CN110669765B - 鳜干扰素诱导蛋白启动子和应用 - Google Patents

鳜干扰素诱导蛋白启动子和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了鳜干扰素诱导蛋白启动子和应用。本发明通过pro‑F和pro‑R为引物，以鳜肝脏和皮肤提取的总DNA为模板扩增得到该基因的启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建了含有该干扰素诱导蛋白基因启动子的双荧光素酶报告质粒，此质粒可以被I型和II型干扰素显著激活，可作为阳性分子标记在干扰素系统研究中进行应用。

Description

鳜干扰素诱导蛋白启动子和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及鳜干扰素诱导蛋白启动子和应用，该启动子可用于干扰素系统研究。
背景技术
干扰素(interferon,IFN)是一种在先天性免疫和获得性免疫中起着重要作用的细胞因子，具有抑制细胞分裂、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。在四足类动物中根据其基因序列和位置、受体组成、信号通路以及功能等，干扰素被分为I型、II型和III型。当I型干扰素与细胞表面的特异性受体IFNAR1结合之后导致胞内的JAK1和TYK2活化，进而引起IFNAR1受体发生磷酸化，磷酸化的IFNAR1诱导STAT1和STAT2磷酸化并招募其与受体链上的STAT结合位点结合，STAT1同源二聚体或者与其STAT2形成异源二聚体进入细胞核，结合到干扰素诱导表达基因的启动子中，从而诱导这些基因的转录表达。T细胞或自然杀伤细胞等分泌的II型干扰素也可以与细胞膜上的IFNGR1受体特异性结合，通过激活JAK-STAT信号通路，最终使得STAT1磷酸化并形成同源二聚体进入细胞核内与干扰素诱导基因的启动子区结合，从而特异性调控干扰素诱导表达基因的转录表达。
干扰素的功能实现依赖于其诱导产生的各种干扰素诱导蛋白的直接或者间接作用。哺乳动物中已经鉴定了成百个干扰素诱导表达基因，这些基因的功能多样化，如参与抗病毒、抗肿瘤、抗菌等。近年来，关于硬骨鱼类干扰素的研究逐渐增多，已在多种鱼类中鉴定了I型和II型干扰素，并对其抗病毒功能做了简单的研究。而关于硬骨鱼类干扰素诱导表达基因的鉴定还远远落后于其在哺乳动物中的研究。目前在硬骨鱼类中研究最多的干扰素诱导基因有Mx，Viperin和ISG15等，已在多种鱼类中对这几个基因的表达调控、抗病毒功能做了深入的研究，因而也经常被用做研究干扰素系统功能的阳性标记分子。为了更准确和全面的研究硬骨鱼类I型和II型干扰素系统的功能及其功能实现的分子基础，我们需要鉴定更多的干扰素诱导蛋白，以便研究者在不同实验中进行阳性分子标记选择时有更多的备选基因。本发明的启动子能被I型和II型干扰素显著性激活，作为干扰素激活阳性分子标记在研究硬骨鱼类干扰素系统功能方面具有很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供了鳜干扰素诱导蛋白启动子，所述的启动子序列为SEQ IDNO.1所示序列，或与SEQ ID NO.1所示序列的相关序列
本发明的另一个目的在于鳜干扰素诱导蛋白启动子的应用，本发明的鳜干扰素诱导蛋白启动子可用于制备成荧光素酶报告质粒，用于鳜干扰素功能研究。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
鳜干扰素诱导蛋白启动子，所述启动子的序列为SEQ ID NO.1所示。
以上所述的鳜干扰素诱导蛋白启动子的截短和点突变序列，也为本发明的保护内容，例如在SEQ ID NO.1所示序列中缺失了包括GAAACCCAGAAAATATTTTC位点的序列，或是以引物pro-F-518:CGGGGTACCGCTTTGCGCTTGTTTGAAT和pro-R1:CCCAAGCTTCACAAGGACACATAGTTGTCTCTGA扩增得到的序列；
或者是将启动子中GAAAAAGAAACTGAAA突变后的序列(如SEQ ID NO.2所示的序列)；或是以引物pro-F-365:CGGGGTACCGATTTCCGAGGACAGATTGT和pro-R1:CCCAAGCTTCACAAGGACACATAGTTGTCTCTGA扩增得到的序列。
鳜干扰素诱导蛋白启动子的应用，包括将鳜干扰素诱导蛋白启动子构建成报告质粒；例如，可将SEQ ID NO.1所示序列，或是以引物pro-F-518:CGGGGTACCGCTTTGCGCTTGTTTGAAT和CCCAAGCTTCACAAGGACACATAGTTGTCTCTGA扩增得到的序列插入到报告基因中，鳜干扰素可将其激活，用于研究鳜干扰素功能；
或是将不具备被鳜干扰素激活的启动子截短或突变序列插入报告质粒，作为阴性对照。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明扩增得到一种干扰素诱导蛋白基因的启动子序列，并构建了一系列野生型和截短突变以及位点突变型启动子的双荧光素酶报告质粒，对其被I型和II型干扰素诱导激活情况作了分析，结果发现该基因的启动子可以被鳜I型和II型干扰素显著激活。此发明首次在硬骨鱼类中扩增得到该基因的启动子序列，并对其被I型和II型干扰素的激活情况作了详细分析，为研究硬骨鱼类干扰素的功能实现提供理论依据。此外，该启动子可作为阳性分子标记在干扰素系统研究中进行应用。
附图说明
图1为含有鳜干扰素诱导蛋白启动子的双荧光素酶报告质粒的构建及被I型和II型干扰素激活情况；
其中A：启动子序列按照图示进行截短处理，并构建含有这些截短启动子序列的双荧光素酶报告质粒；B和C为I型和II型干扰素对含不同截短体启动子双荧光素酶报告质粒的激活情况；D为双荧光素酶报告质粒(pro(-518))中启动子的ISRE1位点的点突变位点；
E和F分别是I型和II型干扰素对ISRE1位点突变后的启动子(pro(-518)ΔISRE1)双荧光素酶报告质粒的激活情况。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
鳜干扰素诱导蛋白启动子的获得：
以鳜肝脏和皮肤提取的总DNA为模板，以pro-F:ACAATAGCAGCAATTAGCGG和pro-R:CACAAGGACACATAGTTGTCTCTGA为引物扩增得到鳜干扰素诱导蛋白启动子序列，启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将得到的启动子序列构建进入PMD18T载体中，命名为PMD18T-pro，并进行测序验证。
实施例2：
含有鳜干扰素诱导蛋白启动子的双荧光素酶报告质粒的构建：
1)不同截短突变形式启动子的双荧光素酶报告质粒的构建：
为了研究该干扰素诱导蛋白启动子的功能区域，分别以pro-F-1036:CGGGGTACCACAATAGCAGCAATTAGCGG，pro-F-518:CGGGGTACCGCTTTGCGCTTGTTTGAAT，pro-F-365:CGGGGTACCGATTTCCGAGGACAGATTGT为正向引物，以pro-R1：CCCAAGCTTCACAAGGACACATAGTTGTCTCTGA为反向引物，以上述保种的PMD18T-pro为模板扩增得到与鳜干扰素诱导蛋白启动子相关的三个序列。用Kpn I和Hind III快切酶分别进行双酶切上述引物得到的基因片段以及空载体pGL3-basic质粒，酶切后的目的基因片段和载体进行产物回收处理之后用T4连接酶连接，25℃连接30min，然后将连接后的产物转化进入Top10大肠杆菌中。挑选克隆通过测序进行阳性验证，将最后所得到的阳性菌进行去内毒素质粒提取，分别得到不同截短突变形式启动子的双荧光素酶报告质粒，根据引物名称分别命名为：pro(-1036)、pro(-518)和pro(-365)，其中pro(-1036)定义为野生型启动子双荧光素酶报告质粒，含有SEQ IDNO.1所示序列。
2)ISRE1位点突变启动子的双荧光素酶报告质粒构建：
研究已经表明，干扰素通过激活JAK/STAT信号通路最终使得STAT1同源二聚体或者STAT1和STAT2形成的异源二聚体结合到干扰素诱导表达基因的启动子区的ISRE位点或GAS位点从而调控其基因的表达。本发明对得到的启动子序列分析发现，在此启动子中存在两个潜在的ISRE位点，按照其距转录起始位点由近至远，依次命名为ISRE1(对应序列为：GAAAAAGAAACTGAAA)和ISRE2(对应序列为：GAAACCCAGAAAATATTTTC)。在此启动子序列中未发现GAS位点。在启动子截短实验中我们发现ISRE2截短缺失之后并不影响I型和II型干扰素对启动子的激活能力，而ISRE1截短缺失之后启动子则丧失了响应I型和II型干扰素的能力。为了进一步确定ISRE1位点的功能，本发明构建了含有ISRE1位点突变型启动子的双荧光素酶质粒，具体步骤如下：
分别以pro-F-518:CGGGGTACCGCTTTGCGCTTGTTTGAAT为正向引物，以ISREmut-R>ACATTAATTCTTTCAGTGGCTTGGTC为反向引物，以及以ISREmut-F>GACCAAGCCACTGAAAGAATTAATGT为正向引物，以pro-R1：CCCAAGCTTCACAAGGACACATAGTTGTCTCTGA为反向引物，均以PMD18T-pro为模板，扩增得到的产物分别命名为ISRE-F和ISRE-R。将上述得到的ISRE-F和ISRE-R产物分别稀释10倍备用。紧接着进行第二轮PCR反应，以pro-F-518为正向引物，pro-R1为反向引物，分别加入稀释后的第一轮PCR产物ISRE-F和ISRE-R(作为模板)各0.5μl，进行PCR反应，由此扩增得到含有ISRE位点突变的序列(SEQ ID NO.2所示)。按照步骤1)进行酶切连接，最后测序验证得到启动子区ISRE1位点发生突变的双荧光素酶报告质粒，命名为pro(-518)ΔISRE1。
实施例3：
为了验证本发明中得到的正常形式和截短以及点突变形式的启动子质粒的功能，验证其是否可以作为I型和II型干扰素诱导激活基因的阳性标志分子，本发明进行了双荧光素酶测定实验，具体步骤如下：
1)按照1.2×105个/孔的密度将MFF-1细胞接种于48孔板，过夜培养；
2)按照每孔加入0.4μg启动子质粒以及0.02μg pRL-TK内参质粒，总质粒共为0.42μg与25μl Opti-MEM培养基混匀后室温孵育5min；
3)另取1.5ml的离心管将25μl Opti-MEM与1.0μl
Figure BDA0002258790070000041
HD混匀，室温静置孵育5min；
4)将含有质粒和转染试剂Opti-MEM混匀，室温孵育15min；
5)将50μl上述混合物加入细胞孔中，每组三个重复。将细胞轻轻晃动混匀之后，置于28℃培养箱继续培养；
6)转染24h之后，弃掉培养基，分别对转染了启动子质粒的MFF-1细胞用鳜I型(IFNh、IFNc和IFNd)或II型干扰素(IFN-γ和IFN-γrel)的蛋白进行刺激；其中鳜I型和II型干扰素是通过真核质粒在HEK293T细胞中过表达得到，鳜I型和II型干扰素真核表达质粒构建的方法参见2018年Laghari等和2019年Li等发表的文章(Laghari et al.,2018；Li etal.,2019)。制备干扰素蛋白的具体方法为：将HEK293T细胞按照8×105个/孔的密度接种于6孔板，过夜培养之后，每孔转染2μg真核表达IFNh、IFNc、IFNd、IFN-γ或者IFN-γrel质粒。转染6h后进行细胞换液，继续培养24h后收取含有干扰素的细胞上清液用于进一步的实验。本发明的启动子激活实验中所使用的干扰素是将上述得到的含有干扰素的细胞上清进行2倍稀释使用。
7)干扰素刺激24h之后，弃掉培养基，用预冷PBS漂洗细胞，然后每孔加入100μl裂解液，晃动裂解20min，收取裂解液，12000g离心5min；
8)吸取适量上清，按照说明用荧光素酶检测试剂盒(Dual-Luciferase AssaySystem，Prom ega公司)测定荧光素梅活性。
结果说明：野生型启动子pro(-1036)双荧光素酶报告质粒和截短突变型启动子pro(-518)双荧光素酶报告质粒均可以被I型干扰素IFNh、IFNc以及II型干扰素IFN-γ显著激活，而截短形式pro(-365)启动子双荧光素酶报告质粒则丧失了响应I型和II型干扰素激活的能力(图1中A、B和C)。通过对-518至-365之间的启动子序列分析发现，在此段序列中存在ISRE1位点，因此本发明对pro(-518)启动子中的ISRE1位点进行点突变(图1中D)，即实施例2制备的ISRE1位点突变启动子的双荧光素酶报告质粒。结果发现当ISRE1位点发生突变之后，pro(-518)启动子质粒丧失了响应I型和II型干扰素的能力，这表明此干扰素诱导表达基因启动子中的ISRE1位点对于其响应I型和II型干扰素的诱导表达是必需的。综上所述，本发明中构建的启动子双荧光素酶质粒可以作为研究I型和II型干扰素系统的阳性分子。
序列表
<110> 中国科学院水生生物研究所
<120> 鳜干扰素诱导蛋白启动子和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1427
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acaatagcag caattagcgg ttactttaaa gctatctgcc catcaggaaa cgctgtaaat 60
cacagagagt tgaggcagag cagccgaagg acatcagagg gaaacccaga aaatattttc 120
tccataaaat atgatccaat ttcaccaaaa tcagtcaatt aagttataaa agttgtgttg 180
tgtgcagaaa caatctcaac acacgtctgt cgttttttcc aacgtaatac gtttgcggtc 240
aggtaaacgg taaattcatc caattcagtg tcccatatca caattttaca agctaaatgc 300
aagttactgt agctctcatg tgctgtagag ctcaccacca actatagcct gtctaaaaca 360
acacagtgac tgggtgtgga aggcccagtc ccattaagta tcaaaagtac tcattatgca 420
gtaaaatggt ccctgccaaa ttcgtcgctg tcctgtcaga aacaacgtct ctataaaaag 480
taatttccca gtttatccat tttactcccc cctctggtgc tttgcgcttg tttgaatgta 540
gagaggctat attttcgacg gcacctgaat gcagcaccac agactaaatg gctgcagcgc 600
cccctgatgg agaaaacaga cgcgttcacg gcctcttgct gctgggaaaa agaaactgaa 660
agaattaatg tgatttccga ggacagattg tcgatagaag gtaagttgtt acccaactgc 720
tttttagtta acttaaacac accaatataa cgatagtcta ggcgtaacat ggacgttctc 780
actgacttat ttaaagttat tctgacgtat ataaagattt taagagtcgt ttagacatac 840
agtctatggt ttagacggtg gattgtttat ctgaaagcag ggcctacagt aaatgtatat 900
atgtttgtaa tttaacagta tttttcctta ttgacagtct ttgttatgta tatatcttca 960
taagtaaatt taatatgctg actttggctg acagcatgca aaaactataa tatttcgtga 1020
attattccag attactttca caatgtcttc agatgaggtg agacgtcatt ttgcttcttc 1080
ctgctattgt tctttcttat gaagttaaag ataaatatta cacataagaa catacaaaat 1140
gtatttgtaa tattgttgtt acagacattt tcgctgtggg ttgaactatt gtccttagca 1200
tcactgaaac gttgttgctg aatttaattt taatactagt ttcacttata agattgctaa 1260
tttatcctca taaaaatgtc tacttaactt aaggcttctc tgcattatac accctgtgtc 1320
ttgatggttt attaacatta atgcaaaaaa aaataaataa aatgaggtga ggtgtttatt 1380
tattctccac catttccctg gctcagagac aactatgtgt ccttgtg 1427
<210> 2
<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctttgcgct tgtttgaatg tagagaggct atattttcga cggcacctga atgcagcacc 60
acagactaaa tggctgcagc gccccctgat ggagaaaaca gacgcgttca cggcctcttg 120
ctgctgggaa aaagccactg aaagaattaa tgtgatttcc gaggacagat tgtcgataga 180
aggtaagttg ttacccaact gctttttagt taacttaaac acaccaatat aacgatagtc 240
taggcgtaac atggacgttc tcactgactt atttaaagtt attctgacgt atataaagat 300
tttaagagtc gtttagacat acagtctatg gtttagacgg tggattgttt atctgaaagc 360
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ctttgttatg tatatatctt cataagtaaa tttaatatgc tgactttggc tgacagcatg 480
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tacacataag aacatacaaa atgtatttgt aatattgttg ttacagacat tttcgctgtg 660
ggttgaacta ttgtccttag catcactgaa acgttgttgc tgaatttaat tttaatacta 720
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gtccttgtg 909
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acaatagcag caattagcgg 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacaaggaca catagttgtc tctga 25
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggggtacca caatagcagc aattagcgg 29
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggggtaccg ctttgcgctt gtttgaat 28
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
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<400> 7
cggggtaccg atttccgagg acagattgt 29
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccaagcttc acaaggacac atagttgtct ctga 34
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaaaaagaaa ctgaaa 16
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaacccaga aaatattttc 20
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acattaattc tttcagtggc ttggtc 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaccaagcca ctgaaagaat taatgt 26

Claims (4)

1.鳜干扰素诱导蛋白启动子，所述启动子的序列为SEQ ID NO.1所示。
2.鳜干扰素诱导蛋白启动子，所述启动子为SEQ ID NO.1所示序列中缺失了GAAACCCAGAAAATATTTTC位点的序列。
3.鳜干扰素诱导蛋白启动子，是以鳜肝脏和皮肤提取的总DNA为模板，引物pro-F-518:CGGGGTACCGCTTTGCGCTTGTTTGAAT和pro-R1: CCCAAGCTTCACAAGGACACATAGTTGTCTCTGA扩增得到的序列。
4.权利要求1~3中的任意一个启动子序列在制备报告质粒中的应用。
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CN107427552A (zh) * 2014-08-22 2017-12-01 中国科学院生物物理研究所 治疗和/或预防与ifp35蛋白家族的异常水平和/或活性相关的疾病或不适的方法和组合物

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