CN103131687A - 聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶及其制备方法和应用。聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶,该溶葡萄球菌酶采用支化聚乙二醇对溶葡萄球菌酶进行修饰,支化聚乙二醇为含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇,并且单一活性功能基团设置在端点,所述的含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇的结构式如下:;所述的n1、n2、n3分别为大于等于1的正整数,并且n1+n2+n3的总和为80~2000;所述的R为修饰溶葡萄球菌酶的活性功能基团。本发明聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶免疫原性降低,活性下降少,半衰期延长,适合临床应用于葡萄球菌引起的感染。
Description
技术领域
本发明涉及用聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶及其制备方法和应用。
背景技术
葡萄球菌(Staphylococcus)是革兰氏阳性球菌的一种,广泛分布于自然界,如空气、水、土壤、饲料和一些物品上,也存在于人和动物的体表、鼻咽部及肠道,绝大多数不致病,少数可引起人和动物致病,其中金黄色葡萄球菌致病力最强。金黄色葡萄球菌是一种常见病菌,可引起皮肤、肺部、血液、关节、组织及器官感染,是烧伤创面感染、急性肝功能衰竭和血源性肾炎等疾病的主要病源菌。
目前主要采用抗生素治疗金黄色葡萄球菌的感染,但随着抗生素的广泛使用,耐药菌比例不断增加,开发新型抗菌剂显得尤为迫切。溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)作为葡萄球菌细胞壁裂解酶引起了人们的重视。Schindle 等1964年首次从 Staphyloccus simulans 培养物中发现溶葡萄球菌酶(“Lysostaphin a New Bacteriolytic Agent for the Staphylococcus.”Proc. Natl. Acad. Sci. 1964,51:414-421),该酶是含246个氨基酸组成的单链分子, 分子量为27kDa, Zn2+为必须的辅助因子。溶葡萄球菌酶具有内切肽酶活性, 能特异性水解细菌胞壁肽聚糖交联结构Gly五肽桥联(水解第2与第3位Gly形成的肽键)而产生破壁溶菌作用。由于Gly五肽桥联结构仅大量存在于葡萄球菌细胞壁, 其中又以金黄色葡萄球菌细胞壁中分布最广, 因此, 溶葡萄球菌酶主要对葡萄球菌尤其是金黄色葡萄球菌具有溶菌杀菌作用。
但是溶葡萄球菌酶作为异源蛋白质,在机体内的主要不良反应是产生免疫反应,引起过敏反应。静脉注射血浆半衰期短,动物药代动力学研究表明该酶进入体内1小时95%的酶已经降解。聚乙二醇(poly(ethylene glycol),简称PEG)修饰技术的应用使PEG的许多优良特性转移到修饰蛋白中去。当PEG偶联到蛋白质分子表面时,可减少蛋白质药物的酶解,避免在肾脏的代谢中很快消除,并使蛋白质药物不易被免疫系统的细胞识别。PEG修饰的蛋白质药物动力学性质也发生很大的改变,半衰期延长。2003年Walsh等报道用PEG修饰溶葡萄球菌酶,采用支化的两臂单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯mPEG2-NHS。但由于该支化聚乙二醇的活性基团位于该聚合物的中点,由于位阻效应在同药物分子偶合时,使药物活性降低甚至消失。
中国发明专利申请(申请号:200710068724.X 申请日:2007-05-22)公开了溶葡萄球菌酶的制备方法和其衍生物及衍生物的制备方法。溶葡萄球菌酶的制备方法主要包括:设计并合成优化的溶葡萄球菌酶基因,构建表达载体后转化大肠杆菌工程菌,筛选高表达菌株,发酵培养工程菌,表达产物分离纯化。其中所述的表达载体质粒是PET系列载体质粒。本发明的方法,表达方案简单,表达量高,纯化工艺简单,收率高,表达产物可溶,不需要复性,直接用层析方法进行纯化,纯化收率大大提高,适合大规模制备。本发明公开的溶葡萄球菌酶衍生物由PEG修饰后免疫原性降低,半衰期延长,适合临床应用于葡萄球菌感染的治疗。
上述的方法采用直链的聚乙二醇修饰溶葡萄球菌酶,为了降低免疫原性,需要多点修饰,而修饰位点多使药物活性降低甚至消失。为此,有必要开发能够降低免疫原性同时活性下降少的聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶,更好的满足溶葡萄球菌酶在临床应用方面的需求。
发明内容
为了解决上述的技术问题,本发明的第一个目的是提供一种聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶,该溶葡萄球菌酶免疫原性降低,活性下降少,半衰期延长,适合临床应用于葡萄球菌引起的感染。本发明的第二个目的是提供上述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶的制备方法。本发明的第三个目的是提供上述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶的医药用途。
为了实现上述的第一个目的,本发明采用了以下的技术方案:
聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶,该溶葡萄球菌酶采用支化聚乙二醇对溶葡萄球菌酶进行修饰,支化聚乙二醇为含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇,并且单一活性功能基团设置在端点,所述的含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇的结构式如下:
;
所述的n1、 n2、n3分别为大于等于1的正整数,并且n1+ n2+ n3的总和为80~2000;所述的R为修饰溶葡萄球菌酶的活性功能基团。
作为优选,上述的含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇的分子量为5kDa-40kDa。
作为优选,上述的活性功能基团选自琥珀酸基碳酸酯、琥珀酸基琥珀酸酯、硝基苯酯和琥珀酰亚胺酯中的一种。作为再优选,上述的活性功能基团选用琥珀酸基碳酸酯。
作为优选,上述的溶葡萄球菌酶与含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇采用单点或多点修饰构成。
为了实现上述的第二个目的,本发明采用了以下的技术方案:
一种制备上述任意一个技术方案所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶的方法,该方法中含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇与溶葡萄球菌酶发生共价结合反应的重量比例为1:0.5~20,缓冲液的pH值为4~8,反应温度为2℃~37℃,反应时间为2~48小时。
作为优选,在修饰反应结束后采用分子筛柱Sephacryl-200去除未修饰的溶葡萄球菌酶以及游离的聚乙二醇,以pH8.0、20mM的磷酸盐缓冲液为洗脱液,流速5ml/min,收集第一个蛋白峰为修饰蛋白峰。
作为优选,该方法还包括纯化步骤,纯化步骤将修饰后产物上样于Sephacryl S-200分子筛凝胶层析柱,以40mM PB进行洗脱,分别收集洗脱峰。
为了实现上述的第三个目的,本发明采用了以下的技术方案:
上述任意一个技术方案所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶用于制备治疗葡萄球菌引起的感染的药物中的应用。
本发明由于采用了上述的技术方案,采用支化的Y型单甲氧基聚乙二醇,与直链的聚乙二醇相比,在同样降低免疫原性的情况下,可以减少修饰位点的个数,但由于该支化聚乙二醇的活性基团位于该聚合物的中点,由于位阻效应在同药物分子偶合时,使药物活性降低。本发明聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶免疫原性降低,活性下降少,半衰期延长,适合临床应用于葡萄球菌引起的感染。
附图说明
图1 为聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶的SDS-PAGE图谱(M为标准蛋白,1为溶葡萄球菌酶,2为Y型甲氧基聚乙二醇5kDa修饰的溶葡萄球菌酶,3为Y型甲氧基聚乙二醇10kDa修饰的溶葡萄球菌酶,4为Y型甲氧基聚乙二醇20kDa修饰的溶葡萄球菌酶)。
具体实施方式
实施例1 溶葡萄球菌酶基因的合成、克隆和表达
表达载体采用pET-22b(Invitrogen),宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
根据Genebank公布的Staphylococcus simulans的Lysostaphin基因序列(AX828346)及专利WO03074689的溶葡萄球菌酶基因序列,根据大肠杆菌高效表达的需要优化设计溶葡萄球菌酶基因序列,基因编码产物的氨基酸序列,基因序列和氨基酸序列分别参见中国发明专利(申请号:200710068724.X 申请日:2007-05-22)公开的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。合成20段互补的寡核苷酸,并在5,端和3,端分别引入酶切位点Nde I、BamH I,按分子克隆的常规方法以等摩尔混合,94℃变性5min,立即65℃退火10 min,然后加入T4连接酶,16℃连接过夜。取连接产物用下述引物进行扩增:
引物1:5‘—TATACATATGGCTGCAACACATGAACA
引物2:3‘—TCTGGATCCTCAGTTACTTTATAGTTCCCCAAA
扩增条件:95℃、30s;55℃、30s;70℃、60s,循环次数:30次。最后70℃保温延伸10 min。用Nde I和BamH I双酶切回收大片段,与合成的溶葡萄球菌酶基因片段连接,20μL反应体系基因片段与载体大片段的比例为10:1,加T4DNA连接酶300单位,15℃连接过夜,取10μL连接产物直接转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,涂布于氨苄青霉素抗性平板,37℃培养过夜,获得工程菌经进一步筛选。氨苄青霉素做抗性筛选,得到阳性克隆。提取质粒,用限制性内切酶进行鉴定。阳性转化子用通用引物进行序列分析,结果克隆序列与设计序列完全一致。
接种阳性克隆进行培养,经1mmol/L的IPTG诱导。
实施例2 不同培养条件对表达的影响
采用培养基(0.5% Yeast Extract,1.0% Peptone,0.5%Nacl,0.05mg/Lamp,pH7.4)研究了不同温度条件诱导对产物表达状态的影响。接种量:5%(种子液体积占培养基体积的比例),诱导前培养温度37℃,采用IPTG诱导,剂量1mmol/L。培养后4个温度进行诱导,结果见下表。
诱导温度 | 表达量 | 目标蛋白上清% | 目标蛋白沉淀% |
20℃ | 20% | 90% | 10% |
25℃ | 30% | 90% | 10% |
30℃ | 30% | 65% | 35% |
37℃ | 30% | 50% | 50% |
总结:加诱导剂后25℃培养4小时,表达量可以达到30%,而且目标蛋白主要表达在破菌上清中,如果延长表达时间,如表达8小时,则目标蛋白超过80%在破菌后的沉淀中,因此优选的条件是37℃培养后,25℃诱导表达4小时,目标蛋白主要在破菌后上清中,有利于分离纯化。
实施例3 表达产物的分离、纯化
用菌体破碎缓冲液(40mM Tris-cl,0.2M Nacl,0.5mM EDTA,pH8.0)按照20ml/g的比例悬浮湿菌体。超声波法破碎菌体(220V,20khz,900W,冰水浴条件下超声破碎)。
将破菌液用高速离心进行离心(10000g,30min,4℃),去掉沉淀,收集上清。收集到的破菌上清液用离子交换层析法分离纯化,其过程为用pH值为8.5的20mmol/L Tris. CL缓冲液稀释,使其电导率小于5mS/cm。用同样的缓冲液平衡层析柱(50mm×10cm),层析凝胶可选用CM-Sepharose Fast Flow、SP-Sepharose Fast Flow、Mono-S(Amersham Pharmacia)。上样后用平衡缓冲液洗至基线,用缓冲液(0.01-0.5mol/L Nacl,20mM Tris-cl,pH8.0)进行梯度洗脱,当Nacl浓度达到30%时出现目标蛋白,收集目标蛋白峰。
洗脱出来的蛋白样品纯度在85-90%。将离子交换目标蛋白峰补加(NH4)2SO4使终浓度为0.6-0.8mol/L,疏水层析柱(XK26/20)用缓冲体系A(20mM Tris-cl,pH8.5,0.6M(NH4)2SO4)平衡,疏水凝胶可选用Phenyl-Sepharose Fast Flow、Phenyl-Sepharose High Perforance及Butyl-Sepharose Fast Flow,流速10ml/min,上样后用缓冲液B(20mM Tris-cl,pH8.5)通过降低盐浓度梯度洗脱,收集目标蛋白峰,目标蛋白电泳纯度95%。
得到的疏水层析峰经Sephadex G-25脱盐,平衡液为20 mmol/L PB,pH7.4。样品脱盐后即为纯化的溶葡萄球菌酶。
实施例4 聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶
将纯化的溶葡萄球菌酶溶于pH8.0、100mM的磷酸盐缓冲液中,按溶葡萄球菌酶:Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5000=1:5(W/W)的比例加入溶解后,加入甘氨酸使其终浓度为8mM,冰箱2-8℃反应16-24小时。修饰反应结束后采用分子筛柱(Sephacryl-200)去除未修饰的溶葡萄球菌酶以及游离的聚乙二醇。以pH8.0、20mM的磷酸盐缓冲液为洗脱液,流速5ml/min,收集第一个蛋白峰为修饰蛋白峰。
上述的Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯具有以下的结构:
实施例5 修饰产物的分离、纯化
将实施例4修饰后产物上样于Sephacryl S-200分子筛凝胶层析柱,以40mM PB进行洗脱,分别收集洗脱峰。电泳分析图谱见图1。
实施例6 生物活性(比活力)测定
酶活性分析采用比浊法,受试菌为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus。活化的金黄色葡萄球菌在LB培养基中37℃培养至OD620nm为0.25,加入适量纯化溶葡萄球菌酶(10μL,约1μg),37℃保温10min,将6ml金黄色葡萄球菌悬液OD620nm为0.25降至0.125所需的酶量为1个单位。溶葡萄球菌酶、Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶及直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶的生物活性见表一。
表1 溶葡萄球菌酶及聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶的生物活性
样品 | 比活力(U/mg) |
溶葡萄球菌酶 | 420 |
Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶 | 309 |
直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶 | 117 |
实施例7 热稳定性研究
取溶葡萄球菌酶和实施例4聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶液体,分别置于25℃、60℃条件下,定时取样测定其生物活性。结果表明,溶葡萄球菌酶在60℃条件下15min内活性不变,而聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶在90 min内活性不变。在25℃条件下溶葡萄球菌酶7天内活性不变,而聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶在25天内活性不变。因此,可以初步认为聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶可以明显增加溶葡萄球菌酶的热稳定性。
实施例8免疫原性的研究
以家兔作为制备抗血清的实验动物,采用福氏佐剂免疫法,并分别以溶葡萄球菌酶、Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶及直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶作为抗原,剂量均为6U/kg/次,每周一次,共5次。
分别以溶葡萄球菌酶、Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶及直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶作为抗原,用双向免疫扩散法测定他们各自抗血清的效价,测定结果为:溶葡萄球菌酶组抗血清的效价为1:16;Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶和直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶抗血清的效价测不出。
分别以溶葡萄球菌酶、Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶及直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶作为抗原,然后用溶葡萄球菌酶的抗血清作为第一抗体,再以辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG作为第二抗体,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定他们各自的免疫原性,测定结果为:溶葡萄球菌酶组为阳性,Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶及直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶为阴性。
以上结果表明,同溶葡萄球菌酶比较,Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶及直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶的免疫原性显著降低,这样更有利于作为治疗药物进行使用。
实施例9
用Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯10kDa、Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯20kDa和Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基琥珀酸酯20kDa代替实施例4中的Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa,得到了实施例中6-8相似的结果。
Claims (9)
1.聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶,其特征在于: 该溶葡萄球菌酶采用支化聚乙二醇对溶葡萄球菌酶进行修饰,支化聚乙二醇为含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇,并且单一活性功能基团设置在端点,所述的含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇的结构式如下:
;
所述的n1、 n2、n3分别为大于等于1的正整数,并且n1+ n2+ n3的总和为80~2000;所述的R为修饰溶葡萄球菌酶的活性功能基团。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶,其特征在于: 含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇的分子量为5kDa-40kDa。
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶,其特征在于:活性功能基团选自琥珀酸基碳酸酯、琥珀酸基琥珀酸酯、硝基苯酯和琥珀酰亚胺酯中的一种。
4.根据权利要求3所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶,其特征在于: 活性功能基团选用琥珀酸基碳酸酯。
5.根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶,其特征在于: 溶葡萄球菌酶与含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇采用单点或多点修饰构成。
6.一种制备权利要求1~5任意一项权利要求所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶的方法,其特征在于:该方法中含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇与溶葡萄球菌酶发生共价结合反应的重量比例为1:0.5~20,缓冲液的pH值为4~8,反应温度为2℃~37℃,反应时间为2~48小时。
7.根据权利要求6所述的制备聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶的方法,其特征在于:修饰反应结束后采用分子筛柱Sephacryl-200去除未修饰的溶葡萄球菌酶以及游离的聚乙二醇,以pH8.0、20mM的磷酸盐缓冲液为洗脱液,流速5ml/min,收集第一个蛋白峰为修饰蛋白峰。
8.根据权利要求7所述的制备聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶的方法,其特征在于:该方法还包括纯化步骤,纯化步骤将修饰后产物上样于Sephacryl S-200分子筛凝胶层析柱,以40mM PB进行洗脱,分别收集洗脱峰。
9.权利要求1~5任意一项权利要求所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶用于制备治疗葡萄球菌引起的感染的药物中的应用。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130605 |