KR20120018762A - 제어된 혈청 약동학적 특성을 갖는 인간 단백질 스캐폴드 - Google Patents

제어된 혈청 약동학적 특성을 갖는 인간 단백질 스캐폴드 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 인간 혈청 알부민의 도메인 III, 도메인 IIIa 또는 도메인 IIIb, 또는 상기 도메인 III, 상기 도메인 IIIa 또는 상기 도메인 IIIb에 실질적인 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 스캐폴드; 상기 단백질 스캐폴드에 공유 결합된 표적화 부분; 및 상기 단백질 스캐폴드에 공유 결합된 치료성 부분 및/또는 영상화 부분을 포함하는 구성체를 제공한다. 상기 스캐폴드는 상기 구성체의 혈청 약동학적 특성을 조정하기 위해 변형될 수 있다. 상기 구성체의 제조 방법 이외에도, 상기 구성체의 치료, 영상화 및 진단 용도도 제공한다.

Description

제어된 혈청 약동학적 특성을 갖는 인간 단백질 스캐폴드{HUMAN PROTEIN SCAFFOLD WITH CONTROLLED SERUM PHARMACOKINETICS}
[관련 출원에 대한 상호 참조]
본 출원은 2009년 4월 8일에 출원된 미국 가출원 제61/167844호를 기초로 우선권의 이익을 주장하며, 상기 가출원의 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
[연방 정부 지원 연구 및 개발 하에 이루어진 발명의 권리에 대한 언급]
본 발명은 국립보건원에 의해 허여된 보조금 번호 CA086306으로 정부 지원 하에 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 갖는다.
[컴팩 디스크로 제출된 "서열목록", 표, 또는 컴퓨터 프로그램 목록 첨부물에 대한 언급]
해당 없음
[발명의 분야]
본 발명은, 구성체가 하나 이상의 표적화 부분 및 하나 이상의 영상화용, 진단용 또는 치료성 부분이 부착된 스캐폴드로서 인간 혈청 알부민 도메인 III을 포함하는 구성체, 그 조성물 및 그 용도에 관한 것이다.
지난 10년 간, 조합 라이브러리 기술은 높은 특이성 및 친화성으로 다양한 표적 또는 조직에 결합하도록 선택된 펩티드, 압타머 및 소형 화학 분자를 비롯한 다수의 분자를 산출하였다(Aina et al., 2007; Barbas and White, 2009; Bembenek et al., 2009). 그러나, 이들 분자가 생체내에 투여될 경우, 이들 분자는 종종, 일시적 혈청 지속성 및 영상화 또는 치료 용도를 위한 충분한 수준으로 표적 부위에 축적되지 못하는 성질을 특징으로 하는, 최적에 못미치는 약동학적 특성(PK)을 나타낸다. 이 문제를 해결하기 위해, 그러한 표적화 분자를 스캐폴드에 부착시킬 수 있다. 최근의 리뷰 문헌에 몇 종류의 스캐폴드가 기재되어 있다(Gronwall and Stahl, 2009; Nuttall and Walsh, 2008). 그러나, 이들은 비인간 기원이거나(예를 들어, 스타필로코커스 단백질 A(Friedman et al., 2007), 카멜리드 및 상어 단일 도메인 항체 이소타입(Saerens et al., 2008)으로부터 유래된 어피바디(affibody), 식물 사이클로타이드(Simonsen et al., 2008)로부터 유래된 시스테인 노트 미니단백질), 제어 가능한 PK를 제공할 수 없다(안키린, 아드넥틴, 아비머, 리포칼린 및 안티칼림(Nuttall and Walsh, 2008)).
인간 혈청 알부민(HSA; 67 kDa)은 인체에서 가장 풍부한 단백질이며(30～50 g/L), 이미 승인된 약물에 도입되었다(즉, Albuferon®, Novartis). 전임상 연구에서, HSA는 약물 전달 위한 담체 분자로서(Burger et al., 2001; Kratz et al., 2000; Wosikowski et al., 2003), 또 유전자 전달을 위한 벡터로서(Aina et al., 2007) 성공적으로 사용된 바 있다. 융합 단백질로서, HSA는 인터페론-α(Osborn et al., 2002), 인터루킨-2(Melder et al., 2005), 재조합 이중 특이적 항체 분자(Muller et al., 2007) 또는 scFv 항체 단편(Yazaki et al., 2008)과 같은 분자의 PK를 향상시킬 수 있는 그 능력을 입증하였다. IgG와 유사하게, HSA는 신생아의 Fc 수용체, 즉 FcRn(Brambell 수용체로도 알려져 있음)과 상호작용한다(Chaudhury et al., 2003). 이러한 상호작용은 알부민의 혈청 내 장기 지속성을 책임진다. 요약하면, 알부민 분자는 순환계로부터 유동상 피노사이토시스(pinocytosis)에 의해 혈관 내피 세포의 엔도솜으로 흡수된다. 조기 엔도솜(약 pH 6.5)에서, 알부민은 FcRn에 결합하고, 이것은 이 구획 내에 잔류한다. 엔소솜과 라이소솜이 융합되면, 엔도솜의 비결합 내용물은 방출되어 분해되는 한편, FcRn 결합 알부민은 보호된다. 엔도솜 사이클은 내피 세포의 선단측으로 다시 순환되어, 순환계의 중성 환경(pH 7.4)에 접하고, 여기서 알부민은 FcRn에 의해 다시 혈액으로 방출된다. 특히, HSA 도메인 III(DIII; 23 kDa)은 FcRn에 pH 의존적 방식으로 결합하는 것으로 확인되었다(Chaudhury et al., 2006). HSA 내의 3개의 보존된 히스티딘 잔기(H535, H510 및 H464)가 HSA-FcRn 상호작용에서 역할을 하는 것으로 추정되고 있다(Bos et al., 1989; Chaudhury et al., 2006).
현재, 임상에서 암 치료에 사용되는 가장 성공적인 표적화제는 완전한 항체이다(예를 들어, 트라스투주맵(Trastuzumab), 리툭시맵(Rituximab), 베바시주맵(Bevacizumab)). 항체를 이용하는 것의 이점은 그들의 뛰어난 표적 친화성 및 특이성과 우수한 안전성 이외에도 치료 효과를 달성하는 데 필요한 약동학적 특성(PK)을 갖고 있다는 것이다. 항체는 그 연장된 순환 지속성이 주로 Fc 도메인과 FcRn의 상호작용에 기인한다. HSA DIII의 크기의 2배인 것 이외에도, 항체의 Fc 도메인은 추가의 내인성 Fc 수용체와 상호작용한다. 이러한 생물학적 기능은 임상 용도에서 원치않는 부작용을 초래할 수 있다. 항체의 단점으로는 또한 표적 접근성과 관련된 특정한 제약뿐만 아니라, 주로 수명, 항체 약물 가격을 상승시키기도 하는 매우 힘든 제조 공정을 들 수 있다.
펩티드 및 압타머를 비롯한 다른 치료성 부분도 다양한 표적에 대한 나노몰의 친화성 및 고특이성을 나타내도록 선택될 수 있으며, 이들은 항체보다 제조 공정이 훨씬 빠르고 비용이 적게 든다. 이러한 저분자량 표적화제는 일반적으로 순환계로부터 매우 빨리 제거되어 전형적인 혈청 반감기가 몇분 정도라는 주된 단점이 있다. 이것은 표적 흡수율 감소를 초래하고 진단 영상화 및 치료에서의 임상적 사용을 위한 잠재력을 제한한다. 현대 의학에서는, 표적화된 영상화제와 치료제에 대한 바람직한 PK를 조정할 수 있는 능력이 매우 중요하다. 이것은 생체분자를 표적으로 할 수 있는 분자를 사용한 생체내 치료 및 영상화를 위한 조성물과 방법을 제공하였고, 분자량을 크게 변화시키지 않고 순환 반감기 범위를 갖는 혈청 지속성을 연장시켰다. 본 발명은 영상화 및/또는 치료를 비롯한 생체내 용도에 필요한 적절한 약동학적 특성을 갖도록 펩티드, 압타머 또는 소형 화학 물질 등의 종양 표적화 분자를 제공할 수 있는 저분자량의 저면역원성 또는 비면역원성의 물질에 대한 요구를 해결하는 것이다.
제1 양태에서, 본 발명은 HSA-DIII, HSA-DIII에 접합된 하나 이상의 소형 분자 표적화제 및 HSA-DIII에 접합된 영상화 부분 또는 치료성 부분 중 하나 이상을 포함하는 구성체의 제조에 있어서 스캐폴드로서 사용되는 HSA-DIII의 용도를 제공한다. HSA-DIII 스캐폴드 또는 담체는 조정된 약동학적 특성(PK)을 갖는 구성체를 제공하도록 변형될 수 있고, 또한 다가 및/또는 다중 특이성을 위한 기회 및 작용기의 부착을 위한 잔기를 제공한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 a) 인간 혈청 알부민의 도메인 III, 도메인 IIIa, 또는 도메인 IIIb 또는 변경된 FcRn 수용체 결합 특성을 위해 선택된 이들의 변이체인 단백질 스캐폴드; b) 상기 단백질 스캐폴드에 공유 결합된 표적화 부분; 및 c) 상기 단백질 스캐폴드에 공유 결합된 치료성 부분 또는 영상화 부분을 포함하는 구성체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되거나 질환 또는 병태를 갖고 있는 피험체에게 본 발명에 따른 구성체를 투여함으로써 피험체의 질환 또는 병태와 관련된 생체분자를 검출하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 구성체의 표적화 부분은 상기 생체분자에 결합하고, 상기 구성체에 결합된 영상화제가 검출된다. 몇몇 구체예에서, 질환 또는 병태의 존부를 진단한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 조직 내의 생체분자의 과발현의 존재와 관련된 질환 또는 병태의 표적화 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 질환 또는 병태를 갖는 피험체에게 본 발명에 따른 구성체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 상기 구성체의 표적화 부분은 생체분자에 결합하고, 상기 구성체의 치료제는 상기 생체분자의 존재와 관련된 조직 또는 세포의 질환 또는 병태를 치료한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 표적화 영상화 및 치료용 구성체의 설계에 있어서 스캐폴드로서 사용하기 위한 다양한 표적 특이성 및 소정의 FcRn 친화성을 갖는 변형된 도메인 III 단백질의 라이브러리를 제공하는 것을 고려한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따라 사용하기 위한 도메인 III 스캐폴드 및 그 변이체 중 하나 이상을 코딩하는 핵산을 제공한다. 또 다른 추가적인 구체예에서, 본 발명은 도메인 III 스캐폴드의 발현을 제어하는 유전자 조절 인자에 작동 가능하게 연결된 핵산을 포함하는 벡터를 제공하고, 또한 벡터 또는 핵산을 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명의 모든 구체예 및 양태에 있어서 몇몇 구체예에서, 구성체는 HSA의 도메인 I 또는 도메인 II 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함하지 않거나, 대안적으로 구성체는 HSA의 도메인 II의 5개, 10개, 15개, 또는 20개 이상의 연속된 아미노산 서열을 포함하지 않는 것을 조건으로 한다.
도 1(A). Db-DIII 구성체의 유전자 어셈블리. L - 포유동물 세포 분비를 위한 단일 펩티드 리더; 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH) 항체 사슬이 8개(글리신, 세린 풍부) 아미노산 링커를 통해 연결되어 단일쇄 단편 가변 영역(scFv, 25 kDa)을 형성한다. scFv는 18개 아미노산 링커에 의해 HSA DIII 유전자에 연결된다. DIII은 한 DIII의 다른 DIII로의 교환(예를 들어, WT를 H535A로 등)을 용이하게 하기 위해 카세트 내에서 SpeI 및 EcoRI 제한 부위의 측면에 위치한다. 도 1(B). Db-DIII 단백질의 카툰 도해, 여기서 2개의 scFv-DIII 분자가 비공유 결합 이량체를 형성한다.
도 2(A). 4종의 Db-DIII 단백질의 SDS-PAGE: NR 조건 하에 각각 레인 1, 2 및 3의 H535A, H510A 및 H464A, R 조건 하에 레인 5의 WT. 도 2(B). NR 조건 하의 Db-DIII WT의 웨스턴 블롯(레인 2; AP 접합 항마우스 Fab mAb로 프로빙됨) 및 R 조건 하의 Db-DIII WT의 웨스턴 블롯(레인 3; HRP-단백질 L로 프로빙됨). 도 2(C). Superdex 200 컬럼 및 0.5 ml/min의 유속을 이용한 크기 배제 크로마토그래피. Db-DIII WT 단백질은 28.17분째 용리되었다. 순도는 피크의 적분에 의해 약 98%인 것으로 추정되었다.
도 3(A). 절반 도메인 DIIIa(녹색) 및 DIIIb(황색)으로 이루어진 HSA DIII의 PyMOL 모델. 6개의 디설파이드 결합이 적색으로 표시되어 있다. 잔기 H535, H510 및 H464의 위치가 화살표로 표시되어 있다. DIIIa에 위치한 H464 잔기는 A로 돌연변이되어 DIII H464A 변이체를 형성하였다. DIIIb에 위치한 아미노산 H535 및 H510은, 각각 A로 치환되어 DIII H535A 및 DIII H510A 변이체를 형성하였다. 도 3(B). HSA DIII(녹색) 및 FcRn(오렌지색) 및 FcRn(오렌지색) 분자의 도킹 모델. IgG 결합에 관여하는 FcRn 상의 분자는 적색으로 표시되어 있고, 서로 상호작용하는 FcRn 및 DIII 분자의 계면에서의 잔기는 청색으로 표시되어 있다. 도 3(C). 2가 Db-DIII 분자의 모델, 여기서 각각의 Db는 양쪽의 C 말단에 DIII 단백질을 가지고 있다. Db를 구성하는 scFv 단량체는 연녹색 및 암녹색으로 표시되어 있고, 18개 아미노산 링커는 청색으로, DIII 분자는 황색으로 표시되어 있다.
도 4. CEA 양성 LS174T(왼쪽) 및 CEA 음성 C6(오른쪽) 종양이 이종이식된 무흉선 누드 마우스의 소형 동물 PET/CT 영상화. 마우스에 124I 표지 Db-DIII 단백질(WT, H535A, H510A, 또는 H464A) 및 참조물질로서의 항CEA Db를 주사하였다. 마우스를 10분 동안 영상화하였으며, 5개의 상이한 시점의 관상단면이 도시된다. 동시에 기록된 PET/CT 이미지를 종양 및 장기 위치의 해부학적 참조를 위해 포함시켰다.
도 5(A). PET 이미지의 종양 대 연조직 ROI 분석. 도 5(B). 각 시점에서의 PET 이미지로부터의 방사능(% ID/g)의 정량에 의해 생성된 혈액 활성 곡선.
도 6. 세포 결합 분석. 증가하는 농도의 Alexa 647 접합 HSA, DIII WT, H535A, H510A 및 H464A 단백질을 인간 FcRn으로 트랜스펙션된 293 세포와 함께 인큐베이트하였다. 대조군으로서 Alexa 접합 HSA를 비트랜스펙션 293 세포와 함께 인큐베이트하였다.
도 7. Balb/c 마우스에서의 131I 표지 HSA 및 DIII 단백질의 혈액 활성 곡선.
도 8. Db-DIII의 DNA 및 번역된 단백질 서열. 하기 DNA 및 단백질 분절의 특정 서열 및 출발 지점이 선으로 표시되어 있다: 제한 효소 분해 부위, Kozac 서열, 리더 - 분비 신호 펩티드, VL, 8개 아미노산 도메인 간 펩티드 링커, VH, Db와 HSA DIII 사이의 18개 아미노산 링커; Db-DIII 변이체 생성을 위해 알라닌으로 개별적으로 돌연변이된 히스티딘 잔기 H535, H510A 및 H464; 및 2개의 종결 코돈과 이어지는 제한 효소 절단 부위.
도 9a. DIII WT의 DNA 및 번역된 단백질 서열. 하기 DNA 및 단백질 분절의 중요한 서열과 출발 지점이 표시되어 있다: 클로닝에 사용되는 제한 효소 분해 부위, Kozac 서열, HSA DIIIa, HSA DIIIb를 시작하는 리더, 히스티딘 잔기 H535, H510 및 H464, c-Myc 펩티드, 2개의 종결 코돈과 이어지는 제한 효소 절단 부위. 도 9b. HSA DIIIa; 및 도 9c. HSA DIIIb.
도 10. 124I 표지 항CEA 펩티드-DIIIb 접합체의 소형 동물 PET/CT 영상화. 관상단면과 함께 주사 후 4시간, 20시간 및 27시간째 10분 정지 스캔이 도시되어 있다. CEA 양성(LS174T) 및 CEA 음성(C6) 종양이 화살표로 표시되어 있다.
본 발명은 HSA-DIII, HSA-DIII에 접합된 하나 이상의 소형 분자 표적화제 및 HSA-DIII에 접합된 영상화 부분 또는 치료성 부분 중 하나 이상을 포함하는 구성체의 제조에 있어서 스캐폴드로서 사용되는 HSA-DIII의 용도를 제공한다. FcRn 수용체에 대한 결합에 영향을 주거나 표적화를 위한 추가적인 부착 부위를 제공하는 도메인 III 내의 아미노산 서열 변형을 선택함으로써, 조정된 약동학적 특성(PK)을 갖는 구성체를 제공하고, 또한 다가 및/또는 다중 특이성을 위한 기회와 작용기의 부착을 위한 잔기를 제공하도록 HSA-DIII 스캐폴드 또는 담체를 변형시킬 수 있다.
본 발명자들은, 저분자량 종양 표적화 분자가 고유 혈청 안정성을 특징으로 하는 HSA 도메인 III 단백질 스캐폴드 상에 부착, 그래프팅 또는 디스플레이될 경우, 개선된 약동학적 프로파일 및 표적 흡수를 얻을 수 있다는 것을 발견하였다. 종양 축적을 최대화하는 것은 영상화 용도에 있어서의 더 강한 신호 또는 치료에 있어서의 충분한 약물 페이로드 전달로 이어질 수 있다. 또한, HSA DIII 스캐폴드는 작용기(예를 들어, 방사성 핵종, 세포독성 약물, 독소)의 접합을 위한 잔기를 제공할 수 있으며, 또한 소수성 표적화 분자의 가용성을 향상시킬 수 있다. 이러한 스캐폴드는 다음과 같기 때문에 유익하다: 1. 대체로 비면역원성이다. 2. 다양한 용도를 위한 최적의 혈청 지속성을 제공할 수 있다(조정 가능함). 3. 분자량이 작아서, 관외유출, 종양 침투 및 신장 제거가 용이하여(< 60 kDa), 영상화 용도에 바람직하다. 4. 결합력 효과(avidity effect)를 이용하거나(동일한 스캐폴드 상에 2～3개의 표적화 분자), 다중 특이성을 도입함으로써 표적화 분자의 기능적 친화력을 증가시키기 위한 플랫폼. 5. 혈청 중에서 가용성이어서 그 표면에 부착된 분자도 가용성이 될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은, 인간 혈청 알부민의 도메인 III, 도메인 IIIa 또는 도메인 IIIb, 또는 이들의 변이체를 포함하는 단백질 스캐폴드; b) 상기 단백질 스캐폴드에 공유 결합된 표적화 부분; 및 c) 상기 단백질 스캐폴드에 공유 결합된 치료성 부분 또는 영상화 부분을 포함하는 화합물/구성체를 제공한다. 상기 표적화 부분는 표적 조직 또는 세포의 수용체에 결합하는 리간드이다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 상기 표적화 부분은 항체이거나, 더 바람직하게는, 항체의 면역학적 활성 단편이며, 상기 항체 또는 단편은 표적 조직 또는 세포의 생체분자(예를 들어, 종양 특이적 항원)에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 scFv 디아바디, 트리아바디 또는 미니바디이다. 몇몇 구체예에서, 상기 표적화 부분은 핵산 압타머이다. 상기 표적화 부분은 피험체에, 또는 피험체의 표적 조직 또는 세포 상에 존재하는 생체분자에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 생체분자는 표적화 조직 또는 세포에서의 그 존재가 질환 또는 병태와 관련되어 있거나 그것이 질환 또는 병태에서 과발현되는 종양 특이적 항원 또는 다른 생체분자이다. 고려되는 종양 특이적 항원으로는 CEA, CD20, HER2/neu, PSCA, PSMA, CA-125, CA-19-9, c-Met, MUC1, RCAS1, Ep-CAM, Melan-A/MART1, RHA-MM, VEGF, EGFR, 인테그린 및 피브로넥틴의 ED-B를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 표적 조직 또는 세포는 암성 조직 또는 세포이다.
본 발명에 따른 몇몇 구체예에서, 표적화 부분, 영상화 부분 또는 치료성 부분을 비펩티드 링커 또는 비펩티드 결합에 의해 스캐폴드에 공유 결합시킨다. 다른 구체예에서, 표적화 부분, 영상화 부분 또는 치료성 부분 중 하나 이상 또는 모두를 헤테로이작용성 크로스링커, 길이가 0인(zero-length) 크로스링커, 디설파이드 결합, 또는 생리학적으로 절단 가능한 크로스링커에 의해 스캐폴드에 공유 결합된다. 표적화, 영상화 및 치료성 부분을 위한 링커는 바람직하게는 2～50개 원자의 길이(예를 들어, 2～10개, 4～40개, 10～30개 원자의 길이)이다. 하나 이상의 표적화, 영상화 또는 치료성 부분이 도메인 III 스캐폴드에 부착될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 소형 펩티드 또는 다른 표적화 부분(압타머, 화학 물질)을 HSA DIII에 유전적으로 융합 또는 접합시킨다. 다른 구체예에서, 단백질(예를 들어, 항체, 항체 단편, 효소, 수용체 리간드, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자)를 표적화 부분으로서의 HSA DIII 스캐폴드에 융합시키거나, 또는 3) 나노입자, 반자성 물질, 양자점, 방사성 핵종 또는 화학적 화합물을 영상화 부분으로서 HSA DIII 스캐폴드에 부착시킬 수 있다.
분자 영상화 목적을 위해, 감마 또는 SPECT 카메라, 또는 PET 스캐너를 사용한 검출을 위해 다양한 방사성 핵종을 단백질 스캐폴드에 부착시킬 수 있다. 반자성 물질는 MR 영상화를 위해 접합시킬 수 있다. 광학 영상화를 위해서는, HSA DIII 스캐폴드를 형광 염료, 단백질, 또는 생물발광 효소(예를 들어, 반딧불이, 레닐라 또는 가우시아 루시퍼라제)에 융합시킬 수 있다.
치료 용도를 위해서는, 치료성 방사성 핵종, 세포독성 약물, 독소, 사이토카인, 효소 또는 다른 치료성 부분을 표적화 HSA DIII 스캐폴드에 종양으로의 표적 특이적 전달을 위해 결합시킬 수 있다. 몇몇 구체예에서, DIII에의 결합은 생리학적 조건 하의 절단(예를 들어, 효소 절단, 라이소솜에서의 산성 절단)에 대해 감수성이다.
본 발명은 HSA보다 분자량이 작고(예를 들어, 23 kDa 또는 11 kDa) 이것이 부착되는 분자의 혈청 지속성을 정해진 정도까지 변경하거나 연장할 수 있는 능력을 갖는 저면역원성 또는 비면역원성 인간 HSA 도메인 III 단백질을 제공한다는 이점을 제공한다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, HSA 도메인 III은 바람직하게는 야생형이고, FcRn 수용체에 대한 도메인의 결합을 변경하는 H535, H510 또는 H464에서의 돌연변이를 갖는다. 몇몇 구체예에서, 상기 돌연변이는 H535A, H510A, H464A; H535A 및 H510A 및 H464A; H535A 및 H464A; H535A 및 H510A; 또는 H510A 및 H464A이다. 몇몇 구체예에서, 특히, 상기 단백질 스캐폴드는 HSA 도메인 III, 도메인 IIIa, 또는 도메인 IIIb 또는 서열이 이들과 실질적으로 동일한 폴리펩티드로 필수적으로 구성된다.
몇몇 구체예에서, 상기 구성체의 치료성 부분은 약물이다. 예를 들어, 상기 치료성 부분은 치료성 방사성 핵종, 세포독성 약물, 사이토카인, 화학요법제, 방사선 감작제 또는 효소일 수 있다. 추가적인 구체예에서, 다수의 치료성 부분을 단백질 스캐폴드에 공유 결합시킨다.
다른 구체예에서, 상기 구성체는 영상화제를 포함한다. 적절한 영상화제로는 방사성 핵종, 반자성 물질, 상자성 입자, 형광단, 색원체, 양자점, 나노입자 및 생물발광 효소를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 다수의 영상화제 중 하나를 스캐폴드에 공유 결합시킬 수 있다.
몇몇 구체예에서, 상기 구성체는 1가 또는 다가이다. 예를 들어, 표적화 부분 또는 구성체의 다른 부분(예를 들어, DIII 스캐폴드에 결합된 표적화 부분,도 3 참조)은 그 자체가 1가, 2가, 3가 또는 다가일 수 있으며, 그 각각의 구성원은 그 HSA DIII 스캐폴드에 공유적으로 연결 또는 결합된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 질환 또는 병태를 갖고 있는 것으로 의심되거나 질환 또는 병태를 갖고 있는 피험체에게 본 발명에 따른 구성체를 투여함으로써 질환 또는 병태와 관련된 생체분자를 검출하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 구성체의 표적화 부분은 생체분자에 결합하여 상기 구성체에 결합된 영상화제를 검출한다. 몇몇 구체예에서, 질환 또는 병태의 존부는 검출에 따라 진단된다. 예를 들어, 생체분자가 암에서 과발현되는 종양 특이적 항원일 경우, 종양 특이적 항원과 관련된 암의 존부는 본 발명에 따른 구성체를 피험체에게 투여하여 피험체 내에서 이 구성체에 결합된 영상화 부분을 검출함으로써 판단할 수 있다. 종양 부위에 구성체의 영상화 부분이 위치하는 것이 검출된 것은 암의 존재를 나타내는 것이다. 몇몇 구체예에서, 구성체 또는 영상화제의 혈청 지속성은 FcRn 수용체에 대한 도메인 III(DIII)의 변경된 친화성을 제공하는 돌연변이를 갖는 도메인 III 폴리펩티드를 선택함으로써 미세 조정한다. 영상화에 이용되는 방사성 핵종으로는 SPECT 영상화를 위해서는 I-131, I-123, In-111 및 Tc-99m, PET 영상화를 위해서는 F-18, I-124, Cu-64, Y-86을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 조직 내의 생체분자의 과발현의 존재와 관련된 질환 또는 병태를 갖고 있는 피험체에게 본 발명에 따른 구성체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 조직 내의 생체분자의 과발현의 존재와 관련된 질환 또는 병태의 표적화 치료 방법을 제공하며, 여기서, 상기 구성체의 표적화 부분은 상기 생체분자에 결합하고, 상기 구성체의 치료제는 생체분자의 존재와 관련된 조직 또는 세포의 질환 또는 병태를 치료한다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 상기 표적화 부분은 암의 종양 특이적 항원에 결합하고, 치료하고자 하는 질환 또는 병태는 암이며, 치료제는 치료성 방사성 핵종, 세포독성 약물, 사이토카인, 또는 화학요법제이다. 표적화 DIII에 부착될 수 있는 치료용 화학요법제로는 젬시타빈, 독소루비신, 빈크리스틴, 노포테칸, 이리노테칸을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. DIII에 접합될 수 있는 독소의 예로는 아우리스타틴 또는 슈도모나스 외독소 A가 있다. 치료성 방사성 핵종으로는 베타 에미터 - Y-90, Lu-177, I-131, Sm-153 및 Sr-89; 및 알파 에미터 - Ra-223, Th-227, Ac-225, At-211, Bi-212 및 Bi-213을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 1종 이상의 치료제는 DIII 스캐폴드에 공유 결합시킬 수 있다.
몇몇 구체예에서, 종양/병소에의 약물 접합체의 표적화를 가시화하는 것, 분자 영상화에 의한 치료 진행의 모니터링 및 대사적 제거 경로를 결정하는 것 등의 용도를 위해 동일한 표적 특이적 DIII 플랫폼에 치료용 작용기와 영상화 작용기를 둘 다 부착시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 2) 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명에 따른 치료용 구성체를 사용하기 위한, 또는 질환 또는 병태를 검출하기 위한 진단제의 제조에 있어서 본 발명에 따른 영상화 구성체를 사용하기 위한, 1) 상기 치료용 및 영상화 구성체 및 생리학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약학적 또는 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 선택된 DIII 플랫폼에 종양 표적화 펩티드를 화학적으로 접합시키는 것을 고려한다. 예를 들어, 종양 보유 피험체에게 124I(t1/2 4.2일) 또는 64Cu(t1/2 12.7시간) 표지 단백질을 주사하고, PET 영상화로 항원 양성 종양의 표적화를 평가할 수 있다. 방사성 핵종으로 표지된 네이티브 항체 골격 상의 또는 scFv, 트리아바디, 디아바디 또는 미니바디로서의 이들 가변 영역 서열의 발현은 표적 보유 세포의 생체내 검출에 특히 유용하다. 이러한 골격 또는 네이티브 항체 골격 상에서의 발현은 표적화를 위해서뿐만 아니라 표적 생체분자의 기능을 차단하고/하거나 이들을 보유하는 세포의 생체내 성장 또는 증식을 억제하거나 세포를 사멸시키는 데 유리할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 표적화 영상화 및 치료용 구성체의 설계에 있어서 스캐폴드로서 사용하기 위한 다양한 소정의 FcRn 친화성을 갖는 변형된 도메인 III 단백질의 라이브러리를 제공하는 것을 고려한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 용도를 위한 도메인 III 스캐폴드 및 그 변이체 중 하나 이상을 코딩하는 핵산을 제공한다. 또 다른 추가적인 구체예에서, 본 발명은 도메인 III 스캐폴드의 발현을 제어하는 유전자 조절 인자에 작동 가능하게 연결된 핵산을 포함하는 벡터를 제공하며, 또한 상기 벡터 또는 핵산을 포함하는 세포를 제공한다.
HSA DIII 내의 3개의 보존된 히스티딘 잔기(H535, H510 및 H464)는 HSA-FcRn 결합에서 역할을 하는 것으로 추정되었고, 이들 잔기에서의 변이체가 특히 또한 특히 고려된다. HSA-FcRn 상호작용을 조절할 수 있는 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 항CEA 디아바디(Db, 2개의 scFv로 이루어진 비공유 결합 이량체; 55 kDa) 및 HSA DIII 야생형(WT, 비돌연변이) 또는 3개 변이체 중 하나(각각 알라닌 잔기에 대한 H535, H510 또는 H464의 돌연변이를 포함함)로 이루어진 융합 단백질을 생성하고 발현시켰다. 124I 표지 Db-DIII 단백질을 주사한 이종이식 무흉선 마우스의 소형 동물 PET/CT 영상화는 종양 표적화를 유지하면서 Db의 혈청 지속성을 연장시킬 수 있는 HSA DIII의 능력을 보여주었다. 이미지 분석과 생체분포 연구는 HSA DIII이 추정 평균 체류 시간 (MRT) 56.7 h로 순환계 중에 가장 오래 지속되었고, 그 다음으로 Db-DIII H535A(25 h) > H510A(20 h) > H464A(17 h) 및 Db(2.9 h)였다. HSA DIII WT 및 변이체(H535A, H510A 및 H464A)뿐만 아니라, 서브도메인 DIIIa(아미노산 잔기 384～492; 14.2 kDa) 및 DIIIb(510～585; 12.2 kDa)도 생성하였다. 이들의 혈액 중에서의 약동학적 프로파일은 각각의 131I 표지 DIII 단백질을 Balb/c 마우스에 정맥내 주사함으로써 생체내에서 평가하였다. 8개의 다양한 시점(0 h～72 h)에 꼬리로부터 채혈하여 감마웰 카운터로 방사능을 카운팅하였다. 각각의 단백질의 최종 혈청 반감기(t1/2β)는 다음과 같이 측정되었다: 전체 HSA 단백질(17.3 h)와 비교하여, DIII WT(15.3 h), H535A(10.7 h), H464A(10.2 h), H510A(9.75 h), DIIIa(8.93 h) 및 DIIIb(6.87 h). 선택된 DIII 단백질을 종양 표적화 분자(펩티드, 압타머 또는 소형 화학 잔기)를 그래프팅 또는 화학적으로 접합하기 위한, 또, 직접 조합 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 스캐폴드로서 사용된다. 진단 목적을 위한 적절한 약동학적 특성을 갖는 표적 특이적 스캐폴드는 영상화 용도에 사용될 수 있다. 대안으로, 잠재적인 항종양 약물을 치료를 위한 최적 특성을 갖는 표적화 스캐폴드에 접합시켜 암 치료에 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, DIII 내의 2개 이상의 잔기가 FcRn과의 상호작용에 중요하다는 것(즉, 글루탐산 잔기 E505 및 E531)을 나타내는 도킹 모델을 제공한다. 따라서, 몇몇 구체예에서 본 발명은 변이체 DIII, DIIIa 또는 DIIIb 단백질 스캐폴드 및 핵산, 및 벡터, 및 핵산을 포함하는 트랜스덕션된 세포를 제공하며, 이들은 위치 E505 및/또는 E531에서 아미노산 치환을 갖거나 그렇지 않으면 HSA의 도메인 III, IIIa 또는 IIIb 서열과 실질적으로 동일하거나 동일하다. 몇몇 구체예에서, 이들 잔기 중 어느 하나 또는 둘 다가 아스파르트산으로 치환되고, 다른 구체예에서, 이들 아미노산 중 어느 하나 또는 둘 다가 비하전 아미노산으로 치환되며, 추가적인 구체예에서, E505 및 E531 중 어느 하나 또는 둘 다가 알라닌 또는 글리신으로 치환된다. 또 다른 구체예에서, 치환은 FcRn에 대한 DIII의 결합을 교란하여 표적 특이적 DIII 영상화제 또는 치료제의 순환 반감기를 조절하는 E505D, A, G, I, V, 또는 L 또는 E531D A, G, I, V, 또는 L 치환이다.
표적화 부분은 표적 생체분자에 결합할 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 표적 분자는 세포의 외부 표면 상에 존재하는 종양 특이적 항원이다. 표적화 부분은 항체이거나, 더 바람직하게는, 항체에 의해 인식되는 분자에 대해 친화성을 갖는 항체의 단편이다. 바람직한 구체예에서, 항체는 scFv, 디아바디, 미니바디 또는 트리아바디이다. 몇몇 구체예에서, 표적화 부분은 생체분자에 결합할 수 있는 핵산 압타머 또는 소형 펩티드(예를 들어, 5～30개 아미노산, 2～20개 아미노산 길이)이다. 바람직하게는, 표적화 부분은 생체분자에 대해 높은 친화성을 가지며, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 또는 1 nM 미만의 Kd를 갖는다. 또한, 스캐폴드당 표적 생체분자에 대해 이러한 친화성 또는 더 낮은 친화성을 갖는 복수의 표적화 부분(2개, 3개, 4개 또는 그 이상)은 결합력 효과를 통해 표적 세포에 대한 결합을 증대시킬 수 있다.
본원에서 용어 "영상화제 또는 영상화 부분"은 직접적으로 또는 신호 생성 시스템의 추가적인 구성원과의 상호작용을 통해 검출 가능한 신호를 제공할 수 있는 물질 또는 부분을 의미하는 것으로 사용된다. 바람직하게는, 신호는 구성체에 의해 피험체의 체내에서 생성될 때 외적으로 검출이 가능하다.
"치료성 부분"은 질환 또는 병태를 치료하고 피험체, 표적화 조직 및/또는 세포에 몇 가지 다른 의도된 이익을 제공하는 데 유용한 물질을 의미한다. 치료성 부분은 치료용 약물, 호르몬, 사이토카인, 인터페론, 항체 또는 항체 단편, 핵산 압타머, 효소, 폴리펩티드, 독소, 세포독소, 또는 화학요법제일 수 있다. 치료성 부분은 방사선 감작제일 수 있다.
표적화 부분, 영상화 부분 또는 치료성 부분을 스캐폴드에 연결하는 데 사용되는 링커는 1～100개 원자의 길이 또는 그 이상의 길이의 원자쇄 또는 공유 결합을 포함할 수 있다. 링커는 쇄 내에 탄소, 질소, 황 또는 산소 원자를 포함할 수 있다. 탄소쇄가 특별히 고려된다(예를 들어, 약 5개～약 50개 탄소). 링커는 핵산 또는 아미노산을 포함할 수 있다. 링커와 같은 탄소쇄의 예로는 알킬, 알켄 또는 알데하이드를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 탄소쇄는 치환, 비치환, 비분지형 또는 분지형 중 하나 이상일 수 있다. 링커는 약 5 nm～약 50 nm, 3～30 nm, 더 바람직하게는, 약 5 nm～약 10 nm의 길이를 포함할 수 있다. 링커의 예로는 약 10개 탄소～약 20개 탄소 길이를 갖는 탄소쇄를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, PEG) 링커도 고려된다. 링커는 비펩티드 결합을 포함할 수 있다. 링커는 헤테로이작용성 크로스링커, 호모이작용성 크로스링커, 길이가 0인 크로스링커, 디설파이드 결합, 또는 생리학적으로 절단 가능한 크로스링커를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 표적화 부분, 영상화 부분 및 치료성 부분을 위한 링커는 바람직하게는 2 ～80개 원자의 길이(예를 들어, 2～10개, 4～40개, 10～30개, 2～50개 원자의 길이)이다. 도메인 III과 표적화제, 영상화제 또는 치료제 중 하나 이상의 융합 단백질도 융합된 물질이 폴리펩티드일 경우 고려된다. 표적화제, 영상화제 및 치료제가 각각 융합 단백질로서 스캐폴드에 연결되지 않거나 다른 아미노산에 의해 또는 펩티드 결합에 의해 스캐폴드에 연결되지 않을 수 있는 것도 고려된다.
영상화제 및 치료성 부분은 당업계에 잘 알려져 있는 통상적인 방법을 이용하여 DIII 단백질 스캐폴드에 직접 접합될 수 있다. 방사성 및 비방사성 표지도 일반적으로 이용된다(핵산 및 단백질의 표지를 위한 효소적, 광화학적 및 화학적 방법의 리뷰를 위해서는, 문헌[Bioconjugate Techniques, 2nd Edition By Greg T. Hermanson, Published by Academic Press, Inc., 2008, p. 1202] 참조).
압타머는 특정 표적 분자에 결합하는 올리고핵산 분자이다. 압타머는 통상적으로 큰 랜덤 서열 풀에서의 선택 작업에 의해 생성한다. 핵산 압타머는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 반복되는 시험관내 선택 라운드, 또는 그와 동등한 방식으로 소형 분자, 단백질, 핵산 및 심지어 세포 및 조직과 같은 다양한 분자 표적에 결합하는 SELEX(지수적 농축에 의한 리간드의 체계적 발달(systematic evolution))에 의해 얻을 수 있다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 핵산 압타머는, SELEX라 불리는 공정을 이용하여, 복잡한 핵산계 조합 형상 라이브러리(예를 들어, 라이브러리당 1014개 초과의 형상)의 시험관내 스크리닝에 의해 생성할 수 있다(본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 공보 제2009-0004667호 참조). SELEX는 RNA 서열의 무작위화된 풀의 라이브러리를 선택된 단백질 표적과 인큐베이트하는 반복 공정이다. 그 후, 상호작용하는 RNA를 비결합 RNA로부터 분리하고, 계속해서 역전사를 통해 증폭시킨 뒤 폴리머라제 연쇄 반응(RT/PCR)을 통해 증폭시킨다. 2' 플루오로 변형 피리미딘의 도입을 가능하게 하는 돌연변이 T7 RNA 폴리머라제를 사용한 시험관내 전사를 통해 농축된 RNA 풀을 생성하기 위해 DNA 주형을 사용할 수 있다. 이러한 변형은 RNA가 뉴클레아제에 대해 더 큰 내성을 갖게 한다. 농축된 RNA 풀이 생성되게 하는 이 단계를 "선택 라운드(selection round)"라 부른다. 단백질 표적에 대한 선택 라운드는 일반적으로 결합 친화성 진행의 평탄역에 도달할 때까지 계속한다. 그 후, 풀로부터 개개의 클론을 단리하여 시퀀싱할 수 있다. 압타머는 항체의 분자 인식 특성에 필적하거나 그것을 초과하는 분자 인식 특성을 제공할 수 있다. 압타머는 그 특이적인 인식 이외에도 항체에 비해 이점을 제공한다. 압타머는 시험관 내에서 완전히 조작이 가능하고 화학적 합성에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 압타머는 또한 바람직한 저장 특성 및 가용성 특성을 보유하며 치료 용도에서 비교적 거의 또는 전혀 면역원성을 나타내지 않는다. 본 발명에 따라 사용되는 압타머는 CEA, CD20, HER2/neu, PSCA, PSMA, CA-125, CA-19-9, c-Met, MUC1, RCAS1, Ep-CAM, Melan-A/MART1, RHA-MM, VEGF, EGFR, 인테그린 및 피브로넥틴의 ED-B에 대해 높은 친화력(예를 들어, 100 nM, 10 nM 또는 1 nM 미만의 Kd를 가짐)으로 결합하는 핵산일 수 있다. 압타머는 바람직하게는 10～30개, 10～20개, 또는 15～25개 핵산의 길이이다.
본 발명에 따른 도메인 III의 아미노산 서열은 HSA 도메인 III, IIIa 또는 IIIb의 서열(각각 도 9a, 9b, 9c 참조) 또는 이들과 실질적으로 동일한 서열이다. 도메인 III은, 1) 도 9a, 9b, 9c의 폴리펩티드의, 바람직하게는 전체 서열에 대해 또는 적어도 약 15개, 20개, 25개, 50개, 75개, 100개, 125개, 150개 이상의 아미노산의 영역에 대해 약 90%, 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 가지고, FcRn(Brambell) 수용체에 결합할 수 있는 아미노산 서열로 구성되거나 필수적으로 구성된다. 도메인 III(아미노산 잔기 384～585)은 2개의 서브도메인, 즉, DIIIa(아미노산 잔기 384～492) 및 DIIIb(아미노산 잔기 510～585)를 갖는다(HSA 서열 및 구조에 대해서는 본원에서 참고로 인용하는 문헌[Sugio et al, Protein Engineering, Vol. 12, No. 6, 439-446, June 1999] 참조). 몇몇 구체예에서, 청구범위의 도메인 III은 HSA의 도메인 III, 도메인 IIIa 또는 도메인 IIIb 및 본원에 개시된 이들의 H535, H510, 또는 H464 변이체로 구성되거나 필수적으로 구성된다.
본 발명에 따른 도메인 III, 도메인 IIIa 또는 도메인 IIIb는 각각 도 9a, 9b 또는 9c의 폴리펩티드의 보존적 변형 변이체일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이 변이체는 그 혈청 지속성을 미세 조정하는 FcRn(Brambell) 수용체에 대한 변경된 친화성을 갖는다. 몇몇 구체예에서, 이들 도메인의 위치 H535, H510, H464에서의 히스티딘 잔기 중 하나 이상은 결실되거나 다른 염기성 또는 비염기성 아미노산으로 치환된다. 몇몇 구체예에서, 도메인 III 서열은 치환을 가지거나 치환만을 가지며, 이 치환은 H535A 또는 G, H510A 또는 G, H464A 또는 G 중 하나 이상이다. 몇몇 추가적인 구체예에서, 치환은 H535A, H510A, H464A 중 1개, 2개 또는 3개이다. 다른 구체예에서, 치환은 H535V, I, 또는 L; H510 V, L, 또는 I; 또는 H464 V, L, 또는 I 중 어느 하나 이상이다. 추가적인 구체예에서, 다른 보존적 치환(1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상)이 도메인 III, IIIa 또는 IIIb 스캐폴드의 다른 위치에 이루어진다. 또한, HSA 서열은 GenBank에 개시되어 있다: AAA98797.1.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 폴리펩티드를 얻는 방법(예를 들어, 제조, 단리, 정제, 합성 및 재조합적 제조)은 당업자에게 잘 알려져 있다.
용어 "아미노산"은 천연 아미노산과 합성 아미노산뿐만 아니라 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 바람직한 아미노산은 인체에서 발견되는 천연 아미노산이다. 천연 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 것들뿐만 아니라 나중에 변형된 아미노산, 예를 들어 하이드록시프로필린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린을 포함한다. 아미노산 유사체는 천연 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물, 즉, 수소에 결합된 α 탄소, 카복실기, 아미노기 및 R 기를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 의미한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기를 갖거나(예를 들어, 노르루신), 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 천연 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아아미노산의 일반적 화학 구조와는 다른 구조를 갖지만 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화합물을 의미한다.
아미노산은 본원에서 널리 알려진 3문자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에서 권장하는 1문자 기호로 표시될 수 있다. 뉴클레오티드 역시 널리 인정되는 1문자 코드로 표시될 수 있다.
아미노산 서열의 "보존적으로 변형된 변이체"에 대해서는, 당업자가, 코딩된 서열 내의 단일 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실하는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가가, 그 변경이 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 경우 "보존적 변형 변이체"를 형성한다는 것을 알고 있다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 보존적 변형 변이체는 본 발명의 다형 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자에 부가적인 것으로서 이들을 배제하는 것이 아니다.
이하의 8개의 그룹은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 이소루신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins (1984)] 참조).
문헌[Hollinger et al., PNAS (USA) 90(14): 6444-6448 (1993)]에 최초로 기재된 디아바디는 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄를 이용하여 구성할 수 있을 뿐만 아니라 본원에 개시된 개개의 CDR 영역을 이용하여 구성할 수도 있다. 일반적으로, 디아바디 단편은, 동일 사슬 상의 2개의 도메인끼리 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 도메인 및 VL 도메인은 다른 단편의 VH 도메인 및 VL 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원 결합 부위를 형성하게 된다. 트리아바디는 마찬가지로 3개의 항원 결합 부위를 갖도록 구성된다. Fv 단편은 비공유 상호작용에 의해 서로 결합된 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하는 완전한 항원 결합 부위를 포함한다. 본 발명이 포함하는 Fv 단편은 또한 VH 도메인 및 VL 도메인이 글루타르알데하이드, 분자간 디설파이드 또는 다른 링커를 통해 가교결합된 구성체를 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 서로 융합되어 단일쇄 가변 단편(scFv)을 형성하며, 이것은 모 면역글로불린의 본래의 특이성을 유지한다. 문헌[Gruber et al., J. Immunol. 152(12):5368-74 (1994)]에 처음 기재된 단일쇄 Fv(scFv)는 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄를 이용하여 구성할 수 있을 뿐만 아니라 본원에 개시된 개개의 CDR 영역을 이용하여 구성할 수도 있다. 당업계에 공지된 많은 기법이 본 발명의 특이적 결합 구성체를 제조하는 데 이용될 수 있다(특히 미니바디 및 디아바디 설계에 대해서는, 모든 목적을 위해 본원에서 각각 그 전체를 참고로 인용하는 미국 특허 출원 공개 제2007-0196274호 및 미국 특허 출원 공개 제2005-0163782호 참조).
이중 특이적 항체는 화학적 가교결합에 의해 또는 하이브리드 하이브리도마 기법에 의해 생성할 수 있다. 대안으로, 이중 특이적 항체 분자는 재조합 기법에 의해 제조할 수 있다(참조: 이중 특이적 항체). 이량체화는, VH 도메인과 VL 도메인을 연결하는 링커의 길이를 scFv 단편의 제조에 통상적으로 이용되는 약 15개 아미노산에서 약 5개 아미노산으로 감소시킴으로써 촉진할 수 있다. 이들 링커는 VH 도메인과 VL 도메인의 사슬내 조립을 촉진한다. 적절한 짧은 링커는 SGGGS이나, 다른 링커도 사용될 수 있다. 따라서, 2개의 단편이 이량체 분자로 조립된다. 링커 길이를 0～2개 아미노산으로 추가로 감소시키면 삼량체(트리아바디) 또는 사량체(테트라바디) 분자를 생성할 수 있다.
항체, 예를 들어, 재조합, 단일클론 또는 다클론 항체를 제조하기 위해서는, 당업계에 공지된 많은 기법들을 이용할 수 있다(예를 들어, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); 및 Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986) 참조). 관심있는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 세포로부터 클로닝할 수 있으며, 예를 들어, 단일클론 항체를 코딩하는 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여 재조합 단일클론 항체를 제조할 수 있다. 또한, 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자 라이브러리를 하이브리도마 또는 플라즈마 세포로부터 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 유전자 생성물의 무작위 조합이 다양한 항원 특이성을 갖는 큰 항체 풀을 생성한다(예를 들어, Kuby, Immunology (3rd ed. 1997) 참조). 단일쇄 항체 또는 재조합 항체의 제조 기법(미국 특허 제4,946,778호, 미국 특허 제4,816,567호)은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 제조하도록 적합화될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 마우스 또는 다른 포유동물과 같은 다른 생물체도 인간화 또는 인간 항체를 발현시키는 데 사용할 수 있(예를 들어, 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); 및 Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995) 참조). 대안으로, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 헤테로머 Fab 단편을 확인하기 위해 파지 디스플레이 기법을 이용할 수 있다(예를 들어, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992) 참조). 항체는 또한 이중 특이적이 되도록, 즉, 2종의 상이한 항원을 인식할 수 있도록 제조될 수 있다(예를 들어, WO 93/08829, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); 및 Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986) 참조). 항체는 또한 헤테로접합체, 예를 들어, 공유 결합된 2개의 항체, 또는 면역독소일 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호, WO 91/00360; WO 92/200373; 및 EP 03089 참조).
비인간 항체를 인간화 또는 영장류화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 인간이 아닌 공급원으로부터 그것으로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기를 종종 임포트(import) 잔기라 칭하며, 이것은 일반적으로 임포트 가변 도메인으로부터 선택된다. 인간화는, 설치류 CDR 또는 CDR 서열들로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써, 본질적으로 Winter 연구진의 방법에 따라 수행된다(예를 들어, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) 참조). 따라서, 이러한 인간화 항체는 키메라 항체이고(미국 특허 제4,816,567호), 이때 완전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 서열이 비인간 종 유래의 상응하는 서열로 치환되었다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 CDR 잔기와 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
"키메라 항체"는 (a) 불변 영역 또는 그 일부분이, 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이한 또는 변경된 클래스, 이펙터 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 전혀 다른 분자(예를 들어, 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등)에 연결되도록, 변경, 치환 또는 교환되거나, (b) 가변 영역 또는 그 일부분이 상이한 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 교환, 치환되거나 변경된 항체 분자이다.
단백질 또는 펩티드를 언급할 때 항체에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합하는" 또는 "～와 특이적으로 (또는 선택적으로) 면역반응성을 보이는"이라는 어구는, 결합 반응이 단백질 존재, 종종 단백질 및 다른 생물학적 물질의 불균질 집단 중에서의 단백질 존재의 결정 요인이라는 것을 의미한다. 따라서, 정해된 면역분석 조건 하에, 지정된 항체는 백그라운드보다 적어도 2배, 더 일반적으로는 백그라운드보다 10～100배 이상 더 많이 특정 단백질에 결합한다. 그러한 조건 하에서의 항체에 대한 특이적인 결합은 특정 단백질에 대한 그 특이성으로 선택된 항체를 필요로 한다. 예를 들어, 선택된 항원과 특이적으로 면역반응성을 보이되 다른 단백질과는 그렇지 않은 다클론 항체만을 얻도록 다클론 항체를 선택할 수 있다. 이러한 선택은 다른 분자와 교차 반응하는 항체를 제외시킴으로써 수행할 수 있다. 다양한 면역분석 포맷이 특정 단백질과 특이적으로 면역반응성을 보이는 항체를 선택하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역분석이 단백질과 특이적으로 면역반응성을 보이는 항체를 선택하는 데 통상적으로 이용된다(예를 들어, 특이적 면역반응성을 판단하기 위해 이용될 수 있는 면역분석 포맷과 조건의 설명에 대해서는, 문헌[Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)] 참조).
핵산은 이것이 다른 핵산 서열과 기능적 관계가 되도록 배치될 때 "작동 가능하게 연결된"이라고 한다. 예를 들어, 프리서열(presequence) 또는 분비 리더에 대한 DNA는 이것이 폴리펩티드의 분비에 관여하는 프리단백질로서 발현될 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결된 것이며, 프로모터 또는 인핸서는 이것이 서열의 전사에 영향을 미칠 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이며, 또한, 리보솜 결합 부위는 이것이 번역을 용이하게 하도록 배치될 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 서로 가까이 위치하고, 분비 리더의 경우, 인접해 있고 리딩 페이즈(reading phase) 내에 있는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해 있지 않아도 된다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 수행할 수 있다. 그러한 부위가 존재하지 않을 경우, 종래의 관행에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 사용한다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 서열과 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우, 실질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 특정 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 그 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변경하지 않고 기재된 상응하는 코돈 중 어느 하나로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변이를 "침묵 변이"라 하며, 이것은 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원에서의 모든 핵산 서열은 또한 그 핵산의 가능한 모든 침묵 변이를 나타내기도 한다. 당업자는 핵산 내의 각각의 코돈(일반적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG 및 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)을 기능적으로 동일한 분자를 생성하기 위해 변형시킬 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는, 실제 프로브 서열에 대해서는 그렇지 않지만 발현 생성물에 대해서는 각각의 기재된 서열이 함축적이다.
2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"이란 용어는, 이하에 기재하는 디폴트 파라미터를 갖는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 이용하거나 수동 정렬 및 시각적 조사에 의해 측정할 때(NCBI 웹 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 등 참조), 2개 이상의 서열 또는 부분서열이 동일하거나, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 특정 비율로 갖는 것(즉, 비교창 또는 지정된 영역에 대해 최대 상응도로 비교 및 정렬될 때 특정 영역에 대해 약 60% 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 동일성)을 의미한다. 그 후, 이러한 서열을 "실질적으로 동일하다"고 한다. 이 정의는 테스트 서열의 상보서열에 관련되거나 적용되기도 한다. 이 정의는 또한 결실 및/또는 부가를 갖는 서열뿐만 아니라 치환을 갖는 서열도 포함한다. 이하에 기재하는 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 갭 등을 고려할 수 있다. 바람직하게는, 동일성은 약 25개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐, 또는 더 바람직하게는 50～100개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 일반적으로 1개의 서열이 테스트 서열의 비교 대상이 되는 참조 서열로서의 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 경우, 테스트 서열과 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 부분서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 바람직하게는, 디폴트 프로그램 파라미터를 이용할 수 있고, 대안의 파라미터를 지정할 수도 있다. 그 후, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 대한 테스트 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
본원에서 사용될 때 "비교창"은, 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 연속된 위치의 참조 서열에 서열이 비교될 수 있는, 20개～참조 서열의 전체 길이, 일반적으로 약 25개～100개, 또는 50개～약 150개, 더 일반적으로는 약 100개～약 150개로 구성된 군에서 선택되는 연속된 위치의 수 중 어느 하나 수의 세그먼트를 지칭하는 것을 포함한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 Smith & Waterman의 국부적 상동성 알고리즘[Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]에 의해, Needleman & Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘[J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]에 의해, Pearson & Lipman의 유사성 조사 방법[Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 Genetics Computer Group, Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각적 조사(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 증보) 참조)에 의해 수행할 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 측정하는 데 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이것은 각각 문헌[Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)] 및 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기재되어 있다. 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 서열 동일성을 측정하기 위해 본원에 기재된 파라미터와 함께 BLAST 및 BLAST 2.0을 이용한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 이 알고리즘은 먼저, 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드와 정렬할 때 일치하거나 약간의 양의 값의 역치 점수 T를 만족하는, 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 고득점 서열쌍(HSP)을 찾는 것을 포함한다. T를 이웃 워드 점수 역치라 칭한다(Altschul et al., supra). 이러한 초기 이웃 워드 히트는 이들을 포함하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 점수는, 뉴클레오티드 서열의 경우 파라미터 M(일치하는 잔기쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(불일치 잔기에 대한 벌점; 항상 < 0)을 이용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 누적 점수를 계산하는 데 득점 행렬을 이용한다. 각 방향으로의 워드 히트의 연장은, 누적 정렬 점수가 달성된 최대값으로부터 X 양만큼 떨어질 때 중단되거나(누적 점수는 하나 이상의 음의 값 점수 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 또는 그 이하가 된다); 어느 한 서열의 말단에 도달된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 워드 길이(W) = 11, 기대값(E) = 10, M = 5, N = -4 및 양 가닥의 비교를 디폴트로서 이용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 길이 = 3 및 기대값(E) = 10, 및 BLOSUM62 득점 행렬(see Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) 정렬(B) = 50, 기대값(E) = 10, M = 5, N = -4 및 양 가닥에 대한 비교를 이용한다.
"핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그 중합체와 이들의 상보 서열을 말한다. 이 용어는, 합성, 천연 또는 비천연이고 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 결합을 포함하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예로는 포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
달리 나타내지 않는다면, 특정 핵산 서열은 또한 이들의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보 서열을 함축적으로 포함할 뿐만 아니라, 명시적으로 나타낸 서열도 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 3번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 얻을 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드와 상호 교환 가능하게 사용된다.
특정 핵산 서열은 또한 "스플라이스 변이체"를 함축적으로 포함한다. 유사하게, 핵산에 의해 코딩된 특정 단백질은 그 핵산의 스플라이스 변이체에 의해 코딩된 임의의 단백질을 함축적으로 포함한다. "스플라이스 변이체"는 그 명칭이 시사하는 바와 같이 유전자의 선택적 스플라이싱의 산물이다. 전사 후, 초기 핵산 전사체는 상이한(선택적) 핵산 스플라이스 생성물이 상이한 폴리펩티드를 코딩하도록 스플라이싱될 수 있다. 스플라이스 변이체 생성 메커니즘은 다양하지만, 엑손의 선택적 스플라이싱을 포함한다. 리드쓰루(read-through) 전사에 의한 동일 핵산으로부터 유도된 선택적인 폴리펩티드도 이 정의에 포함된다. 스플라이스 생성물의 재조합 형태를 비롯한 스플라이싱 반응의 임의의 생성물이 이 정의에 포함된다. 칼슘 채널 스플라이스 변이체의 예가 문헌[Leicher et al., J. Biol. Chem. 273(52):35095-35101 (1998)]에 기재되어 있다.
핵산의 일부를 지칭할 때 사용되는 용어 "이종성"은 핵산이 자연에서는 서로 동일한 관계로 존재하지 않는 2개 이상의 부분서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 새로운 기능의 핵산을 형성하도록 배열된 비관련 유전자로부터의 2개 이상의 서열(예를 들어, 한 공급원으로부터 프로모터, 다른 공급원으로부터 코딩 영역)을 갖는 핵산을 일반적으로 재조합에 의해 제조한다. 유사하게, 이종성 단백질은 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계로 존재하지 않는 2개 이상의 부분서열을 포함한다는 것(예를 들어, 융합 단백질)을 나타낸다.
"엄격한 하이브리드화 조건"이란 어구는, 프로브가, 일반적으로 복잡한 핵산 혼합물 중에서, 다른 서열에는 하이브리드화하지 않으면서 그 표적 부분서열에 하이브리드화하는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며 상이한 환경에서 상이하다. 서열이 길수록 더 고온에서 특이적으로 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 관한 총괄적 지침은 문헌[Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic assays" (1993)]에서 찾아볼 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 특정 이온 강도, pH에서의 특정 서열에 대한 융점(Tm)보다 약 5～10℃ 더 낮게 선택된다. Tm은 표적에 상보성인 프로브의 50%가 평형 상태에서 표적 서열에 하이브리드화하는 온도(특정 이온 강도, pH 및 핵산 농도에서)이다(표적 서열이 과량 존재하기 때문에, Tm에서, 평형 상태에서 프로브의 50%가 점유된다). 엄격한 조건은 포름알데하이드와 같은 탈안정화제의 첨가로 형성할 수도 있다. 선택적 또는 특이적 하이브리드화의 경우, 양성 신호가 백그라운드 하이브리드화의 적어도 2배, 바람직하게는 백그라운드 하이브리드화의 10배이다. 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 다음과 같다: 50% 포름아미드, 5x SSC 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이트, 또는 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이트, 65℃에서 0.2x SSC 및 0.1% SDS에서 세척.
엄격한 조건 하에 서로에게 하이브리드화하지 않는 핵산은, 이들이 코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다면, 여전히 실질적으로 동일한 것이다. 이것은, 예를 들어, 유전자 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 이용하여 핵산 카피가 생성될 경우 발생한다. 이러한 경우, 핵산은 일반적으로 중간 정도로 엄격한 하이브리드화 조건 하에 하이브리드화한다. 예시적인 "중간 정도로 엄격한 하이브리드화 조건"은 37℃에서 40% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS의 완충액 중에서의 하이브리드화 및 45℃에서 1x SSC에서의 세척을 포함한다. 양성 하이브리드화는 백그라운드보다 적어도 2배이다. 당업자라면 유사한 엄격도 조건을 제공하기 위해 대안적 하이브리드화 및 세척 조건을 이용할 수도 있음을 쉽게 알 것이다. 하이브리드화 파라미터를 결정하는 것에 관한 추가적인 지침은 다수의 문헌, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al., John Wiley & Sons]에 제공된다.
PCR의 경우, 약 36℃의 온도가 저엄격도 증폭에 전형적이나, 어닐링 온도는 프라이머의 길이에 따라 약 32℃～48℃에서 달라질 수 있다. 고엄격도 PCR 증폭의 경우, 약 62℃의 온도가 전형적이나, 고엄격도 어닐링 온도는 프라이머 길이 및 특이성에 따라 약 50℃～약 65℃일 수 있다. 고엄격도 증폭과 저엄격도 증폭에 전형적인 사이클 조건은 30초～2분 동안의 90℃～95℃의 변성 단계, 30초～2분 동안 지속되는 어닐링 단계 및 1～2분 동안의 약 72℃에서의 연장 단계를 포함한다. 저엄격도 및 고엄격도 증폭 반응을 위한 프로토콜 및 지침은, 예를 들어 문헌[Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.]에 제공된다.
"표지" 또는 "검출 가능한 부분" 또는 "영상화제 또는 영상화 부분"은 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적, 방사선학적 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출할 수 있는 화합물이다. 예를 들어, 유용한 표지로는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(예를 들어, ELISA에서 통상 사용되는 것), 바이오틴, 디곡시게닌 또는 합텐 및 예를 들어, 방사능 표지를 펩티드에 도입하는 것에 의해 검출 가능하게 될 수 있거나 펩티드와 특이적으로 반응하는 항체를 검출하기 위해 이용될 수 있는 단백질을 들 수 있다. 바람직한 영상화제 또는 영상화 부분은 자성, 형광성 또는 방사성이다. 표지에 의해 생성된 신호를 시험관내 또는 생체내에서 검출하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
예를 들어, 세포 또는 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때의 "재조합"이란 용어는 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입 또는 네이티브 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변경되었거나 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유래되는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 네이티브(비재조합) 형태의 세포에는 존재하지 않는 유전자를 발현하거나, 재조합이 아니면 비정상적으로 발현되거나 저발현되거나 전혀 발현되지 않는 네이티브 유전자를 발현한다.
조성물
본 발명과 관련하여 약학적 목적으로 사용될 경우, 본 발명에 따른 구성체는 일반적으로, 임의의 약학적으로 허용되는 완충제일 수 있는 적절한 완충제, 예컨대 인산염 완충 식염수 또는 인산나트륨/황산나트륨, Tris 완충제, 글리신 완충제, 멸균수 및 문헌[Good et al., Biochemistry 5:467 (1966)]에 기재된 것들과 같은 당업자에게 공지된 다른 완충제 중에서 제제화할 수 있다. 이 조성물은 안정화제, 증진제 또는 약학적으로 허용되는 담체 또는 비이클을 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드 및 임의의 관련된 벡터를 안정화하기 위해 작용하는, 생리학적으로 허용되는 화합물을 포함할 수 있다. 생리학적으로 허용되는 화합물은, 예를 들어, 탄수화물, 예컨대 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 글루타티온; 킬레이트제; 저분자량 단백질 또는 다른 안정화제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 다른 생리학적으로 허용되는 화합물은 습윤제, 유화제, 분산제, 또는 미생물의 증식 또는 작용을 방지하는 데 특히 유용한 방부제를 포함한다. 다양한 방부제가 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 페놀 및 아스코르브산을 포함한다. 담체, 안정화제 또는 어쥬번트의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)]으로부터 참조할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 치료적 유효량의 본 발명에 따른 구성체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 "치료적 유효 용량 또는 치료적 유효량"은 이것이 투여되어 나타나는 효과(예를 들어, 망막 박리의 치료 또는 예방)를 산출하는 양을 의미한다. 정확한 양과 배합비는 치료 목적에 따라 달라지며, 공지의 기법을 이용하여 당업자가 확인할 수 있다(예를 들어, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003), 및 Pickar, Dosage Calculations (1999)). 구성체는 이것이 염이라면 "약학적으로 허용되는 염"으로서 제제화된다.
"약학적으로 허용되는 염"은 투여 경로에 따라 비교적 비독성인 산 또는 염기로 제조되는 활성 화합물의 염을 포함한다. 본 발명의 억제제가 비교적 산성인 작용기를 포함할 경우, 순수 또는 적절한 비활성 용매 중에서 그러한 화합물의 중성 형태를 충분한 양의 원하는 염기와 접촉시킴으로써 염기 부가염을 얻을 수 있다. 약학적으로 허용되는 염기 부가염의 예로는 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 암모늄염, 유기 아미노 또는 마그네슘 염, 또는 유사한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 비교적 염기성인 작용기를 포함할 경우, 산 부가염은 순수 또는 적절한 비활성 용매 중에서 그러한 화합물의 중성 형태를 충분한 양의 원하는 산과 접촉시킴으로써 얻을 수 있다. 약학적으로 허용되는 산 부가염의 예로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 일수소탄산, 인산, 일수소인산, 이수소인산, 황산, 일수소황산, 요오드화수소산 또는 아인산 등과 같은 유기산으로부터 유도된 염들과, 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠설포산, p-톨릴설폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄설폰산 등과 같은 비교적 비독성인 유기산으로부터 유도된 염들을 포함한다. 아르기네이트 등과 같은 아미노산의 염과 글루쿠론산 또는 갈락투론산 등과 같은 유기산의 염도 포함된다(예를 들어, Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19 (1977) 참조). 본 발명의 특정한 화합물은 화합물이 염기 부가염 또는 산 부가염으로 전환될 수 있도록 하는 염기성 작용기와 산성 작용기를 포함한다.
화합물의 중성 형태는 염기를 염기 또는 산과 접촉시키고 통상적인 방식으로 모 화합물을 단리함으로써 재생시킬 수 있다. 모 화합물 형태는 특정 물성(예컨대, 극성 용매 중에서의 가용성)에 있어서 다양한 염 형태와 상이하지만, 그 밖에는, 염은 본 발명의 목적상 모 화합물 형태와 동등하다.
염 형태 이외에도, 본 발명은 프로드럭 형태의 화합물을 제공한다. 본원에 기재된 화합물의 프로드럭은 생리학적 조건 하에 화학적 변화를 쉽게 겪어 본 발명의 화합물을 제공하는 화합물이다. 또한, 프로드럭은 생체외 환경에서 화학적 또는 생화학적 방법에 의해 본 발명의 화합물로 전환될 수 있다. 예를 들어, 프로드럭은 적절한 효소 또는 화학적 시약을 함유한 경피 패치 저장소에 놓여질 경우 본 발명의 화합물로 천천히 전환될 수 있다.
본 발명의 특정 화합물은 비용매화 형태뿐만 아니라 수화 형태를 비롯한 용매화 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 용매화 형태는 비용매화 형태와 동등하며, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 특정 화합물은 다수의 결정질 또는 비결정질 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 모든 물리적 형태가 본 발명에 고려되는 용도에 있어서 동등하며, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
핵산 및 폴리펩티드와 같은 생체고분자 이외에도, 본 발명의 특정 화합물은 비대칭 탄소 원자(광학 중심) 또는 이중 결합을 보유하며, 라세미체, 부분입체이성체, 기하 이성체 및 개별 이성체 모두 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 화합물이 아미노산 또는 핵산을 포함하는 바람직한 구체예에서, 아미노산 및 핵산은 각각 주된 자연 발생 생물학적 거울상이성체이다.
투여용 조성물은, 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체 중에 용해된 본원에 기재된 물질을 일반적으로 포함한다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 완충 식염수 등이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균 상태이며, 일반적으로 바람직하지 않은 물질을 포함하고 있지 않다. 이들 조성물은 통상적인 잘 알려진 멸균 기법으로 멸균할 수 있다. 이 조성물은 생리학적 조건에 가깝게 하는 데 필요한 약학적으로 허용되는 보조제, 예컨대 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들어 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 포함할 수 있다. 이들 제제 중의 활성 물질의 농도는 광범위하게 다양할 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 필요에 따라 주로 체액 부피, 점도, 체중 등에 기초하여 선택된다.
본 발명에 사용하기 위한 적절한 제제는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003)]에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본원에서 참고로 인용한다. 또한, 약물 전달 방법의 간단한 리뷰를 위해서는, 본원에서 참고로 인용되는 문헌[Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]을 참조할 수 있다. 본원에 기재된 약학 조성물은 당업자에게 공지된 방식으로, 즉, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분쇄(levigating), 유화, 캡슐화, 봉입 또는 동결건조 공정을 이용하여 제조할 수 있다. 이하의 방법 및 부형제는 단지 예시를 위한 것이며 한정을 의도한 것이 아니다.
주사를 위해서는, 본 발명의 화합물을 수용액 중에서, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충액, 예컨대 행크스액(Hanks's solution), 링거액(Ringer's solution) 또는 생리 식염수 완충액 중에서 제제화할 수 있다. 경점막 투여를 위해서는, 장벽 투과에 적절한 침투제를 제제에 사용한다. 이러한 침투제는 당업계에 널리 알려져 있다.
경구 투여를 위해서는, 본 발명에 따라 사용되는 억제제를 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용되는 담체와 배합함으로써 용이하게 제제화할 수 있다. 그러한 담체는, 치료되는 환자에 의한 구강 섭취를 위해, 화합물을 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 에멀션제, 친유성 및 친수성 현탁액제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러러제, 현탁액제 등으로서 제제화할 수 있게 한다. 경구 사용을 위한 약학 제제는 화합물을 고체 부형제와 혼합하고, 경우에 따라 얻어진 혼합물을 분쇄하고, 필요에 따라 적절한 보조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 얻음으로써 제조할 수 있다. 적절한 부형제로는 특히, 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 솔비톨을 비롯한 당과 같은 충전제; 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트래거캔스 검, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)와 같은 셀룰로스 제제를 들 수 있다. 필요에 따라, 가교결합 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 그 염(예컨대, 알긴산나트륨) 등의 붕해제를 첨가할 수 있다.
약학 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 제형 및 양으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여에 적합한 단위 제형으로는 분말제, 정제, 환제, 캡슐제 및 로젠지를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 경구 투여될 경우 항체는 소화되는 것으로부터 보호되어야 한다는 것이 인식되고 있다. 이것은 일반적으로 분자를, 산성 및 효소적 가수분해에 대해 저항성을 띠게 하는 조성물과 복합체화함으로써, 또는 분자를 적절한 저항성의 담체, 예컨대 리포솜 또는 보호 장벽으로 포장함으로써 수행한다. 소화로부터 보호하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
특히 본 발명에 따른 구성체의 약학 제제는 원하는 순도를 갖는 구성체를 선택적인 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조할 수 있다. 그러한 제제는 동결건조 제제 또는 수용액일 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 아세테이트, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 항산화제(예를 들어, 아스코르브산), 방부제, 저분자량 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민 또는 젤라틴, 또는 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 및 아미노산, 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물(글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함함); 킬레이트제; 및 이온성 및 비이온성 계면활성제(예를 들어, 폴리솔베이트); 염 형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 구성체는 0.5～200 mg/ml, 또는 10～50 mg/ml의 농도로 제제화될 수 있다.
본 발명에 따른 구성체를 함유하는 조성물은 진단적, 치료적 또는 예방적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적 용도에서, 조성물은 "치료적 유효량"으로 환자에게 투여된다. 환자의 필요에 따른, 또, 허용성에 따른 투여량 및 투여 빈도에 따라 조성물을 1회 또는 다회 투여할 수 있다. 본 발명의 목적상 "환자" 또는 "피험체"는 인간과 다른 동물을 모두 포함하며, 특히 포유동물을 포함한다. 따라서, 본 방법은 인간의 치료 용도와 수의학적 용도에 적용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 환자는 포유동물, 바람직하게는 영장류이며, 가장 바람직한 구체예에서, 환자는 인간이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "담체"는 생체내 또는 시험관내에서 생물학적 시스템에 적용될 수 있는 활성 물질(예를 들어, 치료제와 같은 약물)에 대한 희석제 또는 비이클로서 사용되는 일반적으로 비활성인 물질을 말한다. 이 용어는 또한 조성물에 응집성을 부여하는 일반적으로 비활성인 물질을 포함한다.
본 발명의 조성물은 통상적인 널리 알려진 멸균 기법에 의해 멸균되거나 멸균 조건 하에 제조될 수 있다. 수용액은 무균 상태에서 사용을 위해 포장하거나 여과하여 동결건조할 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수용액과 배합된다. 이 조성물은 생리학적 조건에 가깝게 하기 위해 필요에 따라 약학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있으며, 그 예로는 pH 조절제 및 완충제, 등장성 조절제, 습윤제 등, 예를 들어 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 솔비탄 모노라우레이트 및 트리에탄올아민 올레이트를 들 수 있다.
치료 방법
"치료하는" 또는 "치료"란 용어는 다음을 포함한다:
(1) 질환에 노출되어 있을 수 있지만 그 질환의 증상을 아직 경험하거나 발현하지 않은 포유동물에서 질환을 예방하는 것, 즉, 그 질환의 임상 증상이 발생하지 않도록 하는 것,
(2) 질환을 억제하는 것, 즉, 그 질환 또는 그 임상 증상의 발달을 저지하거나 감소시키는 것. 이것은 박리를 갖는 피험체의 위험 또는 피험체의 관찰된 박리 정도 또는 수를 줄이는 것을 포함한다.
(3) 질환을 경감하는 것, 즉, 그 질환 또는 임상 증상의 역행을 유발하는 것.
본 발명에 따라 사용되는 구성체는 임의의 투여 경로(예를 들어, 정맥내, 국소, 복강내, 비경구, 경구, 질내, 직장내, 안내(ocular), 유리체내(intravitreal) 및 안구내(intraocular) 경로)로 투여될 수 있다. 이 구성체는 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입으로서, 근육내, 복강내, 피하, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 투여될 수 있다. 항체의 정맥내 또는 피하 투여가 바람직하다. 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 이 구성체는 해당 질환을 앓고 있는 것으로 진단되었거나 그 질환의 병력이 있거나 그 질환에 대한 위험이 있는 피험체에게 투여될 수 있다.
[실시예]
하기 실시예는 예시를 위해 제공되는 것이며 청구된 발명을 제한하는 것이 아니다. 본 발명을 CEA와 도메인 III 스캐폴드의 융합 단백질을 이용하여 예시하였지만(도 8 참조), 스캐폴드를 표적화제 및/또는 영상화제 및 치료제에 접합하는 다른 방법도 고려된다
실시예 1
본 발명자들은 HSA DIII 야생형(WT, 비돌연변이) 또는 3종의 HSA DIII 변이체 중 하나(각각 H535, H510 또는 H464의 알라닌 잔기로의 돌연변이를 포함함) 및 종양 태아 항원(carcinoembryonic antigen: CEA)을 표적화하는 잘 연구된 항체 단편으로 이루어진 융합 단백질을 테스트하였다. 이종이식 무흉선 마우스에 124I 표지 Db-DIII 또는 Db 단백질을 주사하고, 일련의 소형 동물 PET/CT 영상 연구를 수행하여 HSA DIII이 생체내에서 Db의 혈청 지속성을 조절할 수 있는 능력을 평가하였다. 또한, 본 발명자들은 FcRn 결합 및 알부민의 혈청 지속성에 대한 H535, H510 및 H464 잔기의 상대적 중요성에 관한 결론을 도출할 수 있었다.
재료 및 방법
Db-DIII 구성체의 제조
주형으로서의 시판되는 HSA cDNA(OriGene Technologies, Rockville, MD)와 5' SpeI 및 3' EcoRI 제한 부위를 도입하는 프라이머를 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 HSA DIII 유전자를 증폭시켰다. 프라이머 서열은 다음과 같았다:
정방향: SpeI-DIII: 5'-CCACTAGTGGCGAAGAGCCTCAGAATTTAATC-3'
역방향: DIII-EcoRI: 5'-GAGAATTCTATTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3'
DIII에서의 히스티딘 잔기 H535, H510 또는 H464의 알라닌으로의 돌연변이는 Quick-Change 돌연변이 유발 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 적절한 돌연변이 유발 프라이머(정방향 프라이머만 제시함)를 이용하여 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 도입하였다:
H464A (464번 위치의 히스티딘 잔기를 알라닌 잔기로 치환함)
5'-CTGAACCAGTTATGTGTGTTGGCTGAGAAAACGCCAGTAAGTGAC-3'
H510A
5'-GTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCGCTGCAGATATATGCACAC-3'
H535A
5'-CTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAAGCCAAGCCCAAGGCAAC-3'
완전한 DIII(WT, H535A, H510A 및 H464A) 유전자를 pCR2.1-Topo 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클로닝한 후, 항CEA Db(Wu et al., 1999)를 이미 포함하고 있는 pUC18 벡터(New England Biolabs, Beverly, MA). 전체 Db-DIII 유전자를 pUC18 벡터로부터 잘라 내어 XbaI 및 EcoRI 부위를 이용하여 pEE12 포유동물 발현 벡터(Bebbington et al., 1992)로 결찰하였다.
발현, 선택 및 정제
NS0 쥐과동물 골수종 세포(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를, 5% 열 불활성화 투석 우태 혈청(FBS; Omega Scientific Inc., Tarzana, CA), 1% v/v의 200 mM L-글루타민(Mediatech, Inc., Manassas, VA) 및 1% v/v의 페니실린-스트렙토마이신(10,000 IU/ml의 페니실린, 10,000 mg/ml의 스트렙토마이신; Mediatech Inc.)이 보충된 비선택성 글루타민 무함유 둘베코 조정 이글 배지(DME/High Modified; SAFC Biosciences, Lenexa, KS)에서 유지하였다. 대수 성장기에 있는 1x107개 NS0 세포를 이전에 알려진 바와 같이(Kenanova et al., 2005) SalI(New England Biolabs, Ipswich, MA)을 이용한 분해에 의해 선형화한 10 ㎍의 pEE12-Db-DIII DNA를 사용한 전기천공에 의해 트랜스펙션시켰다.
Db-DIII 생산은 ELISA로 분석하고 웨스턴 블롯으로 확인하였다. ELISA를 위해서는, 단백질 A(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)를 Db-DIII 단백질을 포획하는 데 사용하였다. 알칼라인 포스파타제(AP) 접합 항마우스 Fab 특이적 항체(Sigma-Aldrich)는 ELISA와 웨스턴 블롯 둘 다에서 검출에 사용되었다. 트랜스펙션된 NS0 세포를 5% 열 불활성화 투석 FBS(Omega Scientific Inc.), 2% v/v의 50x GS 보충물(SAFC Biosciences) 및 1% v/v의 페니실린-스트렙토마이신(Mediatech Inc.)이 보충된 선택성 글루타민 무함유 DME/High 조정 배지(SAFC Biosciences)에서 유지하였다. 다량의 Db-DIII 단백질을 발현하는 선택된 클론을, 2% 열 불활성화 투석 FBS(Omega Scientific Inc.) 및 1% v/v의 페니실린-스트렙토마이신(Mediatech Inc.)이 보충된 300 ml의 선택 배지를 포함하는 삼중의 플라스크(Nunclon, Rochester, NY)로 점차로 증식시켰다.
배양물이 종점 상태에 도달하면(약 3주), 수거된 상청액을, 분자량 컷오프(mwco) 30,000 Da의 필터를 이용한 실험실 규모의 접선 흐름 여과(TFF) 시스템(Millipore, Billerica, MA)을 이용하여 원심분리, 여과 멸균 및 농축하였다. Db-DIII 단백질을 AKTA 정제기(GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 사용하여 단백질 A 컬럼(Thermo Fisher Scientific, Inc.)에서 정제하였다. 결합된 단백질은 1x PBS 중 15%의 0.2 M 시트레이트 완충제(pH 2.1)로 용리시키고, pH는 80% v/v의 1 M Tris 염기(pH 8.2)를 용리된 단백질에 직접 첨가하여 즉시 중화시켰다. 순수한 Db-DIII 단백질을 포함하는 분획을 모아 1x PBS에 대해 투석하고, Vivaspin 20(mwco: 30,000; Sartorius Stedim Biotech Gmbh, Goettingen, Germany)에 의해 농축시켰다. 정제된 Db-DIII 단백질의 최종 농도는 흡광계수 ε=1.5를 이용하여 A280로 측정하였다.
Db-DIII 단백질의 특징 분석
정제된 Db-DIII 단백질을 비환원(NR) 및 환원(R) 조건 하의 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 웨스턴 블롯, 질량 분광분석 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 단백질을 환원시키기 위해, 1 M의 디티오트레이톨(DTT)을 최종 농도가 0.2 M이 되도록 첨가하였다. SDS-PAGE를 위해, 4～20% 구배의 Tris-HCl 레디 겔(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 러닝하여 Instant Blue Coomassie계 용액(Expedion Protein Solutions, Cambridge, UK)에서 현상시켰다. 웨스턴 블롯에서의 Db-DIII 단백질의 검출은, 니트로 블루 테트라졸륨(NBT) 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트(BCIP)(Promega, Madison, WI) AP 기질로 하여 접합 염소 항마우스 Fab 특이적 mAb(Sigma-Aldrich)를 이용하여, 또는 4-클로로-1-나프톨/3,3'-디아미노벤지딘(CN/DAB) 기질 키트(Thermo Scientific, Rockfort, IL)를 이용하여 현상되는 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 접합 단백질 L(Sigma-Aldrich)을 이용하여 수행하였다.
LTQ-FT 울트라 리니어 이온 트랩 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(FT-ICR) 질량 분광분석계(Thermo Fisher)를 이용한 질량 분광분석을 수행하여, 정제된 단백질의 실체를 확인하였다. 요약하면, http://massspec.wiki.zoho.com/In-Gel-Trypsin-Digest.html에 상세히 기재된 겔 내에서의 트립신 분해 절차에 따라 Db-DIII 단백질을 단리하였다. 직렬 질량 분광분석(nLC-MSMS) 및 충돌 활성화 분해(CAD) 단편화를 이용한 나노액체 크로마토그래피를 Eksigent nano-LC가 통합된 LTQ-FT(Thermo Fisher)에서 수행하였다. Mascot(Matrix Science, UK) 및 Sequest(Thermo Fisher)를 이용하여 가장 최근의 국제 단백질 인덱스 데이터베이스(Version 3.54, 39,925개 엔트리 포함)에 대해 스펙트럼을 조사하였다. 그 결과를 엄격한 점수 필터링 기준 및 10 ppm 질량 분해 필터로 필터링하였다. 확인된 펩티드는 Db-DIII 서열에도 일치하였다.
정제 후 Db-DIII 단백질 순도 측정, 네이티브, 비환원 조건(1x PBS, pH 7.4)에서의 Db-DIII 단백질 입체구조(conformation) 및 분자량 추정은 Superdex 200 HR 10/30 컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피를 통해 수행하였다.
PyMOL 소프트웨어(DeLano Scientific)를 이용하여 DIII 및 Db-DIII 분자의 컴퓨터 모델을 생성하였다. 또한, 공개 서버(http://zlab.bu.edu/rong/dock)에서 이용 가능한 ZDOCK-FFT 알고리즘(Chen et al., 2003)을 이용하여 HSA와 DIII 간의 단백질 도킹의 모델링을 수행하였다.
Db-DIII 융합 단백질의 방사선 동위원소 표지화, 이종이식편 영상화 및 생체분포
정제된 Db-DIII WT, H535A, H510A 및 H464A를 이전에 공지된 바와 같이(Olafsen et al., 2006) Iodogen법을 이용하여 양전자 에미터 124I(0.02 M NaOH 중 염화나트륨; IBA Molecular, Sterling, VA)로 방사선 동위원소 표지를 행하였다. 표지화 용액(0.114～0.130 ml)은 0.1 mg의 정제된 단백질 및 12.9～18.0의 MBq Na124I를 포함하였다. 표지화 효율은, 이전에 공지된 바와 같이, 단일클론 항체 ITLC 스트립 키트(Biodex Medical Systems, Shirly, NY)를 이용하여 순단 박막 크로마토그래피(ITLC)로 측정하였다(Olafsen et al., 2006).
생체내 연구를 위해서는, 7～8주령의 무흉선 누드 마우스(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)에게, 왼쪽 어깨 부위에 1～5x106개 CEA 양성 LS174T 인간 결장 암종 세포(American Type Culture Collection, Manassas, VA)를, 오른쪽 어깨 부위에 거의 동일한 수의 CEA 음성 C6 래트 신경교종 세포(ATCC) 피하 주사하였다. 종양 덩어리를 평균 10일 동안 증식시켜 최대 중량이 200 mg이 되게 하였다. 구성체당 4마리의 종양 보유 마우스에게 꼬리 정맥에 식염수 1% HSA 중 3.9～5.4 MBq 124I 표지 Db-DIII 또는 Db를 주사하였다. 상이한 5개 시점(4 h, 20 h, 28 h, 44 h 및 51 h)에, 주사된 마우스를 2% 이소플루란을 사용하여 마취시켜 베드 위에 놓고 10분 동안 영상화하였다. 51시간째의 최종 PET 스캔 후 10분 CT 스캔을 완료하였다. 모든 영상화 실험은 Focus 220 소형 동물 PET(Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN) 및 소형 동물 CAT II(Concorde Microsystems, Knoxville, TN) 스캐너를 이용하였다. 마지막 스캔(51 h) 후, 마우스를 안락사시켰다. 혈액, 종양(LS174T 및 C6), 간, 비장, 신장, 폐 및 도체를 수집하여 칭량하고 Wallac WIZARD 자동 감마 카운터(PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc., Wellesley, MA)로 카운팅하였다. 붕괴율 보정 후, 각 단백질의 표지화 효율의 보정과 표준 오차(SE)를 도입하여 각각의 조직/장기에 대한 그램당 퍼센트 주사 용량(%ID/g)을 계산하였다.
이미지 분석 및 통계 분석
모든 이미지는 여과 후 역투사(filtered back projection: FBP) 알고리즘(Defrise et al., 1997)을 이용하여 재구성하여, AMIDE 소프트웨어(Loening and Gambhir, 2003)로 디스플레이하였다. 동일 색 역치를 모든 이미지에 적용하였다. CEA 양성 종양 부위와 신체 아랫쪽의 저활성의 연조직 부위(근육)에서 관심있는 영역(ROI; 타원체, 깊이 0.4 mm, n=4)을 골랐다. 개개의 마우스에 대해 종양 대 연조직(T:ST) 비를 측정하여 각 시점과 구성체에 대해 평균하였다. 각 이미지 상의 심장에 대해 ROI(n=4)를 얻고, MBq 중의 주사된 용량 및 MBq/cc/이미지 단위의 실린더 팩터(cylinder factor)를 입력 함수로서 입력한 후 AMIDE 소프트웨어로 혈액의 %ID/g을 계산하였다. ADAPTII 소프트웨어를 이용하여 그 혈액 활성 곡선(D'argenio and Schumitzky, 1979)으로부터 각각의 단백질의 평균 체류 시간(MRT)을 계산하였다. SE는 모든 비 및 %ID/g 값에 대해 계산하여 그래프로 표현하였다(오차 막대). 모든 T:ST ROI 비 및 혈액 활성 곡선을 각각 이표본 스튜던트 t 검정을 이용하여 유의차에 대해 비교하였다. 0.05 이하인 양측 P 값이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
결과
Db-DIII 단백질의 제조 및 생화학적 특성 분석
a. 생성, 발현 및 정제
Db-DIII 구성체는 XbaI 및 EcoRI 제한 부위가 측면에 위치하는 길이 약 1.4 kb의 염기쌍이다(도 1A). ELISA로 측정되는 바와 같이, 조작된 Db-DIII 분자를 트랜스펙션된 NS0 세포의 최종 배양물 중에서 10～16 mg/ml로 발현시켰다. 단백질 L이 Db-DIII 단백질에 결합할 수 있긴 하지만, 단백질 A에 의한 포획이 더 효율적이었다. 따라서, 정제를 위해 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 선택하였다. Db는 2개의 scFv 분자의 비공유결합 이량체이기 때문에, 각각의 Db 분자는 그 C 말단에 2개의 DIII 단백질이 부착되어, 계산 분자량이 약 101 kDa인 융합 단백질을 생성한다(도 1B).
b. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯
정제된 Db-DIII WT 및 변이체를 NR 및 R 조건 하에 SDS-PAGE로 분석하였다(Fig. 2A). Db-DIII 단백질은 NR 조건 하에 예상 분자량 약 101 kDa에 해당하는 주밴드를 형성시켰다(도 2A, 레인 1, 2 및 3). 저분자량의 2개의 약한 밴드도 SDS-PAGE 쿠마시 염색 겔(도 2A, 레인 1, 2 및 3) 및 항마우스 Fab 특이적 항체로 프로빙된 웨스턴 블롯(도 2B, 레인 2) 둘 다에서 확인되었다. 환원시킬 경우, 주밴드[(scFv-DIII)2; 101 kDa]가 scFv-DIII 단편(약 48 kDa) 및 DIII 분자(약 23 kDa)(Fig. 2A, 레인 5)에 해당하는 2개의 밴드로 분리된다. 다클론 항HSA 항체를 사용하여 융합 단백질의 DIII 부분을 검출하려는 시도는 성공적이지 못했으며, 따라서, Db-DIII 단백질의 Db 성분에 결합하는 HRP 접합 단백질 L을 대신에 웨스턴 블롯에 사용하였다(도 2B, 레인 3). 윗쪽 밴드[(scFv-DIII)2; 101 kDa] 및 중간 밴드(scFv-DIII; 48 kDa)만이 검출되었다. 따라서, 환원된 단백질 SDS-PAGE 겔 상의 약 23 kDa의 아랫쪽 밴드(도 2A, 레인 5)는 DIII 도메인만을 나타내어야 한다. 정제된 단백질 정말로 Db-DIII인지를 확인하기 위해, 질량 분광분석법을 이용하였다. Db 또는 DIII 아미노산 서열에 일치하는 몇 개의 펩티드가 확인되어, 단백질의 실체가 확인되었다(데이터는 제시하지 않음).
c. 크기 배제 크로마토그래피
크기 배제 크로마토그래피는 Db-DIII WT(101 kDa)가 용리 시간 28.17분에 단일 피크로서 용리되었음을 보여주었다(도 2C). 동일한 조건 하에, Db-DIII H535A, H510A 및 H464A 단백질이 평균 용리 시간 28.2분에 확인되었으며, 응집이나 다량체화가 검출되지 않았다. 크기 배제 크로마토그래피 피크의 적분은 1 단계의 단백질 A 친화성 컬럼 정제 후 단백질 순도가 약 98%임을 나타내었다.
d. HSA DIII, DIII-FcRn 상호작용 및 Db-DIII의 컴퓨터 모델링
HSA의 결정 구조에 기초하여 HSA DIII의 구조 모델을 생성하였다(Sugio et al., 1999)(도 3A). DIII은 루프에 의해 서로 연결된 10개의 α 나선(DIIIa에서 6개 및 DIIIb에서 4개)으로 이루어진다. 잔기 H464(DIIIa에서), H535 및 H510A(둘 다 DIIIb에서)가 도시된다. HSA 및 FcRn의 결정 구조(Martin et al., 2001)를 이용하여 DIII 및 FcRn의 도킹 모델도 생성하였다(도 3B). ZDOCK 알고리즘은 FcRn 잔기 H161 및 H166(Andersen et al., 2006), 및 HSA DIII H535, H510 및 H464를 포함한 상호작용에 대하여 편향되었다. 이들 구조를 분류하여, 잠재적인 강한 pH 의존적 결합에 대해 PyMOL을 이용하여 분석하였다. 분석으로부터 얻은 전체적인 인상은, 예측 구조의 대부분에서 그러하였듯이, FcRn 잔기 H166 및 H161을 둘러싼 보존된 방향족 잔기가 DIII H510 및 H535 잔기 중 2개와 접촉할 가능성이 있다는 것이었다. FcRn H166 및 H161은, 히스티딘이 낮은 pH 환경에서 양성자화될 때 친화성이 증가하는 DIII 상의 글루탐산 잔기와 상호작용할 가능성 있는 것으로 보인다. 또한, 제안된 구조의 다수에서 상호작용한 FcRn 잔기 D102 및 N101이 역할을 하는 것 같다. ZDOCK에 의해 제공된 10번째로 얻은 구조가 강한 pH 의존성 결합을 나타낼 가능성이 가장 큰 것으로 간주되었다. 이 구조는 DIII H535와 FcRn F157; DIII H510과 FcRn W51과 Y60; DIII H464와 FcRn D101 및 N102 또는 K123 중 어느 하나; FcRn H166과 DIII E505; 및 FcRn H161과 DIII E531 사이의 잠재적인 상호작용을 포함하였다. 마지막으로, Db-DIII 분자의 모델을 T84.66 디아바디의 결정 구조를 이용하여 생성하였다(Carmichael et al., 2003)(도 3C). 2개의 DIII 분자가 18개 아미노산 링커를 통해 각각의 이량체 디아바디에 부착되며, 이것은 매우 융통성 있는 분자 구조를 생성하여야 한다.
방사선 동위원소 표지화 및 쥐과동물 이종이식편 영상 연구
Db-DIII 융합 단백질에 대한 124I 표지화 효율은 63.9～81.5%였으며, 주사된 비활성은 13.0～18.0 GBq/μmol이었다. 일련의 소형 동물 PET 영상화를 통해, 종양 표적화 및 순환 지속성에 있어서의, 생체내에서의 Db 단독과 Db-DIII 융합 단백질을 비교할 수 있었다(도 4). 이미지는, 5종의 단백질 모두가 LS174T(CEA 양성) 종양을 표적으로 한다는 것을 보여준다. CT 이미지에서는 종양의 해부학적 위치가 분명히 관찰된다. 표적화는 Db 및 Db-DIII H464A의 경우 4시간으로서 일찍, Db-DIII WT, H535A 및 H510A 분자의 경우 20시간에 확인되었다. CEA 양성 종양에서의 신호는 모든 단백질에 대해 전체 연구 기간 동안(51시간) 지속된 반면, 백그라운드(순환 활성)는 가변적이었다. 상이한 시점에서의 Db-DIII 및 Db 단백질의 T:ST ROI 비의 통계적 비교(도 5A)는 4시간 및 20시간째 모든 단백질이 서로 유의적인 차이가 없는 T:ST 비를 나타내었음(P > 0.05)을 보여주었다. 28시간부터, 44시간 내지 51시간에 이르기까지, Db T:ST 비는 모든 Db-DIII 단백질보다 유의적으로 큰 상태로 유지되었다(P 값 범위 0.04～0.01). 51시간째, H535A(P=0.03), H510A(P=0.02) 및 H464A(P=0.01) 변이체는 WT에 비해 유의적으로 큰 T:ST 비를 보였으며, 이는 연조직 신호 감쇠 속도가 더 빠른 것에 기인한다. 그러나, H510A T:ST 비는 H535A와 유의적인 차이가 없었다(P=0.1). H464A T:ST 비도 H510A T:ST 비와 유의적인 차이가 없었다(P=0.07). H464A T:ST 비는 H535A와 유의적인 차이가 있었다(P=0.02). 각 시점에 대한 혈액 중 방사능(%ID/g)의 PET 이미지 정량은 혈액 활성 곡선의 생성(도 5B) 및 혈액 중의 각 단백질의 MRT 계산(표 1)을 가능하게 하였다. Db-DIII WT는 모든 히스티딘 돌연변이체 및 Db 단독에 비해 유의적으로 더 느린 혈액 제거 역할을 나타내었다(P<0.05). Db-DIII H535A 및 H510A뿐만 아니라, H510A 및 H464A 혈액 활성 곡선은 서로 유의적인 차이가 없었던 반면(각각 P=0.09 및 P=0.08), H535A는 H464A 변이체에 비해 혈액 지속성이 유의적으로 더 긴 것으로 나타났다(P=0.01). 따라서, 혈청 MRT를 가장 긴 것부터 가장 짧은 것 순으로 나타내면 다음과 같다: Db-DIII WT > H535A ≥ H510A ≥ H464A > Db, 여기서 Db-DIII H535A는 H464A에 비해 순환 체류 시간이 유의적으로 더 길다. 51시간째의 생체분포는 혈청 지속성 순서를 확인해 주었다(표 2). Db-DIII 단백질에 대한 혈액 중 측정 활성은 4.0～1.6 %ID/g인 반면, LS174T 종양 흡수율은 2.5～1.3 %ID/g이었고, 이에 비해 Db의 경우 0.5 %ID/g이었다. 이전 연구는 방사성 동위원소 표지 T84.66 Db가 주사 후 2시간째 최대 종양 흡수율(13.68±1.49 %ID/g)에 도달하고, 그 후 종양 내 활성이 감소하기 시작한다는 것을 보여주었다(Wu et al., 1999). 종양 질량은 평균이 LS174T 및 C6 종양 각각에 대해 161 mg 및 126 mg이었다. 혈청 체류 시간이 길수록 일반적으로 더 높은 LS174T 종양 흡수율과 관련되어 있는 것으로 확인되었다. 51시간째, Db-DIII에 대한 CEA 양성 종양 흡수 대 음성 종양 흡수 비는 1.5～2.2였으며, 이에 비해 Db 단독의 경우 13이었다.
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Figure pct00002
고찰
HSA DIII이 조정 가능한 PK를 갖는 단백질 스캐폴드로서 작용할 수 있다는 원리를 증명하기 위한 제1 단계로서, 본 발명자들은 2개의 성분들로 이루어진 융합 단백질을 설계하였다. 하나는 항CEA T84.66 Db였고, 이것은 생체내에서 광범위하게 연구되었던 소형 2가 항체 단편이다. 항CEA Db는 LS174T(CEA 양성) 종양 보유 마우스에서 최종 β 반감기 2.89 h (123I)～3.04 h(111In)를 나타낸다(Yazaki et al., 2001). 이 Db는 또한 다른 단백질(즉, 레닐라 또는 가우시아 루시퍼라제)에도 성공적으로 융합되었으며, 여기서 이것은 생체내 표적화 능력을 유지하였다(Venisnik et al., 2007; Venisnik et al., 2006). 따라서, Db는 개념 연구의 증명을 위한 우수한 모델 표적화 분자를 만든다. 두번째 성분은 알려지지 않은 특성을 갖는 것, 즉 HSA DIII WT 또는 돌연변이된 H535, H510 또는 H464 잔기를 갖는 그 변이체 중 하나이다. Db-DIII 융합 단백질을 적절한 폴딩을 담보하기 위해 포유동물 세포에서 발현시켰다. 발현 수준은 적당하였고, 친화성 정제는 분자량 계산치가 101 kDa에 일치하는 단백질을 산출하였다(도 2A). Db는 2개의 scFv 분자의 비공유 결합 이량체이며, 이것은 SDS-PAGE 조건 하에 서로 분리되어 25 kDa으로 이동한다(Wu et al., 1999). 본 발명자들은, DIII 및 scFv 둘 다에서 모든 시스테인 잔기가 쌍을 이루기 때문에, Db-DIII 분자가 scFv-DIII(약 48 kDa) 종으로서 이동할 것으로 예측하였다(Curry et al., 1998; Dugaiczyk et al., 1982; Wu, 1999). 흥미로운 점은, 비환원 조건 하에, 단백질 벌크가 이량체 형태[(scFv-DIII)2; 101 kDa]로 유지되어, SDS 조건 하에서의 증가된 구조적 안정성 나타내었다는 것이다. Db-DIII 컴퓨터 모델을 더 면밀히 관찰한 결과(도 3C), Db와 DIII 사이의 링커 길이는 18개 아미노산에서 5개 아미노산으로 감소되었다(데이터는 제시되지 않음). 이러한 변경은 단백질[(scFv-DIII)2; 도 2A)의 이동 패턴에 영향을 미치지 않았다. 이러한 예측 못한 거동으로 인해, SDS-PAGE 겔(도 2A)로부터 Db-DIII 단백질을 잘라 내어, 추출된 단백질을 질량 분광분석으로 분석하였다(데이터는 나타내지 않음). 결과는, 약 101 kDa의 단백질이 정말로 Db-DIII였음을 확인해 주었다. 증가된 SDS 및 열 안정성은, β-글리코시다제의 경우에서와 같이(Gentile et al., 2002), 2개의 scFv-DIII 분자 간의 극성 이온성 상호작용에 의한 것일 수 있다. Db-DIII 단백질의 분자 크기는 생리학적 조건 하에 크기 배제 크로마토그래피로 확인하였다. Db-DIII의 용리 시간은, 같은 조건 하에 약 27.3분째 용리하는 유사한 분자량의 다른 단백질(scFv-Fc, 105 kDa)과 유사하다(Kenanova et al., 2005). 약간 더 작기 때문에 Db-DIII은 약 28.2분째 용리하는 반면, Db 단독은 38.2분째 용리한다(Kenanova et al., 2005). 고순도 이외에도, 크로마토그램(도 2C) 상의 단일 피크는 Db-DIII 단백질의 온전성과 이것이 단일 종으로 존재함을 보여주었다. DIII-FcRn 도킹 모델(Fig. 3B)은 H535, H510 및 H464 잔기의 가능한 FcRn 상호작용 파트너를 한정하는 데 유용하였으며, 또한 FcRn 결합에 있어서의 그 중요성을 정의할 수 있었다. 그러나, DIII 히스티딘 잔기의 실제 등급은 생체내 분자 영상화에 의해 결정하였다.
분자 영상화, 특히 PET의 강점은, PK, 종양 표적화, 교차반응성에 대한 정량적 정보를 도출하기 위해 트레이서 주입 후 여러 차례 동일한 개체를 단층 X선 사진 촬영으로 영상화할 수 있다는 것이다. 이 연구에서, CEA 양성 및 음성 이종이식편을 갖는 마우스에게 124I 표지 Db-DIII 또는 Db 단백질을 주사하고, 5개의 상이한 시점에 영상화하였다. 이것에 의해 순환 지속성 및 종양 표적화의 점에서 Db-DIII 단백질을 서로, 또 Db 단독과도 일대일로 비교하는 것이 가능하였다. Db는 불변 성분이기 때문에, Db-DIII 단백질 간의 PK 차이는 DIII의 기능에 기인하는 것이었다. 따라서, 간접적이긴 하지만, PET 영상화로써 생체내에서의 DIII 단백질의 거동에 관한 결론을 도출할 수 있었다. 혈청 제거 속도가 더 빠른 표적화제는 더 이른 시점에 더 큰 T:ST 비에 도달한다. 따라서, 각각의 시점에서의 T:ST ROI 비(도 5A)에만 기초하여, 본 발명자들은 가장 빠른 것(최고 T:ST 비)부터 가장 느린 것(최저 T:ST 비)까지 혈액 제거 순서를 도출할 수 있었다: Db >> Db-DIII H464A > H510A > H535A > WT. 흥미로운 점은, 통계 분석에 의하면, Db-DIII H510A는 H535A보다 제거 속도가 유의적으로 빠르지 않다는 것이다. H535 및 H510 잔기는 둘 다 서브도메인 DIIIb에 위치한다. 이러한 발견은 알부민 내에 H510 및 H535 잔기가 풍부하여, 어느 하나가 FcRn에의 결합에 대해 비기능성이거나 그에 이용될 수 없는 경우 서로 백업해 주는 역할을 한다는 것을 시사할 수 있다. 이러한 가설은 아직 규명할 필요가 있다. 두 잔기의 동시 돌연변이가 더 많은 통찰을 제공할 수 있다. 동일한 순환 제거 순서가, 각각의 단백질에 대해 각각의 시점에 마우스 심장 중의 방사능을 정량한 것으로부터 생성한 혈액 활성 곡선에 의해서도 확인되었다(도 5B). 혈액 활성 곡선의 통계적 비교는 상기와 동일한 결론으로 이어졌다. - Db-DIII H535A는 H464A보다 유의적으로 느리게 제거되지만, H510A에 비교해서는 아니다. 트레이서 주입 후 처음 12시간 내에는 더 많은 시점이 없기 때문에, α 및 β 반감기가 아니라 MRT 계산이 더 합당하였다. MRT는 Db-DIII WT의 경우 약 2.4일 대 Db-DIII H464A의 경우 17시간이었으며, 이에 비해 Db 단독의 경우 2.9시간이었다. Db-DIII 융합 단백질(101 kDa)의 전체 크기는 신장 제거의 역치(약 60 kDa)보다 크다. 따라서, Db-DIII 단백질은 간담도 경로를 통해 제거되지만, Db(55 kDa)는 신장을 통해 제거된다. 따라서, Db와 Db-DIII 단백질 사이의 분자량 차이는 대개 MRT에서의 차이에 기인한다. 그러나, 생체내에서 Db-DIII PK가 단일 아미노산 돌연변이(동일한 분자량)를 통해 조절될 수 있다는 사실은 분자 크기의 증가와는 별도로 생체내에서 혈청 PK를 지배하는 추가의 분자 메커니즘(예를 들어, FcRn 상호작용)이 존재한다는 것을 시사한다. 또한, 돌연변이(H535A, H510A 또는 H464A)에 의해, 전체적인 단백질 혈청 체류 시간의 미세 조정이 가능하다. 수일 내지 수시간에 이르는 순환 반감기 범위로부터 선택할 수 있다. 이것은 특정 혈청 PK 요건을 갖는 진단제 또는 치료제를 선택할 때 유익하다.
영상 분석은, 종양 표적화를 유지하면서 Db의 순환 지속성을 증가시킬 수 있는 HSA DIII 도메인의 능력을 명백히 입증한다. 모든 Db-DIII 단백질이 Db 단독보다 유의적으로 더 긴 시간 동안 혈액 중에 잔존한다(P < 0.05). Db-DIII 융합 단백질을 주사한 마우스에 대해 혈액 중에 남아있는 방사능(%ID/g)을 직접 카운팅한 결과는 51시간째 Db를 주사한 마우스보다 50배(WT)～20배(H464A) 더 높았다. 종합적으로, 본 발명자들의 결론은, HSA DIII WT 및 돌연변이 단독이 이들이 부착된 부분의 혈청 체류 시간을 조정할 수 있다는 것을 시사한다. 혈액 제거의 DIII 순위는 실험적으로 결정된 Db-DIII 순서와 동일하게 유지되는 것으로 예상된다. DIII WT 역시 전체 HSA 분자가 T84.66 scFv에 대해 그러했던 것 (Yazaki et al., 2008)보다 약간 더 많이 Db의 혈청 지속성을 연장시킬 수 있었다. LS174T 이종이식 무흉선 누드 마우스에게 125I 표지 항CEA scFv-HSA 융합 단백질(약 90 kDa)을 주사한 후 48시간째, 혈액 중의 잔류 활성은 2.79 %ID/g였으며, 이에 비해 51시간째 124I 표지 Db-DIII WT의 경우 4.00 %ID/g이었다(표 2). 이러한 차이는 Db-DIII의 큰 분자량에 의해 설명이 가능하다. 그러나, 이것은 DIII이 전체 HSA 분자의 혈청 반감기를 유지하는 데 필요 충분 조건이라는 것을 시사한다. H464(DIIIa에 위치)는 FcRn 결합 및 순환 지속성에 큰 영향을 미치는 것으로 생각된다. 또한, H535A 및 H510A 돌연변이가 WT에 비해 유의적으로 더 빠른 혈액 제거를 보이기 때문에, 본 발명자들은 서브도메인 DIIIa 및 DIIIb가 둘 다 혈청 지속성 유지에 관여한다고 결론을 내릴 수 있다.
Db-DIII 단백질의 목적은, 제어된 PK를 갖는 단일 도메인 스캐폴드로서 사용하기 위한 HSA DIII의 잠재성을 규명하는 것이었다. 표적화 부분이 없는 DIII WT 및 변이체의 발현과 생체내에서의 PK 평가는 영상화 또는 치료 용도에 최적인 특성을 나타내는 DIII 스캐폴드의 선택을 위한 다음 단계이다. 본 연구에 기재된 DIII 스캐폴드는 종양 표적화 분자(펩티드, 압타머, 소형 화학 분자)의 그래프팅 또는 화학적 접합을 위해, 또는 디스플레이 조합 라이브러리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 영상화를 위해 적절한 PK를 갖는 표적화된 스캐폴드는 진단 목적에 사용될 수 있다. 대안으로, 잠재적 항종양제를 암 치료를 위한 최적 특성을 갖는 표적화된 스캐폴드에 접합시킬 수 있다.
실시예 2
Alexa Fluor 647 접합 DIII 단백질을 사용한 결합 연구
Alexa Fluor 647 단백질 표지화 키트(Invitrogen, Eugene, OR)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 형광단 Alexa Fluor 647(1.25 kDa)을 HSA, DIII WT, H535A, H510A 및 H464A 단백질에 접합시켰다. 0.316～3160 nM의 각각의 형광 단백질 희석액(삼중으로)을 둥근 바닥 96웰 플레이트에서 pH 6.5로 인간 EcRn을 발현하는 포화 상태의 293 인간 배아 신장 세포(Petkova et al., Int Immunol. 2006;18:1759-1769)와 함께 인큐베이트하였다. Alexa Fluor 647 접합 HSA도 또한 FcRn 발현이 없는 293 세포와 함께 인큐베이트하였다(대조군 반응). 1x PBS(pH 6.5)를 사용한 세척 단계 후, 암적색(671～705 nm) 여기 및 적색(700 nm 롱패스) 발광 필터를 이용하여 MaestroTM In-Vivo Fluorescence Imaging System(CRi, Woburn, MA)에 의해 세포를 영상화하였다. 각 웰에서 동일한 크기의 관심있는 부위(ROI)를 선택하여 형광 신호를 측정하고 각 희석액에 대해 평균하였다. Alexa-Fluor 647 접합 DIII 단백질 농도의 함수로서 평균 형광으로 결합 곡선을 생성하였다. 50% 형광이 측정디는 DIII 농도는 FcRn에 대한 DIII 단백질 상대 결합 친화성을 의미하였다(도 6 참조).
인간 FcRn에 대한 DIII 단백질의 결합
도 7은 형광단 접합 HSA 및 DIII 단백질의 결합 곡선을 도시한다. 더 왼쪽으로 이동한 곡선(HSA 및 DIII WT)은 상대 결합 친화도 100 nM로 FcRn 발현 293 세포에 대해 더 강한 결합력을 나타내고, 그 다음으로 DIII H535A 및 H510A(각각 약 200 및 300 nM)이며, DIII H464A가 약 1 μM의 가장 낮은 결합 친화도를 나타내었다. Alexa Fluor 647 접합 HSA는 293 세포(FcRn 없음)에 결합하지 않았으며, 따라서, FcRn과의 특이적 상호작용을 시사한다. 세포 결합 연구에 기초할 때, 높은 것부터 낮은 것 순서로 인간 FcRn에 대한 결합 친화력 순서는 다음과 같다: HSA > DIII WT > DIII H535A > DIII H510A > DIII H464A.
마우스에서의 DIII 단백질의 순환 반감기
HAA 및 DIII 단백질에 대한 131I 표지화 효율은 39.6～93.6%였으며, 주사된 비활성은 1.5～3.1 μCi/mg이었다. 완전한 HSA 및 모든 DIII 단백질의 혈액 활성 곡선(도 10)은 DIIIa 및 DIIIb가 추가된 Db-DIII 융합 단백질에서 관찰되는 것과 동일한 제거 순서를 보인다. 또한, HSA 및 DIII 단백질의 FcRn에 대한 상대 결합 친화력의 감소(도 7)는 순환 지속성 감소에 비례한다. 하기 표 3은 혈액 반감기의 추정값을 요약하고 있다. 혈액 제거 순서는, 느린 것부터 빠른 것 순서로 다음과 같다: HSA > DIII WT > DIII H535A > DIII H510A > DIII H464A > DIIIa > DIIIb. 제거 속도가 가장 느린 단백질(DIII WT)에서 가장 빠른 단백질(DIIIb)까지의 느린 단계(β) 반감기 범위는 약 2배이며, 이때 t1/2β는 15.3～6.9시간이다. 이러한 순환 체류 시간 스펙트럼은 원하는 용도(예를 들어, 치료, 영상화)에 최적으로 맞출 수 있는 DIII 플랫폼을 선택할 수 있게 한다.
Figure pct00003
실시예 3
압타머 분자의 생성 및 선택된 DIII 스캐폴드로의 접합
뉴클레아제 내성 피리미딘 2'-플루오로 UTP 및 2'F CTP를 포함하는 변형된 표적 특이적 압타머를, T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 보유하는 이중 가닥 DNA 주형의 런오프(runoff) 전사에 의해 생성할 수 있다. 전사 반응은 Y639F 돌연변이 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 수행할 수 있다. 반응에 사용된 뉴클레오티드는 ATP, GTP, 2'F dCTP 및 2'F dUTP로 이루어진다. 압타머의 DIII 스캐폴드로의 접합을 위해, 숙신이미딜 6-하이드라지노니코틴아미드 아세톤 하이드라존(SANH)을 DIII 스캐폴드 라이신 잔기와 반응시킬 수 있다(하기 그림 참조). 2개 분자 사이의 비스-아릴 하이드라존 결합은 354 nm에서 UV로 추적이 가능하며, 따라서 접합 비를 분광분석적으로 측정할 수 있다. 정제 후, 모든 접합 생성물을 시험관내(세포)에서, 그 후 생체내(이종이식 마우스)에서 표적에 결합하는 능력에 대해 평가할 수 있다.
압타머의 스캐폴드 DIII(●으로 표시됨)로의 접합 화학. 비반응 SANH를 제거하기 위해 제1 반응 단계 후에 탈염 단계가 필요하다.
Figure pct00004
표적 특이적 펩티드 또는 다른 단백질의 생체접합은 2개의 헤테로이작용성 링커를 사용함으로써 수행한다. 하나는 방향족 하이드라진[6-하이드라지노니코틴아미드(HyNic)]이고, 그 펩티드 또는 단백질의 C 말단 또는 N 말단에서 합성된다. 다른 하나는 DIII 단백질 상의 임의의 라이신(K) 잔기에 부착된 방향족 알데하이드[4-포르밀벤즈아미드(4FB)]이다. 4FB 도입 공정을 DIII의 "변형"이라 칭한다. 변형되면, 작용기화된 DIII 및 펩티드 분자를 탈염하여 과잉 링커를 제거하고 접합에 적합한 완충제 시스템 중의 생체분자로 치환한다. 그 후, 2개의 변형된 생체분자를 서로 혼합하며, 접합은 열 안정성이 있고, 또 A354nm에서 분광광도계로 측정할 수 있는 2개 종 사이의 비스-아릴 하이드라존 결합 형성을 통해 일어난다. 그 후, 펩티드/DIII 비를 계산한다. SoluLink(San Diego, CA)로부터 상업적으로 이용 가능한 시약을 이 접합 반응을 완료하는 데 사용할 수 있다.
실시예 4
항CEA 펩티드-DIIIb 접합체의 평가:
CEA 특이적 환형 펩티드(SDWVCEFIKSQWFCNVLASG, Kd = 160 nM)를, C 말단에 HyNic 기(SoluLink)를 이용하여 상업적으로 합성하였다. 수용액에 용해시킬 경우, 펩티드는 침전되었다. 수용해도 부족은 바로 이 펩티드를 생체내 용도에 부적합하게 한다. 접합 전에, HyNic 변형 펩티드를 디메틸 포름아미드(DMF) 유기 용매에 용해시켰다. SoluLink가 제공하는 프로토콜에 따라, 정제된 DIIIb를, 임의의 라이신 잔기에 4FB 부분을 도입함으로써 변형시켰다. 접합 후, A354nm를 측정하여 모든 DIIIb 분자에 대해 평균 2 CEA 특이적 펩티드가 되도록 하는 펩티드/DIII 비를 결정하였으며, 접합체는 수용액에 가용성이었다. Superdex 200 컬럼(GE Healthcare Piscataway, NJ)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피를 정제에 이용하였다. 그 후, 정제된 항CEA 펩티드-DIIIb 접합체를 124I로 방사성 표지하고, LS174T(CEA 양성) 및 C6(CEA 음성) 종양을 보유한 4마리의 무흉선 누드 마우스에 정맥내 주사하였다. 4시간, 20시간 및 27시간째, 마우스를 소형 동물 PET/CT로 영상화한 후, 안락사시키고, 해부하여, 조직/장기를 감마 웰 카운터로 카운팅하였다. 하기 표 4에 주사 후 27시간째의 그램당 퍼센트 주사 용량(%ID/g) 계산값을 기재하였다.
PET/CT 이미지(도 10)는 CEA 양성 종양을 표적화할 수 있는 펩티드-DIIIb 접합체의 능력을 입증한다. 높은 순환 활성이 확인되며, 이는 종양 표적화 펩티드의 순환 반감기를 연장시킬 수 있는 DIIIb의 능력이 유지됨을 시사한다. 그러나, 표적화 부분(펩티드)은 표적에 효율적으로 결합할 수 없어서, 펩티드-DIIIb 접합체의 분해를 초래하여 이것을 순환계로 다시 되돌린다. 이는 LS174T 종양 흡수율이 비교적 낮고 주사 후 27시간째의 높은 혈액 활성을 보여주는 생체분포 데이터(표 4)에 의해 확인된다.
Figure pct00005
5.1의 종양/근육 비는 허용 가능하고, 항체 영상화와 유사하다. 종양/혈액 및 (CEA 양성)종양/(CEA 음성) 종양 비는 비교적 낮으며(각각 0.51 및 1.2), 이는 혈액 중에서의 높은 활성과 감소된 종양 표적화를 나타내는 것이다. 이러한 관찰은, 접합체가 혈액 중에 충분히 오랫동안 유지되나(DIIIb 기능), 이 펩티드는 표적(LS174T 종양에 의해 발현된 CEA)에 결합하는 데에는 능숙하지 않다는 것을 다시 한번 시사한다. 본 발명자들은, 결합력(avidity)만으로는 불충분한 친화력(affinity)을 보충할 수 없기 때문에, 더 높은 친화도(예를 들어, Kd < 10 nM)를 갖는 펩티드가 DIII에의 접합에 대한 영상화에 바람직하다는 결론을 내린다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
본원에 기재된 실시예와 구체예는 단지 예시를 목적으로 하는 것이며, 그것에 비추어 다양한 변경 또는 수정이 당업자에게 시사될 것이고 본 출원 및 첨부된 청구범위의 정신 및 범위에 포함될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

Claims (38)

  1. a) 인간 혈청 알부민의 도메인 III, 도메인 IIIa 또는 도메인 IIIb, 또는 상기 도메인 III, 상기 도메인 IIIa 또는 상기 도메인 IIIb에 실질적인 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 스캐폴드;
    b) 상기 단백질 스캐폴드에 공유 결합된 표적화 부분; 및
    c) 상기 단백질 스캐폴드에 공유 결합된 치료성 부분 또는 영상화 부분
    을 포함하는 구성체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적화 부분이 표적 조직 또는 세포의 수용체에 결합하는 리간드인 구성체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 표적화 부분이 종양 특이적 항원에 결합하는 항체 또는 이것의 면역학적 활성 단편인 구성체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체가 항체의 면역학적 활성 단편, 디아바디, 트리아바디 또는 미니바디인 구성체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표적화 부분이 압타머인 구성체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 압타머가 종양 특이적 항원에 결합하는 것인 구성체.
  7. 제2항에 있어서, 상기 리간드가 표적 조직 또는 세포에서 과발현되는 단백질에 결합하는 것인 구성체.
  8. 제2항에 있어서, 상기 표적 조직 또는 세포가 암인 구성체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 표적화 부분, 영상화 부분 또는 치료성 부분 중 하나 이상이 비펩티드 링커에 의해 상기 스캐폴드에 공유 결합되는 것인 구성체.
  10. 제1항에 있어서, 실질적인 동일성이 90%인 구성체.
  11. 제1항에 있어서, 실질적인 동일성이 95%인 구성체.
  12. 제1항에 있어서, 상기 표적화 부분, 영상화 부분 또는 치료성 부분 중 하나 이상이 헤테로이작용성 크로스링커, 호모이작용성 크로스링커, 길이가 0인(zero-length) 크로스링커, 디설파이드 결합, 또는 생리학적으로 절단 가능한 크로스링커에 의해 상기 스캐폴드에 공유 결합되는 것인 구성체.
  13. 제1항에 있어서, 상기 표적화 부분이 2～20개 원자 길이의 링커에 의해 상기 스캐폴드에 공유 결합되는 것인 구성체.
  14. 제1항에 있어서, 상기 영상화 부분 또는 치료성 부분이 2～20개 원자 길이의 링커에 의해 상기 스캐폴드에 결합되는 것인 구성체.
  15. 제1항에 있어서, 분자량이 40 kDa 미만인 구성체.
  16. 제1항에 있어서, 분자량이 30 kDa 미만인 구성체.
  17. 제1항에 있어서, 분자량이 20 kDa 미만인 구성체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 III이 야생형이거나 H535, H510 또는 H464에서의 돌연변이를 갖는 것인 구성체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 돌연변이가 H535A, H510A 또는 H464A인 구성체.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 스캐폴드가 도메인 III, 도메인 IIIa 또는 도메인 IIIb로 필수적으로 구성되는 것인 구성체.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 부분이 펩티드 결합에 의해 상기 스캐폴드에 연결되는 것이 아닌 것을 조건으로 하는 구성체.
  22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영상화 부분 및 치료성 부분이 펩티드 결합에 의해 상기 스캐폴드에 연결되는 것이 아닌 것을 조건으로 하는 구성체.
  23. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제를 포함하는 것인 구성체.
  24. 제23항에 있어서, 치료성 부분이 약물인 구성체.
  25. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료성 부분이 치료성 방사성 핵종, 세포독성 약물, 사이토카인, 화학요법제, 방사선 감작제 또는 효소인 구성체.
  26. 제25항에 있어서, 복수의 치료성 부분이 상기 스캐폴드에 공유 결합되는 것인 구성체.
  27. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 영상화제를 포함하는 것인 구성체.
  28. 제27항에 있어서, 상기 영상화제가 방사성 핵종, 반자성 물질, 형광 마커, 색원체, 양자점, 나노입자 및 생물발광 효소로 구성된 군에서 선택되는 것인 구성체.
  29. 제27항에 있어서, 복수의 영상화제가 상기 스캐폴드에 공유 결합되는 것인 구성체.
  30. 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 피험체에게 제27항의 구성체를 투여하는 것을 포함하는, 피험체의 질환 또는 병태와 관련된 생체분자를 검출하는 방법으로서, 상기 구성체의 표적화 부분이 생체분자에 결합하고, 상기 구성체의 영상화제가 검출되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 질환 또는 병태의 존부를 진단하는 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 생체분자가 종양 특이적 항원이고, 상기 질환 또는 병태가 암인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 상기 생체분자가 상기 병태를 갖는 피험체의 세포에서 과발현 또는 저발현되는 세포 표면 수용체 또는 단백질인 방법.
  34. 조직 내 생체분자의 과발현의 존재와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 질환 또는 병태를 갖는 피험체에게 치료적 유효량의 제23항의 구성체를 투여하는 것을 포함하며, 상기 구성체의 표적화 부분이 상기 생체분자에 결합하고, 치료제가 상기 질환 또는 병태를 치료하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 표적화 부분이 암의 종양 특이적 항원에 결합하고, 상기 질환 또는 병태가 암이며, 상기 치료제가 치료성 방사성 핵종, 세포독성 약물, 사이토카인 또는 화학요법제인 방법.
  36. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 구성체 및 생리학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약학적 또는 진단용 조성물.
  37. 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 구성체의 용도.
  38. 질환 또는 병태를 검출하기 위한 진단제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 구성체의 용도.
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