa aga ggc aaa gta aaa ggg acc caa gag atg aag aat aat    297Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn

            70                  75                  80tac aat atc atg gaa atc agg aca gtg gca gtt gga att gtg gca atc    345Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile

        85                   90                  95aaa ggg gtg gaa agt gaa ttc tat ctt gca atg aac aag gaa gga aaa    393Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys

   100                  105                  110ctc tat gca aag aaa gaa tgc aat gaa gat tgt aac ttc aaa gaa cta    441Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu

115                 120                 125att ctg gaa aac cat tac aac aca tat gca tca gct aaa tgg aca cac    489Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His130                 135                 140                  145aac gga ggg gaa atg ttt gtt gcc tta aat caa aag ggg att cct  gta    537Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val

            150                 155                 160aga gga aaa aaa acg aag aaa gaa caa aaa aca gcc cac ttt ctt cct     585Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro

        165                 170                 175atg gca ata act  taa gtcgac                                         606Met Ala  Ile Thr

     180<210>5<211>17<212>PRT<213>人工序列<400>5Met Thr Met Ile Thr Asn Ser Ser Ser Val Pro Gly Asp Pro Leu Glu1               5                   10                  15Ile<210>6<211>164<212>PRT<213>人工序列<400>6Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys1                5                  10                  15Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

        20                  25                  30Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg

    35                  40                  45Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn

50                  55                  60Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile65                  70                  75                  80Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys

            85                  90                  95Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu

        100                 105                 110Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His

    115                 120                 125Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val

130                 135                 140Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro145                 150                 155                 160Met Ala Ile Thr

Claims (16)

1.一种重组人角质细胞生长因子或其变异体的质粒载体，其特征在于它包括：

一表达人角质细胞生长因子的基因序列或其等位变异体；

一顺反子序列，与所述表达人角质细胞生长因子的基因序列或其等位变异体连接；

一启动子，与所述顺反子序列连接。

2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于所述表达人角质细胞生长因子的基因序列为SEQ ID NO.1所示DNA。

3.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于所述表达人角质细胞生长因子的基因序列为SEQ ID NO.3所示的DNA。

4.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于所述顺反子序列为SEQ IDNO.2所示的序列。

5.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于所述启动子为噬菌体P_L启动子。

6.根据权利要求2所述的质粒载体，其特征在于所述SEQ ID NO.1的DNA来源于中国人皮肤组织。

7.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于所述质粒载体中进一步包含一转导终止子。

8.一种由权利要求1所述质粒载体转化的宿主细胞。

9.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为大肠杆菌。

10.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于所述大肠杆菌为E.coliGI724/pLacKGF。

11.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于所述大肠杆菌为E.coliGI698/pLacKGF。

12.一种由权利要求9所述大肠杆菌宿主制备重组人角质细胞生长因子或其变异体的方法，包括以下步骤：1)在包含有有效铜离子剂量的培养基中培养含有重组人角质细胞生长因子

基因或其等位变异体的大肠杆菌，表达出的重组人角质细胞生长因子或

其变异体以可溶的形式存在；

2)用适当的方法裂解培养后的大肠杆菌，分离裂解液，从可溶性成分中用

适当的方法纯化出重组人角质细胞生长因子或其变异体。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述铜离子剂量为1～10mM。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养基中以甘油作为碳源。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述大肠杆菌宿主为E.ColiGI724/pLacKGF。

16.根据权利要求12所述的方法，其中所述大肠杆菌宿主为E.ColiGI698/DLacKGF。