CN114561418A

CN114561418A - 一株高产β-1，3-葡聚糖酶的黑曲霉突变菌

Info

Publication number: CN114561418A
Application number: CN202011363991.1A
Authority: CN
Inventors: 徐晓东; 陆娜
Original assignee: Weifang Kdn Biotech Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Weifang Kdn Biotech Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2040-11-27
Also published as: CN114561418B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供了一株高产β‑1，3‑葡聚糖酶的黑曲霉突变菌株及其应用。申请人首先将来源于巴伦葛兹类芽孢杆菌（Paenibacillus barengoltzii）的β‑1，3‑葡聚糖酶基因在黑曲霉（Aspergillus niger）宿主中过表达，构建得到重组表达该酶的基因工程菌株，然后进一步通过紫外诱变方法，筛选获得一株β‑1，3‑葡聚糖酶产量显著提高的突变菌，保藏编号为CCTCC NO:M2020699。该突变菌可广泛应用于β‑1，3‑葡聚糖酶的生产，有利于降低该酶的生产成本。

Description

一株高产β-1，3-葡聚糖酶的黑曲霉突变菌

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产β-1,3-葡聚糖酶的黑曲霉菌株及其应用。

技术背景

β-葡聚糖是一种非淀粉性多糖，广泛存在于植物和微生物的细胞壁中，是由葡萄糖以β-1,3和β-1,4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物。β-葡聚糖分子量比较大，分为水溶性和水不溶性2种，与蛋白质结合的β-葡聚糖大都不溶于水，水溶性β-葡聚糖所占比例较大。β-葡聚糖在水中溶解成为粘性溶液，浓度愈高，粘度愈大。高浓度β-葡聚糖会形成网状结构，吸收其周围的水分子，从而降低了周围环境的物理特性。β-葡聚糖是表层带负电荷的表面活性物质，在溶液中极易与带相反电荷的养分物质结合，从而影响养分的吸收。此外，β-葡聚糖还能吸附Ca²⁺、Zn²⁺、Na⁺等金属离子以及有机质，造成这些物质的代谢受阻。

β-葡聚糖酶属于水解酶类，对谷物中的β-葡聚糖具有水解作用。β-葡聚糖酶能够用于啤酒的澄清；在家畜饲料中添加该酶可以改善肠道菌群结构，促进营养物质的消化吸收，在真菌中用于原生质体的制备、细胞融合与转导；在植物中作为抗菌诱导剂抵御真菌病害等，因此在食品、生物技术、医药、饲料、农业等领域具有广泛的应用前景。目前β-葡聚糖酶的生产方法主要有两种，即提取分离法和发酵法。提取分离法主要应用于动物、植物生产β-葡聚糖酶，例如王骥等在甲壳类软体动物福寿螺体内发现了两种外切β-1,4-葡聚糖酶和不少于三种内切β-1,4-葡聚糖酶。国内外主要利用微生物来生产β-葡聚糖酶，其优点为：(1)种类繁多，易变异，可根据酶作用的pH值、作用温度及底物特异性的不同而定向选育产酶菌株；(2)微生物生长繁殖快，易获得纯培养，便于进行连续的工业化生产；(3)产酶周期短，原料来源广，发酵产物单纯，易获得高纯度制剂。

许多微生物能产生β-葡聚糖酶，主要是细菌、真菌和瘤胃微生物。微生物产β-葡聚糖酶系对β-葡聚糖多无特异性，只分解β-1,2、β-1,3、β-1,6键构成的纤维素及昆布聚糖等。这些产酶菌存在于青霉属、木霉属、曲霉属、镰刀菌属、毛霉属和纤维素诺卡氏菌属中；而能特异分解β-葡聚糖的酶主要来源于芽抱杆菌属和曲霉属，包括枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)、环状芽抱杆菌(Bacillus circulans)、解淀粉芽抱杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽抱杆菌(Bacillus Licheniformis)、短小芽抱杆菌(Bacilluspumilus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、冻土毛霉(Mucor hiemalis)和米曲霉(Aspergillus oryzae)等。

β-1,3-葡聚糖酶属于β-葡聚糖酶的一种，能够高效、专一的水解β-1,3-糖苷键。卢雪梅等发现了一株产β-1,3-葡聚糖酶的微生物，分类命名为壳聚糖酶产生菌H12(Mitsuariachitosanitabida H12)，保藏号为CGMCC 2949；闫巧娟等发现了一株产β-1,3-葡聚糖酶的米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432，该酶能够高效水解可得然多糖，生成一系列β-1,3-葡寡糖，所得β-1,3-葡寡糖中不含单糖。

但由于己筛选得到的产酶菌株大部分产酶量较低，故国内外仍有不少学者在致力于筛选和培养新的产酶菌株，期望筛选出能产生适应不同应用目标的β-葡聚糖酶的野生菌株。本发明即提供了一株可高产β-1,3-葡聚糖酶的黑曲霉菌株，以满足工业生产需求，降低生产成本。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产β-1，3-葡聚糖酶的黑曲霉突变菌株及其应用。申请人首先将来源于巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)的β-1，3-葡聚糖酶基因在黑曲霉(Aspergillus niger)宿主中过表达，构建得到重组表达该酶的基因工程菌株，然后进一步通过紫外诱变方法，筛选获得一株β-1，3-葡聚糖酶产量显著提高的突变菌。该突变菌可广泛应用于β-1，3-葡聚糖酶的生产，有利于降低该酶的生产成本。

本发明一方面提供了一种表达载体，其携带有β-1，3-葡聚糖酶基因。

所述β-1，3-葡聚糖酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明一方面提供了一种黑曲霉工程菌，其携带有上述表达载体。

本发明还提供了一种黑曲霉突变菌株，是以上述黑曲霉工程菌为出发菌，通过紫外诱变方法获得的。

所述黑曲霉突变菌株命名为黑曲霉Su12-BG2(Aspergillus niger Su12-BG2)，已于2020年11月6日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2020699。

本发明还提供了上述黑曲霉突变菌株在β-1，3-葡聚糖酶生产中的应用。

本发明将β-1，3-葡聚糖酶基因在黑曲霉(Aspergillus niger)宿主Su12中过表达，构建得到的表达菌株黑曲霉Su12-BG1，该菌株20L罐发酵160h后，发酵上清液中β-1，3-葡聚糖酶酶活达到135u/ml。

为了提高β-1，3-葡聚糖酶的产量，申请人以黑曲霉Su12-BG1为出发菌，通过紫外诱变的方法筛选获得一株高产突变菌株黑曲霉Su12-BG2。该突变菌能大幅度提高β-1，3-葡聚糖酶的表达量，20L罐发酵160h后，发酵上清液中β-1，3-葡聚糖酶酶活达到293u/ml，比出发菌提高了117％，取得了意料不到的技术效果。所述黑曲霉突变菌株可广泛应用于β-1，3-葡聚糖酶的生产，从而有利于降低β-1，3-葡聚糖酶的生产成本，促进其在酵母细胞壁降解领域中的推广与应用。

附图说明

图1为质粒pSU图谱；

图2为黑曲霉Su12-BG1和黑曲霉Su12-BG2 20L罐发酵曲线；

图3为β-1，3-葡聚糖酶相对酶活-pH变化曲线；

图4为β-1，3-葡聚糖酶相对酶活-温度变化曲线。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，3nd Ed.(Sambrook，2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel，2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1β-1，3-葡聚糖酶基因的克隆

申请人以来源于巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)的β-1，3-葡聚糖酶基因BG为模板，利用引物1和引物2扩增出β-1，3-葡聚糖酶基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

PCR引物和反应条件如下：

引物1(F)：GCTCCCAACTGGCAGTTGGTC；

引物2(R)：TTAGTTTACCTTCGTAAACAT。

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸120s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，扩增得到的β-1，3-葡聚糖酶基因大小为1161bp。

实施例2表达载体的构建

PCR扩增上述β-1，3-葡聚糖酶基因，引物两端引入XbaI位点，N端与载体的糖化酶信号肽融合。引物序列如下：

引物3(F)：GTATCTAGA GCTCCCAACTGGCAGTTGGTC；

引物4(R)：GACTCTAGATTAGTTTACCTTCGTAAACAT。

PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸120s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，β-1，3-葡聚糖酶基因为大小1161bp的片段。

将上述获得的β-1，3-葡聚糖酶基因片段与表达载体pSU分别进行限制性内切酶XbaI单酶切，酶切条件如下：

37℃水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20ul ddH₂O。用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系如下：

22℃连接1h，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AMP平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到含有β-1，3-葡聚糖酶基因的重组载体pSU-BG。

实施例3重组表达β-1，3-葡聚糖酶的基因工程菌株的构建

1、原生质体制备：

接种黑曲霉宿主菌Su12于PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％；琼脂粉1.5％)平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％)培养基中，30℃培养16h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

2、转化：

将上述获得的黑曲霉Su12原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ml；每200ul原生质体中分别加入10ul准备好的重组载体pSU-BG，加入50ul 25％的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25％的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

3、转化子筛选：

培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养3d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基(麦芽糖12％；玉米浆1.5％；硫酸铵0.5％；硫酸镁0.3％；硫酸钾0.37％；氯化钙0.1125％；微量元素0.1％)中发酵，30℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测及β-1，3-葡聚糖酶酶活力检测。

申请人将β-1，3-葡聚糖酶表达量最高的阳性转化子命名为黑曲霉Su12-BG1(Aspergillus niger Su12-BG1)，其发酵上清液中β-1，3-葡聚糖酶酶活高达135u/ml。

酶活测定方法

(1)β-1，3-葡聚糖酶酶活单位的定义

在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为4mmol/L的昆布多糖溶液中降解释放1微摩尔还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。

(2)酶活测定方法

昆布多糖溶液：准确称取昆布多糖0.40g,精确到0.0001g，加入5.0ml乙醇，再加入40ml相应的pH5.5缓冲液，磁力搅拌缓慢加热约10min，直至底物溶解。停止加热，继续搅拌30min，再用缓冲液定容到50ml，现用现配。

酶液：用pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释至适当倍数，控制吸光值在0.2-0.24范围。

标准曲线的绘制：吸取乙酸-乙酸钠缓冲液4.0ml，加入DNS试剂5.0ml，沸水浴加热5min，冷却后定容至25.0ml，制成标准空白样。分别吸取浓度为10.0mg/ml的葡萄糖溶液1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml、6.00ml和7.00ml，分别用缓冲液定容至100ml，配成不同溶度的葡萄糖标准溶液。分别吸取上述葡萄糖标准溶液各2.00ml，加入2.00ml缓冲液和5.00ml DNS试剂，混匀后沸水浴加热5min，冷却后定容至25.0ml，以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光值。

酶活测定：吸取2.00ml经过适当稀释的酶液，加入到试管中，再加入5.00ml DNS试剂，加入2.00ml昆布多糖溶液，37℃反应30min，沸水浴加热5min，冷却后定容至25.0ml，以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光值A0。

吸取2.00ml经过适当稀释的酶液，加入到试管中，加入2.00ml昆布多糖溶液，37℃反应30min，再加入5.00ml DNS试剂，沸水浴加热5min，冷却后定容至25.0ml，以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光值A1。

酶活计算公式：X＝[(A1-A0)×K+C0]×1000/(180.2×30)

式中：

X—β-1，3-葡聚糖酶酶活力，u/g(或u/mL)；

A0—酶空白样的吸光度；

A1—酶反应液的吸光度；

K—标准曲线的斜率；

C0—标准曲线的截距；

180.2—葡萄糖的摩尔分子量，g/mol；

30—酶反应时间，min；

1000—转化因子，1mmol＝1000μmol。

实施例4诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以黑曲霉Su12-BG1为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其β-1，3-葡聚糖酶的产量。

1、确定致死率：

接种出发菌黑曲霉Su12-BG1于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射90s时，致死率为96％，选取该照射时间进行后续诱变实验。

2、第一轮诱变筛选：

取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。

共涂布220块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出20-40个菌落，先通过菌落形态，筛选短分枝的突变菌。申请人挑取菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变菌共126个，分别接种到PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基中发酵，30℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行蛋白电泳检测及β-1，3-葡聚糖酶酶活力检测。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的126株突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中β-1，3-葡聚糖酶的酶活显著高于出发菌；其中，112株突变菌的酶活与出发菌基本相当，其余14株突变菌的酶活甚至比出发菌普遍降低了3-6％。

申请人按照上述方法继续进行了12轮诱变筛选，最终获得1株β-1，3-葡聚糖酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为黑曲霉Su12-BG2(Aspergillus niger Su12-BG2)。

申请人进一步将出发菌黑曲霉Su12-BG1和突变菌黑曲霉Su12-BG2分别进行20L罐发酵，发酵曲线如图2所示，发酵160h后，黑曲霉Su12-BG1发酵上清液中β-1，3-葡聚糖酶酶活达到135u/ml，而黑曲霉Su12-BG2发酵上清液中β-1，3-葡聚糖酶酶活高达293u/ml，提高了117％，取得了意料不到的技术效果。

实施例5β-1，3-葡聚糖酶的酶学性质分析

1、最适作用pH值

采用pH值分别为2.0、2.5、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的缓冲液，将上述出发菌黑曲霉Su12-BG1和突变菌黑曲霉Su12-BG2的发酵上清液进行稀释测定，β-1，3-葡聚糖酶底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在37℃下进行β-1，3-葡聚糖酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。

结果如图3所示，出发菌和突变菌黑曲霉Su12-BG2发酵上清液中重组β-1，3-葡聚糖酶的最适作用pH均为4.0。

2、最适作用温度

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，pH5.5条件下，测定出发菌黑曲霉Su12-BG1和突变菌黑曲霉Su12-BG2的发酵上清液的β-1，3-葡聚糖酶活力，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。

结果如图4所示，出发菌和突变菌黑曲霉Su12-BG2发酵上清液中重组β-1，3-葡聚糖酶的最适作用温度均为65℃。

综上所述，本发明提供的突变菌黑曲霉Su12-BG2重组表达的β-1，3-葡聚糖酶的最适作用pH为4.0，最适作用温度为65℃。

本发明提供的突变菌株黑曲霉Su12-BG2可广泛应用于β-1，3-葡聚糖酶的生产，能显著降低该酶的生产成本，有利于促进该酶在酵母细胞壁降解领域中的推广与应用。

序列表

<110> 潍坊康地恩生物科技有限公司

青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一株高产β-1，3-葡聚糖酶的黑曲霉突变菌

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1161

<212> DNA

<213> 巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)

<400> 1

gctcccaact ggcagttggt ctggagcgat gaatttaacg gttcctcgtt gaatcgaggc 60

gtatggaccc ccgaaattgg caccggctat aacggatggg ggaacaacga acttcagtat 120

tataccgaca ggccgcaaaa cgtacaggtt acaggcggca atctggtcat caccgctcag 180

cgagaaaatt atgaaggaag aaactatacc tccgcacgaa tcaaaaccca aggcttaaag 240

agcttcaagt acggcaagat cgaagcccgc ataaagattc ctactggaca aggcatatgg 300

ccggcattct ggatgctggg cgaaagcttc agagatgtcg gttggcctta ctgtggagaa 360

atcgatatta tggaacatgt caacaatgaa tcggttgtcc acggaaccgt ccattgggac 420

gccaatggat atgcctctta cggccgggct tcgggcaatt tggatttctc gcaattccac 480

acgtactcga tcgaatggga tccgagctat atccgctggt tcgttgacgg cgttcagtac 540

aacgagatct atatcgccaa cggaaccgga aatacagaag aattccagaa gccgttcttc 600

attctgctga acctcgccgt tggcggtaac tggccgggca gcccgaacgg ctcgaccccg 660

ttcccggcgc aaatgcttgt ggattatgtt cgcgtctatc aggatcaagg gggatcctct 720

cccgtgcttg agaacggtgc ggtatacacc atcgcctcca aagtcagcgg caaggtactg 780

gatgtcacgg atgtctccac tgcggacggc gctaaaattc agcaatggac caactattcc 840

gccagcaacc aacgtttccg tctggaatct accggcgacg gctattataa gctgaccgcc 900

attcatagcg gcaaggtgtt ggacgtgcct agtgcaagca cagccgctgg cgtacagcta 960

cagcaatgga cggataacgg tacggacgcg cagcggtggc ggatcgtgga tgccggcggc 1020

ggatacttca agctgatctc caaagccagc ggtttggtca tggatgtatc tggcgcttca 1080

acagcggacg gagcggcggt acagcagtgg accgataacg gcacagatgc gcagaagtgg 1140

atgtttacga aggtaaacta a 1161

<210> 2

<211> 386

<212> PRT

<213> 巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)

<400> 2

Ala Pro Asn Trp Gln Leu Val Trp Ser Asp Glu Phe Asn Gly Ser Ser

1 5 10 15

Leu Asn Arg Gly Val Trp Thr Pro Glu Ile Gly Thr Gly Tyr Asn Gly

20 25 30

Trp Gly Asn Asn Glu Leu Gln Tyr Tyr Thr Asp Arg Pro Gln Asn Val

35 40 45

Gln Val Thr Gly Gly Asn Leu Val Ile Thr Ala Gln Arg Glu Asn Tyr

50 55 60

Glu Gly Arg Asn Tyr Thr Ser Ala Arg Ile Lys Thr Gln Gly Leu Lys

65 70 75 80

Ser Phe Lys Tyr Gly Lys Ile Glu Ala Arg Ile Lys Ile Pro Thr Gly

85 90 95

Gln Gly Ile Trp Pro Ala Phe Trp Met Leu Gly Glu Ser Phe Arg Asp

100 105 110

Val Gly Trp Pro Tyr Cys Gly Glu Ile Asp Ile Met Glu His Val Asn

115 120 125

Asn Glu Ser Val Val His Gly Thr Val His Trp Asp Ala Asn Gly Tyr

130 135 140

Ala Ser Tyr Gly Arg Ala Ser Gly Asn Leu Asp Phe Ser Gln Phe His

145 150 155 160

Thr Tyr Ser Ile Glu Trp Asp Pro Ser Tyr Ile Arg Trp Phe Val Asp

165 170 175

Gly Val Gln Tyr Asn Glu Ile Tyr Ile Ala Asn Gly Thr Gly Asn Thr

180 185 190

Glu Glu Phe Gln Lys Pro Phe Phe Ile Leu Leu Asn Leu Ala Val Gly

195 200 205

Gly Asn Trp Pro Gly Ser Pro Asn Gly Ser Thr Pro Phe Pro Ala Gln

210 215 220

Met Leu Val Asp Tyr Val Arg Val Tyr Gln Asp Gln Gly Gly Ser Ser

225 230 235 240

Pro Val Leu Glu Asn Gly Ala Val Tyr Thr Ile Ala Ser Lys Val Ser

245 250 255

Gly Lys Val Leu Asp Val Thr Asp Val Ser Thr Ala Asp Gly Ala Lys

260 265 270

Ile Gln Gln Trp Thr Asn Tyr Ser Ala Ser Asn Gln Arg Phe Arg Leu

275 280 285

Glu Ser Thr Gly Asp Gly Tyr Tyr Lys Leu Thr Ala Ile His Ser Gly

290 295 300

Lys Val Leu Asp Val Pro Ser Ala Ser Thr Ala Ala Gly Val Gln Leu

305 310 315 320

Gln Gln Trp Thr Asp Asn Gly Thr Asp Ala Gln Arg Trp Arg Ile Val

325 330 335

Asp Ala Gly Gly Gly Tyr Phe Lys Leu Ile Ser Lys Ala Ser Gly Leu

340 345 350

Val Met Asp Val Ser Gly Ala Ser Thr Ala Asp Gly Ala Ala Val Gln

355 360 365

Gln Trp Thr Asp Asn Gly Thr Asp Ala Gln Lys Trp Met Phe Thr Lys

370 375 380

Val Asn

385

Claims

1.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体携带有β-1，3-葡聚糖酶基因。

2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述β-1，3-葡聚糖酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

3.一种黑曲霉工程菌株，其特征在于，所述工程菌株携带有权利要求1或2所述的表达载体。

4.一种黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述的黑曲霉突变菌株是对权利要求3所述的黑曲霉工程菌株进行紫外诱变后筛选获得的。

5.如权利要求4所述的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述的黑曲霉突变菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2020699。

6.权利要求3所述的黑曲霉工程菌株在生产β-1，3-葡聚糖酶中的应用。

7.权利要求4或5所述的黑曲霉突变菌株在生产β-1，3-葡聚糖酶中的应用。