CN110004124A - 一种磷脂酶d的编码基因及其表达和应用 - Google Patents

一种磷脂酶d的编码基因及其表达和应用 Download PDF

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Abstract

本发明为一种磷脂酶D的编码基因及其表达和应用，提供了一种利用大肠杆菌E.coli BL21表达重组磷脂酶D并利用其产生磷脂酰丝氨酸的方法。该方法包括对重组质粒pET‑28a(+)‑sspld的构建、重组质粒转化至E.coli BL21及利用重组菌催化产生磷脂酰丝氨酸。重组菌株可成功表达磷脂酶D，酶活达到17.07U/mL。通过诱导条件优化，重组菌酶活最高可达38.58U/mL。经HPLC检测，该酶具有良好的转磷脂酰基能力，能以卵磷脂和L‑丝氨酸为底物合成产物磷脂酰丝氨酸，转化率可达28％，产量达到1.34g/L。该重组磷脂酶D发酵周期短，催化性能良好，为其实际应用奠定了基础。

Description

一种磷脂酶D的编码基因及其表达和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种磷脂酶D的编码基因及其重组表达和在磷脂酰丝氨酸合成中的应用。
背景技术
磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)于1942年由Jordi Floch首次提取出来，其提取来源为牛脑，随后对其进行了分子结构的定性分析[FOLCH J.Journal ofBiological Chemistry,1942,146:35-44]。它是磷脂中一种能够调控膜蛋白功能状态的磷脂[冯雷刚等.食品研究与开发,2006,27(9):191-193]，其在细胞膜的磷脂双分子层中占有10％-20％。近年来，磷脂酰丝氨酸广泛应用于医疗、保健行业，主要用于治疗脑衰老和修复脑损伤，且疗效显著，更是作为“脑专一性营养物质”而备受关注[BIRGE RB,et al.CellDeath&Differentiation,2016,23(6):962-978]。随着研究的不断深入，除了其营养价值外，许多其他的用途和功能也逐渐被发现。磷脂酰丝氨酸主要具有以下功能：(1)改善记忆力，缓解脑疲劳，治疗老年痴呆；(2)修复大脑损伤，治疗儿童多动症；(3)缓解精神压力，治疗抑郁症；(4)改善橡胶性能[MCDANIEL MA,et al.Nutrition,2003,19(11):957-975；王兆明等.食品工业科技,2014,35(19):362-367]。
磷脂酰丝氨酸对人体生命活动具有关键作用，可是其在自然界中的含量较少，随着目前人们对磷脂酰丝氨酸需求量日益增加，高效制备磷脂酰丝氨酸的方法越来越受到广泛关注。国内外制备磷脂酰丝氨酸的方法已研究多年，主要包括两方面：提取法和生物酶转化法。提取法是指通过有机溶剂从植物种籽和动物细胞中萃取获得磷脂酰丝氨酸，酶转化法是指利用磷脂酶D(phospholipase D，PLD)的转磷脂酰作用，生物催化合成磷脂酰丝氨酸。但提取法获得的磷脂酰丝氨酸得率较低、且具有携带疯牛病等动物流行病毒的安全风险，而酶转化法具备成本较低、操作简单、反应工艺绿色环保等优点，逐渐成为了合成磷脂酰丝氨酸的理想方法[周彦峰等.中国油脂,2018,43(10):53-57；CHOOJIT S,etal.European Journal of Lipid Science&Technology,2016,118(5):803-813]。
磷脂酶是可以水解磷脂的一类酶的总称，根据其水解位置的差异，可以将其分为磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)。磷脂酶D(Phospholipase D，PLD)即磷脂酰胆碱磷脂水解酶(EC3.1.4.4)，具备水解磷酸二酯键和碱基互换的能力。磷脂酶D(EC 3.1.4.4)广泛存在于多种生物体中，包括哺乳动物、植物、酵母和细菌。磷脂酶D是一类具备水解和碱基互换能力的特殊酶类。其催化反应分为两种：一是催化磷脂酰胆碱(PC)的磷酸酯键发生水解反应生成磷脂酸(PA)和羟基化合物胆碱；二是催化另一种羟基化合物与磷脂酰基团发生碱基互换反应生成新的磷脂，也就是磷脂酰基转移反应。磷脂酶D目前已成为合成和修饰磷脂的重要工具。
近年来，研究者已对磷脂酶D的异源表达进行了多方位的尝试，主要的表达系统有大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统和链霉菌表达系统。作为异源表达最常用的原核表达宿主，多位研究者在大肠杆菌内进行了磷脂酶D的异源表达。Carlo等选择来源于Streptomyces antibioticus的磷脂酶D基因序列进行异源表达引物的设计，通过PCR扩增获得完整的磷脂酶D基因序列，长度约2200bp。选择E.coli BL21(DE3)pLys作为表达宿主，pET-27b(+)作为表达载体，将目的基因和表达载体通过双酶切进行重组质粒的构建并导入至表达宿主中。当获得阳性转化子后，以IPTG作为诱导剂进行诱导产酶，通过PpNP法可检测到明显的重组磷脂酶D水解活性[Zambonelli C,et al.Enzyme and MicrobialTechnology,2003,33(5):676-688]。
枯草芽孢杆菌表达系统作为较安全且相对成熟的表达系统，同样可作为磷脂酶D的异源表达体系。路福平等将来自于大肠杆菌K12的磷脂酶D基因与表达载体pBES连接进行重组质粒的构建，将重组质粒导入宿主Bacillus subtilis DB104中，对重组菌发酵获取上清并进行水解活性的测定，结果表明酶活可达1.5U/mL[张业尼等.中国生物工程杂志,2008,28(9):56-60]。
早期对磷脂酶D的研究主要集中于野生菌培养发酵条件的优化[梁丽敏等,中国食品添加剂,2014,(9):114-120；韩海霞等,食品工业科技,2014,35(13):176-180]。但由于野生菌发酵周期长，培养条件复杂，越来越多的研究者们采用异源表达的方法生产磷脂酶D。本研究为实现磷脂酶D应用于生物催化制备磷脂酰丝氨酸，尝试将来源于链霉菌的磷脂酶D基因在研究相对成熟的大肠杆菌体系中进行异源表达和表征，并探究磷脂酶D在有机相-水相双向体系下的磷脂酰丝氨酸合成工艺条件，为生物法制备磷脂酰丝氨酸奠定理论基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达磷脂酶D的重组菌株及应用，提供包含本发明基因的编码序列、重组质粒及包含该重组质粒的宿主细胞，以及利用重组菌株所产磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的方法。
本发明的第一个目的是提供一种磷脂酶D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种编码上述磷脂酶D的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供包含SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
本发明的第四个目的是提供一种表达磷脂酶D的重组质粒，所用质粒为pET-28a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，重组质粒的构建方法包括以下步骤：
(1)以含有磷脂酶D编码基因的质粒为模板，利用引物PCR扩增磷脂酶D编码基因；
(2)将步骤(1)得到的扩增产物克隆至pET-28a质粒中构建重组质粒。
本发明的第五个目的是提供一种表达磷脂酶D的重组菌株，重组菌株中导入上述表达磷脂酶D的重组质粒。
进一步地，重组质粒的宿主菌为大肠杆菌大肠杆菌Escherichia coli DH5α，Escherichia coli BL21或Escherichia coli Rosetta。
进一步地，表达磷脂酶D的重组菌株的构建方法包括以下步骤：
将表达磷脂酶D的重组质粒转化入E.coli JM109，然后于含卡那霉素抗性的固体种子培养基中，在37℃下培养培养10-12h至转化子长出，筛选出阳性转化子，然后将阳性转化子接种至含卡那霉素抗性的LB培养基培养至OD600nm达到0.6～0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃摇床培养8h，离心收集菌体。用缓冲液洗涤重悬菌体，并进行超声破碎，离心后获得的上清液即为含磷脂酶D的粗酶液。
本发明的第六个目的是公开上述重组菌株在生产磷脂酰丝氨酸中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种生产磷脂酰丝氨酸的方法，包括以下步骤：
利用上述生产磷脂酶D的重组菌株所产生的生产磷脂酶D催化底物大豆卵磷脂和丝氨酸的反应，在30-70℃条件下反应2-30h，得到磷脂酰丝氨酸。
进一步地，大豆卵磷脂和丝氨酸的浓度比为1:5。
进一步地，反应在有机-水相的混合体系中进行，有机相和水相体积比为4:1-4:4。
进一步地，有机相为乙醚、正己烷、乙酸乙酯和氯仿中的一种或几种。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明提供了一种新的磷脂酶D编码序列，构建了表达磷脂酶D的重组表达载体、重组菌株，同时提供了一种新的生产磷脂酰丝氨酸的方法。本发明所构建的重组菌株表现出磷脂酶D活性，可成功表达磷脂酶D，酶活达到17.07U/mL，通过培养条件优化，酶活提高了2.26倍。本发明的磷脂酶D具有良好的转磷脂酰基能力，能以卵磷脂和L-丝氨酸为底物合成产物磷脂酰丝氨酸。重组菌酶活稳定性较好，发酵周期短，为大规模工业化生产奠定了基础具有良好的转酰基能力，在磷脂酰丝氨酸的生物合成领域具有潜在应用价值。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是PCR扩增磷脂酶D编码基因的核酸电泳图谱。泳道M：1,0000bp DNA标记物；泳道1：扩增得到的磷脂酶D基因(sspld)。
图2为双酶切后的sspld片段。泳道M：1,0000bp DNA Marker；泳道1：双酶切后的目的基因(1566bp)和pMD19-T载体(2300bp)。
图3为pET-28a质粒双酶切后的核酸电泳图谱。泳道M：1,0000bp DNA Marker；泳道1：双酶切后的pET-28a质粒基因。
图4为扩增验证pET-28a(+)-sspld质粒上sspld片段的核酸电泳图谱。泳道M：1,0000bp DNA Marker；泳道1：扩增得到的sspld片段。
图5为双酶切验证重组质粒pET-28a(+)-sspld的核酸电泳图谱。泳道M：1,0000bpDNA Marker；泳道1：双酶切后的pET-28a质粒和sspld片段。
图6为重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-sspld的SDS-PAGE图谱。泳道1：磷脂酶D的蛋白条带；泳道2：空白对照；泳道3：蛋白Marker。
图7为不同诱导条件下的酶活。
图8为不同转化条件下的磷脂酰丝氨酸转化率。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本发明提供了一种磷脂酶D编码序列(sspld)，包括522个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该磷脂酶D的基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，全长1,566个核苷酸。
本发明还提供了一种表达磷脂酶D的重组质粒，包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，全长6916个核苷酸。
实施例2
本实施例提供了重组质粒pET-28a(+)-sspld的构建及其在大肠杆菌E.coli BL21中的表达方法，具体步骤如下：
(1)磷脂酶D编码序列的扩增
以实验室前期保藏的来源于链霉菌的磷脂酶D编码序列sspld为模板，设计引物(P1、P2)扩增磷脂酶D编码序列：
引物P1：5’-CGAAGCTTATGGCACGTCATCC-3’(Hind III)
引物P2：5’-CCGGATCCTTAGCCAGCCAGAT-3’(BamH I)
PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μL (Premix)，20μL ddH2O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，52.4℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。将步骤(1)回收产物克隆至pMD19-T载体构建重组克隆质粒，将质粒转化至E.coli JM 109，挑取多个转化子至LB液体培养基(Kan)，37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后进行PCR验证，验证正确的进行序列测定。
(2)重组质粒pET-28a(+)-sspld的构建
将pET-28a质粒和步骤(1)得到的验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒同时用BamH I和Hind III进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用T4 DNA连接酶在16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli JM 109感受态细胞中，在含卡那霉素抗性(100mg/L)的固体LB培养基上过夜培养，挑取多个转化子至LB液体培养基(Kan),37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后进行PCR验证。将重组质粒送至上海睿迪测序公司进行序列测定，将序列正确的重组质粒命名为pET-28a(+)-sspld。
(3)重组质粒pET-28a(+)-sspld转化E.coli BL21
将步骤(2)中的重组质粒转化到E.coli BL21中。在含卡那霉素抗性(100mg/L)的固体LB培养基上过夜培养，挑取多个转化子至LB液体培养基(Kan),37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后进行PCR验证。将重组质粒送至上海睿迪测序公司进行序列测定。重组菌株转化子接种于LB培养基培养至OD600nm达到0.6～0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃摇床培养8h，离心收集菌体。用缓冲液洗涤重悬菌体，并进行超声破碎，离心后获得的上清液即为含磷脂酶D的粗酶液。重组菌株E.coli BL21/pET-28a(+)-sspld发酵酶液经分子量分析，大小约为60kDa。酶活检测结果显示以卵磷脂为底物其酶活能达到17.07U/mL。
本发明以上实施例中，磷脂酶D水解活力的测定方法如下：
100μL反应体系：60μL底物卵磷脂溶液(预热5min)和40μL破碎的酶液充分混匀后于60℃条件下反应20min，加入50μL终止液终止反应，并在沸水浴中放置5min后立即放于冰上冷却；6000rpm离心5min，吸取全部上清加入60μL胆碱氧化酶、200μL苯酚溶液、200μL 4-氨基安替比林溶液和40μL过氧化物酶，充分混匀后于37℃反应20min；反应结束后，于OD505nm处测定吸光值，根据标准曲线计算酶活。
本发明以上实施例中，磷脂酶D蛋白分子量的测定方法如下：
根据10％分离胶和浓缩胶的配方进行分离胶和浓缩胶制备，制备完成后，取80μL样品加入20μL 5×上样缓冲液，充分混匀后于沸水浴中放置5min使蛋白变性。根据蛋白浓度进行上样，并加入蛋白标记物。上层浓缩胶采用80V电压(约30min)，后期分离胶采用100V电压，当样品至分离胶底部约1cm处关闭电源。结束后用蒸馏水冲洗干净，进行染色和脱色，测定磷脂酶D蛋白分子量大小。SDS-PAGE结果显示(图1)，本发明实施例2中表达的磷脂酶D分子量为60kDa。
实施例3
本实施例提供了一种通过诱导培养提高磷脂酶D酶活的培养方法。
(1)诱导温度对产酶的影响
在其他发酵诱导条件一致的情况下，将重组菌分别置于15、20、25、30、35℃等不同温度条件下诱导8h后，按照标准活力测定方法测定不同诱导温度条件下磷脂酶D的酶活。由图7a可知，诱导温度为20℃时发酵酶活最高。
(2)诱导时机对产酶的影响
将重组菌分别培养至OD600nm为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4时进行IPTG诱导，诱导时间保持一致，按照标准活力测定方法测定不同诱导时机条件下磷脂酶D的酶活。在重组磷脂酶D发酵过程中，诱导时机不同，即添加诱导剂时菌体浓度OD600nm不同，同样对发酵产酶具有显著影响。在菌体生理状态最旺盛时进行诱导，酶活也会得到显著提高。由图7b可知，重组菌在OD600nm为1.0时加入IPTG进行诱导效果最佳。
(3)IPTG浓度对产酶的影响
在培养基中分别加入终浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mM的IPTG进行产酶诱导，按照标准活力测定方法测定不同IPTG终浓度条件下磷脂酶D的酶活。由图7c可知，当加入IPTG终浓度为0.5mM时，重组菌诱导发酵所产磷脂酶D的酶活可达最高。
(4)诱导时间对产酶的影响
在其他发酵诱导条件一致的情况下，将重组菌分别诱导6、8、10、12、14、16h后，按照标准活力测定方法测定不同诱导时间条件下磷脂酶D的酶活。由图7d可知，重组菌在诱导14h时酶活达到最高，继续增加诱导时间，酶活逐渐降低。
实施例4
为获得最佳转化率，本研究对转化条件进行了优化。从有机溶剂的选择，有机相水相体积比，底物浓度比，转化温度，转化时间这4个角度对转化工艺进行优化。
初始催化体系：有机相为8mL乙酸乙酯，PC60浓度为8mg/mL；水相为8mL粗酶液，其中包含200mg L-丝氨酸；两相液体混合反应12h。PS即存在于有机相中。
向上述反应液中加入20mL氯仿/甲醇(体积比2/1)混合溶液，3mL超纯水，2500rpm离心5min，去除底层溶液，经真空离心浓缩仪浓缩后，加入2mL正己烷/异丙醇(体积比1/1)溶解，经0.22μm有机膜过滤后，采用HPLC进行产物磷脂酰丝氨酸的检测分析。
为获得最佳转化率，本实施例对转化条件进行了优化。从有机溶剂的选择，有机相水相体积比，底物浓度比，转化温度，转化时间这4个角度对转化工艺进行优化。
(1)有机溶剂的选择
分别使用乙醚、正己烷、乙酸乙酯、氯仿作为催化反应的有机相。通过HPLC检测分析，有机相为乙酸乙酯时，磷脂酰丝氨酸的转化率最高(图8a)，因此乙酸乙酯可作为最佳有机相。
(2)有机相水相体积比
将初始转化条件中的有机相换为乙酸乙酯，有机相水相体积比分别设置为4:4、4:3、4:2、4:1，其余转化条件不变，考察两相体积比对转化率的影响。有机相水相体积比为4：2时，磷脂酰丝氨酸的转化率最高(图8b)，因此4:2的两相体积比为最佳比例。
(3)底物浓度比
浓度为8mg/mL的PC60溶解于8mL乙酸乙酯，作为有机相，分别取4，8，16，24，32，40，48mg/mL的L-丝氨酸溶于4mL粗酶液作为水相；将有机相和水相充分超声混匀后，振荡反应12h，以考察不同底物浓度比对转化率的影响。当PC60浓度为8mg/mL，L-丝氨酸浓度为40mg/mL时，磷脂酰丝氨酸的转化率最高，可达43.2％(图8c)，因此1:5为最佳底物浓度比。
(4)转化温度
浓度为8mg/mL的PC60溶解于8mL乙酸乙酯，作为有机相，40mg/mL的L-丝氨酸溶于4mL磷脂酶D粗酶液作为水相；将有机相和水相充分超声混匀后，分别于25,30,35,40,45,50℃、120rpm条件下振荡反应12h，以考察不同转化温度比对转化率的影响。由HPLC检测结果可知当转化温度为40℃时最佳，此时转化率为28％(图8d)，产量为1.34g/L。因此40℃可作为最佳转化温度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种磷脂酶D，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的磷脂酶D的基因序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
3.包含SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
4.一种表达磷脂酶D的重组质粒，其特征在于：包括权利要求2所述的基因序列，所用质粒为pET-28a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.一种表达磷脂酶D的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株中导入由权利要求4中所述表达磷脂酶D的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于：所述重组质粒的宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli DH5α，BL21或Rosetta。
7.权利要求5所述的重组菌株在生产磷脂酰丝氨酸中的应用。
8.一种生产磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求5所述的重组菌株所产生的磷脂酶D催化底物大豆卵磷脂和丝氨酸的反应，在30-70℃条件下反应2-30h，得到所述磷脂酰丝氨酸。
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