CN101948806A - 一种人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株，是将人干扰素-alpha基因转染入自然杀伤细胞株NKL细胞，构建成的稳定分泌、表达人干扰素-alpha的细胞株。本发明所构建的细胞株，经RT-PCR及ELISA检测鉴定能够在胞内表达，并将合成的IFN-α分泌到胞外培养上清中。进一步研究表明，人IFN-α基因修饰的NKL细胞株能够有效杀伤肝癌细胞，这种抗肿瘤效应与NKL-IFNα细胞IFN-γ、Granzyme、TNF-α和Perforin基因和蛋白的表达水平提高相关。并且修饰后的NKL细胞株对外界刺激更加敏感。因此，本发明的细胞株的生物学特征更有利于临床过继免疫治疗的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株及其构建方法，属于肿瘤的过继免疫治疗领域。
背景技术
众所周知，NK细胞作为机体固有免疫的重要组成部分是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线，故NK细胞在肿瘤过继免疫治疗方面的作用倍受关注，输注供者异源反应性NK细胞已经成为临床移植辅助治疗及抗肿瘤生物治疗的新策略。但NK细胞体外扩增效率低，因此建立NK细胞株成为肿瘤生物治疗的重要手段。
NKL细胞株来源于CD3-CD16+CD56+的大颗粒淋巴细胞白血病患者的外周血，具有广谱的细胞毒活性，具有良好的临床应用前景。
干扰素是具有抗病毒、抗增殖和调节免疫活性的一种糖蛋白，多项实验证明干扰素-alpha具有抗肿瘤作用。
基于上述现有技术，如果能够建立人干扰素-alpha基因修饰的NKL细胞株，则有望能够进一步增强NKL细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，提高其对刺激的敏感性和活化程度，能够更加符合过继免疫治疗的要求，更适合应用于肿瘤的生物治疗。迄今为止，未见有关建立人干扰素-alpha基因修饰的NKL细胞株的相关报道。
发明内容
针对上述肿瘤过继免疫治疗的现状，针对干扰素-alpha的作用特点，本发明的目的是建立一种人干扰素-alpha基因修饰的NKL细胞株，使其更加符合肿瘤生物治疗的要求。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株，是将人干扰素-alpha基因转染入自然杀伤细胞株NKL细胞，构建成的稳定分泌、表达人干扰素-alpha的细胞株。
一种人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株的构建方法，包括以下步骤：
(1)分离人外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，扩增人IFN-α的cDNA片段，长度为569bp；
(2)将上述RT-PCR产物与T-载体连接，构建T-IFNα，然后转入感受态大肠杆菌DH5α，过夜培养，提取质粒测序鉴定，筛选阳性克隆，对于测序正确的阳性克隆，提取纯化T-IFNα；
(3)对T-IFNα和表达载体psectag-B分别进行BamH I和EcoR I的双酶切，并回收目的条带；
(4)将步骤(3)制得的酶切后的载体片段与IFN-α条带进行连接，产物转入感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性重组子，提取纯化psectagB-IFNα载体(人干扰素-alpha的分泌型重组真核表达载体)；
(5)将psectagB-IFNα载体通过电转入自然杀伤细胞株NKL细胞，将电转后的细胞转入筛选培养基，筛选培养基为：含终浓度为50mg/L Zeocin的1640完全培养基，培养3～4天，从中挑选出阳性细胞克隆；
(6)将上述阳性细胞克隆在含10％胎牛血清、100活性单位的IL-2的1640培养基中进行扩增，即得到人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株。
所述步骤(1)中，扩增所用引物序列为：
IFN-α-F：5′-TTAGGATCCATGGCCTCGCCCTTT-3′；
IFN-α-R：5′-CGCGAATTCGTTATTCCTTCCTCC-3′；
PCR反应条件为：95℃变性5min，94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环，72℃延伸10min。
本发明所构建的人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞NKL细胞株，经RT-PCR及ELISA检测鉴定能够在胞内表达，并将合成的IFN-α分泌到胞外培养上清中。进一步研究表明，人IFN-α基因修饰的NKL细胞株能够有效杀伤肝癌细胞HepG2、H7402、PLC/PRF-5和HepG2.2.15，这种抗肿瘤效应与NKL-IFNα细胞IFN-γ、Granzyme、TNF-α和Perforin基因和蛋白的表达水平提高相关。并且修饰后的NKL细胞株对外界刺激更加敏感，在肝癌细胞HepG2，HepG2.2.15，或者刺激剂PMA刺激下，能够分泌更多IFN-γ。因此，本发明的人IFN-α基因修饰的NKL细胞的生物学特征更有利于临床过继免疫治疗的应用。
本发明的IFN-α基因修饰的NK细胞株(NKL-IFNα)，通过电转的方法将目的基因IFN-α转入NKL细胞株，此转染方法解决了NK细胞难以转染的问题，转染效率高且成本低，利于筛选和推广。修饰后的细胞与未修饰NKL细胞相比，该细胞株可以稳定表达IFNα，可以对多种来源的肝癌肿瘤细胞的杀伤能力显著提高，提高使用效率，在达到同等抗肿瘤效果的前提下，减少NK细胞的剂量，从而降低成本，更适于临床用于过继免疫治疗肿瘤。
附图说明
图1为psectagB-IFNα载体构建的示意图。
图2为PT-PCR检测基因修饰后NKL细胞表达IFN-α的mRNA水平。
图3为ELISA检测IFN-α基因修饰后，细胞培养上清中IFN-α的分泌水平；图示分别为细胞培养24h，48h时，基因修饰后组细胞上清中IFN-α的分泌水平明显升高。
图4为IFN-α基因修饰后的NKL细胞对四种肝癌细胞HepG2，H7402，PLC/PRF-5，HepG2.2.15杀伤能力的增强，其中，左上为HepG2，右上为H7402，左下为PLC/PRF-5，右下为HepG2.2.15。
图5为Real-time PCR检测IFN-α基因修饰后，NKL细胞杀伤相关分子NKG2D，NKG2A，IFN-γ，Perforin，FasL的表达情况。
图6为ELISA检测IFN-α基因修饰前后的NKL细胞，在HepG2，HepG2.2.15细胞刺激下IFN-γ分泌水平。
图7为IFN-α基因修饰的NKL细胞在刺激剂PMA和Ionomycin作用24h和48h后，IFN-γ分泌水平明显升高，其中，上图为未刺激时修饰前后的NKL细胞分泌IFN-γ的水平，下图为PMA和Ionomycin刺激24h和48h后，修饰前后的NKL细胞分泌IFN-γ的水平。
图8为IFN-α基因修饰NKL细胞前后，胞内Granzyme B分子的表达情况。从左到右分别为同型对照，NKL-psec，NKL-IFNα和前两图的叠加。从图中可以看出，IFN-α基因修饰NKL细胞前表达量为31.2％，IFN-α基因修饰NKL细胞后表达量为86.53％，说明，IFN-α基因修饰能够增强Granzyme B的表达水平。
图9为IFN-α基因修饰NKL细胞前后，胞内TNF-α分子的表达情况。从左到右分别为同型对照，NKL-psec，NKL-IFNα和前两图的叠加。从图中可以看出，IFN-α基因修饰NKL细胞前后表达量分别为21.16％和50.86％，说明，IFN-α基因修饰能够增强TNF-α的表达水平。
图10为IFN-α基因修饰NKL细胞前后，胞内Perforin分子的表达情况。从左到右分别为同型对照，NKL-psec，NKL-IFNα和前两图的叠加。从图中可以看出，IFN-α基因修饰NKL细胞前后表达量分别为40.35％和78.44％，说明，IFN-α基因修饰能够增强Perforin的表达水平。
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售产品。
实施例 构建人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株
(一)人干扰素-alpha分泌型真核表达载体的构建，根据构建流程(图1)进行，具体步骤如下：
(1)分离人外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，扩增人IFN-α的cDNA片段，长度为569bp，扩增所用引物序列为：
IFN-α-F：5′-TTAGGATCCATGGCCTCGCCCTTT-3′；
IFN-α-R：5′-CGCGAATTCGTTATTCCTTCCTCC-3′；
PCR反应条件为：95℃变性5min，94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环，72℃延伸10min；
(2)RT-PCR产物与T-载体连接，产物转入感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，委托上海博亚生物工程公司进行DNA序列测定，结果表明序列与报道完全一致；
(3)T-IFNα和表达载体psectag-B分别进行BamH I和EcoR I的双酶切，并回收目的条带；
(4)将步骤(3)制得的酶切后的载体片段与IFN-α条带进行连接，产物转入感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性重组子。
(二)psectagB-IFNα稳定转染NKL细胞株
(1)psectagB-IFNα载体通过电转入NKL细胞株：
取对数生长期的细胞，电转前24小时换液，使细胞处于良好的营养状态；收集细胞，调节细胞数为107/管；用600μl预冷的Hepes液悬起细胞，加入100ug质粒，充分混匀；将细胞与质粒的混合物转入直径4cm的电转杯，电压200V，电容975μF条件下电击；冰浴15分钟后，将电转后的细胞转入100mL细胞培养瓶，37℃继续培养；
(2)转染后阳性细胞的筛选：
将电转后的细胞转入传入筛选培养基(含终浓度为50mg/L Zeocin的1640完全培养基)，培养3～4天，从中挑选出阳性细胞克隆；
(3)将上述阳性细胞克隆在含10％胎牛血清、100活性单位的IL-2的1640培养基中进行扩增，即得到具有临床应用价值的人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株。
(三)IFN-α基因修饰的阳性细胞克隆的鉴定过程
psectagB-IFNα载体转染NKL细胞株后，取筛选完成的阳性细胞进行RT-PCR检测IFN-α的转录水平，并用ELISA检测培养上清中IFN-α的分泌水平。
(1)RT-PCR分析：
经Zeocin筛选后的NK细胞，Trizol方法提取RNA进行RT-PCR分析，有IFN-α的mRNA转录(图2)。
(2)ELISA检测：
收集处于对数生长期的NKL-psec，NKL-IFNα细胞，接入96孔板中，分别检测24h，48h细胞培养上清中IFNα的分泌水平，如图3所示，NKL-IFNα细胞在24h时IFN-α的分泌能够达到200pg/ml，48h能够达到350200pg/ml左右。
(四)IFN-α基因修饰NK细胞的生物学特性
(1)IFN-α基因修饰对NKL细胞系杀伤活性的影响
应用MTT比色法检测IFN-α基因修饰的NKL细胞(NKL-IFN-α)和NKL-psec对人肝癌细胞系HepG2，H7402，PLC/PRF-5，HepG2.2.15细胞的杀伤能力。结果显示，NKL-IL15细胞在效靶比为10∶1，5∶1，2.5∶1时对HepG2细胞的杀伤活性显著增强(图4)，对H7402，HepG2.2.15，PLC/PRF-5细胞的杀伤效应也比对照NKL-psec细胞增强，提示内源性IFN-α能够提升NK细胞对肝癌细胞的杀伤效应。
(2)IFN-α基因修饰对NKL细胞系杀伤相关分子mRNA和蛋白表达的影响
为了阐明IFN-α对NK细胞杀伤活性的增强是否与杀伤相关分子的表达量有关，我们用RT-PCR检测了NKG2D，NKG2A，IFN-γ，FasL和Perforin基因的mRNA水平。结果显示，NKL-IFN-α细胞组的IFN-γ，Perforin基因的mRNA表达水平显著高于对照NKL-psec细胞组，NKG2A基因的mRNA表达低于对照细胞，NKG2D、FasL基因的mRNA表达没有明显变化(图5)。后续用流式细胞术检测NKL细胞胞内Granzyme、TNF-α和Perforin蛋白表达水平，NKL-IFNα细胞组均比对照细胞组有显著提高(图8，9，10)。
(3)ELISA检测NKL-IFNα细胞在刺激下，IFN-γ的分泌水平
NKL-IFNα细胞在肝癌细胞HepG2，HepG2.2.15刺激下，上清中IFN-γ的分泌水平高于对照细胞组(图6)。在刺激剂PMA和Ionomycin作用后，IFN-γ的分泌水平大幅提高，尤其在作用48h后，IFN-γ的分泌量能够达到7000pg/ml以上(图7)。
Claims (3)
1.一种人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株，其特征在于：是将人干扰素-alpha基因转染入自然杀伤细胞株NKL细胞，构建成的稳定分泌、表达人干扰素-alpha的细胞株。
2.权利要求1所述的一种人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离人外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，扩增人IFN-α的cDNA片段，长度为569bp；
(2)将上述RT-PCR产物与T-载体连接，构建T-IFNα，然后转入感受态大肠杆菌DH5α，过夜培养，提取质粒测序鉴定，筛选阳性克隆，对于测序正确的阳性克隆，提取纯化T-IFNα；
(3)对T-IFNα和表达载体psectag-B分别进行BamH I和EcoR I的双酶切，并回收目的条带；
(4)将步骤(3)制得的酶切后的载体片段与IFN-α条带进行连接，产物转入感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性重组子，提取纯化psectagB-IFNα载体；
(5)将psectagB-IFNα载体通过电转入自然杀伤细胞株NKL细胞，将电转后的细胞转入筛选培养基，筛选培养基为：含终浓度为50mg/L Zeocin的1640完全培养基，培养3～4天，从中挑选出阳性细胞克隆；
(6)将上述阳性细胞克隆在含10％胎牛血清、100活性单位的IL-2的1640培养基中进行扩增，即得到人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)中，扩增所用引物序列为：
IFN-α-F：5′-TTAGGATCCATGGCCTCGCCCTTT-3′；
IFN-α-R：5′-CGCGAATTCGTTATTCCTTCCTCC-3′；
PCR反应条件为：95℃变性5min，94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环，72℃延伸10min。
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