JP7467666B2 - マンナナーゼ活性を有する変異型ポリペプチド - Google Patents

Description

本出願は、マンナナーゼ（mannanase）の活性を有する変異型ポリペプチド及びその用途に関する。

マンナン（mannan）ポリマーは、ヘミセルロース（hemicellullose）を形成する主要構成物質であり、構成する糖の間にβ－１，４結合が直鎖骨格を形成し、糖成分によってβ－マンナン（β-mannan）、グルコマンナン（glucomannan）、ガラクトマンナン（galactomannan）、ガラクトグルコマンナン（galactoglucomannan）に分けられる。β－マンナンは、アイボリーナット（ivory nut）をはじめとする非マメ科植物に存在するものであり、β－１，４結合マンノース（beta-1,4-linked mannose）で形成された骨格を有する非置換線形ポリマーである。グルコマンナンは、コンニャク（konjac）に存在するものであり、β－１，４結合マンノースとグルコースが規則的に交互に繰り返される構造の骨格を有するポリマーである。ガラクトマンナン及びガラクトグルコマンナンは、それぞれマンノース残基のＯ－６に結合されたα－ガラクトースを有するβ－マンナン及びグルコマンナンである。ガラクトマンナンはマメ科植物の種内に大量に存在し、アセチル化されたガラクトグルコマンナンは軟質木の主要構成成分である。

β－Ｄ－マンナナーゼ（Mannan endo-1,4-beta-mannosidase; EC 3.2.1.78）は、ガラクトマンナン（galactomannan）、グルコマンナン（glucomannan）、ガラクトグルコマンナン（galactoglucomannan）及びマンナン（mannan）から構成される１，４－β－Ｄ－マンナンをランダムに分解する特性を有するエンド（endo）型の加水分解酵素である。マンナンは抗栄養因子として知られるマメ、グアー、アルファルファ、パーム核粕、コプラなどの様々な植物性材料の構成成分であり、これらの消化吸収を活性化するためには、マンナンの分解が必須である。よって、様々なマンナナーゼが飼料用酵素として用いられている。

動物が飼料を摂取すると、栄養分を吸収するために、中性ｐＨの腸内で様々な酵素によりそれらを分解する。しかし、マンナナーゼは中性ｐＨにおいて相対的に活性が低いので、飼料用酵素の適用に限界がある。よって、腸内ｐＨ条件におけるマンナナーゼの活性改善に関する研究の必要性が高まっている。

韓国公開特許第１０－２０１６－００４５４６５号公報

Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444 Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277 Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453 Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984) Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990) Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994 [CARILLO et al.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745 J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797 Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066 Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518 Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374 Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64 Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900 Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22 : 4673-4680 Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615 Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815 McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881 Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919 Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96 Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747 Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567 Irwin H. Segel, Enzyme kinetics, John Wiley & Sons, 1979 A. G. Marangoni, Enzyme kinetics, Wiley-Interscience, 2003 A. Fersht, Enzyme structure and mechanisms, John Wiley & Sons, 1981 Structure and Mechanism in Protein Science: A guide to enzyme catalysis and protein folding, Alan Fersht, W.H. Freeman, 1999 Fundamentals of Enzyme Kinetics, Athel Cornish-Bowden, Wiley-Blackwell 2012 Voet ef al. "Biochemie" [Biochemistry], 1992, VCH-Verlag, Chapter 13, pages 331-332 with respect to enzymatic activity Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)

本出願は、マンナナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドを提供することを目的とする。

一具体例として、前記変異型ポリペプチドは、配列番号３～６のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなる変異型ポリペプチドである。

また、本出願は、本出願の変異型ポリペプチドを含む組成物を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、本出願の変異型ポリペプチドを含むマンナン含有物質との反応用組成物を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、マンナン含有物質との反応のための、前記変異型ポリペプチド及び／又は前記変異型ポリペプチドを含む組成物の用途を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドを発現する宿主細胞、及び／又は前記変異型ポリペプチドを含む組成物とマンナンを接触させるステップを含む、マンノース、マンノビオース、マンノトリオース又は長鎖マンノオリゴ糖を製造する方法を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドを発現する宿主細胞、及び／又は前記変異型ポリペプチドを含む組成物でマンナン含有物質を処理するステップを含む、マンナン含有物質を分解する方法を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記ポリヌクレオチドを含む核酸構築物を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記ポリヌクレオチド又は前記核酸構築物を含むベクターを提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記変異型ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記核酸構築物及び／又は前記ベクターを含む宿主細胞を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記宿主細胞を培養するステップと、前記培養ステップで発現する前記変異型ポリペプチドを回収するステップとを含む、変異型ポリペプチドを製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、マンナナーゼ（mannanase）の活性を有する変異型ポリペプチド及びその用途を開発し、本出願を完成するに至った。

以下、発明を実施するための具体的な内容について説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。

また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。

本出願の明細書及び請求の範囲において用いられるように、単数型の冠詞（「ａ」、「an」及び「the」）には、特に断らない限り、複数型の対象が含まれる。特に断らない限り、単数型の用語には複数型が含まれ、複数型の用語には単数型が含まれる。本出願の明細書及び請求の範囲において、特に断らない限り、「又は」は、「及び／又は」を含む意味で用いられる。

本出願における「約（about）」は、特定の数値の前に用いられる。本出願における「約」とは、約という用語の後に続く正確な数値のみでなく、ほとんどその数値であるか、又はその数値に近い範囲をも含むものである。その数値が用いられた文脈を考慮すると、言及された具体的な数値と近いか、ほとんどその数値であるかを決定することができる。一例として、「約」は、所定の数値の－１０％～＋１０％の範囲を示す。他の例として、「約」は、所定の数値の－５％～＋５％の範囲を示す。しかし、これらに限定されるものではない。

本出願における「第一、第二、第三、」、「ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、」、「（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、」などは、類似した構成を区別するために用いられるものであり、連続的であることや、順番に行われることを意味するものではない。例えば、上記用語が方法、用途又は分析のステップ（step）に関して用いられる場合、それらのステップ間に時間的な間隔がなくてもよく、同時に行われてもよく、数秒、数分、数時間、数日又は数カ月の間隔をおいて行われてもよい。

本出願における「本質的に～からなる（consisting essentially of）」とは、本出願が請求する対象の特徴が不特定成分の存在に実質的に影響を受けない場合に、前記不特定成分が存在することを意味する。

本出願における「からなる（consisting of）」とは、特定成分の比率が合計１００％であることを意味する。「からなる」と言及される成分又は特徴は、必須であるか、義務的なものである。一具体例においては、「からなる」と言及される成分又は特徴以外に、他の任意の成分又は必須でない成分は排除される。

本出願における「含む（comprising）」とは、上記用語により言及される特徴、ステップ又は構成要素が存在することを意味し、１つ以上の特徴、ステップ又は構成要素の存在又は追加を排除するものではない。本出願において「含む」と言及される成分又は特徴は、必須であるか、義務的なものであるが、一具体例においては、他の任意の又は必須でない成分又は特徴をさらに含んでもよい。

本出願における「含む」は、一具体例において、「本質的に～からなる」又は「からなる」という意味で用いられる。

本出願において、アミノ酸配列に関して、特定配列番号で表されるアミノ酸配列を「含む」ポリペプチド、特定配列番号で表されるアミノ酸配列「からなる」ポリペプチド、又は特定配列番号で表されるアミノ酸配列を「有する」ポリペプチドもしくはタンパク質と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にタンパク質の機能を変更しない配列の付加、自然に発生し得る突然変異、その非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本出願における「タンパク質」又は「ポリペプチド」とは、連続的なアミノ酸残基のポリマー又はオリゴマーを意味する。本出願における「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」は、「アミノ酸配列」と互換的に用いられる。

場合によっては、活性を示すアミノ酸配列を「酵素」という。本出願におけるアミノ酸配列は、特に断らない限り、Ｎ末端→Ｃ末端の方向で記載されている。

細胞、核酸、ポリペプチドもしくはベクターに関して、本出願における「組換え」とは、細胞、核酸、ポリペプチドもしくはベクターが異種（heterologous）核酸もしくはポリペプチドの導入や、天然核酸もしくはポリペプチドの変更により改変されること、又は細胞がそのように改変された細胞から誘導されることを意味する。よって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）の形態では見出されない遺伝子を発現するか、又は発現するか全く発現しないか、もしくは異常に発現する天然遺伝子を発現する。

本出願における「分離された（isolated）」ものとは、自然界では発生しない環境に存在するか、又は自然界には存在しない形態の物質を意味する。これは、自然界で自然に会合し、自然界で見出されるものと同様の物質、例えば配列、酵素又は核酸を有する少なくとも１つの他の成分から前記物質（配列、酵素又は核酸）が少なくとも実質的に分離されたものを含む。

例えば、本出願において提供する分離された配列、酵素又は核酸は、少なくとも１つの汚染物質が実質的にない形態で提供される。

分離された物質の例としては、ｉ）非自然発生（non-naturally occurring）の任意の物質、ｉｉ）自然状態で結合された（associated）１つ、それ以上又は全ての自然発生する構成が除去された任意の物質（例えば、酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補因子（cofactor））、ｉｉｉ）自然界で見出される物質が人為的に改変された任意の物質、又はｉｖ）自然に結合された他の構成成分に比べてその物質の量が変更されるように改変された物質（例えば、特定物質をコードする遺伝子のコピー数の増加、特定物質をコードする遺伝子と自然に連結されたプロモーターの活性が強いプロモーターへの改変など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本出願における「野生型」とは、人為的な改変のない天然（naturally-occurring）のものを意味する。前記「野生型」がポリペプチドに関して用いられる場合、天然（naturally occurring）ポリペプチドであって、１つ以上のアミノ酸位置における人為的な変異（置換、挿入、欠失など）を有さないものを意味する。それと同様に、前記「野生型」がポリヌクレオチドに関して用いられる場合、１つ以上のヌクレオチドにおける人為的な改変（置換、挿入、欠失）を有さないものを意味する。しかし、野生型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然ポリヌクレオチドに限定されるものではなく、任意の野生型ポリペプチドをコードする配列も含まれる。

本出願における親配列（parent sequence）又は骨格（backbone）とは、改変（modification）を導入すると変異型ポリペプチドになる基準配列を意味する。すなわち、親配列は、開始配列（starting sequence）であって、置換、挿入及び／又は欠失などの変異を導入する対象である。前記親配列は、天然（naturally occurring）のもの又は野生型（wild type）であってもよく、前記天然のもの又は野生型に１つ以上の置換、挿入又は欠失が発生した変異体（variant）であってもよく、人為的に合成された配列であってもよい。前記親配列が活性を示すアミノ酸配列、すなわち酵素のアミノ酸配列であれば、親酵素（parent enzyme）という。

本出願における「参照配列（reference sequence）」とは、任意のアミノ酸配列中のアミノ酸の位置（position）の決定に用いられる配列を意味する。任意のアミノ酸配列と参照配列をアラインメント（align）すると、任意のアミノ酸配列中における参照配列の特定位置に相当するアミノ酸の位置を決定することができる。

本出願において、アミノ酸又は核酸配列に関して、「断片」とは、親配列（parent sequence）の一部を意味する。例えば、親配列において１つ以上のアミノ酸がＣ又はＮ末端から除去された形態のポリペプチドであってもよい。

本出願における酵素の「断片」は、「機能的フラグメント（functional fragment）」であってもよい。「機能的フラグメント」とは、活性断片（active fragment）ともいい、親酵素の一部であると共に、親酵素の酵素活性を有するポリペプチドを意味する。例えば、酵素の機能的フラグメントは、酵素の活性部位（catalytic site）を含むものであってもよい。

酵素の断片は、親酵素の全長（full length）の一部を含むものであってもよい。例えば、親酵素の全長の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％以上、１００％未満のアミノ酸を含むものであってもよい。

本出願における「変異／改変させる（modifying）」とは、変化（changing）又は変更（altering）させることを意味する。これは、自然発生するものからの変更であってもよい。例えば、酵素が親配列又は参照配列から変更されるようにする方法で酵素を変化させることができる。

本出願における改変された酵素は、それ自体で天然に存在しない、すなわち非自然発生（non-naturally occurring）の酵素であってもよい。

本出願における「改変された（modified）」とは、例えばその自然発生する形態から変更されたことを意味する。本出願の改変された酵素は、非自然発生の酵素や自然発生の変異体を含むものである。例えば、本出願の改変された酵素は、自然界では見出されない改変された酵素である。例えば、本出願の改変された酵素は、自発的に（spontaneously）発生しないものであるが、これに限定されるものではない。

本出願における「改変（modification）」がアミノ酸／核酸配列に関して用いられる場合、アミノ酸配列の少なくとも１つの部位における異なるアミノ酸／核酸残基への親配列のアミノ酸／核酸残基の置換（substitution）、少なくとも１つの部位における親配列のアミノ酸／核酸残基（又は一連のアミノ酸／核酸残基）の欠失（deletion）、少なくとも１つの部位における親配列のアミノ酸／核酸残基（又は一連のアミノ酸／核酸残基）の挿入（insertion）、Ｎ末端及び／もしくはＣ末端のアミノ酸配列又は５’及び／もしくは３’核酸配列の切断（truncation）、並びにそれらの任意の組み合わせが含まれる。

本出願における酵素の「変異体（variant）」又は「変異型ポリペプチド（modified polypeptide）」とは、少なくとも１つのアミノ酸が保存的置換（conservative substitution）及び／又は改変（modification）により親酵素とは異なるタンパク質を意味する。「変異体」と「変異型ポリペプチド」は互換的に用いられる。前記変異体又は変異型ポリペプチドは、非自然発生（non-naturally occurring）のものであるが、これに限定されるものではない。

前記変異体は、少なくとも１つの改変、例えばアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入により親酵素の配列とは異なる。

このような変異体は、一般に前記親酵素における少なくとも１つのアミノ酸を改変し、その改変したタンパク質の特性を評価することにより識別することができる。すなわち、変異体の能力は、親酵素より向上するか、変わらないか、又は低下する。

また、一部の変異体には、Ｎ末端リーダー配列や膜貫通ドメイン（transmembrane domain）などの少なくとも１つの部分が除去された変異型ポリペプチドも含まれる。

他の変異体には、成熟タンパク質（mature protein）のＮ及び／又はＣ末端から一部分が除去された変異体も含まれる。

「変異体」又は「変異型ポリペプチド」は、変異型、改変、変異したタンパク質、変異などの用語（英語表現では、modification、modified protein、mutant、mutein、divergent、variantなど）と混用されるが、変異を意味する用語であればいかなるものでもよい。

変異体は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に（co-translationally）又は翻訳後に（post-translationally）タンパク質の移転（transfer）に関与するタンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合されてもよい。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製又は合成できるように、他の配列又はリンカーに結合されてもよい。

例えば、前述した翻訳と同時に（co-translationally）又は翻訳後に（post-translationally）タンパク質の移転（transfer）に関与するタンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合された変異体は、これに限定されるものではないが、配列番号７のポリペプチドである。また、マンナナーゼ活性を有するものであれば、配列番号７のポリペプチドと約６０％、７０％、７５％。８０％。８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドであってもよく、配列番号７のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、タンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合された変異体に含まれるが、これらに限定されるものではない。

また、例えば、タンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合された変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでもよい。本出願の一例として、前記ポリヌクレオチドは、配列番号８の配列を有するものであってもよく、含むものであってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、配列番号８の配列からなるものであってもよく、必須に構成されるものであってもよい。具体的には、前記ポリヌクレオチドは、配列番号８の配列と相同性又は同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列を有するものであってもよく、含むものであってもよく、配列番号８の配列と相同性又は同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列からなるものであってもよく、必須に構成されるものであってもよい。

本出願における「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。

本明細書全体を通して、天然に存在するアミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられる。また、本出願において略語で言及したアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法に従って記載したものである。
アラニン Ａｌａ，Ａ
アルギニン Ａｒｇ，Ｒ
アスパラギン Ａｓｎ，Ｎ
アスパラギン酸 Ａｓｐ，Ｄ
システイン Ｃｙｓ，Ｃ
グルタミン酸 Ｇｌｕ，Ｅ
グルタミン Ｇｌｎ，Ｑ
グリシン Ｇｌｙ，Ｇ
ヒスチジン Ｈｉｓ，Ｈ
イソロイシン Ｉｌｅ，Ｉ
ロイシン Ｌｅｕ，Ｌ
リシン Ｌｙｓ，Ｋ
メチオニン Ｍｅｔ，Ｍ
フェニルアラニン Ｐｈｅ，Ｆ
プロリン Ｐｒｏ，Ｐ
セリン Ｓｅｒ，Ｓ
トレオニン Ｔｈｒ，Ｔ
トリプトファン Ｔｒｐ，Ｗ
チロシン Ｔｙｒ，Ｙ
バリン Ｖａｌ，Ｖ

一方、任意のアミノ酸はＸａａ、Ｘと記載する。

また、天然に存在するアミノ酸だけでなく、Ａｉｂ（2-Aminoisobutyric acid）、Ｓａｒ（N-methylglycine）、α－メチルグルタミン酸（α-methyl-glutamic acid）などの他のアミノ酸に対して一般に許容される３文字コードが用いられる。

アミノ酸は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて分類される。よって、アミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。

例えば、電荷を帯びた側鎖（electrically charged amino acid）を有するアミノ酸のうち正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、電荷を帯びていない側鎖（uncharged amino acid）を有するアミノ酸のうち非極性アミノ酸（nonpolar amino acid）としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びプロリンが挙げられ、極性（polar）又は親水性（hydrophilic）アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ、前記非極性アミノ酸のうち芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられる。

本出願における「遺伝子（gene）」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、前記コード領域の前後の領域を含むポリヌクレオチドを意味する。一具体例において、遺伝子は、それぞれのコード領域（エクソン；exon）間に挿入される配列（イントロン；intron）を有するものであってもよい。

本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が関連する程度を意味し、百分率で表すことができる。相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。

保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドにおいて一般のコドン又はコドンの縮退を考慮したコドンを有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることは言うまでもない。

任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献１のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献３）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５、６及び７を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができるが、これらに限定されるものではない。

ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献８に開示されているように、非特許文献３などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献９に開示されているように、非特許文献１０の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。

また、任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される適切なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献１１、１２）で決定されるが、これらに限定されるものではない。

本出願における「成熟ポリペプチド（mature polypeptide）」とは、シグナル配列（signal sequence）やプロペプチド配列（propeptide sequence）がない形態のポリペプチドを意味する。成熟タンパク質／ポリペプチド／ペプチドは、タンパク質／ポリペプチド／ペプチドの機能的形態であってもよい。成熟ポリペプチドは翻訳後の又は翻訳後修飾を経た最終形態（final form）であってもよい。翻訳後修飾の例としては、Ｎ又はＣ末端の改変、グリコシル化、リン酸化、リーダー配列（leader sequence）の除去などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本出願における「核酸構築物（nucleic acid construct）」とは、少なくとも１つの調節配列（regulatory sequence）を含み、人為的に合成されるか、自然界に存在しない方法で特定配列を含むように操作されるか、自然界から分離された一本鎖又は二本鎖核酸分子を意味する。

本出願における「発現」には、ポリペプチドの生成に関与する任意のステップ、例えば転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、分泌などが含まれるが、これらに限定されるものではない。

本出願における「発現ベクター」とは、コード配列及びその発現のために作動可能に連結された調節配列を含む線状又は環状核酸分子を意味する。

本出願における「作動可能に連結された」ものとは、調節配列がコード配列の発現を示すように調節配列が適切な位置に配置された構成を意味する。よって、「作動可能に連結された」ものには、プロモーター、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー領域などの周知又は所望の活性を有する機能的ドメインの調節領域がターゲット（遺伝子又はポリペプチド）の発現、分泌又は機能をその周知又は所望の活性に応じて調節できるように、そのターゲットに付着又は連結されたものが含まれる。

本出願における「ｃＤＮＡ」とは、真核又は原核細胞から得られる成熟した、スプライシングされたｍＲＮＡ分子から逆転写により作製されるＤＮＡ配列を意味する。ｃＤＮＡ配列は、対応するゲノムＤＮＡに存在するイントロン配列を含まない。初期の１次ＲＮＡ転写物は、スプライシングを含む一連のステップにより処理されて成熟した、スプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前のｍＲＮＡの前駆体である。

本出願における「調節配列（regulatory sequence）」とは、コード配列の発現に必要なポリヌクレオチド配列を意味する。それぞれの調節配列は、コード配列に対して天然（起源が同一である）の配列であってもよく、外来（foreign；他の遺伝子に由来する）の配列であってもよい。前記調節配列の例としては、リーダー配列（leader sequence）、ポリアデニル化配列（polyadenylation sequence）、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列が挙げられる。前記調節配列の最小単位は、プロモーター、転写及び翻訳終結配列を含むものである。

本出願における「相当する（corresponding to）」は、タンパク質もしくはポリペプチドにおいて列挙される位置のアミノ酸残基であるか、又はタンパク質もしくはポリペプチドにおいて列挙される残基に類似、同一もしくは相当するアミノ酸残基を意味する。相当する位置のアミノ酸を確認することは、特定配列を参照する配列の特定アミノ酸を決定することになる。本出願における「相当領域」とは、一般に関連タンパク質又は比較（reference）タンパク質における類似又は対応する位置を意味する。

例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号１とアラインメント（align）すると、それに基づいて、前記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の数、位置を参照してナンバリングすることができる。例えば、本出願における配列アラインメントアルゴリズムは、クエリー配列（「参照配列」ともいう）と比較すると、アミノ酸の位置、又は置換、挿入、欠失などの改変が生じる位置を確認することができる。

このようなアラインメントには、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（非特許文献３）、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）などを用いることができるが、これらに限定されるものではない。

また、多重配列アラインメント（Multiple sequence alignment）により、他のマンナナーゼにおいて相当するアミノ酸残基を識別することができる。当該技術分野で公知の多重配列アラインメントプログラムの例として、ＭＵＳＣＬＥ（multiple sequence comparison by log-expectation；バージョン３．５又はそれ以降のバージョン；非特許文献１３）、ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７又はそれ以降のバージョン；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）などのプログラム、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗを用いるＥＭＢＯＳＳ ＥＭＭＡ（１．８３又はそれ以降のバージョン；非特許文献１９）などが挙げられ、上記各プログラムのデフォルトパラメーターを用いることができるが、これらに限定されるものではない。

その他に、配列番号１の成熟ポリペプチドから分離された酵素が従来の配列ベースの比較でそれらの関係を検出できない場合、他のペアワイズ配列（pairwise sequence）比較アルゴリズムが用いられる（非特許文献２０）。配列ベースの検索においては、データベースを検索するためのポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率的表現を用いる検索プログラムにより高感度（sensitivity）が得られる。例えば、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベース検索過程により、プロファイルを算出し、遠縁の相同体（remote homolog）を検出することができる（非特許文献２１）。ポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーがタンパク質構造データベースにおいて少なくとも１つの表現を有する場合は、はるかに大きな感度が得られる。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（非特許文献２２；非特許文献２３）などのプログラムは、クエリー配列（query sequence）の構造的折り畳みを予測するニューラルネットワークへの入力としてＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アラインメントプロファイル、溶媒和ポテンシャルなどの様々な供給源からの情報を用いる。同様に、非特許文献２４の方法は、未知の構造の配列とＳＣＯＰデータベースに存在するスーパーファミリーモデルをアラインメントするために用いられる。これらのアラインメントはポリペプチドに対する相同性モデルを生成するために順次用いられ、これらのモデルはその目的のために開発された様々なツールを用いて正確性の評価が行われる。

公知の構造のタンパク質に対しては、構造的アラインメントを検索して作成するために複数のツール及びリソースが用いられる。例えば、タンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーは構造的にアラインメントされており、このアラインメントはアクセス及びダウンロードが可能である。２つ以上のタンパク質構造は、ディスタンスアラインメントマトリックス（distance alignment matrix）（非特許文献２５）、ＣＥ（Combinatiorial extension）（非特許文献２６）などの様々なアルゴリズムを用いてアラインメントすることができる。これらのアルゴリズムの実現は、可能性のある構造的相同体を見出すべく、対象構造を有する構造データベースにクエリーを行うためにさらに用いられてもよい（非特許文献２７）。

前述した方法は一例であり、これらに限定されるものではない。

以下、本出願の具体例をより詳細に説明する。

本出願におけるマンナナーゼとは、マンナンにおいて１，４－β－Ｄ－マンナンをランダムに分解するという特性を有するエンド（endo）型の加水分解酵素を意味する。例えば、β－Ｄ－マンナナーゼ（Mannan endo-1,4-beta-mannosidase）であってもよい。例えば、ＥＣ番号が３．２．１．７８の酵素であるが、これに限定されるものではない。本出願における前記マンナナーゼは、「β－Ｄ－マンナナーゼ」及び「エンド－１，４－β－マンナナーゼ」と混用される。

本出願におけるマンナナーゼ活性は、本出願の実施形態をはじめとする当該技術分野で公知の方法を用いることにより測定及び評価することができる。

本出願における「親マンナナーゼ（Parent mannanase）」とは、本出願の変異体又は変異型ポリペプチドを生産するために改変が加えられるマンナナーゼを意味する。具体的には、親マンナナーゼ、親酵素又は親配列は、自然発生するポリペプチド又は野生型ポリペプチドであってもよく、その成熟ポリペプチドであってもよく、その変異体又は機能的フラグメントを含んでもよく、マンナナーゼ活性を有して変異体の母体となるポリペプチドであれば、これらに限定されるものではない。

本出願において提供する親マンナナーゼ（Parent mannanase）は、これに限定されるものではないが、配列番号１のポリペプチドである。また、マンナナーゼ活性を有するものであれば、配列番号１のポリペプチドと約６０％、７０％、７５％。８０％。８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドであってもよく、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、親マンナナーゼ（Parent mannanase）に全て含まれる。

本出願の親マンナナーゼ（Parent mannanase）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。本出願の一例として、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２の配列を有するものであってもよく、含むものであってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２の配列からなるものであってもよく、必須に構成されるものであってもよい。

本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により又は本出願の親マンナナーゼ（Parent mannanase）を発現させる生物において好まれるコドンを考慮し、本出願の親マンナナーゼ（Parent mannanase）のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変が行われてもよい。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２の配列と相同性又は同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列を有するものであってもよく、含むものであってもよく、配列番号２の配列と相同性又は同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列からなるものであってもよく、必須に構成されるものであってもよい。

本出願において提供する変異体の親マンナナーゼ（Parent mannanase）は、アスペルギルス（Aspergillus）属由来のものであってもよい。具体的には、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のものであってもよい。

一方、前述した微生物は、本出願において提供する親マンナナーゼ（Parent mannanase）が由来する微生物の一例であり、微生物の名称に関係なく、それと分類学的に相同である微生物も含まれる。

前述した微生物は、ＡＴＣＣ、ＤＳＭＺ、ＣＢＳ、ＮＲＲＬ、ＫＣＴＣ、ＫＣＣＭなどの公知の微生物寄託機関から分譲されてもよい。

本出願における特定微生物に「由来する（derived from）」配列には、その微生物から自然生成されるか、生成可能であるものだけでなく、その遺伝子を含む微生物から生成されて分離される遺伝子によりコードされる配列も含まれる。

例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属由来マンナナーゼには、アスペルギルス（Aspergillus）から自然に生産されるマンナナーゼ活性を有する酵素だけでなく、アスペルギルス（Aspergillus）ｓｏｕｒｃｅから生産されるものや、当該技術分野で公知の遺伝的改変（例えば、前記酵素をコードする配列に形質転換する）により他の宿主細胞から生産されるものも含まれる。

本出願における「マンナナーゼ活性を有する変異型ポリペプチド」は、親マンナナーゼの変異体であってもよい。

本出願における「親マンナナーゼの変異体」又は「マンナナーゼ変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸が親マンナナーゼ（Parent mannanase）のアミノ酸配列とは異なり、マンナナーゼの活性を有するタンパク質を意味する。

前記「マンナナーゼ活性を有する変異型ポリペプチド」、「親マンナナーゼの変異体」、「マンナナーゼ変異体」は混用される。

本出願において提供する変異体は、マンナナーゼ活性を有すると共に、親マンナナーゼ（Parent mannanase）配列に少なくとも１つのアミノ酸の改変（modification）を含むものであってもよい。また、前記変異体は、ｉ）配列番号１と７０％以上、１００％未満の配列同一性を有するポリペプチドであり、かつ／あるいはｉｉ）前記変異型ポリペプチドは、配列番号１の成熟ポリペプチドをコードする配列と７０％以上、１００％未満の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであり、かつ／あるいはｉｉｉ）前記変異型ポリペプチドは、（ａ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列、（ｂ）そのｃＤＮＡ、又は（ｃ）前記（ａ）もしくは（ｂ）の全長相補配列（full-length complement）と低いストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、中の上程度のストリンジェンシー条件、高いストリンジェンシー条件、又は非常に高いストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであり、かつ／あるいはｉｖ）前記変異型ポリペプチドは、マンナナーゼ活性を有するｉ）、ｉｉ）又はｉｉｉ）のポリペプチドの機能的フラグメントであってもよい。

具体的には、本出願において提供する変異体は、マンナナーゼ活性を有すると共に、親マンナナーゼ配列に少なくとも１つのアミノ酸の改変（modification）を含み、親マンナナーゼに対して少なくとも１つの変更された機能又は特性を有するものであってもよい。

一具体例として、本出願において提供する変異体は、マンナナーゼ活性を有すると共に、親マンナナーゼ配列に少なくとも１つのアミノ酸の改変（modification）を含み、親マンナナーゼに対して少なくとも１つの変更された機能又は特性を有し、少なくとも１つの保存的置換を有するものであってもよい。

本出願において提供する変異体は、親マンナナーゼの変異体であって、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。

一具体例として、本出願において提供する変異体は、配列番号３～６のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

前述した具体例のうちの一具体例として、本出願の変異体は、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するか、含むものであってもよく、前記アミノ酸配列から必須に構成される（essentially consisting of）か、からなるものであってもよい。

前述した具体例のうちの一具体例として、本出願の変異体は、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％又は９９．９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。また、このような相同性又は同一性を有して本出願の変異体に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも本出願に含まれることは言うまでもない。

一具体例として、本出願において提供する変異体は、翻訳と同時に（co-translationally）又は翻訳後に（post-translationally）タンパク質の移転（transfer）に関与するタンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合された変異体であってもよい。「タンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合された変異体」については前述した通りである。

前記タンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合された変異体のアミノ酸配列中のアミノ酸の位置（position）を決定するために、配列番号７が参照配列（reference sequence）として用いられてもよい。

本出願において提供する変異体は、他のマンナナーゼ、例えば野生型マンナナーゼ、親マンナナーゼ、他のマンナナーゼ変異体などと比較して、選択又は検出されるポリペプチドの任意の特性又は属性が少なくとも１つ変更されたものであってもよい。

前記特性又は属性には、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、アルカリ安定性、ｐＨ活性プロファイル、タンパク質分解に対する耐性、Ｋｍ、ｋ_ｃａｔ、ｋ_ｃａｔ／Ｋｍ比、タンパク質フォールディング、免疫反応誘導、リガンドに結合する能力、受容体に結合する能力、分泌される能力、細胞の表面に提示される能力、オリゴマーを形成する能力、シグナルを送る能力、細胞増殖を促進する能力、細胞増殖を抑制する能力、アポトーシスを誘導する能力、リン酸化又はグリコシル化により修飾される能力、及び／又は疾患を治療する能力が含まれるが、これらに限定されるものではない。

具体的には、本出願において提供する変異体は、親配列に比べて耐熱性及び／又は熱安定性が向上したものであってもよい。例えば、本出願の変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドに比べて耐熱性及び／又は熱安定性が向上したものであるが、これらに限定されるものではない。

具体的には、本出願において提供する変異体は、親配列に比べてｐＨ５．０～ｐＨ９．０、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０、ｐＨ５．０～ｐＨ７．５、又はｐＨ５．５～ｐＨ７．０における酵素活性が向上したものであってもよい。すなわち、本出願において提供する変異体は、動物の腸内ｐＨの範囲で高い酵素活性を示すので、効率的な加水分解物が得られる。例えば、本出願の変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドに比べてｐＨ５．０～ｐＨ９．０における酵素活性が向上したものであるが、これに限定されるものではない。

本出願における「酵素活性（enzymatic activity）」とは、少なくとも１つの触媒活性（catalytic activity）を意味する。具体的には、主にｋ_ｃａｔ／Ｋｍで表される酵素の変換効率であるが、これに限定されるものではない。

ｋ_ｃａｔとは、酵素が基質で完全に飽和したときに、１つの酵素により単位時間に生成物に変換される速度定数（catalytic constant）を意味し、ターンオーバー数（turnover number）ともいう。Ｋｍは、反応速度が最高値（Ｖｍａｘ）の半分のときの基質濃度（substrate concentration）である。

酵素活性を表す方法の例として、特異的活性（specific activity; umol of converted substrate × mg^-1× min^-1）、ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ（umol of converted substrate × mL^-1× min^-1）などが挙げられる。

しかし、酵素活性については、上記内容に限定されるものではなく、非特許文献２８、２９、３０、３１、３２、３３などに開示されている内容に基づいて定義し、評価することができる。

一具体例として、本出願において提供する変異体は、親酵素に対して約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１７１％、約１７２％、約１７３％、約１７４％、約１７５％、約１７６％、約１７７％又は約１８０％以上の向上した酵素活性を有するものであってもよい。前述した具体例のうちの一具体例として、前記親酵素は、配列番号１で表されるポリペプチドであってもよい。

本出願における「特異的活性（specific activity）」とは、タンパク質単位重量当たりの酵素活性を意味し、ｕｎｉｔ／ｍｇで表される。タンパク質の定量は、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙなどを用いて行うことができる。

酵素安定性（enzyme stability）とは、酵素活性が保存又は反応時間を通して保存されることを意味する。このような安定性の変化を測定するために、最初に酵素活性が決定された条件下で、０時間（time zero）（１００％）及び所定時間経過後（ｘ％）に測定して比較することにより、酵素活性が喪失するレベル又は酵素安定性を表すことができる。

酵素活性に影響を及ぼす要素としては、例えば、ｐＨ、熱、他の物質（例えば、酸化剤、キレート剤）の存在などが挙げられる。

本出願における「ｐＨ安定性」とは、特定のｐＨ範囲でタンパク質が機能する能力（ability）を意味する。特定のｐＨ範囲でタンパク質が機能を維持すれば、「ｐＨ安定性」を有すると定義され、一具体例として、本出願において提供する変異体は、ｐＨ５．０～ｐＨ９．０、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０、ｐＨ５．０～ｐＨ７．５、又はｐＨ５．５～ｐＨ７．０において高い酵素活性を有するが、これらに限定されるものではない。

本出願における「熱安定性（thermal stability）」とは、特定の温度範囲でタンパク質が機能する能力を意味する。一具体例として、本出願において提供する変異体は、約２５℃～約１００℃の範囲で活性を有するが、これに限定されるものではない。

本出願における「耐熱性（thermal tolerance）」とは、タンパク質が特定の温度、例えば高熱又は極低温に曝露された後で機能する能力を意味する。例えば、耐熱性を有するタンパク質は、曝露された温度では機能せず、最適温度環境に戻ると再び機能するものであってもよい。

安定性の向上には、他の酵素、例えば野生型酵素、親酵素及び／又は他の変異体と比較した、高い酵素活性維持、タンパク質が機能を維持するｐＨ、温度及び／又は時間などの範囲の増加が含まれる。

安定性の低下には、他の酵素、例えば野生型酵素、親酵素及び／又は他の変異体と比較した、低い酵素活性維持、タンパク質が機能を維持するｐＨ、温度及び／又は時間などの範囲の減少が含まれる。

本出願における「基質特異性（substrate speicifity）」とは、基質及び基質と競合する分子を識別できる酵素の能力を意味する。基質特異性は、異なる基質に対する酵素の活性を測定することにより決定することができる。一具体例として、前記基質特異性の変化は、目的とする産物を生成する基質に対する特異性が向上する方向に変化するものであってもよい。他の具体例として、前記基質特異性の変化は、目的とする産物を生成する基質に対する特異性が低下する方向に変化するものであってもよい。

本出願において提供する変異体の変更された特性は、飼料、製パン、パルプ漂白（Pulp bleaching）などをはじめとする様々な産業分野に適用することのできる活性、改善された活性である。

本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドは、前述した変異体のコード配列を含んでもよい。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記ポリペプチドを発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、ポリペプチドのアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。

また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、本出願の変異体をコードする配列であればいかなるものでもよい。

前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（例えば、非特許文献１１、１２）に具体的に記載されている。

例えば、相同性もしくは同一性の高いポリヌクレオチド同士、４０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、さらに具体的には９９％以上の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチド同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的に６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。

ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願のポリヌクレオチドには、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。

具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。

ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（非特許文献３４参照）。

例えば、「高いストリンジェンシー」は、プローブのＴｍより約５～１０℃下で発生し、「中程度のストリンジェンシー」は、プローブのＴｍより約１０～２０℃下で発生し、「低いストリンジェンシー」は、Ｔｍより約２０～２５℃下で発生するが、これらに限定されるものではない。

例えば、「低いストリンジェンシー条件（low stringency condition）」は、サザンブロッティング標準手順に従って、少なくとも１００個のヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、剪断及び変性したサケ精子ＤＮＡ ２００ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ／ｍｌ、及び２５％ホルムアミドにて、４２℃で１２～２４時間行うプレハイブリダイゼーション（prehybridization）及びハイブリダイゼーションであってもよい。前述した担体物質は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．１～０．２％ＳＤＳを用いて、５０℃で１５分間それぞれ２回～３回洗浄される。

例えば、「中程度のストリンジェンシー条件（medium stringency condition）」は、サザンブロッティング標準手順に従って、少なくとも１００個のヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、剪断及び変性したサケ精子ＤＮＡ ２００ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ／ｍｌ、及び３５％ホルムアミドにて、４２℃で１２～２４時間行うプレハイブリダイゼーション（prehybridization）及びハイブリダイゼーションであってもよい。前述した担体物質は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．１～０．２％ＳＤＳを用いて、５５℃で１５分間それぞれ２回～３回洗浄される。例えば、「中の上程度のストリンジェンシー条件（medium-high stringency condition）」は、サザンブロッティング標準手順に従って、少なくとも１００個のヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、剪断及び変性したサケ精子ＤＮＡ ２００ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ／ｍｌ、及び３５％ホルムアミドにて、４２℃で１２～２４時間行うプレハイブリダイゼーション（prehybridization）及びハイブリダイゼーションであってもよい。前述した担体物質は、最終的に、１～２×ＳＳＣ、０．１～０．２％ＳＤＳを用いて、６０℃で１５分間それぞれ２回～３回洗浄される。

例えば、「高いストリンジェンシー条件（high stringency condition）」は、サザンブロッティング標準手順に従って、少なくとも１００個のヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、剪断及び変性したサケ精子ＤＮＡ ２００ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ／ｍｌ、及び３５％ホルムアミドにて、４２℃で１２～２４時間行うプレハイブリダイゼーション（prehybridization）及びハイブリダイゼーションであってもよい。前述した担体物質は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．１～０．２％ＳＤＳを用いて、６５℃で１５分間それぞれ２回～３回洗浄される。

本出願において提供する核酸構築物は、調節配列に適した条件下で好適な宿主細胞においてコード配列の発現を示す少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結された、本出願において提供する変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。

ポリヌクレオチドは、変異体の発現を可能にする様々な方法で操作される。発現ベクターによっては、ベクターにポリヌクレオチドを挿入する前にポリヌクレオチドを操作することが好ましいこともあり、それが必要とされることもある。そのような操作には、当該技術分野で公知の方法が用いられてもよい。

本出願において提供する「ベクター」とは、好適な宿主内で本出願の変異体を発現させることができるように、好適な発現調節領域（又は発現調節配列）に作動可能に連結された前記変異体をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記発現調節領域には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。

本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。

例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、染色体内で本出願において提供する変異体をコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（homologous recombination）により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。

本出願の宿主細胞は、本出願の変異体を発現するものであれば、いかなるものでもよい。

本出願の宿主細胞は、前述した変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、それを含む核酸構築物及び／又はベクターを含むものであってもよい。

前記核酸構築物又はベクターは、前述したように、染色体に組み込まれるか、又は自己複製される染色体外ベクターとして維持されてもよい。

本出願の宿主細胞は、複製中に起こる突然変異により、親細胞と同一ではない、親細胞の任意の子孫を含むものである。

宿主細胞は、変異体の組換え生成に有用な任意の細胞、例えば原核細胞又は真核細胞であってもよい。

原核宿主細胞は、任意のグラム陽性又はグラム陰性菌であってもよい。

グラム陽性菌には、バチルス、クロストリジウム、エンテロコッカス、ゲオバチルス、ラクトバチルス、ラクトコッカス、オセアノバチルス、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス及びストレプトマイセスが含まれるが、これらに限定されるものではない。

グラム陰性菌には、カンピロバクター、エシェリキア・コリ、フラボバクテリウム、フソバクテリウム、ヘリコバクター、イリオバクター、ナイセリア、シュードモナス、サルモネラ、ビブリオ（例えば、ビブリオ・ナトリエゲンス（Vibrio natriegens））及びウレアプラズマが含まれるが、これらに限定されるものではない。

一具体例として、前記バクテリア宿主細胞は、エシェリキア属宿主細胞であり、具体的にはエシェリキア・コリ細胞が含まれるものであるが、これらに限定されるものではない。

一具体例として、前記バクテリア宿主細胞は、バチルス属宿主細胞であり、具体的にはバチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウジ、バチルス・コアグランス、バチルス・フィルムス、バチルス・ラウタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・プミルス、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・サブティリス及びバチルス・チューリンゲンシス細胞が含まれるものであるが、これらに限定されるものではない。

一具体例として、前記バクテリア宿主細胞は、ストレプトコッカス属宿主細胞であり、具体的にはストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）及びストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）亜種ズーエピデミカス（Zooepidemicus）細胞が含まれるものであるが、これらに限定されるものではない。

一具体例として、前記バクテリア宿主細胞は、ストレプトマイセス属宿主細胞であり、具体的にはストレプトマイセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）及びストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）細胞が含まれるものであるが、これらに限定されるものではない。

一具体例として、前記バクテリア宿主細胞は、コリネバクテリウム属宿主細胞であり、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）又はコリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）であるが、これらに限定されるものではない。

宿主細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、真菌細胞などの真核生物であってもよい。

宿主細胞は、真菌細胞であってもよい。本出願における「真菌」には、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門及び接合菌門だけでなく、卵菌門及びあらゆる不完全菌類が含まれる。

真菌宿主細胞は、酵母細胞であってもよい。本出願の「酵母」には、子嚢胞子形成（ascosporogenous）酵母（エンドミケス（Endomycetales））、担子菌（basidiosporogenous）酵母及び不完全菌類（Fungi imperfecti）（ブラストミセス（Blastomycetes））に属する酵母が含まれる。ただし、これらの分類は変更されることもあり、非特許文献３５に説明されているように分類が定義される。

酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、ピキア（Pichia）、コマガタエラ（Komagataella）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）又はヤロウィア（Yarrowia）細胞、例えばクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Saccharomyces douglasii）、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、サッカロマイセス・オビフォルミス（Saccharomyces oviformis）、コマガタエラ・ファフィ（Komagataella phaffii）又はヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞であってもよい。

真菌宿主細胞は、糸状菌細胞であってもよい。「糸状菌」には、真菌門及び卵菌亜門のあらゆる糸状形態のものが含まれる（上記文献（Hawksworth et al., 1995）に定義された通りである）。糸状菌は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖類からなる菌糸壁を特徴とする。栄養成長は菌糸伸長によるものであり、炭素異化は絶対好気性である。それに対して、酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエによる栄養成長は単細胞葉状体（thallus）の発芽によるものであり、炭素異化は発酵性である。

糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ビルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フザリウム、フミコラ、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオフトラ、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロマイセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）又はトリコデルマ細胞であってもよい。

例えば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、ビルカンデラ・アデュスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・サブバーミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・パンニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クイーンズランジカム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・トロピカム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・ゾナタム（Chrysosporium zonatum）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）、フザリウム・バクトリディオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クロックウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レチクラタム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブシナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコセシオイデス（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・べネナタム（Fusarium venenatum）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ、ミセリオフテラ・サーモフィラ、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジアータ（Phlebia radiata）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。しかし、これらに限定されるものではない。

本出願の変異体を製造する方法は、宿主細胞を培養するステップを含むものであってもよい。

本出願における「培養」とは、前記宿主細胞を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行われる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び流加培養であるが、これらに限定されるものではない。

本出願における「培地」とは、前記宿主細胞を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給する。具体的には、本出願の宿主細胞の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の宿主細胞の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願の宿主細胞を培養することができる。

本出願における前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的にはグルコースや殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。

前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。

前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができる。しかし、これらに限定されるものではない。

また、前記宿主細胞の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加することにより、培地のｐＨを調整することができる。さらに、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。

培地の温度は、２０℃～５５℃、具体的には２５℃～４０℃であるが、これらに限定されるものではない。培養期間は、有用物質の所望の生成量が得られるまで続けられ、具体的には２４時間～１９６時間であるが、これらに限定されるものではない。

一具体例として、本出願のマンナナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドを製造する方法は、前記培養ステップで発現する本出願のマンナナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドを回収するステップをさらに含んでもよい。

他の具体例として、前記培養ステップで発現する変異体は、本出願の属する分野で周知の方法を用いて回収することができる。例えば、変異体は、収集、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、沈殿をはじめとする通常の手順で栄養培地から回収することができるが、これらに限定されるものではない。

前記回収方法は、本出願の宿主細胞の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて変異体を回収（collect）するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ及びそれらの組み合わせが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は宿主細胞から変異体を回収することができる。

さらに他の具体例として、培養ステップで宿主細胞により発現する変異体は、回収されなくてもよい。この具体例においては、変異体を発現する宿主細胞自体を変異体の供給源として用いることができる。

本出願の組成物は、マンナン（mannan）含有物質を分解するために用いてもよい。

本出願の組成物は、マンナン含有物質をマンノース、マンノビオース、マンノトリオース又は長鎖マンノオリゴ糖に変換するために用いてもよい。

本出願の組成物は、本出願において提供する変異体以外に、他の構成要素をさらに含んでもよい。当業者であれば、本出願の組成物に追加される構成要素を適宜選択することができる。

一具体例として、本出願の組成物は、マンナン含有物質をマンノース、マンノビオース、マンノトリオース又は長鎖マンノオリゴ糖に変換するために用いるのに適した任意の構成要素をさらに含んでもよい。

一具体例として、本出願の組成物は、動物飼料、製パン、バイオマス糖化、パルプ漂白などの様々な産業分野に適用するのに適した任意の構成要素をさらに含んでもよい。

追加される物質の例としては、安定化剤、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、分散剤、酵素、酵素安定剤、触媒剤、活性化剤、担体、合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、懸濁化剤、色素、香料、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、等張化剤、希釈剤、潤滑剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

一具体例として、本出願において提供する組成物は、本出願において提供する変異体以外に、自然発生の物質又は非自然発生（Non-naturally occurring）の物質をさらに含んでもよい。

一具体例として、本出願において提供する組成物は、本出願において提供する変異体以外に、動物飼料、製パン、バイオマス糖化、パルプ漂白（Pulp bleaching）などをはじめとする様々な産業分野で通常使用される追加の酵素をさらに含んでもよい。

例えば、前記追加の酵素として、β－アミラーゼ、セルラーゼ（β－グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼ）、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ（エンドマンナナーゼ、β－キシロシダーゼ、α－Ｌ－アラビノフラノシダーゼ、α－Ｄ－グルクロニダーゼ、フェルロイルエステラーゼ、クマロイルエステラーゼ(coumaroyl esterase)、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－マンナナーゼ(mannanase)又はβ－マンノシダーゼ）、イソアミラーゼ、イソメラーゼ、リパーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ及び／又はα－アミラーゼと共に商業的過程に有用なその他の酵素からなる群から選択される１つ以上の酵素をさらに含んでもよい。

本出願のマンナナーゼ変異体又は本出願のマンナナーゼ変異体を含む組成物は、任意のマンナン含有物質を分解するために用いられてもよい。

本出願におけるマンナン含有物質は、マンナナーゼにより分解される任意の物質である。例えば、前記マンナン含有物質は、ガラクトマンナン（galactomannan）、グルコマンナン（glucomannan）、ガラクトグルコマンナン（galactoglucomannan）、ローカストビーンガム（locust bean gum）及びマンナン（mannan）から選択される物質であってもよい。例えば、前記マンナン含有物質はマンナンであるが、これに限定されるものではない。

一具体例として、本出願は、マンナン含有物質を分解（又は崩壊）する方法を提供する。これをマンナンの可溶化ともいう。

本出願のさらなる実施形態において、前記方法は、マンナン分解に由来するポリマー分解（例えば、分解）に関するものである。

分解生成物（マンノース、マンノビオース、マンノトリオース及び長鎖マンノオリゴ糖）は、動物のエネルギー源や発酵工程の供給原料、例えばバイオ燃料（例えば、バイオエタノール）として用いられ、プレバイオティクスとして用いられる。

本出願の変異体、それを発現する宿主細胞、前記変異体及び／又は宿主細胞を含む組成物を用いてマンナンを分解することができる。マンナンの加水分解ステップにおいて、本出願の変異体以外に、補因子（cofactor）、補酵素（coenzyme）などが共に添加されてもよい。基質の加水分解ステップは、最適のｐＨ、温度条件などで行われ、当業者であれば適切な条件を選択することができる。

本出願のマンナナーゼ変異体は、ａ）動物飼料原料への添加剤、ｂ）動物用飼料の補充剤、及び／又はｃ）穀物ベースの物質（例えば、全粒穀物又は穀物の一部）の分解への応用のいずれかに用いられてもよい。

一具体例として、本出願のマンナナーゼ変異体は、飼料原料に用いられてもよい。

一具体例として、マンナン含有物質は、飼料原料又は飼料成分であってもよい。

本出願の飼料組成物とは、動物が食べて摂取し、消化させるための、もしくはそれに適した任意の天然もしくは人工の規定食、一食など、又は前記一食の成分を意味し、当該技術分野で公知の様々な形態に製造することができる。

一具体例として、本出願のマンナナーゼ変異体は、食品組成物又はその製造に用いてもよい。

一具体例として、マンナン含有物質は、穀物ベースの物質（全粒穀物もしくは穀物の一部、又は麦芽穀物、例えば麦芽大麦を含む）であってもよい。

一具体例として、マンナン含有物質は、穀粉（例えば、小麦、エンバク、ライ麦又は大麦粉）であってもよい。

一具体例として、マンナン含有物質は、オオムギ麦芽もしくは糖化液、麦芽大麦又はそれらの組み合わせであってもよい。

一例として、前記食品組成物は、ビール及びワインをはじめとする発酵飲料であってもよい。他の例として、前記食品組成物は、ローブ、ロール、バンズ、ピザ、プレッツェル、トルティーヤ、ケーキ、クッキー、ビスケット、クラッカーをはじめとするベーカリー製品である。しかし、これらに限定されるものではない。

本出願のマンナナーゼ変異体は、小麦グルテン・デンプン分離に用いられてもよい。

例えば、胚乳から小麦粕と小麦胚芽を初期分離し、その後小麦胚乳粉をデンプンとグルテン分画に分画化することにより、高品質のα－デンプン、副産物のβ－デンプン、及び活性グルテンを得るために用いられてもよい。

穀粉（例えば、小麦粉）をデンプンとグルテン分画に分離する方法において、その方法は、穀粉（例えば、小麦粉）、水及びマンナナーゼ変異体を混合するステップを含む。穀粉、水及びマンナナーゼ変異体は、同時に混合してもよく、順次混合してもよい。一実施形態において、マンナナーゼ変異体と混合する前に、穀粉（例えば、小麦粉）と水を混合してもよい。

本出願のマンナナーゼ変異体を小麦グルテン・デンプン分離に用いることにより、さらに高いα－デンプン収率及び／又はさらに優れた品質のグルテン（例えば、さらに優れた品質の活性グルテン）を生成することができる。

他の実施形態において、本出願のマンナナーゼ変異体は、穀物ベースの物質の分解に用いられてもよく、バイオ燃料（例えば、バイオエタノール）生産工程の一部に用いられてもよい。

例えば、本出願のマンナナーゼ変異体は、バイオ燃料（例えば、バイオエタノール）の生産、及びバイオ燃料産業における穀物ベースの物質の利用を向上させることができる。

例えば、バイオ燃料とマンナナーゼ変異体を液化、糖化、発酵、同時糖化、並びに発酵前もしくは発酵中及び発酵後に、又はそれらの組み合わせで混合するステップを行って用いてもよい。

本出願のマンナナーゼ変異体をバイオ燃料生産工程に適用すると、より多くの乾燥物質糖化液を工程に用いることができるか、最終シロップにおける固形物含有量が増加するか、熱伝達が向上するか、エネルギー要求量が低下するか、蒸発器に付着する汚染が減少するか、洗浄コストが減少するか、最終燃料の収率が増加するか、副産物の品質が改善されるか、蒸留後にカスの固体及び液体部分の分離が容易になるか、又は前述した利点の組み合わせが得られる。

本出願のマンナナーゼ変異体は、パルプ漂白に用いられてもよい。

例えば、パルプにおいて、着色されたリグニンがキシランを介して結晶セルロースに連結された状態にて、マンナナーゼ変異体で処理すると、キシランを分解して着色されたリグニンを放出することにより、パルプ漂白を促進することができる。

本出願のマンナナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドは、様々な産業分野において有用である。

本出願の変異型ポリペプチドのｐＨ５．０～ｐＨ７．５における活性を確認した結果を示す図である。 本出願の変異型ポリペプチドの耐熱性を確認した結果を示す図である。

以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示する好ましい実施形態にすぎず、本出願がこれらに限定されるものではない。なお、本明細書に記載されていない技術的事項は、本出願の技術分野又は類似技術分野における熟練した技術者が十分に理解し、容易に実施することのできるものである。

単一変異体の作製
実施例１－１．ランダム変異体の作製
ＡｎＭＡＮにランダム変異を導入し、マンガンと共にＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより、遺伝子増幅技術を用いて、様々なアミノ酸に置換されたＡｎＭＡＮ変異体を作製した。

具体的には、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）マンナナーゼ（mannanase）（ＡｎＭＡＮ）をコードする遺伝子（配列番号２）をＴｅｍｐｌａｔｅとし、Ｐｒｉｍｅｒ、ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（Taq 2X premix, Bioneer）を用いて、ＰＣＲにより変異遺伝子ライブラリーを作製した。ＰＣＲには、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｎｅｘｕｓ ＧＸ２を用いた。反応条件は、次の通りである。

最初の変性（Initial denaturation） － ９５℃，２ｍｉｎ
変性（Denaturation） － ９５℃，２０ｓｅｃ
アニーリング（Annealing） － ５０℃，１０ｓｅｃ
伸長（Extension） － ７２℃，１ｍｉｎ（ＤｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎからＥｘｔｅｎｓｉｏｎまでを３０ｃｙｃｌｅ）
最後の伸長（Final Extension） － ７２℃，５ｍｉｎ

増幅された変異遺伝子を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Takara, Cat. No. 639650）により、ＨＣＥプロモーターを有するｐＨＣＥベクターにクローニングした。次に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１菌株に形質転換し、その後特性評価のためにコロニーを９６ ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（bioneer）のＬＢ培地に接種して培養し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Merck）を培養液と１：１で混合して細胞破砕した。遠心分離により補酵素液（lysate）を分離し、それを新たな９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（SPL）に適量分注し、その後０．３％マンナン液と１：１で混合し、ｐＨ７．０のｐｈｏｓｐｈａｔｅバッファーで酵素反応させた。次いで、１０分後に、適量のＤＮＳ ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加して反応を停止させ、８５℃のオーブンに２０分間放置して発色させ、その後５４０ｎｍの吸光度で活性を測定した。活性が向上した変異体を選択し、シーケンシングにより変異位置を確認した。

本出願のＤＮＳ ｓｏｌｕｔｉｏｎ作製法は次の通りである。蒸留水５００ｍｌを含むビーカーに６．３ｇの３，５－ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ（samchun, D1267）の重量を正確に測定し、５０℃で２１ｇのＳｏｄｉｕｍ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ（Daejung, 7571-4400）を添加し、３００ｍｌの水にＰｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｏｄｉｕｍ ｔａｒｔｒａｔｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｔｅ（Daejung, 6618-4400）１８２ｇを加熱して溶解した予備溶液にＰｈｅｎｏｌ（Sigma-Aldrich, P1037）５ｇを添加し、Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ（Daejung, 7634-4405）５ｇを添加して溶解するまで攪拌し、その後冷却し、次いで蒸留水で１０００ｍｌにし、濾過して作製した。

その結果、配列番号３～５のアミノ酸配列を有するタンパク質が確認された。

実施例１－２．単一変異体の精製
実施例１－１で作製した優れた活性を示す単一変異体（それぞれ、配列番号３～５）、及びＡｎＭＡＮをコードする遺伝子でそれぞれ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１菌株を滅菌ＬＢ ｋａｎａｍｙｃｉｎ培地（BD Difco）５ｍｌに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１２時間培養した。培養した菌体を再度ＬＢ ｋａｎａｍｙｃｉｎ培地４００ｍｌに移し、３７℃、２００ｒｐｍで２４時間本培養し、遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体は、再度回収した菌体にｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）２０ｍｌを加えて再分散させ、その後ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ及び遠心分離により補酵素液を確保した。補酵素液をＮｉ－ＮＴＡ ｒｅｓｉｎ（Qiagen, Cat no. 30230）に流して吸着させ、その後ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒの組成中ｉｍｉｄａｚｏｌｅの濃度のみ２０ｍＭ）、Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒの組成においてｉｍｉｄａｚｏｌｅのみ２５０ｍＭ）を順次流し、精製した単一変異体と精製したＡｎＭＡＮを得た。

組み合わせ変異体の作製
実施例２－１．組み合わせ変異体の作製
実施例１－１で作製した優れた活性を示す単一変異体のうち、配列番号３及び４の変異位置を組み合わせた変異体（配列番号６）を作製した。具体的には、Ｔｅｍｐｌａｔｅ（配列番号２）、Ｐｒｉｍｅｒ、ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（Taq 2X premix, Bioneer）を用いて、ＰＣＲにより作製した。ＰＣＲには、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｎｅｘｕｓ ＧＸ２を用いた。反応条件は、次の通りである。

最初の変性（Initial denaturation） － ９５℃，２ｍｉｎ
変性（Denaturation） － ９５℃，２０ｓｅｃ
アニーリング（Annealing） － ５０℃，１０ｓｅｃ
伸長（Extension） － ７２℃，１ｍｉｎ（ＤｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎからＥｘｔｅｎｓｉｏｎまでを３０ｃｙｃｌｅ）
最後の伸長（Final Extension） － ７２℃，５ｍｉｎ

増幅された遺伝子を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Takara, Cat. No. 639650）により、ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ発現系を有するｐＨＣＥベクターにクローニングした。次に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄｈ５α菌株に形質転換し、その後シーケンシング（sequencing）により配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質を確認した。

実施例２－２．組み合わせ変異体の精製
実施例２－１で作製した組み合わせ変異体（配列番号６）をコードする遺伝子で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１菌株を滅菌ＬＢ ｋａｎａｍｙｃｉｎ培地（BD Difco）５ｍｌに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１２時間培養した。培養した菌体を再度ＬＢ ｋａｎａｍｙｃｉｎ培地４００ｍｌに移し、３７℃、２００ｒｐｍで２４時間本培養し、遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体は、再度回収した菌体にｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）２０ｍｌを加えて再分散させ、その後ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ及び遠心分離により補酵素液を確保した。補酵素液をＮｉ－ＮＴＡ ｒｅｓｉｎ（Qiagen, Cat no. 30230）に流して吸着させ、その後ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒの組成中ｉｍｉｄａｚｏｌｅの濃度のみ２０ｍＭ）、Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒの組成においてｉｍｉｄａｚｏｌｅのみ２５０ｍＭ）を順次流し、精製した組み合わせ変異体を得た。

実験例１．マンナナーゼ変異体の各ｐＨにおける活性の確認
マンナナーゼ変異体の各ｐＨにおける活性の測定のために、実施例１－２及び実施例２－２でそれぞれ精製した変異体及び精製したＡｎＭＡＮの適量を０．３％マンナン液と混合し、ｐＨ５．５の酢酸緩衝液又はｐＨ７．０のリン酸緩衝液で酵素反応させた。次に、３７℃で１０分間反応させ、その後適量のＤＮＳ ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加して反応を停止させた。次に、１００℃で１０分間放置して発色させ、その後５４０ｎｍの吸光度で活性を測定して評価した。

酵素活性として、相対活性（％）を計算した。それを図１及び表３に示す。

具体的には、野生株はＡｎＭＡＮをコードする遺伝子（配列番号２）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１菌株を用いて生産され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～６はそれぞれ配列番号３～６の変異体をコードする遺伝子でそれぞれ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１菌株を用いて生産された酵素の活性を示す図である。

その結果、図１及び表３に示すように、ｐＨ５．５及びｐＨ７．０の条件で相対的に低い活性を示すＡｎＭＡＮ（野生株）に比べて、単一変異体３種（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）において、それぞれ５０％、６０％、４９％高い活性を示し、組み合わせ変異体１種（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）においても、７７％高い活性を示すことが確認された。

実験例２．マンナナーゼ組み合わせ変異体の耐熱性の確認
マンナナーゼ変異体の耐熱性を確認するために、ＡｎＭＡＮをコードする遺伝子（配列番号２）、及び組み合わせ変異体（配列番号６）をコードする遺伝子でそれぞれ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１菌株を用いて、実施例１－２及び実施例２－２でそれぞれ精製した変異体及び精製したＡｎＭＡＮの耐熱性評価を行った。

具体的には、前述したように精製した変異体及び精製したＡｎＭＡＮをそれぞれ４０℃、５０℃、６０℃、７０℃及び８０℃で５分間ずつ放置し、それを０．３％マンナン液及びｐＨ５．５の酢酸緩衝液と混合し、その後３７℃で１０分間反応させた。反応後に、適量のＤＮＳ ｓｏｌｕｔｉｏｎで反応を停止させた。次に、混合液を１００℃で１０分間放置して発色させ、５４０ｎｍで測定して耐熱性を評価した。

その結果、図２に示すように、組み合わせ変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）は、ＡｎＭＡＮ（wild type）と同等の耐熱性を示すことが確認された。

以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

Claims (13)

1. マンナナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドであって、
   前記変異型ポリペプチドは、配列番号３～６のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなる変異型ポリペプチド。
2. 前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドに比べてｐＨ５．０～ｐＨ９．０における酵素活性が向上したものである、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
3. 前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドに比べて耐熱性及び／又は熱安定性が向上したものである、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチドを含む組成物。
5. 請求項１～３のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチド又は前記変異型ポリペプチドを含むマンナン含有物質との反応用組成物。
6. 請求項１～３のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドを発現する宿主細胞、及び／又は前記変異型ポリペプチドを含む組成物とマンナン含有物質を接触させるステップを含む、マンノース、マンノビオース、マンノトリオース又は長鎖マンノオリゴ糖を製造する方法。
7. 請求項１～３のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドを発現する宿主細胞、及び／又は前記変異型ポリペプチドを含む組成物で基質を処理するステップを含む、マンナン含有物質を分解する方法。
8. 請求項１～３のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
9. 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
10. 請求項８に記載のポリヌクレオチド、又は請求項９に記載の核酸構築物を含むベクター。
11. 請求項１～３のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチド、請求項８に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載の核酸構築物、及び／又は請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
12. 請求項１１に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、
    マンナナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドを製造する方法。
13. 前記培養ステップで発現する請求項１～３のいずれか一項に記載のマンナナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドを回収するステップをさらに含む、
    請求項１２に記載のマンナナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドを製造する方法。