CN113009156B

CN113009156B - 一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法

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Publication number: CN113009156B
Application number: CN202110300708.9A
Authority: CN
Inventors: 廖明; 潘志超; 冯赛祥; 王晓冰; 余慧雯; 许斯祺
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-03-22
Filing date: 2021-03-22
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2041-03-22
Also published as: CN113009156A

Abstract

本发明公开了一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN‑α生物学活性的方法，属于蛋白活性检测技术领域。本发明将犬ISRE启动子片段插入带有绿色荧光蛋白的质粒中，构建表达绿色荧光蛋白的重组质粒，通过检测绿色荧光蛋白的表达情况来判断ISRE启动子的激活情况，从而检测犬α‑IFN生物学活性。本发明利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬α‑IFN生物学活性的方法与传统检测方法MDCK‑VSV相比，避免了VSV病毒感染人的风险，提高了生物安全性。本发明操作简单，可重复性高，成本低，具有良好的应用前景。

Description

一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法

技术领域

本发明属于蛋白活性检测技术领域，特别涉及一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法。

背景技术

随着人民的生活水平逐渐提高，伴侣动物的需求量越来越大，随之犬类病毒性疾病对伴侣动物的危害也越来越大，常见的有犬细小病毒病，犬瘟热、犬传染性肝炎等疾病严重危害犬的生命健康；还有狂犬病、钩端螺旋体等人畜共患病对人类的安全存在极大的威胁。在兽医临床上主要以干扰素作为犬病毒性疾病治疗的首选制剂。干扰素是一种信号蛋白，根据其特异性受体结合可分为三大类：I型(IFNα/β)、II型(IFNγ)和III型(IFNλ)。I型干扰素在先天性免疫中起着抗病毒、抗增殖和免疫调节等功能。IFN-I途径是通过检测感染因子的典型结构元素而启动的，这种结构元素可以被特定识别受体识别。病毒复制过程中产生的RNA可被受体检测，这些受体与病毒RNA结合后，招募特异性受体蛋白，诱导IFN-I的转录。IFN-I以自分泌或旁分泌的方式与特异性受体结合，从而触发抑制病毒复制的信号通路。受体相关激酶Janus激酶1(JAK1)和酪氨酸激酶1(TYK2)磷酸化转录因子STAT1和STAT2，然后与IRF9结合形成异源三聚体复合物，成为干扰素刺激基因因子3(ISGF3)。转移到细胞核后，ISGF3诱导许多IFN刺激基因(ISG)的转录，这里基因的启动子位置有一个IFN刺激反应元件(ISRE)。ISGs包括MX蛋白、2′-5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)、PKR等可抑制病毒转录，翻译和释放的细胞因子。因此，干扰素已被广泛用于治疗病毒性疾病和增殖性疾病。目前有关制备犬α干扰素的研究较多，但针对如何检测犬α干扰素的活性仍缺少标准的检测方法。

现干扰素生物学活性的检测主要采用以下方法检测：1、细胞病变抑制法。此方法存在一定的局限性，根据细胞的形态变化判断结果，费时耗力，主观误差较大，且结果只对活细胞染色，特异性和灵敏度较低。传统方法检测犬干扰素时一般采用MDCK-VSV系统，VSV病毒本身存在危险性，会导致猪、牛和人等哺乳动物共感染。2、荧光素酶报告基因法。此法受到多种因素的影响，同一批样品的检测值也会出现浮动，且要避免荧光素酶衰变的影响以及萤火虫荧光素酶发光半衰期的影响。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，包括如下步骤：

S1:将犬ISRE蛋白的启动子克隆在绿色荧光蛋白基因上游，构建成绿色荧光蛋白报告质粒；

S2:将重组质粒转染体外培养的细胞；

S3:用犬IFN-α刺激转染后的细胞，通过检测绿色荧光蛋白的表达量，判断犬ISRE蛋白的启动子的激活情况，从而检测犬IFN-α的生物学活性。

犬IFN-α是I型干扰素家族结构中相关的细胞因子，介导病毒感染后的早期天然免疫应答。在犬基因组中有不同的IFN-α基因，这些基因通过模式识别受体，如维甲酸诱导基因I(RIG-I)解旋酶，在病毒感染的细胞中被转录激活。通过与IFNα/β受体结合，激活JAK-STAT信号转导途径并表达一些具有较强抗病毒活性的蛋白，如Mx蛋白、蛋白激酶等。因此当激活ISGs启动子ISRE，就能够直接反映出犬α干扰素的生物学活性。

步骤S1中，所述犬ISRE蛋白的启动子的核苷酸序列如下所示(亦如SEQ ID NO.1所示)：

TGAGCTCTAGTTTCATTTCCCTAGTTTCATTTCCCTAGTTTCATTTCCCTAGTTTCATTTCCCTAGTTTCATTTCCCCTCGAGGATATCAAGATCTGGCCTCGGCGGCCAAGCTTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTTGGCAATCCGGTACTGTTGGTAAAGCCA。

步骤S1中，所述绿色荧光蛋白的核苷酸序列如下所示(亦如SEQ ID NO.2所示)：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG。

优选的，步骤S1中，所述绿色荧光蛋白报告质粒通过如下方法构建得到：

(1)委托公司合成所述犬ISRE蛋白的启动子片段，用引物ISRE-F和ISRE-R通过PCR将启动子片段的两端加上酶切位点KnpI和NcoI；将纯化的PCR产物用KnpI和NcoI双酶切，再与经同样双酶切的载体pGL3-Basic连接，获得重组质粒pGL3-Basic-ISRE；

(2)将步骤(1)所得重组质粒pGL3-Basic-ISRE用NcoI和XbaI双酶切去除载体中Luciferase片段，获得线性片段；

(3)委托公司合成所述绿色荧光蛋白基因片段，用引物EGFP-F和EGFP-R通过PCR将启动子片段的两端加上酶切位点NcoI和XbaI；将纯化的PCR产物用NcoI和XbaI双酶切，再与步骤(2)所得线性片段连接，获得重组质粒pGL3-ISRE-EGFP，即为所述的绿色荧光蛋白报告质粒；

其中，所述引物ISRE-F和ISRE-R的序列分别为：

ISRE-F：GGGGTACCTGAGCTCTAGTTTC；

ISRE-R：GCCCATGGTGGCTTTACCAACA；

所述引物EGFP-F和EGFP-R的序列分别为：

EGFP-F：CATGCCATGGATGGTGAGCAAGG；

EGFP-R：GCTCTAGACTTGTACAGCTCGT。

步骤(1)中，所述的PCR的反应条件为：95℃3min；95℃15s、55℃15s、72℃30s、35个循环；72℃1min。

步骤(1)中，所述的PCR的反应体系为：浓度为10pmol/μL的上游引物ISRE-F 1μL，浓度为10pmol/μL的下游引物ISRE-R 1μL，基因模板1μL，ddH₂O补足至50μL。

步骤(3)中，所述的PCR的反应条件为：95℃3min；95℃15s、55℃15s、72℃30s、35个循环；72℃1min。

步骤(3)中，所述的PCR的反应体系为：浓度为10pmol/μL的上游引物EGFP-F 1μL，浓度为10pmol/μL的下游引物EGFP-R1μL，基因模板1μL，ddH₂O补足至50μL。

步骤S2中，所述体外培养的细胞优选为犬细胞；更优选为犬肾细胞；最优选为犬肾细胞MDCK。

步骤S2中，所述体外培养的条件为：37℃、5％CO₂、95％湿度的环境中培养20-30h。。

步骤S3中，所述犬ISRE蛋白的启动子的激活情况的判断方法为：观察绿色荧光蛋白的表达情况，若有明显绿色荧光蛋白表达，即犬α干扰素蛋白组和空白对照组相比，绿色荧光蛋白差异较显著，便将其消化为单个细胞，并通过流式细胞术来定量分析绿色荧光蛋白的表达量，以此判断ISRE启动子的激活情况。

所述的方法还包括如下步骤：以梯度稀释的犬IFN-α标准品制备标准曲线，确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系；将待检犬IFN-α样品加入体外培养后的细胞中，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价待检测犬IFN-α样品的效价。

与现有技术相比，本发明具有以下的有点及有益效果：

本发明利用绿色荧光蛋白报告检测系统，将犬ISRE启动子片段插入带有绿色荧光蛋白的质粒中，构建表达绿色荧光蛋白的重组质粒pGL3-ISRE-EGFP，通过检测绿色荧光蛋白的表达情况来判断ISRE启动子的激活情况，从而检测犬α干扰素生物学活性。本发明利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬α-IFN生物学活性的方法与传统检测方法MDCK-VSV相比，避免VSV病毒感染人的风险，提高了生物安全性。且本发明操作简单，可重复性高，成本低。

附图说明

图1是本发明构建的表达绿色荧光蛋白的重组质粒pGL3-ISRE-EGFP结构图。

图2是实施例2的犬α干扰素激活ISRE启动子的情况的流式检测结果图；其中A为对照组(未使用犬α干扰素激)结果，B为犬α干扰素激活组结果。

图3为实施例2的犬α干扰素激活ISRE启动子表达绿色荧光蛋白的结果图；其中A为对照组(未使用犬α干扰素激)结果，B为犬α干扰素激活组结果。

图4为犬α干扰素融合蛋白的可溶性分析结果图；其中，泳道M：Marker，泳道1：24h，泳道2：48h，泳道3：72h，泳道4：96h，泳道5：SMD1168H空菌对照组。

图5为对比例中1中犬α干扰素激活ISRE3启动子表达绿色荧光蛋白的结果图；其中A为犬α干扰素激活组结果，B为对照组(未使用犬α干扰素激)结果。

图6为对比例中2中犬α干扰素激活ISRE4启动子表达绿色荧光蛋白的结果图；其中A为犬α干扰素激活组结果，B为对照组(未使用犬α干扰素激)结果。

图7为对比例中3中犬α干扰素激活ISRE13IN5-2启动子表达绿色荧光蛋白的结果图；其中A为犬α干扰素激活组结果，B为对照组(未使用犬α干扰素激)结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：构建含有ISRE启动子靶序列的重组质粒pGL3-Basic-ISRE。

分析并优化一组NCBI上传的犬ISRE启动子的序列，得到优化后的序列由上海通用公司合成；通过Snapgene4.1.8分析pGL3-Basic质粒选择酶切位点KnpI和NcoI，设计一对引物ISRE-F和ISRE-R，通过PCR将靶序列的5’和3’端加上酶切位点，所得带有酶切位点的启动子序列如下所示(下划线部分为酶切位点)(SEQ ID NO.1)：

GGTACCTGAGCTCTAGTTTCATTTCCCTAGTTTCATTTCCCTAGTTTCATTTCCCTAGTTTCATTTCCCTAGTTTCATTTCCCCTCGAGGATATCAAGATCTGGCCTCGGCGGCCAAGCTTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTTGGCAATCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG

引物为：

上游引物ISRE-F:5’-GGGGTACCTGAGCTCTAGTTTC-3’(SEQ ID NO.3)

下游引物ISRE-R:3’-GCCCATGGTGGCTTTACCAACA-5’(SEQ ID NO.4)

扩增体系：PCR Master Mix酶25μL，上游引物(10pmol/μL)ISRE-F 1μL，下游引物(10pmol/μL)ISRE-R 1μL，基因模板1μL，ddH₂O补足至50μL。

扩增反应条件：95℃3min；95℃15s、55℃15s、72℃30s、35个循环；72℃1min。

PCR完成后，通过1％琼脂糖凝胶电泳将片段进行回收，使用New England Biolabs公司的内切酶进行双酶切；将酶切产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行目的片段分离、回收。将载体pGL3-Basic用New England Biolabs公司的内切酶进行双酶切；将酶切产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行目的片段分离、回收。将目的片段与载体酶切产物用T4 DNA连接酶连接；

连接反应条件：T4连接酶1μL，10倍浓度的T4 DNA连接酶缓冲液(10×T4 DNA连接酶缓冲液)1μL，50ng载体pGL3-Basic片段和三倍摩尔的插入片段，用ddH₂O补足至10μL，将反应管置于16℃金属浴连接仪中过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将菌液涂氨苄霉素(浓度为100μg/mL)LB固体板中，37℃培养；待长出菌落时，挑取单个菌落，用上述ISRE-F和ISRE-R作为引物，进行菌液PCR检测；进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测到大小约为200bp的目的条带。将条带大小正确的PCR产物进行测序，将测序结果正确的PCR产物对应的菌液进行扩大培养并提取质粒命名为pGL3-Basic-ISRE，保存至-20℃冰箱，同时将菌液用含有15％-20％甘油的LB溶液进行保存，放置于-80℃。

实施例2：构建含有ISRE启动子靶序列的绿色荧光蛋白重组质粒pGL3-Basic-ISRE-EGFP。

分析并选定一组NCBI上传的EGFP序列(NCBI登录号为:ABE28520.1)得到优化后的序列由上海通用公司合成；

优化后的绿色荧光蛋白的核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO.2)：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG

根据软件Snapgene4.1.8分析，选择NcoI(CCATGG)和XbaI(TCTAGA)，设计一对引物(EGFP-F和EGFP-R)，通过PCR使得靶序列5’和3’端带有酶切位点；引物为：

上游引物EGFP-F:5’-CATGCCATGGATGGTGAGCAAGG-3’(SEQ ID NO.5)

下游引物EGFP-R:3’-GCTCTAGACTTGTACAGCTCGT-5’(SEQ ID NO.6)

使用引物EGFP-F和EGFP-R通过PCR将目的片段两端加上酶切位点NcoI和XbaI；

扩增体系：PCR Master Mix酶25μL，上游引物(10pmol/μL)EGFP-F 1μL，下游引物(10pmol/μL)EGFP-R 1μL，基因模板1μL，ddH₂O补足至50μL。

扩增反应条件：95℃3min；95℃15s、55℃15s、72℃30s，35个循环；72℃1min。PCR完成后，通过1％琼脂糖凝胶电泳将片段进行回收，使用New England Biolabs公司的内切酶NcoI和XbaI进行双酶切；将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离、回收。将载体pGL3-Basic-ISRE使用New England Biolabs公司的内切酶NcoI和XbaI进行双酶切去除载体中Luciferase片段，通过切胶回收纯化的方式获得线性片段。将目的片段酶切产物与载体酶切产物用T4DNA连接酶进行连接；

连接反应条件：T4连接酶1μL，10倍浓度的T4 DNA连接酶缓冲液(10×T4 DNA连接酶缓冲液)1μL，50ng载体pGL3-Basic-ISRE片段和三倍摩尔的插入片段，用ddH₂O补足至10μL,将反应管置于16℃金属浴连接仪中过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将菌液涂氨苄霉素LB固体板中，37℃培养；待长出菌落时，挑取单个菌落，用上述ISRE-F和ISRE-R作为引物，进行菌液PCR检测；进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测到大小约为800bp的目的条带。将条带大小正确的PCR产物进行测序，将测序结果正确的PCR产物对应的菌液进行扩大培养并提取质粒命名为pGL3-ISRE-EGFP，保存至-20℃冰箱，同时将菌液用含有15％-20％甘油的LB溶液进行保存，放置于-80℃。

实施例3：

(1)转染：

利用实施例2所述方法制备重组质粒pGL3-ISRE-EGFP，采取无内毒素质粒抽提质粒。将pGL3-ISRE-EGFP质粒转染到犬肾细胞MDCK(ATCC)中，步骤参考Lipofectamine ^TM2000操作说明书进行转染，具体操作步骤如下：

A:转染前一天，将培养状态良好的MDCK细胞进行铺板，细胞培养液为10％FBSDMEM培养基，按照5×10⁵个细胞/ml接种于12孔板内，每孔800μL，放置于5％CO₂、37℃和95％湿度的细胞培养箱培养。

B:第二天待细胞长至80-90％时开始转染。

C:转染试剂复合物的准备：取无菌1.5mL离心管1支，标记管1：600μL

Ⅰ减血清培养基加入12μL Lipofectamine^TM 2000。另外取1支无菌1.5mL离心管，标记管2：600μL

Ⅰ减血清培养基加入4μg pGL3-ISRE-EGFP质粒。将两管混合液轻轻吹打混匀，室温孵育5min。

D:5min后，将稀释的脂质体管1稀释的质粒管2混合在一起(总体积1200μL)，轻轻吹打混匀，室温孵育20min。

E:将12孔板中细胞弃去细胞培养液，用PBS清洗2-3次。将脂质体-质粒复合物混合液分装200μL至12孔板中。

F：5％CO₂、37℃和95％湿度的细胞培养箱培养4～6h后，更换为2％的细胞维持液(含2％FBS的DMEM培养基)，24h后进行蛋白孵育。

(2)蛋白孵育：

对已经转染质粒的MDCK细胞进行蛋白孵育，步骤如下：

A:使用含2％FBS的DMEM培养基将犬α干扰素蛋白浓度稀释至终浓度0.3μg/μL；

B:将已经转染的细胞分为犬α干扰素实验组，pGL3-ISRE-EGFP质粒转染对照，空白对照组，每组设置三个重复，进行三次独立实验；

C:将上述稀释好的犬α干扰素加入对应孔中刺激细胞，转染对照组和空白对照组加入2％FBS DMEM培养基，犬α干扰素实验组和对照组中每孔均加入1mL 2％FBS DMEM。

D:将上述加样后的细胞，继续放入5％CO₂ 37℃和95％湿度的细胞培养箱进行培养，24h后通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果如图3所示。

(3)通过流式细胞术来定量检测结果：

A:荧光显微镜观察过绿色荧光蛋白的细胞板，弃去上清，用PBS清洗2-3次。B:每孔加入Gibco公司的胰酶-EDTA(0.25％)600μL，将细胞消化10min，弃胰酶，用含2％FBS PBS将细胞轻轻吹打成单个细胞悬液。

C:用0.44μM细胞筛过滤步骤B中的细胞悬液。

D：在无菌的1.5ml离心管中取25μL细胞悬液和25μL 0.8％台盼蓝等比例混合后，取25μL混合液加入计数板中，使用细胞计数仪计算细胞个数。将细胞悬液稀释成大约2×10⁵个细胞，取1mL稀释后的细胞悬液加入流式管中，充分吹打混匀。

E:上流式细胞仪进行检测绿色荧光蛋白的表达量。结果如图2所示。

(4)记录数据：比较犬α干扰素实验组和转染对照组绿色荧光蛋白的差异。通过实验结果可以得出，质粒转染成功，与对照组相比，实验组经犬α干扰素刺激后产生较强的荧光，且差异显著。

本实验中所用的犬α干扰素通过如下步骤制备得到：

(一)犬α干扰素蛋白的表达载体的构建

根据NCBI上传的犬α干扰素Clifn序列(NCBI登录号为:ABF68838.1)，根据软件分析将其进行密码子优化，得到优化后的连接片段核苷酸序列由通用生物系统(安徽)有限公司合成，经测序正确后，获得犬α干扰素基因，命名为Clifn，序列如下(SEQ ID NO.7)：

GAATTCATGTGTCACTTGCCAGACACTCACGGTTTGAGAAACTGGAGAGTTTTGACTTTGTTGGGTCAAATGAGAAGATTGTCTGCTGGTTCTTGTGACCACTACACTAACGACTTCGCTTTCCCAAAGGAATTGTTCGACGGTCAAAGATTGCAAGAAGCTCAAGCTTTGTCTGTTGTTCACGTTATGACTCAAAAGGTTTTCCACTTGTTCTGTCCAGACACTTCTTCTGCTCCATGGAACATGACTTTGTTGGAAGAATTGTGTTCTGGTTTGTCTGAACAATTGGACGACTTGGAAGCTTGTCCATTGCAAGAAGCTGGTTTGGCTGAAACTCCATTGATGCACGAAGACTCTACTTTGAGAACTTACTTCCAAAGAATCTCTTTGTACTTGCAAGACAGAAACCACTCTCCATGTGCTTGGGAAATGGTTAGAGCTGAAATCGGTAGATCTTTCTTCTCTTCTACTATCTTGCAAGAAAGAATCAGAAGAAGAAAGCACCACCACCACCACCACTAAGCGGCCGC

犬α干扰素前端克隆位点：EcoRI，后端克隆位点NotI，将目的片段克隆至pPICZαA载体上，得到重组表达载体pPICZα-Clifn-yeco。载体由公司合成。

5’AOX:5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’(SEQ ID NO.8)

3’AOX:3’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-5’(SEQ ID NO.9)

将上述构建好的重组表达载体转化至DH5α大肠杆菌感受态中，将菌液涂博来霉素LB固体板中，37℃培养；待长出菌落时，挑取单个菌落，用上述5’AOX和3’AOX作为引物，进行菌液PCR检测；进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测到大小约为1000bp的目的条带。将条带大小正确的PCR产物进行测序，将测序结果正确的PCR产物对应的菌液进行扩大培养并提取质粒命名为pPICZα-Clifn-yeco，保存至-20℃冰箱，同时将菌液用含有15％-20％甘油的LB溶液进行保存，放置于-80℃。

(二)犬α干扰素蛋白的表达菌株的构建与诱导表达

1、将步骤(一)中构建的重组表达载体pPICZα-Clifn-yeco进行单酶切，选用的酶切位点为SacI，通过1％琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收，获得线性化片段。

2、制作SMD1168H感受态细胞和转化。

(1)5mL无菌锥形瓶中放置50mL YPD培养基，挑取单个SMD1168H毕赤酵母菌(NTCC保藏中心)落接种于培养基中，29℃，250rmp摇床过夜培养。

(2)250mL锥形瓶中放置50mL新鲜YPD，按1％的接种量接种到新的培养基中，如取(1)中50μL菌液接种于50mL培养基中，29℃，250rmp摇床过夜培养。等待菌生长至OD600＝1.0-1.5之间。

(3)离心机提前预冷至4℃，1500×g离心5分钟。用50mL预冷的溶液I洗涤细胞3次，再用4mL溶液I重悬细胞。

(4)将重悬细胞分装至1.5mL无菌离心管中，迅速放入-80℃冰箱冻存。

(5)加入1ug线性化质粒和40ug单链的carrier DNA(carrier DNA须在使用前沸水中煮5min后迅速插入冰中，重复两次。)

(6)37℃水浴，每10-15s混匀一次，1min。

(7)加入1.4mL溶液2，轻轻吹打1min使其混匀。

(8)将上述溶液转入15mL离心管中，放置于30℃孵育1小时。

(9)3000×g离心5分钟，弃上清，用1mL溶液3将细胞重悬。将重悬的细胞悬液涂布于含100ug/mL的博来霉素YPD琼脂板上。

(10)在30℃培养箱中孵育2-4天，直至菌落形成。

步骤(1-9)中的溶液1、2、3需提前配置，具体配置方法如下：

溶液1：1.0M山梨醇，10Mm N-双(羟乙基)甘氨酸，3％PEG，5％甘油

溶液2：40％PEG1000，0.2M N-双(羟乙基)甘氨酸

溶液3:0.15M NaCl，10mM N-双(羟乙基)甘氨酸

溶液1、2、3pH调节至8.35后，使用Millpore公司的0.22μm的除菌过滤器过滤除菌。

3.待菌落形成后，在PCR管中加入50μLYPD液体培养基，挑取单菌落用培养基悬浮，加入1μL溶壁酶处理菌液，放置于37℃培养箱30min。用上述5’AOX和3’AOX的引物进行PCR检测。

扩增体系：PCR Master Mix酶25μL,上游引物(10pmol/μL)5’AOX 1μL，下游引物(10pmol/μL)3’AOX 1μL，基因模板1μL，ddH2O补足至50μL。

扩增反应条件：95℃3min；95℃15s、55℃15s、72℃30s，35个循环；72℃1min。PCR反应完成后，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，获得大小约1000bp的目的条带。将PCR检测对应的阳性克隆菌株进行测序，将测序正确的菌株命名为pPICZα-clifn-yeco，将菌液用含有15-20％甘油的YPD培养基保存于-80℃。

4.挑取单菌落至25mL BMGY液体培养基在250mL锥形瓶中，29℃，250rpm摇床过夜培养至OD600＝2-6之间。

5.1500×g离心收集细胞。弃去上清，将细胞用25mL BMMY培养基重悬，转移至新的250mL锥形瓶中。

6.每24h取1mL上清离心取上清弃沉淀，并加入终浓度20％的甘油保存在-20℃，并每24h加入终浓度为0.5％甲醇诱导表达。时间点为：24h，48h，72h，96h。在96h收集全部上清加入终浓度20％甘油保存于-20℃。

(三)犬α干扰素融合蛋白的可溶性分析和定量分析

1、将每个时间段收集的上清分别取少量进行Western Blot，判断目的蛋白可溶性表达，配制SDS-PAGE分离胶：

(1)采用垂直式电泳槽装置，配制10％和12％的分离胶。检查玻璃板的密封性，按照分离胶体系(见表1和表2)，配制分离胶混合液，并将混合液迅速倒入玻璃板间，倒入分离液之后，再加入1mL的异丙醇溶液，来平衡液面，等待30～60min完全凝固后配制层积胶。

表1 10％的PAGE分离胶

表2 12％的PAGE分离胶

(2)待分离胶完全凝固后，将异丙醇倒出，并用吸水纸吸去多余的异丙醇，按照层积胶的体系(见表3)配制层积胶。将混合均匀的层积胶迅速倒入玻璃板中，并且插入合适的梳子，等待30min左右，待层积胶凝固。

(3)蛋白胶处理：待30min左右层积胶完全凝固后，将配置好的SDS-PAGE蛋白胶玻璃板固定在电泳槽上，加入电泳缓冲液，内槽电泳缓冲液没过玻璃板胶面，但是不溢出玻璃板，取出梳子，准备上样。

(4)样品处理：取出适量样品加入5×SDS上样缓冲液，混匀后，至沸水中煮10min，若加热后的样品有粘性产物，将样品进行瞬时离心后，取上清上样。

(5)上样：处理过的样品加入蛋白凝胶的样品孔中，同时加入等量的蛋白Marker跑胶。

(6)电泳：上样后进行电泳，将电泳电压调节至80V，跑胶30min，待条带从层积胶跑至分离胶调节电压至120V，电泳时间由样品中的溴酚蓝到达玻璃板下端的时间而定。

(7)将胶与玻璃板轻轻剥离，切除多余的胶。提前配置预冷转膜缓冲液：25mM Tris(121.4MW)3.03g，190mM甘氨酸(75.07MW)14.26g，溶解于800mL去离子水中，加入200mL甲醇混匀。取一搪瓷盘，加入适量的转膜缓冲液并放入转膜用的夹子，黑面朝下按顺序依次一块海绵垫、三层滤纸、胶、合适大小的NC膜、三层滤纸以及一块海绵垫。操作过程中尽量不要产生气泡，将夹子夹紧后装槽，然后加入1L转膜缓冲液。200mA转移90min，整个过程在冰上进行。

(8)转膜结束后，将膜用TBS洗涤两遍后，预先配置好的封闭液5％脱脂奶粉，将膜放置于平皿中加入适量的封闭液，放置于脱色摇床上封闭1h。

(9)用TBST洗涤膜3次，每次5min。

(10)将一抗用PBS稀释至适当浓度，稀释后的一抗要完全覆盖膜表面，4℃过夜孵育。第二天早上用TBST洗涤3次，每次5min，进行化学发光反应。

(11)将溶液A和溶液B等体积混合后加入膜中，是膜与之充分接触。1min后将膜转移至Tanon公司全自动化学发光式分析仪中进行曝光。显影时间设定为30s，待出现明显条带后，即刻中止显影。

结果如图4所示。结果显示，重组表达载体pPICZα-clifn-yeco在SMD1168H菌种的分泌表达，每24小时经甲醇诱导后收集上清样品Western Blot检测结果。M：Marker；1：24h；2：48h；3：72h；4：96h；5：SMD1168H空菌对照组。

(四)犬α干扰素蛋白的纯化及定量分析

1、采用GE公司的镍柱亲和层析法对目的蛋白进行纯化，纯化步骤如下：

(1)平衡：取1mL镍填料加入柱子中加入10mL提前配好的裂解缓冲液(Lysisbuffer:50mM NaH2PO4·2H2O(MW 137.99g/mol)，300mM NaCl(MW 58.44g/mol)，加入约900mL去离子水溶解均匀后，加入NaOH调节溶液pH值至8.0，加入去离子水定容至1000mL)进行平衡填料，重复3-5次。

(2)上样：在平衡过的柱子中加入培养基上清液，分批量加入，直至样品完全过柱。

(3)洗涤：往柱子中加入已配好的洗涤缓冲液(Wash buffer)清洗柱子，洗两次，每次5mL。

(4)洗脱：在洗涤结束后，加入洗脱缓冲液(Elution buffer)将目的蛋白洗脱下来，每次500uL，清洗5次。

(5)收集：每次洗脱均用不同的1.5mL离心管进行标记、保存。

(6)样品处理：洗脱下来的每管分别取20μL样品进行SDS-PAGE鉴定，结果显示，纯化后得到单一的目的条带。

(7)保存：根据SDS-PAGE结果，将对应的样品加入20％甘油进行保存。

2、定量分析

使用Brandford法测定蛋白浓度。预先配置1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)，用PBS将其稀释为：10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，60μg/mL，80μg/mL，100μg/mL。

取6只1.5mL离心管分别加入900uL Brandford储存液，再加入100uL上述稀释的BSA溶液，充分混匀，在室温下静置10min。取一块酶标板，将反应后的溶液取100uL分别加入相应孔中，在酶标仪OD595波长读数。根据上述方法建立标准曲线为y＝0.0015x+0.1387(R²＝0.9926)。根据标准曲线计算出纯化后的蛋白浓度为：144μg/mL。将测过浓度的蛋白标记后保存于-20℃。

对比例1

参考实施例1和2中的方法，分析并优化一组NCBI上传的犬ISRE启动子的序列，构建含有含有ISRE启动子靶序列的绿色荧光蛋白重组质粒pGL3-Basic-ISRE3-EGFP。

ISRE3序列(SEQ ID NO.10)：

GGTACCTGAGCTCTAGTTTCCTTTCCCTAGTTTCCTTTCCCTAGTTTCCTTTCCCTAGTTTCCTTTCCCTAGTTTCCTTTCCCCTCGAGGATATCAAGATCTGGCCTCGGCGGCCAAGCTTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTTGGCAATCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG

参考实施例3的方法，采取无内毒素质粒抽提质粒，将pGL3-ISRE3-EGFP质粒转染到犬肾细胞MDCK中。对已经转染质粒的MDCK细胞进行蛋白孵育。通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果如图5所示。结果显示，犬α干扰素刺激后，实验组与转染对照组相比荧光数量并没有明显的差异。

对比例2

参考实施例1和2中的方法，分析并优化一组NCBI上传的犬ISRE启动子的序列，构建含有含有ISRE启动子靶序列的绿色荧光蛋白重组质粒pGL3-Basic-ISRE4-EGFP。

ISRE4序列(SEQ ID NO.11)：

GGTACCTGAGCTCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCCTCGAGGATATCAAGATCTGGCCTCGGCGGCCAAGCTTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTTGGCAATCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG

参考实施例3的方法，采取无内毒素质粒抽提质粒，将pGL3-ISRE4-EGFP质粒转染到犬肾细胞MDCK中。对已经转染质粒的MDCK细胞进行蛋白孵育。通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果如图6所示。结果显示，a、b为犬α干扰素刺激组与c对照组相比，荧光数量并没有明显差异，且对照组背景值太高。

对比例3

参考实施例1和2中的方法，分析并优化一组NCBI上传的犬ISRE启动子的序列，构建含有含有ISRE启动子靶序列的绿色荧光蛋白重组质粒pGL3-Basic-ISRE13IN5-2-EGFP

ISRE13IN5序列(SEQ ID NO.12)：

ggtacctgagctctagtttctgtttcccctcgaggatatcaagatctggcctcggcggccaagcttagacactagagggtatataatggaagctcgacttccagcttggcaatccggtactgttggtaaagccaccatgg

参考实施例3的方法，采取无内毒素质粒抽提质粒，将pGL3-ISRE13IN5-2-EGFP质粒转染到犬肾细胞MDCK中。对已经转染质粒的MDCK细胞进行蛋白孵育。通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果如图7所示。结果显示，实验组经犬α干扰素刺激后与对照组相比，荧光数量并没有明显的差别，并不能说明犬α干扰素激活了相关ISRE启动子。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 183

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>犬ISRE蛋白的启动子的核苷酸序列

<400> 1

tgagctctag tttcatttcc ctagtttcat ttccctagtt tcatttccct agtttcattt 60

ccctagtttc atttcccctc gaggatatca agatctggcc tcggcggcca agcttagaca 120

ctagagggta tataatggaa gctcgacttc cagcttggca atccggtact gttggtaaag 180

cca 183

<210> 2

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>绿色荧光蛋白的核苷酸序列

<400> 2

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ISRE-F

<400> 3

ggggtacctg agctctagtt tc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ISRE-R

<400> 4

gcccatggtg gctttaccaa ca 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EGFP-F

<400> 5

catgccatgg atggtgagca agg 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EGFP-R

<400> 6

gctctagact tgtacagctc gt 22

<210> 7

<211> 530

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>犬α干扰素基因

<400> 7

gaattcatgt gtcacttgcc agacactcac ggtttgagaa actggagagt tttgactttg 60

ttgggtcaaa tgagaagatt gtctgctggt tcttgtgacc actacactaa cgacttcgct 120

ttcccaaagg aattgttcga cggtcaaaga ttgcaagaag ctcaagcttt gtctgttgtt 180

cacgttatga ctcaaaaggt tttccacttg ttctgtccag acacttcttc tgctccatgg 240

aacatgactt tgttggaaga attgtgttct ggtttgtctg aacaattgga cgacttggaa 300

gcttgtccat tgcaagaagc tggtttggct gaaactccat tgatgcacga agactctact 360

ttgagaactt acttccaaag aatctctttg tacttgcaag acagaaacca ctctccatgt 420

gcttgggaaa tggttagagc tgaaatcggt agatctttct tctcttctac tatcttgcaa 480

gaaagaatca gaagaagaaa gcaccaccac caccaccact aagcggccgc 530

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5’AOX

<400> 8

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 3’AOX

<400> 9

gcaaatggca ttctgacatc c 21

<210> 10

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ISRE3序列

<400> 10

ggtacctgag ctctagtttc ctttccctag tttcctttcc ctagtttcct ttccctagtt 60

tcctttccct agtttccttt cccctcgagg atatcaagat ctggcctcgg cggccaagct 120

tagacactag agggtatata atggaagctc gacttccagc ttggcaatcc ggtactgttg 180

gtaaagccac catgg 195

<210> 11

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ISRE4序列

<400> 11

ggtacctgag ctctagtttc actttcccta gtttcacttt ccctagtttc actttcccta 60

gtttcacttt ccctagtttc actttcccct cgaggatatc aagatctggc ctcggcggcc 120

aagcttagac actagagggt atataatgga agctcgactt ccagcttggc aatccggtac 180

tgttggtaaa gccaccatgg 200

<210> 12

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ISRE13IN5序列

<400> 12

ggtacctgag ctctagtttc tgtttcccct cgaggatatc aagatctggc ctcggcggcc 60

aagcttagac actagagggt atataatgga agctcgactt ccagcttggc aatccggtac 120

tgttggtaaa gccaccatgg 140

Claims

1.一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1: 将犬ISRE启动子克隆在绿色荧光蛋白基因上游，构建成绿色荧光蛋白报告质粒；具体步骤如下：

（1）委托公司合成所述犬ISRE启动子片段，用引物ISRE-F和ISRE-R通过PCR将该片段的两端加上酶切位点KnpI和NcoI；将纯化的PCR产物用KnpI和NcoI双酶切，再与经同样双酶切的载体pGL3-Basic连接，获得重组质粒pGL3-Basic- ISRE；

（2）将步骤（1）所得重组质粒pGL3-Basic-ISRE用NcoI和XbaI双酶切去除载体中Luciferase片段，获得线性片段；

（3）委托公司合成所述绿色荧光蛋白基因片段，用引物EGFP-F和EGFP-R通过PCR将该片段的两端加上酶切位点NcoI和XbaI；将纯化的PCR产物用NcoI和XbaI双酶切，再与步骤（2）所得线性片段连接，获得重组质粒pGL3-ISRE-EGFP，即为所述的绿色荧光蛋白报告质粒；

其中，所述引物ISRE-F和ISRE-R的序列分别为：

ISRE-F：GG GGTACC TGAGCTCTAGTTTC；

ISRE-R：GC CCATGG TGGCTTTACCAACA；

所述引物EGFP-F和EGFP-R的序列分别为：

EGFP-F：CATG CCATGG ATGGTGAGCAAGG；

EGFP-R：GC TCTAGA CTTGTACAGCTCGT；

S2: 将重组质粒转染体外培养的细胞；

S3: 用犬IFN-α刺激转染后的细胞，通过检测绿色荧光蛋白的表达量，判断犬ISRE启动子的激活情况，从而检测IFN-α的生物学活性；

步骤S1中，所述犬ISRE启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤S1中，所述绿色荧光蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤S3中，所述犬ISRE启动子的激活情况的判断方法为：观察绿色荧光蛋白的表达情况，若有明显绿色荧光蛋白表达，即犬α干扰素蛋白组和空白对照组相比，绿色荧光蛋白差异较显著，便将其消化为单个细胞，并通过流式细胞术来定量分析绿色荧光蛋白的表达量，以此判断ISRE启动子的激活情况。

4.根据权利要求1所述的利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤S2中，所述体外培养的细胞为犬细胞。

5.根据权利要求1所述的利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤S2中，所述体外培养的细胞为犬肾细胞MDCK。

6.根据权利要求1所述的利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤S2中，所述体外培养的条件为：37℃、5%CO₂、95%湿度的环境中培养20-30 h。

7.根据权利要求1所述的利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1）中，所述的PCR的反应条件为：95℃ 3min；95℃ 15s、55℃ 15s、72℃ 30s、35个循环；72℃ 1min；

步骤（1）中，所述的PCR的反应体系按每50μL反应体系组成如下计：PCR Master Mix酶25μL，浓度为10pmol/μL的上游引物ISRE-F 1μL，浓度为10pmol/μL的下游引物ISRE-R 1μL，基因模板1μL，ddH₂O补足至50μL。

8.根据权利要求1所述的利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（3）中，所述的PCR的反应条件为：95℃ 3min；95℃ 15s、55℃ 15s、72℃ 30s、35个循环；72℃ 1min；

步骤（3）中，所述的PCR的反应体系按每50μL反应体系组成如下计：PCR Master Mix酶25μL，浓度为10pmol/μL的上游引物EGFP-F 1μL，浓度为10pmol/μL的下游引物EGFP-R1μL，基因模板1μL，ddH₂O补足至50μL。