CN1303948A - 分泌表达酸性成纤维细胞生长因子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生产酸性成纤维细胞生长因子的方法,特别是涉及利用分子伴侣与人酸性成纤维细胞生长因子在原核生物体内的共表达,以生产可溶性酸性成纤维细胞生长因子蛋白的方法。
Description
本发明涉及生产酸性成纤维细胞生长因子的方法，特别是涉及利用分子伴侣与人酸性成纤维细胞生长因子在原核生物体内的共表达，以生产可溶性酸性成纤维细胞生长因子蛋白的方法。
成纤维细胞生长因子(FGF)是由至少9种结构上相关的蛋白质(FGF 1-9)组成的生长因子家族，其中了解最清楚的是酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或称FGF-1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或称FGF-2)。已知FGF家族的成员均为中胚层和神经外胚层来源的各种类似细胞的有丝分裂原，并且这些因子还具有促进血管生成、神经轴突延伸、神经元再生和存活、骨或软骨组织修复及成肌细胞分化等多种生物学功能。一般说来，FGF家庭各成员之间的核心序列存在有大约25-55％的氨基酸序列同源性，因此FGF家族可能具有共同的始祖基因。
aFGF和bFGF可与同一受体结合，但也不能排除两者各有其特异受体的可能。最近，有人发现每个aFGF分子可与两个受体分子结合。还发现不同组织中存在有不同分子量的aFGF和bFGF，推测这种情况可能是由于这些分子在不同细胞内经受不同的转录后加工过程所导致的。
一般说来，aFGF，和bFGF的共有化学特征是这些因子可与肝素紧密结合，但其中aFGF对肝素的亲和性要比bFGF小，同时aFGF的等电点更偏酸性(pH5-7)。已知肝素可通过几种方式调节FGF分子的功能(Loss,Eur.J.Clin.Invest.,18:321-326,1988)，例如肝素或肝素样分子可直接作用于FGF，激活或增强aFGF和bFGF的活性(Uhlrich et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,137:1205-1213,1986)。另外，发现可溶性肝素的增效作用似乎对aFGF有选择性，而且其强化aFGF活性的程度及比bFGF大10倍。肝素样物质也是FGF特别是aFGF的优选稳定剂。
FGF的独特的血管生成活性和细胞增殖活性使之特别适用于促进组织伤口特别是深部伤口的愈合。例如美国专利4,378,347和欧洲专利0505811分别述及天然bFGF可用于治疗早老性痴呆和帕金森氏病等神经退化性疾病(Wallicke et al.,PNAS,USA 83:3012-3016,1986)。国际专利WO 93/08828和欧洲专利0741143分别公开了使用aFGF活性片段保护中枢神经元并改善脑功能的方法。国际专利申请96/38167描述了以aFGF为基本活性成分的用于促进骨组织修复和/或生长的药物组合物。
就生物学活性而言，虽然aFGF比bFGF低得多，但业已发现，aFGF在待治疗的损伤部位，特别是在大部分的处于酸性环境的损伤部位(如浅表组织损伤和胃溃疡)，aFGF比bFGF更易于发挥其温合而持久的生物学活性，从而更有利于这些条件下的临床应用。
许多现有技术文献已报导了以重组DNA技术生产aFGF的方法(例如参见Biotechnology 5:960,1987；J.Biol.Chem.263:1 6471,1988；EP 0219052等)。近年来，为了进一步改善aFGF的生物学活性、提高产物的表达效率及增加表达产物的稳定性，一些实验室已构建了许多改良的重组表达系统(如参见WO96/08572、WO98/32869、EP406738等)。另一方面，一些专利申请还公开了具有提高的生物学活性和/或稳定性的aFGF类似物或突变体(如意见WO96/22369、WO92/11366、WO91/11459)。但也有人证明，整合形式的全长度aFGF的活性要比去除了N末瑞部分氨基的其他形式aFGF的活性大约高3倍(参见EPO505811)。
迄今为止，主要是使用细菌特别是大肠杆菌作为以重组技术工业规模生产蛋白质的宿主细胞，大肠杆菌的主要优点是：易于遗传操作并能保持转化株的稳定性；经大体积培养可获得高产率的表达产物；以及细胞易于培养，从而可降低生产成本。然而，使用大肠杆菌生产生物学活性蛋白质特别是真核细胞蛋白的一个重要缺点是，表达产物在宿主胞浆内形成所谓“包涵体”，即无生物学活性的不溶性聚合体。形成包涵体的优点是可保护被表达的蛋白质免于遭受宿主细胞中蛋白酶的降解，并能够用离心方法很容易地将包涵体分离出来。但为了得到有生物学活性的蛋白质产物，必须对包涵体进行变性一溶解一变性处理。这个过程一般要在反复试验的基础上完成，而且常常不能获得令人满足的产物回收率。为了解决这一难题，人们试图采用分子伴侣技术，使目的基因与具有协助蛋白质跨膜运输、参予维持蛋白质高级结构及调节细胞的生长与分化等功能的分子伴侣基因共表达，以期在细胞所固有的分泌信号肽帮助下，实现前体分子的跨膜分泌和正确切割，并维持成熟的分泌蛋白的正确构象。
现已知道，大肠杆菌中存在有某些与菌体蛋白质的分泌密切相关的分泌因子，如Sec家族。这些因子与信号肽酶及其他一些已知和未知的因子相互作用，参予细胞内蛋白质的跨膜转运和加工。作为Sec家族的一个重要成员，SecB是以四聚体形式存在于胞浆内的由155个氨基酸组成的可溶性分子伴侣蛋白(Kumatomo.C.A.et al.,Mol.Microbiol.5:19-22,1991)。SecB可与核糖体上合成的大多数分泌型蛋白或多肽结合，以维持其适于跨膜运输的活性构象。当分泌型前体蛋白或多肽的肽链发生折迭时，SecB通过分子骨架的β片层结构与之发生相互作用(Breukink E.et al.,Eur.J.Biochem.208:414-425,1992)。当前体蛋白或多肽被运送到内膜中之后,SecB即与具有ATP酶结构特征的另一个Sec家族成员SecA结合，并在SecA及其他相关因子的帮助下完成分子的跨膜分泌。
本发明的一个目的是提供在大肠杆菌中分泌表达aFGF的重组表达载体，其中所说的表达载体包含与第一启动子可操作地连接的编码分子伴侣的核苷酸序列，而且所说的序列下游连接有一个与第二启动子可操作地连接的编码全长度酸性成纤维细胞生长因子的核苷酸序列。
根据本发明的表达载体，其中所说的分子伴侣是大肠杆菌SecB。
根据本发明的表达载体，其中所说的第一和第二启动子选自IacZ启动子、大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子和噬菌体T7启动子，并且第一和第二启动子是相同或不同的。
根据本发明的表达载体，其中所说的编码aFGF的核苷酸序列是从天然来源中筛选的野生序列、经人工诱变或修饰得到的突变序列或化学合成的序列。
本发明的另一个目的是提供一种在原核宿主中以可溶形式分泌表达酸性成纤维细胞生长因子的方法，该方法包括以下步骤：
(1)提供编码人酸性成纤维细胞生长因子的核苷酸序列；
(2)将步骤(1)的核苷酸序列连接到编码大肠杆菌分子伴侣的核苷酸序列上，并将所得序列连接到适当的表达载体中；
(3)用步骤(2)的重组表达载体转化适当的原核宿主细胞；
(4)在适于以可溶的分泌形式表达人酸性成纤维细胞生长因子的条件下培养步骤(3)的被转化的大肠杆菌宿主细胞；
(5)除去培养物中的不溶性部分，并从可溶性部分中回收所需的具有人酸性成纤维细胞生长因子活性的多肽。
根据本发明的方法，其中的说的重组表达载体包括可操作地连接到编码人酸性成纤维细胞生长因子的核苷酸序列上的第一启动子序列，和位于其上游的可操作地连接到编码分子伴侣的核苷酸序列上的第二启动子序列。
根据本发明的方法，其中所说的第一和第二启动子是lacZ启动子、大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子或噬菌体T7启动子。
根据本发明的方法，其中所说的分子伴侣蛋白是大肠杆菌SecB。
图1显示SecB的氨基酸序列(上方)和其核苷酸编码序列(下方)。
图2显示用于在大肠杆菌中共表达分泌信号SecB和人aFGF的重组表达载体的构建。
本发明涉及以重组DNA技术生产aFGF的方法，特别是涉及以原核生物体作为宿主，以可溶性分泌形式生产人aFGF(haFGF)的方法。更具体他说，本发明涉及用于在大肠杆菌中以可溶性分泌蛋白的形式表达人aFGF的重组表达，被所说的重组表达载体转化的重组体细胞，以及按本发明方法生产的haFGF多肽。本发明进一步涉及按本发明的方法制备的haFGF在治疗由于血管病变、心肌梗塞或脑出血引起的局部缺血性疾病、促进组织修复及伤口愈合中的应用。
本发明用于分泌表达aFGF的重组表达载体包括一个表达分子伴侣蛋白的第一转录单位和用于表达aFGF的第二转录单位，其中所说的第一转录单位和第二转录单位可以彼此串联连接于同一个重组载体内，但也可以分别存在于共转化同一原核宿主细胞的两个不同的重组载体内。
就两转录单位彼此间的串联连接方式而言，本发明的重组表达载体首先包括一个可操作地连接到第一启动子上的编码分子伴侣的核苷酸序列，和一个可操入第二转录单位的插入位点。借助这个插入位点，可以很容易地在所说的表达载体中插入基本上由编码aFGF的核苷酸序列和其上游的第二启动子组成的第二转录单位。另外，在第二转录单位的第二启动子与编码aFGF多肽的DNA序列之间力有一个额外的信号肽序列，并在如此得到的融合基因的下游加入一个转录终止子序列。
得到编码人aFGF基因的优选方法是人工合成方法，因为这样可使翻译的蛋白质最佳化，而且易于对基因序列进行人工诱变。可以基于得自人体或其他动物组织的aFGF的氨基酸序列来合成基因。例如可以基于Gimenes-Gallego等人(Science 230:1385-1388,1985)所述的牛氨基酸序列或基于Gimenes-Gallego等人(Biochem,Biophys,Res。Comm.138:611-617,1986)所述的人氨基酸序列合成牛或人aFGF基因。可按照Itatura等人(Science 198:1056-1063,1977)所述的技术合成编码aFGF的核苷酸序列。或者，也可以按照Aviv和Leder(Proc.Natl Acad.Sci.USA 69:1408-1412,1972)所述的方法，从表达aFGF的细胞，例如人脑垂体、乳腺癌、脑、脑干或下丘脑细胞中提取含poly(A)的RNA，以得到编码haFGF的cDNA。亦可使用Huynh V.T.等人(DNA Cloning Techniques:A PracticalApproach,IRL Press,Oxford,1984)的λgt10载体，从这些组织的mRNA得到cDNA文库，并利用所得到的杂交克隆回收编码aFGF的完整序列。
一般说来，为了提高基因的表达效率和产物的产率，应适当地选择更适合于特定编码序列的启动子、宿主和载体的最佳组合。在使用大肠杆菌宿主表达aFGF的情况下，最好使用强的T7启动子表达aFGF cDNA。另外，考虑到宿主细胞内能量的有限性，我们优选相对较弱(所需能量较少)的lacZ启动子驱动大肠杆菌分子伴侣基因的表达。
作为与编码aFGF的核苷酸序列共表达的分子伴侣基因，本发明优选编码具有分泌功能的分子伴侣SecB蛋白的核苷酸序列。SecB是大肠杆菌分泌因子Sec家族中唯一存在于胞质内的可溶性蛋白质，而SecA、SecD、SecE、SecF及SecY等其他分泌因子则均定位于细胞膜上。SecB可与大多数蛋白或多肽结合，使之维持其特异的松散折叠，处于有益于分子转运的空间构象。SecB将与之结合的蛋白质运送到细胞膜上后，进一步与SecA结合，并在其他分泌因子的协同下完成目的蛋白或多肽的运输。由于SecB结合位点不需要有特定的氨基酸序列，而只要带有单正电荷并具有β折叠区域即可，所以其可与大多数蛋白质或多肽结合。然而，由于受细菌细胞固有的SecB蛋白含量等因素的限制，已在核糖上大量合成的外源蛋白质常常积聚在细胞内，发生前体分子的无规折叠和分子聚集，使这些前体分子不能与各种相关分子伴侣(特别是SecB)蛋白结合，从而丧失其跨膜运输能力。为了克服这一缺陷，我们试图将SecB基因串联到编码aFGF之核苷酸的上游或下游区，以期实现aFGF的分泌表达。或者，亦可使两者分别携带于两个不同的载体上，并用所得到的两个重组载体转化同一大肠杆菌宿主，达到两者同步表达并分泌表达aFGF的目的。
应特别指出的是，为了实现aFGF的分泌表达并提高其表达水平，须在haFGF编码序列的上游和启动子(T7启动子)下游之间插入一个分泌信号序列。该序列在5’→3’方向上包括翻译起始密码子(ATG)，然后是Shina-Dalgarno序列，最后是终止密码子(TAA)。优选的信号序列是ATG TAGT CGA TTA AAT AAG GAG GAA(参见Schoner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8506-8510,1986)。为了方便起见，可在以PCR扩增方法制备合成的aFGF时，在扩增引物中加入这样的序列。
可使用任何一种适于在大肠杆菌宿主中稳定地保留并复制的载体，经遗传操作构建本发明的重组表达载体。可选用的起始质粒包括pBR322、pUC18、pUC119、pSP64、pGEM-3、pTE-3和pT7-7。本发明优选的是带有T7启动子的多拷贝质粒pT7-7。
可使用任何一种适于在其中以高效率共表达所需蛋白质(aFGF和secB)的大肠杆菌株作为宿主，这样的菌株包括大肠杆菌MM294、DH-1、C600、DE-3和BL21等。本发明优选的宿主是大肠杆菌菌株BL21。
可按照本领域已知的技术进行基因的分离和合成、克隆和表达载体的构建、DNA序列分析及鉴定、宿主细胞转化和培养，以及表达产物的分离和纯化等操作(参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Mannual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColaSpring Harbor,NY,1989)。
为本发明的目的，可以首先将以大肠杆菌YU537的染色体DNA为模板，经PCK扩增得到的SecB导入带有lacE启动子(第一启动子)的质粒pUC18中。或者，也可以将预先制备的，包括lacZ启动子和SecB基因第一转录单位直接连接到本发明选用的表达载体pT7-7中T7启动子的(第二启动子)的上游，得到重组质粒pT7-SecB。为了有效地表达基本上没有宿主内源性DNA序列的编码SecB的基因，必要时可在分子伴侣基因的下游连接一个终止信号，或在设计并克隆分子伴侣基因时加入这样的终止子序列。可以适当地调整第一启动子序列与分子伴侣基因之间的距离，以获得最佳转录效率。
然后，使用基于aFGF cDNA的核苷酸序列合成的寡核苷酸引物，并以按上述方法制得的aFGF cDNA作为模板，经PCR扩增得到正链未端带有NdeⅠ位点的合成的双股aFGF基因序列。用SmaⅠ+NdeⅠ双酶切按前述方法制得的质粒pT7-SecB后，将所得到的aFGF编码序列连接到SmaⅠ-NdeⅠ大片段上，进而得到以串联方式连接的，含有处于lacZ启动子驱动下的SecB基因和处于T7启动子驱动下的aFGF基因的重组载体(pUCSec-T7-aFGF)。
可以按常规方法(如CaCl2处理法)用携带上述第一和第二转录单位的重组质粒转化适当的大肠杆菌菌株(如参见Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2110,1972)，并按本领域技术人员熟知的方法，例如使用LB培养基发酵培养经筛选得到的转化株。
发酵完成后，可以用简单的离心法分离培养物上清，并用已知的三步骤层析法(阳离子交换层析-肝素-Sepharose亲和柱-反向高效液相层析(HPLC)(参见美国专利5,312,911)将aFGF纯化到银染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一带的基本上纯的均质状态。可用氨基酸组成分析法和氨基末端序列检测法鉴定haFGF蛋白的结构真实性，并进一步使用Thomas等人(J.Biol.Chem.225:5517-5520,1980)的成纤维细胞(Babl/c 3T3 A31细胞系)有丝分裂法估测纯化的rhaFGF的生物学活性。
可以将按本发明方法制备的rhaFGF与选自人血清白蛋白、多聚甘氨酸、金属阳离子(如Zn++、Mn+和Mg2+)及低分子量肽的活性蛋白质保护剂，选自聚乙二醇、羧甲基纤维素碱金属盐、肝素、硫酸肝素或其类似物、硫酸多糖、谷胱甘肽的稳定剂混合，并加入本领域技术人员熟知的药物载体或赋形剂，制成适于经胃肠道途径，特别是经胃肠道外途径给药的物组合物。可以按照制药领域的常规方法，将这样的药物组合物制成适于经血管内、肌肉内、或腹腔内给药的溶液剂、径口服给药的片剂或粉末剂，或制成适合于外用的栓剂、软膏、霜剂、乳化剂等剂型。
本发明的药物组合物可用于促进因烧伤或其他机械创伤造成的软组织、肌腱、韧带、软骨或骨组织伤口的修复或愈合。所说的软组织包括皮肤、肌肉、血管、内脏器官及角膜组织等除骨和软骨组织外的所有组织。一般说来，aFGF的局部或皮下用药量约为1-100μg/cm2/天。当用于促进骨骼肌和软骨损伤修复时，最好是在外科手术或创伤的损伤部位投用本发明的药物组合物。用于促进骨骼肌愈合的给药剂量约为10-100μg/cm3/天。本发明的药物组合物亦可用于治疗血管组织损伤，如促进血管生长(血管生成)和血管修复(促进受损部位的血管内皮细胞增殖)。可在损伤部位内用药，以发挥其体内血管生成活性，用药量约为10-100μg/cm2/天。本发明的药物组合物还可用于促进中枢和外周神经组织修复，包括刺激阿尔海默氏病(早老性痴呆)病理过程中受损的海马神经元的生长。作为本发明药物组合物的活性成分，aFGF可刺激因各种原因受到损伤的神经组织，使之通过成神经细胞的有丝分裂再生新的神经元，恢复受损部位的神经细胞群体，并促进轴突的延伸。
尽管已知aFGF的生物学活性明显低于碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，但大量的实验研究证明，aFGF比bFGF作用相对更为温和，特别是aFGF更适合于大多数伤口的低pH环境。因此，可将本发明药物组合物制成适于口服给药的制剂，用于治疗胃或十二指肠溃疡，或者制成适当的外用制剂，用于创伤(包括手术创伤，特别是局部呈酸性pH环境的深部创伤)的治疗。我们的研究结果(数据未示出)表明，当与其他用于创伤(如皮肤切割伤或胃溃疡)修复的生长因子，特别是表皮生长因子联合使用时，aFGF似乎比bFGF有更好的治疗效果。aFGF能够使创伤部位的成纤维细胞和表皮细胞保持更好的再生比较，获得更好的生理修复效果。
下列实施例旨在进一步举例说明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。
实施例1:SecB基因的制备
为了制备用于本发明的大肠杆菌分泌因子SecB基因，首先将大肠杆菌菌株YK537(由日本东京大学MAKART YAMASAK1提供)培养在含有氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基(每升含蛋白胨10g，酸母提取物5g和氯化钠10g)中，细胞增殖后按常规方法分离染色体DNA。
以YK537细胞的染色体总DNA为模板，并使用合成的寡核苷酸引物(1):5’-GGAATTCGATGTCAGAACAAAACAACAC-3’(SEQID NO:1)和引物(2):3’-AACTGCAGTTATCAGGCATCCTGATGTTC-5’(SEQ ID NO:2)，在Taq聚合酶存在下进行PCR反应(90°变性30秒，50℃退火60秒，72℃聚合60秒)，共反应30较循环后，72℃延伸10分钟，以扩增得到两末端分别带有EcoRⅠ(GAATTC)和Pstl(CTGCAG)酶切位点的长度约480bp的片段。电泳(1％低熔点胶)分离PCR反应混合物，染色后从凝胶上切下相当于480bp的电泳条带并回收之。
然后用EcoRⅠ+Pstl酶消化带有lacZ启动子(作为第一启动子)的质粒pUC18，回收大片段后在T4 DNA连接酶存在下，将上述480bp片段连接到该大片段上，环化后得到携带SecB基因的重组质粒pUC-SecB。用所得质粒转化感受态大肠杆菌DH5细胞(BethesdaResearch Labs)。培养增殖后从转化株克隆中分离单链EcoRⅠ-PstT片段。按已知方法并使用通用引物测定正向和反向连接片段的DNA序列，结果显示所得到的片段为编码155个氨基酸的SecB蛋白的核苷酸序列，从而得到所需的SecB基因片段。
实施例2：携带SecB基因的重组质粒pT7-SecB的构建
为了利用T7启动子作为表达aFGF蛋白的第二启动子，我们首先将实施例1中制备的SecB基因连接到表达载体中。为此，首先用BglⅡ消化质粒PT7-7(Dept.Of Biol.Chem.,Harvard MedicalSchool,Boston,Mass.02115)，分离质粒大段并用S1核酸酶将其末端修成平端。在T4 DNA连接酶存在下，将其与已用S1核酸酶处理的上述SecB基因(PvuⅡ-PstⅠ)连接在一起，环化后得到携带SecB基因的中间质粒pT7-SecB。
实施例3：分泌表达aFGF蛋白的重组载体的构建
为了构建包括以串联方式连接有处于lacZ启动子控制下的SecB基因，和处于T7启动子控制下并在上游包括一个分泌信号序列的aFGF基因的重组表达载体，首先以aFGF cDNA文库作为模板，并使用基于aFGF的氨基酸序列化学合成的寡核苷酸引物(3):5’-TGTATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATTCAATCTGCCAC-3’(SEQ ID NO:3)(其中下划粗黑线的部分为分泌信号序列，下划细黑线的部分为NdeⅠ酶切位点)，和引物(4):3’-TTAGTCAGAGCTCAC-5’(SEQ ID NO:4)，以常规PCR反应(92℃变性30秒，50℃退火45秒，70℃聚合60秒，经35次循环后72(延伸10分钟)扩增得到5’端带有分泌信号，并且3’端带有一个NdeⅠ酶切位点的编码aFGF的核苷酸片段。
用NdeⅠ酶切实施例2中制得的质粒PT7-SecB，并用T4 DNA连接酶将编码aFGF的核苷酸序列连同其5’端分泌信号序列连接到pT7-SecB中SecB基因序列的下游，从而得到本发明的重组表达质粒pUCSec-T7-aFGF。
实施例4:aFGF蛋白的分泌表达与纯化
按照常规CaCl2处理法用实施例3的重组载体转化感受态大肠杆菌BL21菌株(Stratagene)。在含有1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、0.4％葡萄糖和约50μg/ml青霉素的LB培养基中37℃培养转化细胞。当细胞培养物的560nm光密度约达到0.6时，加入IPTG至终浓度为1mM，并继续培养18小时。培养完成后，离心收集培养物上清，并依次使用阳离子交换树脂、肝素-Sepharose复合物和反向高效液相层柯法(HPLC)纯化aFGF蛋白质。
为此，首先将经过透析的培养物上清液悬浮于约0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，并加入已用同样缓冲液平衡过的阳离子交换剂CM-Sephadex(6ml/克蛋白质)。4℃静止2小时后，将树脂收集到玻璃柱内并用磷酸盐缓冲盐水(pH6.2)洗柱3次。洗柱后用含有0.5MNaCl的磷酸盐缓冲盐水洗脱蛋白质。然后向洗脱物中加入用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡过的肝素-Sopharose(1ml/克蛋白质)。4℃轻轻振动并放置约1小时后，收集树脂-蛋白质复合物并填柱。用含有0.6M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液洗柱后，用含有1.0M NaCl的同样缓冲液洗脱所需的蛋白质.最后收集洗脱物(监测280nm吸光率)并加于已用5mM三氟乙酸(TFA)平衡的C4反相HPLC柱(5mm×25cm)上，用TFA(0-100％)+CH3CN(0-60％)梯度洗脱，收集单一主蛋白质峰值部分后得到高纯度(约98％)的aFGF蛋白质。
纯化的产物蛋白质经还原后用聚丙烯酰胺凝胶(15％分离胶)电脉分离，银染色后显示出分子量约16.1KD的单一带。通过氨基酸组成分析和N末端序列测定进一步证实按本发明方法制备的aFGF的真实性。
实施例5：分泌表达的haFGF的生物学活性
参照Thomas等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:357-361,1984)所述的方法，根据3H-胸腺嘧啶掺入Babl/c小鼠3T3细胞DNA中的量，估测纯化的重组aFGF的促有丝分裂活性。简单地说，在含有10％胎牛血清的培养基中将Babl/c 3T3细胞(5×104/孔)培养至单层汇合后，更换培养基并继续培养24小时。培养后向各孔内加入试验样品(10μl)，保温12小时后再加入0.2μCi3H-胸腺嘧啶(NewEnglamd Nuclear)和0.3μg末标记的胸腺嘧啶(Sigma)，继续保温12小时。保温后检测掺入细胞DNA中的放射活性(cpm)。其中所加样品为连续的2倍稀释液，并在本底峰值DNA合成之间跨越至少3个数量级。一个刺激单位定为产生半数最大反应所需的aFGF稀释液的浓度。将每毫克纯aFGF的刺激单位数定为比有丝分裂活性。按本发明的方法制得的aFGF产生最大DNA合成刺激作用所需的浓度约为3.2ng/ml。
序列表(1) 一般信息(ⅰ)申请人：广州暨南大学医药生物技术研究开发中心(ⅱ)发明名称：分泌表达酸性成纤维细胞生长因子的方法(ⅲ)序列数：4(ⅳ)通讯地址：
(A)联系人：李校坤
(B)街道：天河区石牌
(C)城市：广州
(D)国家：中华人民共和国
(E)邮编：510632(ⅴ)计算机可读形式：
(A)介体类型：3.5英寸软盘
(B)计算机：IBM PremiumⅢ
(C)操作系统：WIN.97
(D)软件：WORD97(ⅳ)电讯信息：
(A)电话：020-85223275
(B)传真：86-20-85223275(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：28碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓朴结构：线性(ⅱ)分子类型：CDNA(ⅲ)序列描述：SEQ ID NO:1
GGAATTCGATGTCAGAACAAAACAACAC(2)SEQ ID NO:2的信息：(ⅰ)序列特征：
(E)长度：29碱基对
(F)类型：核酸
(G)链型：单链
(H)拓朴结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅲ)序列描述：SEQ ID NO:2AACTGCAGTTATCAGGCATCCTGATGTTC(2)SEQ ID NO:3的信息：(ⅰ)序列特征：
(I)长度：37碱基对
(J)类型：核酸
(K)链型：单链
(L)拓朴结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅲ)序列描述：SEQ ID NO:3TGTATG TATCGATTAAATAAGGAGGAATTCAATCTGCCAC(2)SEQ ID NO:4的信息：(ⅰ)序列特征：
(M)长度：15碱基对
(N)类型：核酸
(O)链型：单链
(P)拓朴结构：线性(ⅱ)分子类型：CDNA(ⅲ)序列描述：SEQ ID NO:4TTAGTCAGAGCTCAC
Claims (8)
1、在大肠杆菌中分泌表达aFGF的重组表达载体，其中所说的表达载体包含与第一启动子可操作地连接的编码分子伴侣的核苷酸序列，而且所说的序列下游连接有一个与第二启动子可操作地连接的编码全长度酸性成纤维细胞生长因子的核苷酸序列。
2、根据权利要求1的表达载体，其中所说的分子伴侣是大肠杆菌SecB。
3、根据权利要求1的表达载体，其中所说的第一和第二启动子选自IacZ启动子、大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子和噬菌体T7启动子，并且第一和第二启动子是相同或不同的。
4、根据权利要求1的表达载体，其中所说的编码aFGF的核苷酸序列是从天然来源中筛选的野生序列、经人工诱变或修饰得到的突变序列或化学合成的序列。
5、一种在原核宿主中以可溶形式分泌表达酸性成纤维细胞生长因子的方法，该方法包括以下步骤：
(1)提供编码人酸性成纤维细胞生长因子的核苷酸序列；
(2)将步骤(1)的核苷酸序列连接到编码大肠杆菌分子伴侣的核苷酸序列上，并将所得序列连接到适当的表达载体中；
(3)用步骤(2)的重组表达载体转化适当的原核宿主细胞；
(4)在适于以可溶的分泌形式表达人酸性成纤维细胞生长因子的条件下培养步骤(3)的被转化的大肠杆菌宿主细胞；
(5)除去培养物中的不溶性部分，并从可溶性部分中回收所需的具有人酸性成纤维细胞生长因子活性的多肽。
6、根据权利要求5的方法，其中的说的重组表达载体包括可操作地连接到编码人酸性成纤维细胞生长因子的核苷酸序列上的第一启动子序列，和位于其上游的可操作地连接到编码分子伴侣的核苷酸序列上的第二启动子序列。
7、根据权利要求5的方法，其中所说的第一和第二启动子是lacZ启动子、大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子或噬菌体T7启动子。
8、根据权利要求5的方法，其中所说的分子伴侣蛋白是大肠杆菌SecB。
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