ES2805361T3

ES2805361T3 - Diseño y construcciones de andamios de heteromultímeros multivalentes

Info

Publication number: ES2805361T3
Application number: ES13816831T
Authority: ES
Inventors: Surjit Dixit; Igor Edmondo D'angelo; Mario Sanches; Gordon Yiu Kon Ng
Original assignee: Zymeworks Inc Canada
Current assignee: Zymeworks BC Inc
Priority date: 2012-07-13
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2021-02-11
Anticipated expiration: 2033-07-12
Also published as: HK1212615A1; DK2906237T3; EP2906237A2; EP2906237A4; EP2906237B8; EP2906237B1

Abstract

Un heteromultímero que comprende: una primera construcción de polipéptido que comprende un primer polipéptido transportador y al menos una primera molécula de carga, opcionalmente donde la primera molécula de carga es un polipéptido de carga, opcionalmente donde la primera construcción de polipéptido comprende dos primeros polipéptidos de carga; y una segunda construcción de polipéptido que comprende un segundo polipéptido transportador; y donde dichos primer y segundo polipéptidos transportadores se obtienen por segmentación de un polipéptido de albúmina que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 en un sitio de segmentación, y donde la ubicación del sitio de segmentación es: (a) entre los residuos 339 y 340 de la SEQ ID NO:1; o (b) entre los residuos 300 y 301 de la SEQ ID NO:1; o (c) entre los residuos 364 y 365 de la SEQ ID NO:1; o (d) entre los residuos 441 y 442 de la SEQ ID NO:1; o (e) entre los residuos 171 y 172 de la SEQ ID NO:1; o (f) entre los residuos 281 y 282 de la SEQ ID NO:1; o (g) después del residuo 83 y antes del residuo 85 de la SEQ ID NO:1 y el residuo 84 es eliminado; donde la numeración de los residuos comienza con el primer residuo después de la secuencia de señal, y donde dicho primer polipéptido transportador es diferente de dicho segundo polipéptido transportador, y dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar una estructura cuasi-nativa de la forma monomérica de dicho polipéptido de albúmina.

Description

DESCRIPCIÓN

Diseño y construcciones de andamios de heteromultímeros multivalentes

Campo de la Invención

El campo de la invención es el diseño racional de un andamio para el desarrollo personalizado de bioterapéuticos.

Descripción de la Técnica Relacionada

En el ámbito de las proteínas terapéuticas, los anticuerpos con sus características de unión a dianas multivalentes son andamios excelentes para el diseño de candidatos a fármacos. Avanzando aún más en estas características, los anticuerpos biespecíficos diseñados y otras terapias multiespecíficas fusionadas exhiben especificidades de diana duales o múltiples y una oportunidad para crear fármacos con modos de acción novedosos. El desarrollo de tales proteínas terapéuticas multiespecíficas y multivalentes con farmacocinética y actividad funcional favorables ha constituido un desafío.

La albúmina sérica humana (HSA o HA), una proteína de 585 aminoácidos en su forma madura, es responsable de una proporción significativa de la presión osmótica del suero y también funciona como vehículo de ligandos endógenos y exógenos. El papel de la albúmina como molécula vehículo y su naturaleza estable son propiedades deseables para su uso como vehículo y transportador de polipéptidos in vivo.

La albúmina de suero humano posee muchas características deseables. La HSA se encuentra en todo el cuerpo, pero más específicamente en el espacio intersticial y en la sangre a concentraciones séricas de 40 g/L, que es equivalente a 0,7 mM (Yeh y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1904-1908 (1992)). La HSA se considera la proteína más abundante del suero y es responsable de mantener la osmolaridad. La HSA tiene propiedades farmacocinéticas favorables y se elimina muy lentamente por el hígado y el riñón mostrando vidas medias in vivo de hasta varias semanas (Yeh y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1904-1908 (1992); Waldmann, TA, Albumin Structure, Function and Uses, págs. 255-273 (1977); Sarav y col., J Am Soc Nephrol 20: 1941-1952 (2009)). La HSA carece de actividad enzimática y antigenicidad, lo que elimina los efectos secundarios potencialmente indeseables. La HSA actúa como vehículo de ligandos endógenos y exógenos. También se sabe que la HSA penetra y se retiene en el intersticio de tumores (ver Elsadek y Kratz, J. Control. Release (2012) 157:4-28). La albúmina se ha propuesto como un vehículo farmacológico para proteínas terapéuticas (ver Kratz, J. Control. Release (2008) 132: 171-183) combinadas, estas características se pueden extender, al menos parcialmente, a la proteína de fusión basada en albúmina. Las pobres propiedades farmacocinéticas mostradas por las proteínas terapéuticas se pueden eludir.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Un objeto de la presente invención es proporcionar andamios de heteromultímeros multivalentes y procedimientos para diseñarlos.

En un aspecto de la invención, se proporciona un heteromultímero que comprende: una primera construcción de polipéptido que comprende un primer polipéptido transportador y al menos una primera molécula de carga, opcionalmente donde la primera molécula de carga es un polipéptido de carga, opcionalmente donde la primera construcción de polipéptido comprende dos primeros polipéptidos de carga; y una segunda construcción de polipéptido que comprende un segundo polipéptido transportador; y donde dichos primer y segundo polipéptidos transportadores se obtienen por segmentación de un polipéptido de albúmina que tiene la secuencia de SEQ ID NO:1 en un sitio de segmentación, y donde la ubicación del sitio de segmentación es:

(a) entre los residuos 339 y 340 de la SEQ ID NO:1; o

(b) entre los residuos 300 y 301 de la SEQ ID NO:1; o

(c) entre los residuos 364 y 365 de la SEQ ID NO: 1; o

(d) entre los residuos 441 y 442 de la SEQ ID NO: 1; o

(e) entre los residuos 171 y 172 de la SEQ ID NO:1; o

(f) entre los residuos 281 y 282 de la SEQ ID NO: 1; o

(g) después del residuo 83 y antes del residuo 85 de la SEQ ID NO:1 y el residuo 84 es eliminado;

donde la numeración de residuos comienza con el primer residuo después de la secuencia de señal, y donde dicho primer polipéptido transportador es diferente de dicho segundo polipéptido transportador, y dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar una estructura cuasi-nativa de la forma monomérica de dicho polipéptido de albúmina.

Otro aspecto descrito en esta invención es un heteromultímero que comprende: una primera construcción de polipéptido que comprende (i) un primer polipéptido transportador; y (ii) al menos un primer polipéptido de carga que es una construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a CD3, CD19, CD20, HER2 o HER3, y una segunda construcción de polipéptido que comprende (iii) un segundo polipéptido transportador; y (iv) al menos un segundo polipéptido de carga donde cada uno de dichos polipéptidos transportadores primero y segundo comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 % de identidad con un segmento de un polipéptido de albúmina; y donde dichos primer y segundo polipéptidos transportadores se obtienen por segmentación de dicho polipéptido de albúmina en un sitio de segmentación, donde dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar una estructura cuasi-nativa de la forma monomérica de dicho polipéptido de albúmina.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica el heteromultímero de la invención.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un heteromultímero de la invención y un adyuvante.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para tratar el cáncer que comprende proporcionar a un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la invención.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para inhibir el crecimiento de un tumor, que comprende poner en contacto el tumor con una cantidad efectiva de un heteromultímero de la invención.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para reducir un tumor, que comprende poner en contacto el tumor con una cantidad efectiva de un heteromultímero de la invención.

Otro aspecto descrito en esta invención es un procedimiento de diseño de polipéptidos autoasociantes a partir de una proteína de interés que comprende: segmentar dicha proteína en al menos un sitio de segmentación para obtener al menos dos segmentos de polipéptidos de manera que dichos segmentos de polipéptidos se autoensamblen para formar un heteromultímero, donde dicho heteromultímero forma una estructura monomérica cuasi-nativa de dicha proteína, el procedimiento comprendiendo las etapas de seleccionar al menos un lazo de la proteína de interés que tiene un área de superficie accesible al solvente alta y contacto limitado con el resto de la estructura de dicha proteína, e introduciendo un sitio de segmentación por lazo seleccionado, dando como resultado una interfaz complementaria entre los al menos dos segmentos de polipéptidos, donde la interfaz es apolar, extensa e interdigitada.

En otro aspecto, se proporciona un heteromultímero diseñado por un procedimiento de la invención.

En otro aspecto, se proporciona un andamio terapéutico que comprende un heteromultímero diseñado por un procedimiento de la invención.

En esta invención se proporcionan heteromultímeros multifuncionales de la invención y procedimientos para diseñarlos. En ciertas realizaciones, son heteromultímeros, cada heteromultímero que comprende: al menos una primera construcción de polipéptido que comprende al menos una molécula de carga, y un primer polipéptido transportador; y al menos una segunda construcción de polipéptido que comprende al menos una molécula de carga y un segundo polipéptido transportador; donde los polipéptidos transportadores se derivan por segmentación de una proteína tal que dichos polipéptidos transportadores se autoensamblen para formar una estructura cuasi-nativa de dicha proteína o análogo de la misma. En ciertas realizaciones, al menos una molécula de carga es un fármaco o un agente terapéutico. En ciertas realizaciones, más de una molécula de carga de la misma naturaleza está presente en el polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, al menos una molécula de carga es una biomolécula. En una realización, la al menos una biomolécula es un ADN, ARN, ANP o polipéptido. En una realización, al menos una molécula de carga es un polipéptido. En ciertas realizaciones, cada polipéptido transportador es inestable y forma preferentemente un heteromultímero con al menos otro polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, cada polipéptido transportador es estable y forma preferentemente un heteromultímero con al menos otro polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, la interfaz de heteromultimerización comprende al menos un enlace disulfuro. En ciertas realizaciones, la interfaz de heteromultimerización no comprende un enlace disulfuro.

En ciertas realizaciones es un heteromultímero que comprende: al menos dos construcciones de polipéptidos, cada construcción de polipéptidos comprende al menos un polipéptido de carga unido a un polipéptido transportador, donde dichos primer y segundo polipéptidos transportadores se obtienen por segmentación de un polipéptido de albúmina que tiene la secuencia de SEQ ID NO:1 en un sitio de segmentación, y donde la ubicación del sitio de segmentación es:

(a) entre los residuos 339 y 340 de la SEQ ID NO: 1; o

(b) entre los residuos 300 y 301 de la SEQ ID NO:1; o

(c) entre los residuos 364 y 365 de la SEQ ID NO: 1; o

(d) entre los residuos 441 y 442 de la SEQ ID NO: 1; o

(e) entre los residuos 171 y 172 de la SEQ ID NO:1; o

(f) entre los residuos 281 y 282 de la SEQ ID NO: 1; o

donde la numeración de residuos comienza con el primer residuo después de la secuencia de señal,

y donde dicho primer polipéptido transportador es diferente de dicho segundo polipéptido transportador, y dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar una estructura cuasi-nativa de la forma monomérica de dicho polipéptido de albúmina. En ciertas realizaciones, el heteromultímero es un heterodímero. En una realización, el heteromultímero es biespecífico. En una realización, el heteromultímero es multiespecífico. En ciertas realizaciones, el heteromultímero es bivalente. En una realización, el heteromultímero es multivalente En una realización, el heteromultímero es multifuncional.

En algunos aspectos descritos en esta invención, los polipéptidos transportadores son derivados de una proteína anexina. En un aspecto, los polipéptidos transportadores se derivan de diferentes proteínas anexinas. En ciertos aspectos, los polipéptidos transportadores se derivan de la misma proteína anexina. En un aspecto, al menos un polipéptido transportador se deriva de Anexina A1 o lipocortina I. En ciertos aspectos del heteromultímero, todos los polipéptidos transportadores se derivan de Anexina A1 de SEQ ID NO: 14. En ciertos aspectos del heteromultímero, al menos un polipéptido transportador se deriva de una secuencia homóloga a la SEQ ID NO: 14. En un aspecto, al menos un polipéptido transportador se deriva de Anexina A2 o anexina II. En ciertos aspectos del heteromultímero, todos los polipéptidos transportadores se derivan de Anexina A2 o lipocortina II. En un aspecto, al menos un polipéptido transportador se deriva de proteína semejante a Anexina. En ciertas realizaciones del heteromultímero, todos los polipéptidos transportadores se derivan de proteína semejante a Anexina. En una realización, al menos un polipéptido transportador se deriva del grupo que comprende Anexina A1-Anexina A7. En una realización del heteromultímero descrito en esta invención, todos los polipéptidos transportadores se derivan del grupo que comprende Anexina A1-Anexina A7. SEQ ID No.-14. En ciertos aspectos, el primer polipéptido transportador basado en anexina tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 15, y el segundo polipéptido transportador basado en anexina tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 16.

En algunos aspectos descritos en esta invención, los polipéptidos transportadores son derivados de transferrina. En un aspecto, al menos un polipéptido transportador se deriva de transferrina. En ciertos aspectos del heteromultímero, al menos un polipéptido transportador se deriva de transferrina de SEQ ID NO: 19 o análogo de la misma. En ciertos aspectos del heteromultímero, al menos un polipéptido transportador se deriva de una secuencia de polipéptidos homóloga a la transferrina. En ciertos aspectos del heteromultímero descrito en esta invención, al menos un polipéptido transportador se deriva de apo-transferrina. En ciertos aspectos, el primer polipéptido transportador basado en transferrina tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 15 y el segundo polipéptido transportador basado en transferrina tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 16.

En ciertas realizaciones del heteromultímero, al menos una molécula de carga es un polipéptido de carga. En una realización del heteromultímero descrito en esta invención, todas las moléculas de carga son polipéptidos de carga. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de carga son proteínas terapéuticas o fragmentos o variantes de las mismas. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de carga son antígenos o fragmentos o variantes de los mismos. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de carga son receptores de antígeno o fragmentos o variantes de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido de carga es un anticuerpo, un dominio de anticuerpos, un ligando o un receptor que se une a un polipéptido diana. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de carga se fusiona con el polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, al menos un polipéptido de carga está unido al extremo N del polipéptido transportador. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de carga está unido al extremo C del polipéptido transportador. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de carga está unido químicamente al polipéptido transportador. En algunas realizaciones de los heteromultímeros descritos en esta invención, al menos un polipéptido de carga comprende GLP-1 o fragmento o variante del mismo. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de carga comprende glucagón o fragmento o variante del mismo. En una realización, al menos un polipéptido de carga comprende un dominio similar a EGF-A.

En esta invención se describen heteromultímeros, cada heteromultímero comprende: al menos una primera construcción de polipéptido que comprende al menos un polipéptido de carga y un primer polipéptido transportador; y al menos una segunda construcción de polipéptidos que comprende al menos un polipéptido de carga y un segundo polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, el heteromultímero es un heterodímero. En una realización, el heteromultímero es multiespecífico. En una realización, el heteromultímero es biespecífico. En ciertas realizaciones del heteromultímero, los polipéptidos transportadores son derivados de la misma proteína. En ciertas realizaciones, los polipéptidos transportadores son derivados de albúmina. En ciertas realizaciones del hetermultímero descrito en esta invención, los polipéptidos transportadores se derivan de la albúmina de suero humano de la SEQ ID No 1. En ciertos aspectos, los polipéptidos transportadores son derivados de una anexina. En un aspecto, los polipéptidos transportadores son derivados de Anexina A2. En algunos aspectos, los polipéptidos transportadores son derivados de transferrina.

En ciertas realizaciones, son heteromultímeros, cada heteromultímero comprende: al menos una primera construcción de polipéptido que comprende al menos un polipéptido de carga y un primer polipéptido transportador que comprende un primer segmento de albúmina de suero humano; y al menos una segunda construcción de polipéptidos que comprende al menos un polipéptido de carga y un segundo polipéptido transportador que comprende un segundo segmento de albúmina de suero humano; donde dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar una estructura cuasi-nativa de albúmina o análogo de la misma. En ciertas realizaciones, el primer y el segundo segmento de albúmina de suero humano son de regiones no superpuestas de la proteína.

En ciertos aspectos descritos en esta invención son heteromultímeros, cada heteromultímero comprende: al menos una primera construcción de polipéptido que comprende al menos un polipéptido de carga y un primer polipéptido transportador que comprende una secuencia de ^sE^qID NO:2; y al menos una segunda construcción de polipéptidos que comprende al menos un polipéptido de carga, y un segundo polipéptido transportador que comprende una secuencia de SEQ ID NO:3. En ciertos aspectos, son heteromultímeros, cada heteromultímero comprende: al menos una primera construcción de polipéptidos que comprende al menos un polipéptido de carga y un primer polipéptido transportador que comprende una secuencia de SEQ ID NO:8; y al menos una segunda construcción de polipéptidos que comprende al menos un polipéptido de carga y un segundo polipéptido transportador que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 10. En ciertos aspectos del heteromultímero descrito en esta invención, al menos un polipéptido transportador se deriva de aloalbúminas. En ciertos aspectos, ambos polipéptidos transportadores se derivan de aloalbúminas. En ciertos aspectos, todos los polipéptidos transportadores son derivados de la misma aloalbúmina. En algunos aspectos, los polipéptidos transportadores son derivados de diferentes aloalbúminas. En algunos aspectos, cada polipéptido transportador es un derivado de aloalbúmina basado en una aloalbúmina seleccionada de la Tabla 2. En ciertos aspectos, la primera construcción de polipéptido comprende dos polipéptidos de carga. En algunos aspectos, la segunda construcción de polipéptidos comprende dos polipéptidos de carga. En algún aspecto, al menos una de las construcciones de polipéptidos está diseñada mediante la introducción de mutaciones. En ciertos aspectos, las mutaciones introducidas mejoran la funcionalidad de la construcción del polipéptido en comparación con la forma no mutada de la construcción. En ciertos aspectos, las mutaciones introducidas mejoran una o más de la estabilidad, la vida media y la formación de heteromultímeros del polipéptido transportador.

En esta invención se describe un heteromultímero que comprende: al menos una primera construcción de polipéptido que comprende (i) un primer polipéptido transportador; y (ii) al menos un polipéptido de carga y al menos una segunda construcción de polipéptido que comprende (iii) un segundo polipéptido transportador y (iv) al menos un polipéptido de carga; donde dichos polipéptidos transportadores se derivan de una proteína por segmentación de dicha proteína, cada polipéptido transportador comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 % de identidad con un segmento de dicha proteína, y donde dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar una estructura cuasi-nativa de dicha proteína.

En ciertos aspectos es un heteromultímero descrito en esta invención, donde los polipéptidos transportadores se derivan de una proteína por segmentación de dicha proteína, cada polipéptido transportador comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad con un segmento de dicha proteína.

En ciertos aspectos es un heteromultímero descrito en esta invención, donde los polipéptidos transportadores se derivan de una proteína por segmentación de dicha proteína, cada polipéptido transportador comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 99 % de identidad con un segmento de dicha proteína.

En ciertos aspectos descritos en esta invención, el heteromultímero es un heterodímero. En algunos aspectos, al menos un polipéptido transportador no se deriva de un anticuerpo. En aspectos ejemplares, cada polipéptido transportador es un derivado de albúmina. En algunos aspectos, al menos uno de dichos polipéptidos transportadores primero y segundo comprende al menos una mutación de un residuo de aminoácido a cistina de manera que dicha cisteína forma un enlace disulfuro con un residuo de cisteína en otro polipéptido transportador. En ciertos aspectos, dicho polipéptido transportador primero y segundo comprende al menos una mutación de un residuo de aminoácido a cistina de manera que dicha cisteína forma un enlace disulfuro con un residuo de cisteína en otro polipéptido transportador. En algunos aspectos se proporcionan heteromultímeros donde cada polipéptido transportador es un derivado de albúmina, comprendiendo el primer polipéptido transportador al menos una mutación seleccionada de entre A194C, L198C, W214C, A217C, L331^cy A335C. En algunos aspectos, el segundo polipéptido transportador es un derivado de albúmina que comprende al menos una mutación seleccionada de entre L331C, A335C, V343C, L346C, A350C, V455C y N458C.

En algunos aspectos se proporcionan heteromultímeros descritos en esta invención, donde dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 35 o análogo o variante de la misma, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 36 o análogo o variante de la misma. [En algunos aspectos, dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 37 o análogo o variante de la misma, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 38 o análogo o variante de la misma. En ciertas realizaciones, dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 39 o análogo o variante de la misma, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 40 o análogo o variante de la misma. En realizaciones ejemplares, dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 41 o análogo o variante de la misma, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 42 o análogo o variante de la misma. En ciertas realizaciones, dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 43 o análogo o variante de la misma, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 44 o análogo o variante de la misma. En ciertas realizaciones, dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 45 o análogo o variante de la misma, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 46 o análogo o variante de la misma. En ciertas realizaciones, dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 47 o análogo o variante de la misma, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 48 o análogo o variante de la misma. En ciertas realizaciones, dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 49 o análogo o variante de la misma, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 50 o análogo o variante de la misma. En ciertas realizaciones, dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 51, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 52.

En ciertas realizaciones del heteromultímero descrito en esta invención, al menos un polipéptido de carga se une a un antígeno diana, y donde dicho antígeno diana es al menos uno de la cadena a (CD25) de IL-2R, beta amiloide, anti-EpCAM, anti-CD3, CD16, CD20, CD22, CD23, CD3, CD4, CD52, CD80, CTLA-4, EGFR, EpCAM, proteína F de RSV, G250, glucoproteína IIB/IIIa R, HER2, HER2/neu R, HSP90, anticuerpo IgE, IL-12, IL-23, IL-1b, IL-5, IL-6, RANKL, TNF alfa, TNFR, VEGF-A, receptor de glucagón, receptor de GLP y receptor de LDL.

En esta invención se describen heteromultímeros, cada heteromultímero comprende: al menos una primera construcción de polipéptido que comprende al menos un polipéptido de carga y un primer polipéptido transportador; y al menos una segunda construcción de polipéptidos que comprende al menos un polipéptido de carga y un segundo polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, al menos un polipéptido de carga se selecciona de entre las proteínas enumeradas en la Tabla 2 o fragmentos, variantes o derivados de las mismas. En ciertas realizaciones, al menos un polipéptido de carga se selecciona de entre ligando, receptor o anticuerpo para una o más proteínas enumeradas en la Tabla 2, o fragmento, variante o derivado de dicho ligando, receptor o anticuerpo. En ciertas realizaciones, al menos un polipéptido de carga se dirige a un antígeno de superficie celular del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD40, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, Cd138, CD174, CD205 , CD227, CD326, CD340, MUC16, GPNMB, PSMA, Cripto, ED-B, TMEFF2, EphB2, EphA2, FAP, integrina, Mesotelina, EGFR, TAG-72, GD2, CAIX, 5T4. En ciertas realizaciones, son heteromultímeros, cada heteromultímero comprende: al menos una primera construcción de polipéptido que comprende al menos un polipéptido de carga y un primer polipéptido transportador; y al menos una segunda construcción de polipéptido que comprende al menos un polipéptido de carga y un segundo polipéptido transportador, donde al menos un polipéptido de carga es un anticuerpo, o fragmento o variante del mismo. En ciertas realizaciones, todos los polipéptidos de carga son anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido de carga es un anticuerpo que se une a una proteína enumerada en la Tabla 2. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo comprende la región de anticuerpo Fc o Fab o Fv. En alguna realización, el polipéptido de carga es una proteína que no es anticuerpo, como nanocuerpos, aficuerpo, maxicuerpo, adnectinas, anticuerpo de dominio, evicuerpo, proteínas repetidas de anquirina, anticalinas, camlides o una proteína ligando o un polipéptido que se une a una diana terapéuticamente relevante. En algunas realizaciones, el anticuerpo o sus fragmentos se derivan de una inmunoglobulina seleccionada de entre el grupo que consiste en IgG, IgA, IgD, IgE e IgM. En algunas realizaciones, la IgG es del subtipo seleccionado de entre IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgG4. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es multiespecífico.

En esta invención se describen heteromultímeros, cada heteromultímero comprende: al menos una primera construcción de polipéptido que comprende al menos un polipéptido de carga y un primer polipéptido transportador; y al menos una segunda construcción de polipéptidos que comprende al menos un polipéptido de carga y un segundo polipéptido transportador, donde al menos un polipéptido de carga es un anticuerpo terapéutico. En algunas realizaciones de los heteromultímeros descritos en esta invención, al menos un polipéptido de carga es un anticuerpo terapéutico o fragmento o variante del mismo, donde el anticuerpo se selecciona de entre abagovomab, adalimumab, alemtuzumab, aurograb, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, bevacizumab, briakinumab, canakinumab, catumaxomab, certolizumab pegol, certuximab, daclizumab, denosumab, efalizumab, galiximab, gemtuzumab ozagamicin, golimumab, ibritumomab tiuxetan, infliximab, ipilimumab, lumiliximab, mepolizumab, motavizumab, muromonab, mycograb, natalizumab, nimotuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, omalizumab , palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranizumab, reslizumab, rituximab, teplizumab, toclizumab, tositumomab, trastuzumab, Proxinium, Rencarex, ustekinumab y zalutumumab. En ciertas realizaciones, el anticuerpo terapéutico se une a un antígeno diana relacionado con la enfermedad, tal como antígeno de cáncer, antígeno de enfermedad inflamatoria o un antígeno de enfermedad metabólica. En ciertas realizaciones, el antígeno diana podría ser una proteína en una superficie celular y la célula podría pertenecer al grupo de células B, células T, células estromales, células endoteliales, células vasculares, células mieloides, células hematopoyéticas o células de carcinoma.

En esta invención se describen heteromultímeros, cada heteromultímero comprende: al menos una primera construcción de polipéptido que comprende al menos una molécula de carga, fragmento; y al menos una segunda construcción de polipéptido que comprende al menos una molécula de carga y un segundo polipéptido transportador, donde al menos un polipéptido de carga es una enzima, un inhibidor de enzima, una hormona, un polipéptido terapéutico, un antígeno, una radiotoxina y quimiotoxina que incluye pero no se limita a neurotoxinas , interferones, toxinas de fusión de citocinas y toxinas de fusión de quimiocinas, citocinas, proteínas de fusión de anticuerpos o variantes o fragmentos de las mismas. En algunas realizaciones de los heteromultímeros descritos en esta invención, al menos un polipéptido de carga comprende GLP-1 o fragmento o variante del mismo. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de carga comprende glucagón o fragmento o variante del mismo. En una realización, al menos un polipéptido de carga comprende un dominio similar a EGF-A. En ciertas realizaciones, la toxina es una inmunotoxina tal como Denileukin diftitox y una inmunotoxina Anti-CD22 tal como CAT-3888 y CAT-8015. En ciertas realizaciones, la toxina es saporin. En algunas realizaciones, la toxina es mitotoxina. En algunas realizaciones, la toxina es toxina de difteria. En algunas realizaciones, la toxina es la toxina botulínica tipo A. En algunas realizaciones, la toxina es ricina o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la toxina es una toxina de la familia de toxinas RTX.

En esta invención se describen heteromultímeros, cada heteromultímero comprende: al menos una primera construcción de polipéptido que comprende al menos un polipéptido de carga y un primer polipéptido transportador; y al menos una segunda construcción de polipéptidos que comprende al menos un polipéptido de carga y un segundo polipéptido transportador, donde el polipéptido de carga se une al polipéptido transportador mediante conjugación química, ligadura nativa, ligadura química, un enlace disulfuro o fusión directa o fusión través de un enlazador. En ciertas realizaciones, los enlazadores para unir moléculas de carga tales como polipéptidos de carga a polipéptidos transportadores se seleccionan de los enlazadores descritos en US5482858, US5258498 y US5856456, US2009060721, US6492123, US4946778, US5869620, US7385032, US5073627, US5108910, US7977457, US5856456, US7138497, US5837846, US5990275, EP1088888.

Se proporcionan en esta invención células huésped que comprenden ácido nucleico que codifica un heteromultímero descrito en esta invención. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la primera construcción de polipéptido y el ácido nucleico que codifica la segunda construcción de polipéptido están presentes en un solo vector. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la primera construcción de polipéptido y el ácido nucleico que codifica la segunda construcción de polipéptido están presentes en vectores separados.

Se proporciona en esta invención un procedimiento para fabricar un heteromultímero, donde dicho procedimiento comprende: cultivar una célula huésped descrita en esta invención de manera que el ácido nucleico que codifica un heteromultímero descrito en esta invención se exprese; y recuperar el heteromultímero del cultivo celular. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula procariota o una célula eucariota. En algunas realizaciones, la célula huésped es E. coli. En ciertas realizaciones, la célula huésped es una célula de levadura. En algunas realizaciones, la levadura es S. cerevisiae. En algunas realizaciones, la levadura es Pichia. En algunas realizaciones, la levadura es Pichia pastoris. En algunas realizaciones, la levadura es deficiente en glucosilación y/o deficiente en proteasa. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana. En algunas realizaciones, la célula huésped que expresa un heteromultímero descrito en esta invención es una célula de mamífero. En ciertas realizaciones, la célula de mamífero es una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula COS o una célula humana.

Se proporciona una composición farmacéutica que comprende un heteromultímero descrito en esta invención y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. También se proporcionan procedimientos para tratar a un individuo que padece una enfermedad o trastorno, dicho procedimiento comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de una formulación o composición farmacéutica descrita en esta invención. En ciertas realizaciones es un procedimiento para tratar el cáncer en un paciente, dicho procedimiento comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrito en esta invención. En algunas realizaciones es un procedimiento para tratar un trastorno inmune en un paciente, dicho procedimiento comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrito en esta invención. También se proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad infecciosa en un paciente, dicho procedimiento comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrito en esta invención. En ciertas realizaciones es un procedimiento para tratar un trastorno cardiovascular en un paciente, dicho procedimiento comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrito en esta invención. En ciertas realizaciones es un procedimiento para tratar un trastorno respiratorio en un paciente, dicho procedimiento comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrito en esta invención. En ciertas realizaciones es un procedimiento para tratar un trastorno metabólico en un paciente, dicho procedimiento comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrito en esta invención. En ciertas realizaciones es un procedimiento para tratar una o más de hiperplasia suprarrenal congénita, enfermedad de Gaucher, síndrome de Hunter, enfermedad de Krabbe, leucodistrofia metacromática, enfermedad de Niemann-Pick, fenilcetonuria (PKU), porfiria, enfermedad de Tay-Sachs y enfermedad de Wilson en un paciente, dicho procedimiento comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrito en esta invención. Se proporcionan procedimientos para tratar el cáncer que comprenden proporcionar a un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de la composición farmacéutica descrita en esta invención. En ciertas realizaciones es un procedimiento para inhibir el crecimiento de un tumor, que comprende poner en contacto el tumor con una cantidad efectiva del heteromultímero descrito en esta invención. En algunas realizaciones es un procedimiento para reducir un tumor, que comprende poner en contacto el tumor con una cantidad efectiva del heteromultímero descrito en esta invención.

Se proporciona un kit para detectar la presencia de un biomarcador de interés en un individuo, comprendiendo dicho kit (a) una cantidad de un heteromultímero descrito en esta invención, donde dicho heteromultímero comprende al menos un polipéptido de carga tal que dicho polipéptido de carga es capaz de unirse al biomarcador de interés; y (b) instrucciones de uso.

En esta invención se describen proteínas de heteromultímeros que comprenden al menos dos construcciones de polipéptidos, donde cada construcción de polipéptidos comprende al menos un polipéptido de carga, y un polipéptido basado en albúmina, de modo que dichas construcciones de polipéptidos se autoensamblan para formar el heteromultímero.

En ciertos aspectos, el polipéptido de carga se fusiona con el polipéptido transportador basado en albúmina o aloalbúmina. En algunos aspectos, el polipéptido de carga se fusiona con el polipéptido transportador basado en transferrina. En ciertos aspectos, el polipéptido de carga se fusiona con el polipéptido transportador basado en anexina. En algunos aspectos, la fusión está en el extremo N del polipéptido transportador. En ciertos aspectos, la fusión está en el extremo C del polipéptido transportador. En algunos aspectos, la fusión implica un enlazador de puente o una molécula espaciadora. En algunos aspectos, el polipéptido de carga está conjugado químicamente al polipéptido transportador. En ciertos aspectos, el polipéptido de carga se une al polipéptido transportador por medio de ligadura química o un enlace disulfuro.

En esta invención se proporcionan proteínas de heteromultímeros que comprenden al menos dos construcciones de polipéptidos, donde cada construcción de polipéptidos comprende al menos un polipéptido de carga, y un polipéptido transportador, de modo que dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar el heteromultímero En algunos aspectos, cada polipéptido transportador es un polipéptido basado en aloalbúmina, de modo que dichos polipéptidos basados en aloalbúmina se autoensamblan para formar el heteromultímero. En algunos aspectos, cada polipéptido transportador es un polipéptido basado en transferrina. En algunos aspectos, cada polipéptido transportador es un polipéptido basado en anexina. En ciertos aspectos, cada polipéptido transportador monomérico es inestable y forma preferentemente un heteromultímero con al menos otro polipéptido transportador.

En algunas realizaciones, un heteromultímero descrito en esta invención es un heterodímero. En algunas realizaciones, el polipéptido de carga es un anticuerpo, enzima, hormona, polipéptido terapéutico, antígeno, quimiotoxina, radiotoxina, citocina o una variante o fragmento de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido de carga de una construcción de polipéptido funciona en sinergia con el polipéptido de carga de otra construcción de polipéptido.

En esta invención se describen proteínas de heteromultímeros que comprenden al menos dos construcciones de polipéptidos, donde cada construcción de polipéptidos comprende al menos un polipéptido de carga, y un polipéptido basado en anexina, de modo que dichos polipéptidos basados en anexina se autoensamblan para formar el heteromultímero con una estructura cuasi-nativa de anexina monomérica o análogo de la misma. En algunos aspectos, la anexina es anexina A1. En algunos aspectos, un heteromultímero descrito en esta invención es un heterodímero. En algunas realizaciones, el polipéptido de carga es un anticuerpo, enzima, hormona, polipéptido terapéutico, antígeno, quimiotoxina, radiotoxina, citocina, ligando a un receptor,receptor o una variante o fragmento de los mismos. En algunos aspectos, el polipéptido de carga de una construcción de polipéptido funciona en sinergia con el polipéptido de carga de otra construcción de polipéptido. En algunos aspectos, el polipéptido de carga puede ser un agonista o antagonista del polipéptido de carga de otra construcción de polipéptido.

En esta invención se proporcionan proteínas heterodímeras que comprenden al menos dos proteínas de fusión monoméricas, donde cada proteína de fusión monomérica comprende al menos un polipéptido de carga fusionado a un polipéptido transportador derivado de albúmina de la invención, de modo que dichos polipéptidos derivados de albúmina se autoensamblen para formar el heterodímero multifuncional. En ciertas realizaciones, son proteínas heterodiméricas que comprenden un primer monómero que comprende al menos un polipéptido de carga fusionado a un polipéptido derivado de albúmina; y un segundo monómero que comprende al menos un polipéptido de carga fusionado a un polipéptido derivado de albúmina. En ciertas realizaciones, el al menos un polipéptido de carga del primer monómero es diferente del al menos un polipéptido de carga del segundo monómero. En ciertas realizaciones, el al menos un polipéptido de carga del primer monómero es el mismo que el al menos un polipéptido de carga del segundo monómero.

En ciertos aspectos descritos en esta invención son proteínas de heteromultímeros que comprenden al menos dos proteínas de fusión monoméricas, donde cada proteína de fusión monomérica comprende al menos un polipéptido de carga fusionado a un polipéptido derivado de aloalbúmina, de modo que dichos polipéptidos derivados de aloalbúmina se autoensamblan para formar el heteromultímero multifuncional. En ciertos aspectos son proteínas de heteromultímeros que comprenden al menos dos proteínas de fusión monoméricas, donde cada proteína de fusión monomérica comprende al menos un polipéptido de carga fusionado a un polipéptido derivado de transferrina, de modo que dichos polipéptidos derivados de transferrina se autoensamblan para formar el heteromultímero. En ciertos aspectos son proteínas de heteromultímeros que comprenden al menos dos proteínas de fusión monoméricas, donde cada proteína de fusión monomérica comprende al menos un polipéptido de carga fusionado a un polipéptido derivado de anexina, de modo que dichos polipéptidos derivados de anexina se autoensamblan para formar el heteromultímero. En ciertos aspectos, la anexina es Anexina A2.

En ciertos aspectos, son proteínas de heteromultímeros que comprenden una primera construcción de polipéptido que comprende al menos un polipéptido de carga fusionado a un polipéptido derivado de aloalbúmina; y una segunda construcción de polipéptido que comprende al menos un polipéptido de carga fusionado a un polipéptido derivado de aloalbúmina. En ciertos aspectos, el al menos un polipéptido de carga de la primera construcción de polipéptidos es diferente del al menos un polipéptido de carga de la segunda construcción de polipéptidos. En ciertos aspectos, el al menos un polipéptido de carga de la primera construcción de polipéptidos es el mismo que el al menos un polipéptido de carga de la segunda construcción de polipéptidos.

Se proporciona en esta invención un heteromultímero que comprende: al menos dos monómeros, cada uno de los cuales comprende un polipéptido transportador y opcionalmente al menos una molécula de carga unida a dicho polipéptido transportador, donde cada polipéptido transportador se obtiene por segmentación de una proteína completa de tal manera que dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar una proteína completa cuasi-nativa. En ciertas realizaciones, el heteromultímero es multiespecífico. En ciertas realizaciones, los polipéptidos transportadores no se derivan de un anticuerpo. En algunas realizaciones, cada monómero forma preferentemente el heteromultímero en comparación con un monómero o un homomultímero. En una realización del heteromultímero, al menos una molécula de carga es un agente terapéutico o una biomolécula. En algunas realizaciones, al menos una molécula de carga es una biomolécula que se selecciona de entre un polipéptido, ADN, APN o ARN. En algunas realizaciones, cada polipéptido transportador es un derivado de albúmina o aloalbúmina. En una realización, cada polipéptido transportador es un derivado de anexina. En ciertas realizaciones, cada polipéptido transportador es un derivado de transferrina.

En ciertos aspectos son formulaciones farmacéuticas que comprenden una proteína heteromultimérica basada en albúmina y/o basada en aloalbúmina descrita en esta invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

En ciertos aspectos son formulaciones farmacéuticas que comprenden una proteína heteromultimérica basada en transferrina descrita en esta invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertos aspectos son formulaciones farmacéuticas que comprenden una proteína heteromultimérica basada en anexina descrita en esta invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertos aspectos son formulaciones farmacéuticas que comprenden una proteína heteromultimérica basada en Anexina-A2 descrita en esta invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertos aspectos, una formulación descrita en esta invención se proporciona como parte de un kit o contenedor. En ciertos aspectos, el kit o contenedor está empaquetado con instrucciones relativas a la vida útil prolongada de la proteína terapéutica. En algunos aspectos, un heteromultímero descrito en esta invención se usa en un procedimiento para tratar (por ejemplo, para mejorar), impedir o diagnosticar una enfermedad o síntoma de enfermedad en un individuo, que comprende la etapa de administrar dicha formulación al individuo.

En esta invención se proporciona un procedimiento para obtener andamios de proteínas de fusión con un número conocido de sitios de conjugación basados en cualquier proteína de transporte de interés.

También se proporcionan organismos transgénicos modificados para contener moléculas de ácido nucleico descritas en esta invención para codificar y expresar proteínas de fusión monoméricas descritas en esta invención.

Otros aspectos y características de la presente invención serán evidentes para los expertos habituales en la técnica tras la revisión de la siguiente descripción de aspectos específicos de la invención junto con las figuras adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

En los dibujos que ilustran realizaciones de la invención,

La Figura 1 representa la estructura de la molécula de Albúmina Sérica Humana (HSA). Las secciones alfa helicoidales de la estructura secundaria se muestran esquemáticamente junto con los enlaces representados como bastones.

La Figura 2 es un gráfico del área de superficie accesible al solvente enterrada en la interfaz de dos polipéptidos basados en albúmina. ABH1 está representado por la estructura a la izquierda, mientras que ABH2 está representado por la estructura a la derecha.

La Figura 3 representa dos polipéptidos basados en albúmina expresados por separado. Los dos polipéptidos se muestran en gris claro y gris oscuro respectivamente. Cada polipéptido comprende dos sitios de fusión para proteínas de carga funcionales y estos sitios se representan como esferas. Los residuos de disulfuro en la estructura se muestran como bastones.

La Figura 4 es una representación esquemática de terapias biespecíficas y otras terapias multifuncionales basadas en el heteromultímero multiespecífico descrito en esta invención. Los polipéptidos basados en albúmina o basados en aloalbúmina se denotan como A1 y A2. Los heteromultímeros multifuncionales se obtienen conjugando motivos de unión a antígeno, citocinas y otras formas de moléculas de señalización, quimiotoxinas, radiotoxinas u otros inmunoconjugados funcionalmente relevantes a sitios terminales N y/o C en A1 y A2 y esto se representa con el símbolo □.

La Figura 5 es un esquema de un anticuerpo biespecífico que se deriva de un dominio Fc heterodimérico. Los polipéptidos basados en albúmina o aloalbúmina están conectados al terminal C del Fc para conducir selectivamente la formación de heterodímeros.

La Figura 6B muestra perfiles de electroforesis en gel nativos de HSA de longitud completa y andamios de heterodímeros heteromultímero-1 (ABH1) basado en Albúmina y heteromultímero-2 (ABH2) basado en Albúmina formados por coexpresión de polipéptidos transportadores basados en HSA. La Figura 6A muestra un perfil de gel SDS-PAGE no reductor de ABH2, ABH1 y WT HSA. Los dos polipéptidos de fragmentos de ABH1 y ABH2 se coexpresaron en diferentes proporciones de ADN, como lo indican las proporciones en la parte superior de la figura. Como controles y para observar la homodimerización, los fragmentos A y B se expresaron independientemente. La Figura 6C es un gel nativo del eluyente inicial, de flujo, de lavado y final después de la purificación con Blue Sepharose de WT-HSA (v225) y ABH2 (v221).

La Figura 7 muestra la estabilidad de HSA natural y los andamios heterodímeros ABH1 y ABH2 estudiados usando Calorimetría de Barrido Diferencial.

Las Figuras 8A-8B muestran isotermas de unión en equilibrio 3000 nM FcRN 3x series de dilución sobre 3000 RU. La Figura 8B muestra Albúmina y la Figura 8A muestra el andamio de heteromultímero ABH1

La Figura 9 muestra esquema para heteromultímeros basados en Albúmina multivalentes que comprenden fusiones bioactivas anti-Her2/neu y anti-CD 16 scFv

Las Figuras 10A-10B contienen un análisis SDS PAGE no reductor de las fusiones de heteromultímero ABH2 descritas en la Tabla 8. El gel indica que todas las construcciones forman el complejo correcto con MW esperado.

La Figura 11 muestra la estructura de la molécula de Anexina basada en la estructura PDB 1MCX. Los dos monómeros que se derivarán dividiendo la molécula de Anexina están codificados por color como conjuntos gris claro y gris oscuro. Los sitios de fusión para la proteína de carga se representan como esferas.

La Figura 12 muestra un gráfico del área de superficie accesible al disolvente enterrada en la interfaz del polipéptido transportador basado en anexina-1 y el polipéptido transportador basado en anexina-2.

La Figura 13 muestra la estructura de la molécula de transferrina basada en la estructura PDB 1H76. Los dos monómeros que se derivaron dividiendo la molécula de transferrina están codificados por color como conjuntos gris claro y gris oscuro. Los sitios de fusión para la proteína de carga se representan como esferas.

La Figura 14 muestra un gráfico del área de superficie accesible al solvente enterrada en la interfaz de dos polipéptidos transportadores basados en transferrina descritos en esta invención. Una transferrina dividida cerca de la posición del residuo 330 según diseñado en esta invención, forma un heterodímero con aproximadamente 1800 A2 de área de superficie enterrada.

Las Figuras 15A-15P representan heteromultímeros que comprenden polipéptidos transportadores basados en albúmina que se autoasocian para formar albúmina monomérica cuasi-nativa. Cada par de polipéptidos transportadores se obtiene por segmentación de albúmina en un sitio único, diferente del otro

Las Figuras 16A y 16B proporcionan las estructuras de ABH2 y ABH1 respectivamente. Ambos diagramas incluyen a) la ubicación del sitio de corte en WT-HSA para crear la proteína basada en albúmina, b) la ubicación de los nuevos sitios de corte C' y N' y c) una representación circular simplificada de ABH1 y ABH2, utilizada en numerosos ejemplos posteriores.

La Figura 17 muestra varias configuraciones mono, bi, tri y tetravalente de scFv anti-Her2 que se pueden unir a ABH2. Los controles incluyeron el andamio ABH2, el scFV anti-HER2, el Fc de un solo brazo y el Fc bivalente. Además, la capacidad de las diversas construcciones ABH2 para unirse a células SKOV que expresan Her2 se indica con los valores K^ddentro de las tablas.

La Figura 18A muestra las curvas de unión de cuatro construcciones cargadas anti-Her3 x Her2 (v1087, v1088, v1089 y v1090) a células MALME-3M. La afinidad por las células se evaluó usando FACS con anticuerpos anti-HSA marcados con FITC. El gráfico inferior izquierdo muestra la concentración en una escala lineal, mientras que el inferior derecho está en una escala logarítmica. La Figura 18B muestra las curvas de unión de las cuatro construcciones mencionadas anteriormente a las células SKOV-3. El gráfico inferior izquierdo muestra una escala lineal, mientras que la inferior derecha muestra una escala logarítmica.

La Figura 19A -D demuestra la estabilidad de cuatro ABH2 cargados con anti-Her2 (v519, v520, v518 y v517) en suero humano. La afinidad de unión a las células SKOV-3 se evaluó usando FACS con anticuerpo anti-HSA marcado con FITC.

Las Figuras 20A y 20B muestran la afinidad de unión de anti-Her2 x Her3 ABH2 biespecífico (v1378) a FcRn en comparación con el control v1087 (MM-111). Los gráficos representan las curvas de resonancia de plasmones superficiales (SPR) de los dos compuestos representados como Resp. Dif. en el Tiempo.

La Figura 21 representa los perfiles de gel nativo tanto del andamio ABH2 (v221) como de un ABH2 anti-Her2 monovalente (v517) incubado durante cinco días a tres temperaturas (37°C, temperatura ambiente y 4°C).

La Figura 22A representa el perfil de gel nativo de las fracciones total, de flujo, lavado y eluyente de WT HSA después de purificación con Blue Sepharose. La Figura 22B es un cromatograma de WT-HSA después de la purificación con Blue Sepharose aplicada a una columna de filtración en gel. Diferentes picos representan diferentes productos proteicos. La Figura 22C es un cromatograma de WT-HSA después de purificación con AlbuPure, fraccionado por aplicación a columna de filtración en gel.

La Figura 23A es un cromatograma del análisis de cromatografía líquida de WT-HSA (v225) después de purificación con AlbuPure y filtración en gel. Las Figuras 23B-23E son cromatogramas de los andamios AlbuCORE 1 (v225), 3 (v1636), 6 (v1638) y 9 (v1640) respectivamente después de purificación con AlbuPure, separados en fracciones y analizados por LC de filtración en gel.

La Figura 24A representa el análisis LC de filtración en gel de un andamio de albúmina (v221) después de la purificación con AlbuPure. El producto expreso se amplió mediante coexpresión transitoria en células de CHO. La Figura 24B muestra perfiles de gel SDS-PAGE no reductores (indicados por -DTT) y reductores (indicados por DTT) de la misma variante.

La Figura 25A representa los perfiles de gel nativos del eluyente total, de flujo, de lavado y final de las proteínas WT-HSA y AlbuCORE-A después de purificación con Albupure. La Figura 25B representa un análisis LC/MS de las mismas dos proteínas.

La Figura 26A es un diagrama que indica el grado de separación espacial entre los cuatro términos en ABH2. La Figura 26B es un diagrama comparativo que demuestra el grado de separación espacial entre las regiones variables de una molécula de anticuerpo normal. La Figura 26C muestra cuatro andamios de Albucore que tienen distancias entre extremos diferentes y variables para la unión de antígeno alternativa.

La Figura 27 muestra las curvas de fusión DSC de los andamios AlbuCORE 1, 3, 6 y 9. En cada gráfico, la curva y el punto de fusión de cada andamio basado en albúmina se compara con la curva y el punto de fusión de 75°C del WT HSA.

La Figura 28A es la representación esquemática de heteromultímeros bivalentes biespecíficos anti-CD3xCD19 en un WT-HSA o un andamio de albúmina en splicing. La Figura 28B representa las representaciones esquemáticas de construcciones de heteromultímeros anti-CD3 monovalentes adicionales, así como construcciones de heteromultímeros anti-CD 19 monovalentes y multivalentes. La Figura 28C representa un gel PAGE no reductor de las construcciones descritas anteriormente después de que cada una se expresó en un sistema CHO humano en crecimiento en suspensión.

La Figura 29 proporciona las mediciones de Ka y Hill Slope de cuatro heteromultímeros bivalentes biespecíficos anti-CD3xCD19 en un andamio WT-HSA o de albúmina en splicing. Las pruebas de unión evaluaron la capacidad de la variante para unirse a células Jurkat o Raji según se analizó usando FACS.

La Figura 30A muestra gráficos de población de células FACS del control similar a BiTE (v891), un heteromultímero basado en albúmina anti-CD3xCD19 (v1093) y un heteromultímero basado en Het-Fc anti-CD3xCD19 (v873). Se evaluó la unión a células Raji y Jurkat. La Figura 30B muestra gráficos FACS adicionales de las tres construcciones mencionadas anteriormente y en comparación con un control de albúmina (v221).

La Figura 31A muestra una SDS-PAGE del producto de expresión v218 antes, durante y después de purificación usando afinidad de Co2 . La Figura 31B es un cromatograma de la misma construcción después de purificación adicional mediante filtración en gel.

Figura 32 Gráfico de contactos de residuos realizado por un subconjunto de residuos en la albúmina de suero humano derivada de su estructura 3-dimensional.

Figura 33 Gráfico de la naturaleza de los contactos e interacciones logradas por residuos en focos seleccionados en albúmina de suero humano.

Figura 34 Una representación gráfica de residuos en focos o clusters (parches) de residuos en focos en albúmina de suero humano.

La Figura 35 muestra un gel que demuestra la expresión de varios heteromultímeros basados en albúmina que comprenden residuos de cisteína introducidos.

La Figura 36A proporciona un gel no reductor que muestra la expresión de variantes de heteromultímeros 1635, 1638, 1639 y 1641; la Figura 36B proporciona un gel no reductor que muestra la expresión de variantes de heteromultímeros 1634, 1636, 1637, 1640 y 221. Las células de CHO se transfectaron con las siguientes relaciones de ADN: Relación A = plásmido A: plásmido B 100 %:0 %; Relación D = plásmido A: plásmido B 66 %:34 %; Relación B = plásmido A:plásmido B 50 %:50 %; Relación H = plásmido A:plásmido B 34 %:66 %; y Relación F = plásmido A:plásmido B 0 %/100 %.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En el ámbito de las proteínas terapéuticas, las moléculas biespecíficas exhiben especificidades diana duales o pueden realizar simultáneamente múltiples papeles funcionales al proporcionar la organización espacio-temporal necesaria para la acción del fármaco. En un aspecto, moléculas biespecíficas son particularmente interesantes cuando el modo de acción terapéutica implica redirigir células o moléculas efectoras hacia una diana como una célula tumoral [Muller D. y Kontermann RE (2010) Biodrugs 24, 89-98] El desarrollo de proteínas terapéuticas biespecíficas con farmacocinética y actividad funcional favorables en condiciones estables y homogéneas ha sido un desafío. Se han hecho intentos para ensamblar conjuntos biespecíficos de múltiples dominios de unión a antígeno usando una serie de estrategias. Estas técnicas han implicado el uso de la molécula de IgG de anticuerpo heterodimérico, usando proteínas de cremallera de leucina como el par Fos/Jun u otros andamios ensamblados de las organizaciones alternativas de las cadenas ligeras y pesadas de los dominios variables en un anticuerpo. Kipriyanov y Le Gall han revisado el diseño de una variedad de construcciones biespecíficas [Kipriyanov SM y Le Gall F. (2004) Curr Opin Drug Discov Dev 7, 233-242]. El uso de una molécula de IgG de anticuerpo heterodimérico donde se introducen mutaciones en el dominio CH3 del anticuerpo para lograr el heterodímero y, por lo tanto, introduce los dos sitios únicos de unión a antígeno en una molécula, es muy atractivo debido a la estructura similar a la inmunoglobulina natural de esta construcción. Además, la porción Fc del anticuerpo está involucrada en interacciones con el receptor Fc neonatal (FcRn) que media una vía de natural endocítica y esto se atribuye a una vida media en suero mejorada de la molécula de anticuerpo [Roopenian D. y Akilesh S. (2007) Nature Rev Immunol 7, 715-725]. Por otro lado, moléculas biespecíficas basadas en anticuerpos han sido problemáticas en ensayos clínicos debido a las fuertes respuestas de citoquinas como resultado de la actividad efectora concurrente inducida a través de la porción Fc del anticuerpo biespecífico [Weiner LM; Alpaugh RK y col. (1996) Cancer Immunol Immunother 42, 141-150]. Esto resalta las necesidades de andamios novedosos que pueden ayudar en el diseño de moléculas biespecíficas e inmunoconjugadas.

La proteína de albúmina de suero humano (HSA) es el componente más abundante de la sangre, representando cerca del 60 % de la proteína total en el suero sanguíneo a una concentración de aproximadamente 40 mg/ml. La albúmina es también una de las proteínas más longevas del sistema circulatorio con una vida media de aproximadamente 19 días. Curiosamente, se sabe que la misma vía de recuperación endocítica dependiente de moléculas de FcRn que impide la degradación de anticuerpos también interactúa con la molécula de HSA [Chaudhary C.; Mehnaz S. y col. (2003) J Exp Med 197, 315-322].

HSA (que se muestra en la Figura 1) es una proteína de polipéptido único de 585 residuos no glicosilada y la estructura tridimensional de la proteína se observó por primera vez mediante cristalografía de rayos X por Carter y colegas [revisado en Carter, D.C. y Ho, J.X. (1994) Adv Prot Chem 45, 153-203]. La proteína HSA consiste en tres dominios homólogos: DI, DII, DIII, atribuidos a la duplicación de genes, una característica común a la albúmina sérica en otras especies también [Gray J.E. & Doolittle R.F. (1992) Protein Sci 1, 289-302] Cada uno de los tres dominios se ha expresado y caracterizado por separado y se ha demostrado que es independientemente estable [Dockal M., Carter D.C. y Ruker F. (1999) J Biol Chem 274, 29303-29310]. Cada dominio está formado por 10 segmentos helicoidales y, basado en la organización inter-helicoidal, cada dominio puede clasificarse en 2 subdominios compuestos por hélice 1-6 y 7-10, respectivamente. HSA tiene 17 enlaces disulfuro en total y todos estos pares de cisteína que forman los enlaces están dentro de los dominios individuales. En general, HSA es muy estable debido a la gran cantidad de enlaces disulfuro, así como al pliegue predominantemente helicoidal. Las identidades de secuencia de moléculas de albúmina en varias especies son bastante grandes, más del 70 % entre el ADNc de albúmina derivado de humanos, caballos, bovinos, ratas, etc. [Carter, D.C. & Ho, J.X. (1994) Adv Prot Chem 45, 153-203].

Pares de proteínas divididas se han utilizado como sensores para comprender las interacciones proteína-proteína en el área de la proteómica funcional. La estrategia implica identificar segmentos adecuados de una proteína que puede reconstituirse para formar una proteína nativa activa. Generar nuevas proteínas divididas es técnicamente difícil. Para que una proteína se divida de una manera funcionalmente útil, el sitio de segmentación debe producir dos segmentos que se reconstituyan eficientemente en la proteína cuasi-nativa cuando se asocian entre sí. Además, los segmentos proteicos componentes deben ser lo suficientemente solubles como para permanecer en solución y asociarse selectivamente con los segmentos asociados de manera que los rendimientos de fabricación y purificación sean económicos. Derivar segmentos de proteína divididos que se recombinarían para formar la estructura cuasi-nativa que se asemeje a la proteína nativa monomérica es bastante desafiante [Tafelmeyer P., Johnsson N. y Johnsson K. Chem & Biol 11,681-689]. Dichas proteínas divididas no se han utilizado en el diseño de terapias proteicas, ni como vehículos de entrega de carga en el pasado.

La presente invención proporciona heteromultímeros que comprenden un primer monómero que comprende (i) un primer polipéptido transportador; y un segundo monómero que comprende (ii) un segundo polipéptido transportador; donde cada uno de dichos primer y segundo polipéptido transportador comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 % de identidad con un segmento de un polipéptido de albúmina; y donde dichos primer y segundo polipéptidos transportadores se obtienen por segmentación de dicho polipéptido de albúmina en un sitio de segmentación, donde dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar una estructura cuasi-nativa de la forma monomérica de dicho polipéptido de albúmina. En una realización, el sitio de segmentación se selecciona de modo que resida en un lazo del polipéptido de albúmina que tiene un área de superficie accesible al solvente (SASA) alta y un contacto limitado con el resto de la estructura de albúmina, b) da como resultado una interfaz complementaria entre los polipéptidos transportadores, donde la interfaz es apolar, extensa e interdigitada, y donde la ubicación del sitio de segmentación está: (a) entre los residuos 339 y 340 de SEQ ID NO: 1; o (b) entre los residuos 300 y 301 de la SEQ ID NO: 1; o (c) entre los residuos 364 y 365 de SEQ ID NO: 1; o (d) entre los residuos 441 y 442 de SEQ ID NO: 1; o (e) entre los residuos 171 y 172 de la SEQ ID NO: 1; o (f) entre los residuos 281 y 282 de SEQ ID NO: 1; o (g) después del residuo 83 y antes del residuo 85 de SEQ ID NO: 1 y el residuo 84 es eliminado; donde la numeración de residuos comienza con el primer residuo después de la secuencia de señal. Tales heteromultímeros exhiben una estabilidad comparable a la de la albúmina natural. El primer y el segundo monómeros pueden comprender además al menos un polipéptido de carga. Los heteromultímeros que comprenden dicho al menos un polipéptido de carga pueden usarse como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades.

Definiciones

Debe entenderse que esta invención no está limitada a los protocolos, líneas celulares, construcciones y reactivos particulares descritos en esta invención y como tales pueden variar. También debe comprenderse que la terminología utilizada en esta invención tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.

Como se usa en esta invención y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a una "HSA", "HA", "albúmina", "albúmina de suero humano" y varias formas en mayúscula, con guión y sin guión es una referencia a una o más de tales proteínas e incluye variantes, derivados, fragmentos, equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque cualquier procedimiento, dispositivo y material similar o equivalente a los descritos en esta invención también se puede usar en la práctica o prueba de la presente invención, los procedimientos, dispositivos y materiales preferidos se describen ahora.

Un "heteromultímero" o "polipéptido heteromultimérico" es una molécula que comprende al menos un primer monómero que comprende un primer polipéptido transportador y un segundo monómero que comprende un segundo polipéptido transportador, donde el segundo polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido en al menos un residuo de aminoácido. El heteromultímero puede comprender un "heterodímero" formado por el primer y segundo polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, el heteromultímero puede formar estructuras terciarias de orden superior tales como, pero sin limitación, trímeros y tetrámeros. En algunas realizaciones, están presentes polipéptidos transportadores además del primer y segundo polipéptidos transportadores. En ciertas realizaciones, el ensamblaje de polipéptidos transportadores para formar el heteromultímero es conducido por enterramiento del área superficial. En algunas realizaciones, los polipéptidos transportadores interactúan entre sí por medio de interacciones electrostáticas y/o interacciones de puente salino que impulsan la formación de heteromultímeros al favorecer la formación de heteromultímeros y/o desfavorecer la formación de homomultímeros. En algunas realizaciones, los polipéptidos transportadores interactúan entre sí por medio de interacciones hidrófobas que impulsan la formación de heteromultímeros al favorecer la formación de heteromultímeros y/o desfavorecer la formación de homomultímeros. En ciertas realizaciones, los polipéptidos transportadores interactúan entre sí mediante la formación de enlaces covalentes. En ciertas realizaciones, los enlaces covalentes se forman entre cisteínas presentes o introducidas naturalmente que impulsan la formación de heteromultímeros. En ciertas realizaciones de los heteromultímeros descritos en esta invención, no se forman enlaces covalentes entre los monómeros. En algunas realizaciones, los polipéptidos transportadores interactúan entre sí por medio de interacciones de empaquetamiento/ complementariedad de tamaño/ perillas en orificios/ tipo protruberancia-cavidad que impulsan la formación de heteromultímeros favoreciendo la formación de heteromultímeros y/o desfavoreciendo la formación de homomultímeros. En algunas realizaciones, los polipéptidos transportadores interactúan entre sí por medio de interacciones catión-pi que impulsan la formación de heteromultímeros al favorecer la formación de heteromultímeros y/o desfavorecer la formación de homomultímeros. En ciertas realizaciones, los polipéptidos transportadores individuales no pueden existir como monómeros aislados en solución. En ciertas realizaciones, el heteromultímero es el estado preferido de los polipéptidos transportadores individuales en comparación con el monómero.

El término "biespecífico" pretende incluir cualquier agente, por ejemplo, heteromultímero, monómero, proteína, péptido o complejo de proteína o péptido, que tiene dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la molécula puede unirse o interactuar con (a) una molécula diana de la superficie celular y (b) un receptor de Fc en la superficie de una célula efectora. En ciertas realizaciones de un heteromultímero descrito en esta invención, al menos un monómero se forma biespecífico uniendo al mismo polipéptido transportador, dos moléculas de carga con diferentes especificidades de unión. En ciertas realizaciones de un heteromultímero descrito en esta invención, el heteromultímero en sí mismo se forma biespecíficamente uniendo a los polipéptidos transportadores, al menos dos moléculas de carga con especificidades diferentes. El término "molécula multiespecífica" o "molécula heteroespecífica" pretende incluir cualquier agente, por ejemplo, una proteína, péptido o complejo de proteína o péptido, que tiene más de dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse a, o interactuar con, (a) una molécula diana de la superficie celular tal como, pero sin limitarse a, antígenos de la superficie celular, (b) un receptor de Fc en la superficie de una célula efectora, y (c) al menos otro componente. Por consiguiente, las realizaciones de los heteromultímeros descritos en esta invención incluyen, pero no se limitan a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraspecíficas y otras moléculas multiespecíficas. En ciertas realizaciones, estas moléculas se dirigen a antígenos de la superficie celular, como CD30, y a otras dianas, como los receptores de Fc en las células efectoras.

A menos que se indique lo contrario, la expresión "multivalente" se usa a lo largo de esta memoria descriptiva para denotar un heteromultímero que comprende al menos dos sitios de unión para moléculas diana. El heteromultímero multivalente está diseñado para tener múltiples sitios de unión para las dianas deseadas. En ciertas realizaciones, los sitios de unión están en al menos una molécula de carga unida a un polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, al menos un sitio de unión está en un polipéptido transportador. La expresión "bivalente" se usa a lo largo de esta memoria descriptiva para denotar un heteromultímero que comprende dos sitios de unión diana. En ciertas realizaciones de un heteromultímero bivalente, ambos sitios de unión están en el mismo monómero. La expresión "trivalente" se usa a lo largo de esta memoria descriptiva para denotar un heteromultímero que comprende tres sitios de unión diana. La expresión "tetravalente" se usa a lo largo de esta memoria descriptiva para denotar un heteromultímero que comprende cuatro sitios de unión diana.

Las "proteínas de fusión" y los polipéptidos se crean uniendo dos o más genes que originalmente codifican polipéptidos separados. La traducción de este gen de fusión da como resultado un único polipéptido con propiedades funcionales derivadas de cada uno de los polipéptidos originales. En realizaciones de los heteromultímeros descritos en esta invención, al menos un monómero puede comprender una proteína de fusión formada por la fusión de al menos un polipéptido de carga al extremo N- o C- de un polipéptido transportador.

El término "sustancialmente purificado" se refiere a un heteromultímero descrito en esta invención, o una variante del mismo que puede estar sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con la proteína como se encuentra en su entorno natural, es decir, una célula nativa o célula huésped en el caso de heteromultímero producido de forma recombinante que, en ciertas realizaciones, está sustancialmente libre de material celular que incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente 30 %, menos de aproximadamente 25 %, menos de aproximadamente 20 %, menos de aproximadamente 15 %, menos de aproximadamente 10 %, menos de aproximadamente 5 %, menos de aproximadamente 4 %, menos de aproximadamente 3 %, menos de aproximadamente 2 % o menos de aproximadamente 1 % (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando el heteromultímero o variante del mismo es producido de forma recombinante por las células huésped, la proteína en ciertas realizaciones está presente en aproximadamente 30 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 4 %, aproximadamente 3 %, aproximadamente 2 %, o aproximadamente 1 % o menos del peso seco de las células. Cuando el heteromultímero o variante del mismo es producido de manera recombinante por las células huésped, la proteína, en ciertas realizaciones, está presente en el medio de cultivo a aproximadamente 5 g/L, aproximadamente 4 g/L, aproximadamente 3 g/L, aproximadamente 2 g/L, aproximadamente 1 g/L, aproximadamente 750 mg/L, aproximadamente 500 mg/L, aproximadamente 250 mg/L, aproximadamente 100 mg/L, aproximadamente 50 mg/L, aproximadamente 10 mg/L, o aproximadamente 1 mg/L o menos del peso seco de las células. En ciertas realizaciones, el heteromultímero "sustancialmente purificado" producido por los procedimientos descritos en esta invención, tiene un nivel de pureza de al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 % , al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, específicamente, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, y más específicamente, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 90 %, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 95 %, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 99 % o mayor según determinado por procedimientos apropiados tales como análisis SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC y electroforesis capilar.

Una "célula huésped recombinante" o "célula huésped" se refiere a una célula que incluye un polinucleótido exógeno, independientemente del procedimiento utilizado para la inserción, por ejemplo, captación directa, transducción, apareamiento f u otros procedimientos conocidos en la técnica para crear células huésped recombinantes. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o de manera alternativa, puede estar integrado en el genoma huésped.

Como se usa en esta invención, el término "medio" o "medios" incluye cualquier medio de cultivo, solución, soporte sólido, semisólido o rígido que pueda soportar o contener cualquier célula huésped, incluyendo células huésped bacterianas, células huésped de levadura, células huésped de insectos, células huésped de plantas, células huésped eucariotas, células huésped de mamíferos, células de CHO, células huésped procariotas, células huésped de E. coli o Pseudomonas, y contenido celular. Por lo tanto, el término puede abarcar el medio en el que se ha desarrollado la célula huésped, por ejemplo, el medio en el que se ha secretado la proteína, incluido el medio antes o después de una etapa de proliferación. El término también puede abarcar tampones o reactivos que contienen lisados de células huésped, como en el caso de que un heteromultímero descrito en esta invención se produzca intracelularmente y las células huésped se lisen o se rompan para liberar el heteromultímero.

"Re-plegado", como se usa en esta invención, describe cualquier procedimiento, reacción o procedimiento que transforma polipéptidos que contienen enlaces disulfuro de un estado plegado o no plegado incorrectamente a una conformación nativa o plegada adecuadamente con respecto a los enlaces disulfuro.

"Co-plegado", como se usa en esta invención, se refiere específicamente a procedimientos de replegamiento, reacciones o procedimientos que emplean al menos dos polipéptidos monoméricos que interactúan entre sí y dan como resultado la transformación de polipéptidos no plegados o plegados incorrectamente a polipéptidos nativos, debidamente plegados.

Como se usa en esta invención, el término "vida media en suero modulada" significa el cambio positivo o negativo en la vida media en circulación de un polipéptido de carga que está comprendido por un heteromultímero descrito en esta invención relativo a su forma nativa. La vida media en suero se mide tomando muestras de sangre en varios instantes de tiempo después de la administración de heteromultímero, y determinando la concentración de esa molécula en cada muestra. La correlación de la concentración sérica con el tiempo permite el cálculo de la vida media del suero. Deseablemente, la vida media incrementada del suero tiene al menos aproximadamente dos veces, pero un aumento menor puede ser útil, por ejemplo, cuando permite un régimen de dosificación satisfactorio o evita un efecto tóxico. En algunas realizaciones, el aumento es al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cinco veces o al menos aproximadamente diez veces.

El término "vida media terapéutica modulada" como se usa en esta invención significa el cambio positivo o negativo en la vida media de la cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de carga comprendido por un heteromultímero descrito en esta invención, en relación con su forma no modificada. La vida media terapéutica se determina midiendo las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de la molécula en varios instantes de tiempo después de la administración. El aumento de la vida media terapéutica deseablemente permite un régimen de dosificación beneficioso particular, una dosis total beneficiosa particular, o evita un efecto no deseado. En algunas realizaciones, el aumento de la vida media terapéutica resulta de una mayor potencia, aumento o disminución de la unión de la molécula modificada a su diana, aumento o disminución de la descomposición de la molécula por enzimas tales como proteasas, o un aumento o disminución en otro parámetro o mecanismo de acción de la molécula no modificada o un aumento o disminución en la eliminación de la molécula mediada por el receptor.

El término "aislado", cuando se aplica a un ácido nucleico o proteína, denota que el ácido nucleico o proteína está libre de al menos algunos de los componentes celulares con los que está asociado en el estado natural, o que el ácido nucleico o la proteína se ha concentrado a un nivel mayor que la concentración de su producción in vivo o in vitro. Puede estar en un estado homogéneo. Las sustancias aisladas pueden estar en estado seco o semiseco, o en solución, incluida, entre otras, una solución acuosa. Puede ser un componente de una composición farmacéutica que comprende vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables adicionales. La pureza y la homogeneidad se determinan típicamente usando técnicas de química analítica como la electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto rendimiento. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación está sustancialmente purificada. En particular, un gen aislado se separa de los marcos de lectura abiertos que flanquean el gen y codifican una proteína distinta del gen de interés. El término "purificado" denota que un ácido nucleico o proteína da lugar sustancialmente a una banda en un gel electroforético. En particular, puede significar que el ácido nucleico o la proteína es al menos 85 % puro, al menos 90 % puro, al menos 95 % puro, al menos 99 % o más puro.

El término "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos, desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma de cadena simple o doble. A menos que se restrinja de manera específica, el término abarca los ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que poseen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se especifique de otra forma, el término también hace referencia a análogos de oligonucleótidos incluyendo APN (ácido peptidonucleico), análogos de ADN utilizados en tecnología antisentido (fosforotioatos, fosforamidatos y similares). A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácidos nucleicos particular también comprende de manera implícita las variantes modificadas de manera conservativa de la misma (inclusive, sin limitación, sustituciones de codones redundantes) y secuencias complementarias así como también la secuencia indicada de manera explícita. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer y col., Nucleic Acid Res.

19:5081 (1991); Ohtsuka y col., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini y col., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en esta invención para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Es decir, una descripción dirigida a un polipéptido se aplica de la misma forma a una descripción de un péptido y a una descripción de una proteína y viceversa. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos de origen natural así como también a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un aminoácido codificado no naturalmente. Tal como se usa en esta invención, los términos comprenden cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa, donde los residuos de aminoácidos están unidos mediante enlaces peptídicos covalentes.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y no natural, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos codificados de forma natural son los 20 aminoácidos comunes (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, pralina, serina, treonina, triptófano, tirosina, y valina) y pirrolisina y selenocisteína. Análogos de aminoácidos hace referencia a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, tal como homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, sulfonio metílico de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (como norleucina) o cadenas principales de péptidos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido natural. La referencia a un aminoácido incluye, por ejemplo, L-aminoácidos proteogénicos naturales; D-aminoácidos, aminoácidos modificados químicamente tales como variantes de aminoácidos y derivados; aminoácidos no proteogénicos de origen natural tales como p-alanina, ornitina, etc.; y compuestos sintetizados químicamente que tienen propiedades conocidas en la técnica como características de aminoácidos. Ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, a-metilo aminoácidos (por ejemplo, a-metil alanina), D-aminoácidos, aminoácidos tipo histidina (por ejemplo, 2-amino-histidina, p- hidroxi-histidina, homohistidina), aminoácidos que tienen un metileno extra en la cadena lateral (aminoácidos "homo") y aminoácidos en los que un grupo funcional de ácido carboxílico en la cadena lateral se reemplaza con un grupo de ácido sulfónico (por ejemplo, ácido cisteico). La incorporación de aminoácidos de origen no natural, que incluyen aminoácidos sintéticos no naturales, aminoácidos sustituidos o uno o más aminoácidos D a las proteínas de la presente invención, puede ser ventajosa en una cantidad de maneras diferentes. Péptidos que contienen aminoácidos D, etc., exhiben estabilidad aumentada in vitro o in vivo en comparación con las contrapartes que contienen aminoácidos L. Por lo tanto, las construcciones de péptidos, etc., que incorporan aminoácidos D, pueden ser particularmente útiles cuando se desea o se necesita mayor estabilidad intracelular. Más específicamente, los péptidos D, etc., son resistentes a peptidasas y proteasas endógenas, lo que proporciona una biodisponibilidad mejorada de la molécula y tiempos de vida prolongados in vivo cuando se deseen tales propiedades. Además, los péptidos D, etc., no pueden procesarse eficazmente para presentación restringida de clase II del complejo de histocompatibilidad principal a células T auxiliares, y, por lo tanto, es menos probable que induzcan respuestas inmunes humorales en todo el organismo.

Se puede hacer referencia a los aminoácidos en esta invención por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. De manera similar, se puede hacer referencia a los nucleótidos mediante sus códigos de letras individuales comúnmente aceptados.

"Variantes conservativamente modificadas" se aplican tanto a las secuencias de aminoácidos como a las de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias particulares de ácidos nucleicos, "variantes modificadas conservativamente" se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degradación del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, todos los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición donde una alanina se especifica por un codón, el codón se puede alterar para obtener cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones conservativamente modificadas. Cada secuencia de ácidos nucleicos en esta invención que codifica un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto en la materia reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para la metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para el triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto en la materia reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteínas que altera, agrega o elimina un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante conservativamente modificada" donde la alteración resulta en la deleción de un aminoácido, la adición de un aminoácido o la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son conocidas por los expertos en la materia. Dichas variantes conservativamente modificadas son adicionales y no excluyen variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos de la invención.

Los expertos en la materia conocen las tablas de sustitución conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:

1) Alanina (A), Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) isoleucina (I), leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); y

8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, por ejemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman & Co.; 2a edición (diciembre de 1993)

Los términos "idéntico" o "identidad" porcentual, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Secuencias son "sustancialmente idénticas" si tienen un porcentaje de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, aproximadamente 60 % de identidad, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % de identidad en una región específica), cuando se compara y se alinea para obtener la correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada según se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias (u otros algoritmos disponibles para personas de habilidad ordinaria en la materia) o por alineación manual e inspección visual. Esta definición también hace referencia al complemento de una secuencia de prueba. La identidad puede existir con respecto a una región con una longitud de al menos aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos o con respecto a una región con una longitud de al menos aproximadamente 75-100 aminoácidos o nucleótidos, o, cuando no se especifique, a través de la secuencia completa de un polinucleótido o polipéptido. Se puede obtener un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, que incluye homólogos de especies distintas a la humana, mediante un procedimiento que comprende las etapas de seleccionar una biblioteca en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene una secuencia de polinucleótidos de la invención o un fragmento de la misma, y aislar ADNc de longitud completa y clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótidos. Dichas técnicas de hibridación son bien conocidas por los expertos en la materia.

Para comparación de secuencia, usualmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se ingresan secuencias de prueba y de referencia en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencias, si fuera necesario, y se designan parámetros de programas de algoritmos de secuencias. Pueden usarse parámetros de programas por defecto o pueden designarse parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros de programas.

Una "ventana de comparación", como se usa en esta invención, incluye referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de 20 a 600, usualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en el cual una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas de manera óptima. Procedimientos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos a los expertos en la materia. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse, incluyendo, sin limitación, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante la búsqueda del procedimiento de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BeStFiT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante alineación manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology (1995 suplemento)).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y col. (1997) Nuc. Acids Res.

25:3389-3402, y Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para la realización de los análisis BLAST se encuentra disponible al público a través del sitio web del National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para la Información Biotecnológica) en internet en ncbi.nlm.nih.gov. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, y una expectativa (E) de 10 y la matriz de valor BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. Ee. UU. 89:10915) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. El algoritmo BLAST se realiza típicamente con el filtro de "baja complejidad" desactivado.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90:5873-5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de suma (P(N)), la que es una indicación de la probabilidad de que una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos ocurra por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,2, o menor que aproximadamente 0,01, o menor que aproximadamente 0,001.

La frase "hibrida selectivamente (o específicamente)" se refiere a la unión, duplicación o hibridación de una molécula solo a una secuencia de nucleótidos particular en condiciones de hibridación rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (incluyendo, sin limitación, ADN o ARN total celular o de biblioteca).

La frase "condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a la hibridación de secuencias de ADN, ARN u otros ácidos nucleicos, o combinaciones de los mismos en condiciones de baja fuerza iónica y alta temperatura como se conoce en la técnica. Típicamente, en condiciones estrictas, una sonda se hibridará con su subsecuencia diana en una mezcla compleja de ácido nucleico (que incluye, pero no se limita a, ADN o ARN total celular o de biblioteca) pero no se hibrida con otras secuencias en la mezcla compleja. Condiciones rigurosas dependen de las secuencias y diferirán en circunstancias diferentes. Las secuencias más largas se hibridan de forma específica a temperaturas más elevadas. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993).

Como se usa en esta invención, el término "eucariota" se refiere a organismos que pertenecen al dominio filogenético Eucarya, tales como animales (incluidos, entre otros, mamíferos, insectos, reptiles, pájaros, etc.), ciliados, plantas (incluidos, entre otros, monocotiledóneas, dicotiledóneas, algas, etc.), hongos, levaduras, flagelados, microsporidios, protistas, etc.

Como se usa en esta invención, el término "procariota" se refiere a organismos procariotas. Por ejemplo, un organismo no eucariota puede pertenecer al dominio filogenético de Eubacteria (que incluye, sin limitación, Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc.) o al dominio filogénetico de Archaea (que incluye, sin limitación, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tal como Haloferax volcanii y especie Halobacterium NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pemix, etc.).

El término "sujeto", como se usa en esta invención, se refiere a un animal, en algunas realizaciones, un mamífero, y en otras realizaciones, un ser humano, que es objetivo de tratamiento, observación o experimento. Un animal puede ser un animal de compañía (por ejemplo, perros, gatos y similares), un animal de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos y similares) o un animal de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas y similares).

El término "cantidad efectiva" tal como se usa en esta invención se refiere a la cantidad de heteromultímero que se administra, que aliviará en cierta medida uno o más de los síntomas de la enfermedad, afección o trastorno que se está tratando. Las composiciones que contienen el heteromultímero descrito en esta invención pueden administrarse para tratamientos profilácticos, de mejoría y/o terapéuticos.

Los términos "mejorar" o "mejoría" significan aumentar o prolongar en potencia o duración un efecto deseado. Por lo tanto, con respecto al aumento del efecto de los agentes terapéuticos, el término "mejorar" se refiere a la capacidad de aumentar o prolongar, ya sea en potencia o duración, el efecto de otros agentes terapéuticos en un sistema. Una "cantidad efectiva potenciadora", como se usa en esta invención, se refiere a una cantidad adecuada para mejorar el efecto de otro agente terapéutico en un sistema deseado. Cuando se usa en un paciente, las cantidades efectivas para este uso dependerán de la gravedad y del curso de la enfermedad, trastorno o afección, la terapia previa, el estado de salud del paciente y la respuesta a los fármacos, y el juicio del médico tratante.

El término "modificado", como se usa en esta invención, se refiere a cualquier cambio realizado en un polipéptido dado, tal como cambios en la longitud del polipéptido, la secuencia de aminoácidos, la estructura química, la modificación cotraduccional o la modificación postraduccional de un polipéptido. El término de forma "(modificado)" significa que los polipéptidos que se tratan se modifican opcionalmente, es decir, los polipéptidos tratados pueden modificarse o no modificarse.

El término "modificado postraduccionalmente" se refiere a cualquier modificación de un aminoácido natural o no natural que se produce a dicho aminoácido después de que se ha incorporado a una cadena polipeptídica. La expresión abarca, a modo de ejemplo solamente, las modificaciones cotraduccionales in vivo, las modificaciones cotraduccionales in vitro (tales como en un sistema de traducción sin células), las modificaciones postraduccionales in vivo y las modificaciones postraduccionales in vitro.

El término "segmentación" se refiere a un splicing interno preciso de la secuencia de proteína original que da como resultado "segmentos" de la secuencia de proteína que se asocian preferentemente como heteromultímeros para formar un estructura proteica cuasi-nativa. Alternativamente, la segmentación puede incluir la deleción de más de un residuo de aminoácido. En una realización, la deleción es residuo de un aminoácido. En otra realización, la deleción son residuos de dos aminoácidos. En otra realización, la deleción son residuos de tres aminoácidos.

Estructura Monomérica Cuasi-nativa:

Con referencia a una proteína nativa monomérica o su estructura, las proteínas cuasi-nativas y/o 'estructuras cuasinativas' o estructuras monoméricas cuasi-nativas son conjuntos de polipéptidos de heteromultímero derivado de segmentos de la proteína nativa monomérica de tal manera que dichos conjuntos de heteromultímeros presentan características funcionales y estructurales comparables a la proteína nativa monomérica. En algunas realizaciones, los segmentos son componentes de una construcción de polipéptidos que también comprenden otras entidades moleculares. Las proteínas son moléculas naturalmente dinámicas y muestran un conjunto de configuraciones estructurales, aunque le atribuimos una estructura nativa, como la obtenida por cristalografía de rayos X. Se puede considerar que las estructuras cuasi-nativas se asemejan a una de las configuraciones estructurales alternativas en el conjunto. En un frente diferente, secuencias de proteínas homólogas o proteínas que pertenecen a familias estructurales comunes tienden a plegarse en geometrías estructurales similares. Se puede considerar que las proteínas miembros que pertenecen a esta familia logran una estructura cuasi-nativa entre sí. Algunas de las secuencias únicas en la familia de proteínas también podrían exhibir atributos funcionales similares y, por lo tanto, pueden denominarse proteínas cuasi-nativas entre sí. En el caso de los heteromultímeros descritos en esta invención que comprenden dos o más construcciones de polipéptidos, cada uno de los cuales tiene un componente de polipéptido transportador, los polipéptidos transportadores se ensamblan para formar una estructura cuasi-nativa similar a la forma monomérica nativa de la proteína de la que se derivan los polipéptidos transportadores. La proteína nativa de referencia en este caso es la proteína monomérica a partir de la cual se deriva cada polipéptido transportador y la estructura nativa de referencia es la estructura de la proteína de la cual se deriva el polipéptido transportador. Describimos un caso en el que dos o más polipéptidos diferentes se autoensamblan para formar un heteromultímero con características estructurales y funcionales comparables a la proteína nativa, que en sí misma es una entidad monomérica. En algunas realizaciones, el heteromultímero ensamblado tiene al menos un 50 % de la actividad de la proteína nativa monomérica. En algunas realizaciones, el heteromultímero ensamblado tiene al menos un 60 % de la actividad de la proteína nativa monomérica. En realizaciones específicas, el heteromultímero ensamblado tiene al menos un 75 % de la actividad de la proteína nativa monomérica. En algunas realizaciones, el heteromultímero ensamblado tiene al menos un 80 % de la actividad de la proteína nativa monomérica. En realizaciones particulares, el heteromultímero ensamblado tiene al menos un 90 % de la actividad de la proteína nativa monomérica. En algunas realizaciones, el heteromultímero ensamblado tiene al menos un 95 % de la actividad de la proteína nativa monomérica. En algunas realizaciones, el heteromultímero ensamblado tiene al menos un 99 % de la actividad de la proteína nativa monomérica. En ciertas realizaciones proporcionadas, heteromultímeros que comprenden polipéptidos transportadores derivados de albúmina o aloalbúmina de modo que los polipéptidos transportadores se autoensamblen para formar un heteromultímero que exhibe características estructurales y/o funcionales semejantes a albúmina nativa como unión a FcRn, SPARC y/o gp60. En ciertas realizaciones, los heteromultímeros comprenden polipéptidos transportadores, cada polipéptido transportador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con un segmento de aminoácidos obtenido de la proteína monomérica nativa. En algunas realizaciones, los heteromultímeros comprenden polipéptidos transportadores, cada polipéptido transportador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con un segmento de aminoácidos obtenido de la proteína monomérica nativa. En realizaciones ejemplares, los heteromultímeros comprenden polipéptidos transportadores, cada polipéptido transportador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con un segmento de aminoácidos obtenido de la proteína monomérica nativa. En realizaciones específicas, los heteromultímeros comprenden polipéptidos transportadores, cada polipéptido transportador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con un segmento de aminoácidos obtenido de la proteína monomérica nativa. En ciertas realizaciones, los heteromultímeros comprenden polipéptidos transportadores, cada polipéptido transportador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con un segmento de aminoácidos obtenido de la proteína monomérica nativa. En algunas realizaciones, los heteromultímeros comprenden polipéptidos transportadores, cada polipéptido transportador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con un segmento de aminoácidos obtenido de la proteína monomérica nativa. En algunas realizaciones, la proteína monomérica nativa es una albúmina de mamífero o derivado o análogo de la misma. En ciertas realizaciones, la proteína monomérica nativa es albúmina de suero humano. En ciertas realizaciones, presentamos segmentos de polipéptidos derivados de transferrina que se autoensamblan para formar un heteromultímero que exhibe características estructurales y funcionales de transferrina nativa. En ciertas realizaciones, presentamos segmentos de polipéptidos derivados de anexina que se autoensamblan para formar un heteromultímero que exhibe características estructurales y funcionales de anexina nativa. Estos heteromultímeros se denominan cuasinativos.

Polipéptido transportador

Como se usa en esta invención, el término "polipéptido transportador" o "péptido transportador" o "transportador" se refiere a un polipéptido, de modo que dicho polipéptido transportador es capaz de formar proteínas heteromultiméricas con otros polipéptidos transportadores en solución, y donde dichas proteínas heteromultiméricas tienen una estructura cuasi-nativa de una proteína monomérica de la que se deriva al menos un polipéptido transportador. En ciertas realizaciones de los heteromultímeros descritos en esta invención, todos los polipéptidos transportadores se derivan de la misma proteína de albúmina o aloalbúmina. En ciertas otras realizaciones, los heteromultímeros están formados por polipéptidos transportadores derivados de diversas proteínas de albúmina y aloalbúmina. En ciertas realizaciones de los heteromultímeros descritos en esta invención, los polipéptidos transportadores se derivan de transferrina. En ciertas realizaciones de los heteromultímeros descritos en esta invención, los polipéptidos transportadores se derivan de proteínas de anexina. En ciertas otras realizaciones, los heteromultímeros están formados por polipéptidos transportadores derivados de la misma proteína de anexina. En ciertas otras realizaciones, los heteromultímeros están formados por polipéptidos transportadores derivados de diferentes proteínas de anexina. En una realización, los heteromultímeros están formados por polipéptidos transportadores derivados de anexina A2.

En ciertas realizaciones, los polipéptidos transportadores son segmentos de una proteína entera monomérica, donde dichos segmentos son capaces de ensamblarse para formar un heteromultímero de tal manera que dicho heteromultímero forme una estructura cuasi-nativa similar a la proteína entera monomérica nativa. En una realización, los polipéptidos transportadores son segmentos de una proteína barril beta. En ciertas realizaciones, se proporcionan heteromultímeros que comprenden polipéptidos transportadores que se ensamblan para formar una estructura cuasinativa similar a una proteína monomérica nativa, comprendiendo cada polipéptido transportador una secuencia de aminoácidos con al menos un 50 % de identidad con un segmento de la proteína monomérica nativa. En ciertas realizaciones, se proporcionan heteromultímeros que comprenden polipéptidos transportadores que se ensamblan para formar una estructura cuasi-nativa similar a una proteína monomérica nativa, comprendiendo cada polipéptido transportador una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 % de identidad con un segmento de la proteína monomérica nativa. En ciertas realizaciones, se proporcionan heteromultímeros que comprenden polipéptidos transportadores que se ensamblan para formar una estructura cuasi-nativa similar a una proteína monomérica nativa, comprendiendo cada polipéptido transportador una secuencia de aminoácidos con al menos un 75 % de identidad con un segmento de la proteína monomérica nativa. En ciertas realizaciones, se proporcionan heteromultímeros que comprenden polipéptidos transportadores que se ensamblan para formar una estructura cuasi-nativa similar a una proteína monomérica nativa, comprendiendo cada polipéptido transportador una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad con un segmento de la proteína monomérica nativa. En ciertas realizaciones, se proporcionan heteromultímeros que comprenden polipéptidos transportadores que se ensamblan para formar una estructura cuasi-nativa similar a una proteína monomérica nativa, comprendiendo cada polipéptido transportador una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad con un segmento de la proteína monomérica nativa. En ciertas realizaciones, se proporcionan heteromultímeros que comprenden polipéptidos transportadores que se ensamblan para formar una estructura cuasi-nativa similar a una proteína monomérica nativa, comprendiendo cada polipéptido transportador una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad con un segmento de la proteína monomérica nativa. En ciertas realizaciones, se proporcionan heteromultímeros que comprenden polipéptidos transportadores que se ensamblan para formar una estructura cuasi-nativa similar a una proteína monomérica nativa, comprendiendo cada polipéptido transportador una secuencia de aminoácidos con al menos un 99 % de identidad con un segmento de la proteína monomérica nativa. En una realización, la proteína monomérica nativa es proteína hélice beta. En algunas realizaciones, la proteína monomérica nativa es una proteína en haz helicoidal. En realizaciones, los polipéptidos transportadores se generan, por ejemplo, pero no se limitan a proteínas que comprenden un motivo de dedo de zinc, un motivo de hélice-giro-hélice o un motivo de horquilla beta. En algunas realizaciones, los polipéptidos transportadores comprenden segmentos obtenidos de proteínas no inmunogénicas que son estructuralmente estables y tienen propiedades biológicas favorables.

Los polipéptidos transportadores se derivan de una proteína mediante segmentación de la proteína en un sitio de segmentación. El sitio de segmentación está diseñado basado en los siguientes dos criterios de decisión.

Primero, el sitio de segmentación se selecciona de tal manera que resida en un lazo dentro de la proteína que tenga un alto SASA relativo y un contacto limitado con el resto de la estructura de la proteína. En una realización, el sitio de segmentación reside en un lazo que es flexible y accesible. En otra realización, el sitio de segmentación reside en un lazo que es menos probable que contribuya a la estabilidad del núcleo de la proteína y, por lo tanto, afecte la estabilidad de la estructura de la proteína cuasi-nativa ensamblada en relación con la estructura de la proteína intacta.

En segundo lugar, el sitio de segmentación se selecciona de modo que dé como resultado una interfaz complementaria entre los polipéptidos transportadores, donde la interfaz es apolar, extensa e interdigitada. La apolaridad de la interfaz se relaciona con el número de aminoácidos apolares en la interfaz. Como se sabe en la técnica, los aminoácidos pueden clasificarse ampliamente como residuos polares y apolares. Mientras que los residuos polares interactúan favorablemente con el agua en el ambiente solvente, los residuos apolares no hacen contacto energéticamente favorable con el agua. Por esta razón, los residuos apolares en una proteína tienden a agruparse con otros residuos apolares y excluyen las moléculas de agua de su entorno local y esto es energéticamente favorable. Dichas interacciones que implican residuos apolares también se denominan contacto hidrófobo.

El área superficial enterrada en la interfaz se deriva de la pérdida en la superficie accesible molecular o solvente entre los estados no asociados y asociados de los dos polipéptidos que interactúan. En una realización, el área enterrada de la interfaz está entre aproximadamente 6000 A2 y aproximadamente 2000 A2. En otra realización, el área enterrada de la interfaz está entre aproximadamente 4000 A2 y aproximadamente 2000 A2. En otra realización, el área enterrada de la interfaz está entre aproximadamente 3000 A2 y aproximadamente 2000 A2. En una realización, la contribución apolar al área enterrada de la interfaz es mayor del 50 % del área de superficie enterrada neta en la interfaz.

Con respecto a la interfaz y su interdigitación, un factor importante que impulsa cualquier interacción proteína-proteína y formación de complejo es el contacto de los residuos superficiales en la interfaz formada entre las dos proteínas en contacto. La complementariedad fisicoquímica y estructural de las dos superficies proteicas en contacto en la forma asociada es un sello distintivo de la formación de complejos favorables y estables. La complementariedad fisicoquímica se define por las interacciones preferibles y podría comprender enlaces de hidrógeno, puentes de sal basados en carga, varios tipos de interacciones electrostáticas, contactos hidrófobos y de van der Waals a través de la superficie de las proteínas que interactúan. La superficie de la proteína en el nivel tridimensional se define por protuberancias y cavidades formadas debido a las diferencias en tamaño y orientación de varios aminoácidos que constituyen la región de la superficie. En una interfaz proteína-proteína favorable, las protuberancias y las cavidades de las dos superficies proteicas que interactúan se interdigitan para dar como resultado una complementariedad estructural. Cuanto mayor y más extensa es la interfaz entre las proteínas que interactúan, el contacto proteína-proteína es potencialmente más estable.

En una realización, la interfaz entre los dos polipéptidos transportados es rica en residuos de focos, es decir, residuos individuales o grupo de residuos implicados en una red de interacciones bien conectadas. Las interacciones podrían basarse en interacciones típicas observadas en proteínas tales como enlaces de hidrógeno, interacciones de residuos cargados como puentes salinos, contactos de van der Waals que muestran una fuerte complementariedad estructural y clusters de residuos hidrófobos. Esto maximiza la estabilidad de la interfaz e impide que el complejo se disocie. En una realización, el sitio de segmentación se selecciona para retener un enlace disulfuro natural presente en la proteína de la que se derivan los polipéptidos transportadores, a través de las secciones segmentadas para conectar covalentemente los dos segmentos. El objetivo era aumentar aún más la estabilidad de la estructura heterodimerizante cuasi-nativa similar a proteína que se autoensambla a partir de los dos segmentos derivados después de la segmentación. En esta realización, se eligen regiones de lazo en la secuencia de proteínas que satisfacen los criterios de disulfuro descritos en esta invención, es decir, tienen un disulfuro muy cerca del sitio de segmentación en la región del lazo. Además de la función de entrecruzar covalentemente las dos cadenas, este disulfuro también podría servir como un sustituto para que el lazo esté abierto.

En otro aspecto descrito en esta invención, un enlace disulfuro a través de los dos segmentos está diseñado mediante la introducción de aminoácidos individuales a mutaciones de cisteína en posiciones seleccionadas en cada uno de los dos segmentos derivados.

En otra realización, diseñamos aminoácidos en la interfaz de los dos segmentos para aumentar o mejorar aún más los focos en la interfaz o mejorar la complementariedad estructural y fisicoquímica entre los dos segmentos en la estructura de albúmina cuasi-nativa el ensamblada.

Albúmina

Como se usa en esta invención, "albúmina" se refiere colectivamente a la proteína de albúmina o secuencia de aminoácidos, o un segmento o variante de albúmina, que tiene una o más actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas) de albúmina. En particular, "albúmina" se refiere a albúmina humana o segmentos de la misma (ver, por ejemplo, EP 201239, EP 322094, WO 97/24445, WO95/23857) especialmente la forma madura de albúmina humana como se muestra en la FIG. 1, o albúmina de otros vertebrados, o segmentos de la misma, o análogos o variantes de estas moléculas o fragmentos de las mismas. En ciertas realizaciones, la albúmina se refiere a una versión truncada de albúmina.

El término "albúmina cuasi-nativa" se refiere a una molécula de heteromultímero que tiene una estructura y/o función similar a la albúmina completa, y donde dicha molécula de heteromultímero está formada por el conjunto de dos o más polipéptidos monoméricos diseñados en base a la secuencia de la albúmina completa. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de interés en esta invención comprenden "segmentos" que se asocian preferentemente como pares heteromultiméricos para formar una proteína cuasi-nativa. En alguna realización, esta proteína cuasi-nativa es albúmina cuasi-nativa. En algunas realizaciones, la albúmina cuasi-nativa tiene el 90 % de la actividad de la albúmina completa. En algunas realizaciones, la albúmina cuasi-nativa tiene el 75 % de la actividad de la albúmina completa. En algunas realizaciones, la albúmina cuasi-nativa tiene el 50 % de la actividad de la albúmina completa. En algunas realizaciones, la albúmina cuasi-nativa tiene el 50-75 % de la actividad de la albúmina completa. En una realización, la albúmina cuasi-nativa tiene el 80 % de la actividad de la albúmina completa. En algunas realizaciones, la albúmina cuasi-nativa retiene aproximadamente el 90 % de las características estructurales de la albúmina completa según se determina mediante modelado estructural. En algunas realizaciones, la albúmina cuasi-nativa retiene aproximadamente el 80 % de las características estructurales de la albúmina completa según se determina mediante modelado estructural. En algunas realizaciones, la albúmina cuasi-nativa retiene aproximadamente el 70 % de las características estructurales de la albúmina completa según se determina mediante modelado estructural. En algunas realizaciones, la albúmina cuasi-nativa retiene aproximadamente el 50 % de las características estructurales de la albúmina completa según se determina mediante modelado estructural. En algunas realizaciones, la albúmina cuasinativa retiene aproximadamente el 50-75 % de las características estructurales de la albúmina completa según se determina mediante modelado estructural.

Los términos albúmina sérica humana (HSA) y albúmina humana (HA) se usan indistintamente en esta invención. Los términos "albúmina y albúmina sérica" son más amplios y abarcan la albúmina sérica humana (y fragmentos y variantes de la misma) así como la albúmina de otras especies (y fragmentos y variantes de las mismas).

En ciertas realizaciones, cada monómero basado en albúmina de las proteínas heteromultiméricas descritas en esta invención se basa en una variante de HA normal. Cada porción de polipéptido de carga de las proteínas heteromultiméricas de la invención también puede ser variantes de las proteínas terapéuticas como se describe en esta invención. El término "variantes" incluye inserciones, deleciones y sustituciones, ya sean conservativas o no conservativas, donde dichos cambios no alteran sustancialmente una o más de las propiedades oncóticas, de unión a ligando útiles y no inmunogénicas de la albúmina, o el sitio activo, o dominio activo que confiere las actividades terapéuticas de las proteínas terapéuticas. En ciertas realizaciones, las variantes también podrían significar especies alternativas de heteromultímeros derivadas segmentando la albúmina en ubicaciones alternativas en su secuencia primaria.

En ciertas realizaciones, las proteínas heteromultiméricas descritas en esta invención incluyen variantes polimórficas naturales de albúmina humana y fragmentos de albúmina humana, por ejemplo, aquellos fragmentos descritos en EP 322094 (concretamente HA (Pn), donde n es 369 a 419).

En ciertas realizaciones, la albúmina se deriva de cualquier vertebrado, especialmente de cualquier mamífero que incluya, entre otros, humanos, vacas, ovejas, ratas, ratones, conejos, caballos, perros o cerdos. En ciertas realizaciones, la albúmina se deriva de albúminas no mamíferas que incluyen, entre otras, gallina y salmón.

La secuencia de albúmina humana es como se muestra, en la forma de preproteína con los residuos de señalización N-terminales MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR:

SEQ ID NO: 1

MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQ

YLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETY

GEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYL

YEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAK

QRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL

LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAA

DF VESKD V CKNY AE AKD VFLGMFL YEY ARRHPD Y S VVLLLRL AKTYETTLEKCC A

AADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV

STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRV

TKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV

ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALG

L

Aloalbúmina

Una aloalbúmina es una variante genética de albúmina. En ciertas realizaciones, la aloalbúmina es aloalbúmina humana (HAA). Aloalbuminas que difieren en movilidad electroforética de albúmina se han identificado a través de encuestas de genética de poblaciones en el curso de electroforesis clínica, o en encuestas de donantes de sangre. Como marcadores de mutación y migración, las aloalbúminas son de interés para los genetistas, bioquímicos y antropólogos, pero la mayoría de estas aloalbúmina no están asociadas con la enfermedad (Minchioti y col. Human Mutations 29 (8), 1007-1016 (2008)).

Tabla 1: Lista de sustituciones comprendidas por varias aloalbúminas en comparación con HA de SEQ ID NO: 1. Se proporciona termoestabilidad, información de vida media y otros HAA en Krogh-hansen y col. Biochim Biophys Acta 1747, 81-88 2005; WO2011051489.

Anexina:

Como se usa en esta invención, "anexina" se refiere a un grupo de proteínas celulares encontradas en organismos eucariotas. La anexina también se conoce como lipocortina. Como se usa en esta invención, "anexina" puede referirse a cualquier proteína anexina, o a proteínas anexinas específicas tales como "anexina A1", "anexina A2" y "anexina A5". Las anexinas se caracterizan por su capacidad dependiente de calcio para unir fosfolípidos cargados negativamente (es decir, paredes de membrana). Las anexinas se caracterizan por un andamio de proteínas repetido limitado a un tamaño de 30-50 kDa con una distribución tisular bastante ubicua. La estructura básica de una anexina se compone de dos dominios: una región "núcleo" terminal C conservada estructuralmente y un dominio terminal N divergente. La región central se une a la membrana celular de fosfolípidos de una manera dependiente de Ca2+. La región terminal N se une a proteínas citoplasmáticas. Las anexinas son importantes en diversos procedimientos celulares y fisiológicos y proporcionan un andamio de membrana. El núcleo del terminal C está compuesto por cuatro repeticiones de anexina. La anexina se caracteriza por su naturaleza flexible de repetición que influye en sus capacidades intrínsecas de detección de membrana. Por ejemplo, la afinidad hacia biomembranas específicas puede controlarse mediante el número de repeticiones. Con la detección característica de fosfolípidos, la anexina puede ser útil para detectar/alcanzar uniones intestinales para la administración de fármacos. Otra aplicación potencial para una anexina es alcanzar uniones estrechas intestinales y la región de Zonula Occludens (Zo -1), que se sabe que es particularmente difícil de atravesar para terapias proteicas más grandes, lo que afecta significativamente la absorción de fármacos.

El término "anexina cuasi-nativa" se refiere a una molécula de heteromultímero que tiene una estructura y/o función similar a la anexina completa, y donde dicha molécula de heteromultímero está formada por el conjunto de dos o más polipéptidos monoméricos diseñados en base a la secuencia de la anexina completa. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de interés son "segmentos" que se asocian preferentemente como pares heteromultiméricos para formar una proteína cuasi-nativa. En algunas realizaciones, la anexina cuasi-nativa tiene el 90 % de la actividad de la anexina completa. En algunas realizaciones, la cuasi-anexina tiene el 75 % de la actividad de la anexina completa. En algunas realizaciones, la cuasi-anexina tiene el 50 % de la actividad de la anexina completa. En algunas realizaciones, la cuasianexina tiene el 50-75 % de la actividad de la anexina completa. En algunas realizaciones, la cuasi-anexina tiene el 80 % de la actividad de la anexina completa. En algunas realizaciones, la cuasi-anexina tiene el 90 % de la estructura de la anexina completa según se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasi-anexina tiene el 80 % de la estructura de la anexina completa según se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasi-anexina tiene el 70 % de la estructura de la anexina completa según se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasi-anexina tiene el 50 % de la estructura de la anexina completa según se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasi-anexina tiene el 50%-75 % de la estructura de la anexina completa según se determina por modelado molecular.

La secuencia de la anexina A2 natural Humana es la siguiente:

SEQ ID NO: 14

GSAVSPYPTFNPSSDVAALHKAIMVKGVDEATIIDILTKRNNAQRQQIKAAYLQET

GKPLDETLKKALTGHLEEVVLALLKTPAQFDADELRAAMKGLGTDEDTLIEILASR

TNKEIRDINRVYREELKRDLAKDITSDTSGDFRNALLSLAKGDRSEDFGVNEDLADS

D ARALYE AGERRKGTD VNVFNTILTTRS YPQLRRVF QKYTKY SKHDMNKVLDLEL

KGDIEKCLTAIVKCATSKPAFFAEKLHQAMKGVGTRHKALIRIMVSRSEIDMNDIKA

F Y QKM Y GISLCQ AILDETKGD YEKIL VALCGGN

Transferrina:

Las transferrinas son proteínas monoméricas de aproximadamente 76 kDa de peso molecular presente en todos los vertebrados y funcionan como una proteína de unión y transporte de hierro. La transferrina humana recombinante y sus fusiones se están considerando para el tratamiento de diversas enfermedades, incluyendo talasemia, atransferrinemia, degeneración macular relacionada con la edad, diabetes tipo 2, durante el trasplante de células madre y en el tratamiento de enfermedades infecciosas agudas causadas por la bacteria del ántrax. La transferrina es estable en el ambiente gastrointestinal y varios estudios han demostrado que los conjugados de proteína-transferrina intactos pueden administrarse por vía oral y permanecer bioactivos.

El término "cuasi-transferrina" se refiere a una molécula de heteromultímero que tiene una estructura y/o función similar a la transferrina completa, y donde dicha molécula de heteromultímero está formada por el conjunto de dos o más polipéptidos monoméricos diseñados basado en la secuencia de la transferrina completa. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de interés son "segmentos" que se asocian preferentemente como pares heteromultiméricos para formar una proteína cuasi-nativa. En algunas realizaciones, la cuasi-transferrina tiene el 90 % de la actividad de la transferrina completa. En algunas realizaciones, la cuasi-transferrina tiene el 75 % de la actividad de la transferrina completa. En una realización, la cuasi-transferrina tiene el 50 % de la actividad de la transferrina completa. En algunas realizaciones, la cuasi-transferrina tiene el 50-75 % de la actividad de la transferrina completa. En una realización, la cuasitransferrina tiene el 80 % de la actividad de la transferrina completa. En algunas realizaciones, la cuasi-transferrina tiene el 90 % de la estructura de la transferrina completa según se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasi-transferrina tiene el 80 % de la estructura de la transferrina completa según se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasi-transferrina tiene el 70 % de la estructura de la transferrina completa según se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasi-transferrina tiene el 50 % de la estructura de la transferrina completa según se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasi-transferrina tiene el 50 %-75 % de la estructura de la transferrina completa según se determina por modelado molecular.

La secuencia de la Transferrina Humana natural es la siguiente:

SEQ ID NO: 19

MRLAVGALLV CAVLGLCLAV PDKTVRWCAV SEHEATKCQS FRDHMKSVIP

SDGPSVACVK KASYLDCIRAIAANEADAYT LDAGLYYDAY LAPNNLKPVV

AEFYGSKEDP QTFYYAVAVV KKDSGFQMNQ LRGKKSCHTG LGRSAGWNIP

IGLLYCDLPE PRKPLEKAVA NFFSGSCAPC ADGTDFPQLC QLCPGCGCST

LNQYFGYSGA FKCLKDGAGD VAFVKHSTIF ENLANKADRD QYELLCLDNT

RKPVDEYKDC HLAQVPSHTV VARSMGGKED LIWELLNQAQ EHFGKDKSKE

FQLFSSPHGK DLLFKDSAHG FLKVPPRMDA KMYLGYEYVT AIRNLREGTC

PEAPTDECKP VKWCALSHHE RLKCDEWSVN SVGKIECVSA ETTEDCIAKI

MNGEADAMSL DGGFVYIAGK CGLVPVLAEN YNKSDNCEDT PEAGYFAVAV

VKKSASDLTW DNLKGKKSCH TAVGRTAGWN IPMGLLYNKINHCRFDEFFS

EGCAPGSKKD SSLCKLCMGS GLNLCEPNNK EGYYGYTGAF RCLVEKGDVA

FVKHQTVPQN TGGKNPDPWA KNLNEKDYEL LCLDGTRKPV EEYANCHLAR

APNHAVVTRK DKEACVHKIL RQQQHLFGSN VTDCSGNFCL FRSETKDLLF

RDDTVCLAKL HDRNTYEKYL GEEYVKAVGN LRKCSTSSLL EACTFRRP

Molécula de carga:

Un heteromultímero descrito en esta invención comprende polipéptidos que comprenden al menos una molécula de carga, y al menos un polipéptido transportador, dicha molécula de carga y polipéptido transportador asociados entre sí, por medios inclusivos de, pero no restringidos a fusión genética o conjugación química. En algunas realizaciones, el polipéptido de carga se fusiona con el extremo N o C del polipéptido transportador. En algunas realizaciones, los polipéptidos de carga se fusionan con el extremo N o C del polipéptido transportador. En alguna realización, el polipéptido de carga se conjuga a la posición Cisteína 37 del polipéptido transportador derivado por segmentación de albúmina humana. En ciertas realizaciones, al menos una molécula de carga es un agente terapéutico. En ciertos agentes, la molécula de carga es una toxina. En ciertas realizaciones, la molécula de carga es un antígeno, o análogos del mismo. En una realización, la molécula de carga es un producto natural, análogo o profármaco del mismo. En ciertas realizaciones, la molécula de carga es un agente terapéutico como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo, por ejemplo, emisores alfa como, por ejemplo, 213Bi. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Agentes terapéuticos incluyen, entre otros, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (D^dP) cisplatino), antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p. ej., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC), y agentes antimitóticos (p. ej., vincristina y vinblastina).

En cierta realización, la molécula de carga es una biomolécula. En una realización, la molécula de carga es un ácido nucleico natural o sintético. En algunas realizaciones, al menos una molécula de carga es uno o más de un oligómero de ADN, APN y/o ARN. En ciertas realizaciones, un heteromultímero descrito en esta invención comprende proteínas monoméricas que comprenden al menos un polipéptido de carga, o fragmentos o variantes del mismo, y al menos un polipéptido transportador, dicho polipéptido de carga y polipéptido transportador asociados entre sí, por medios que incluyen, pero no se restringen a, fusión genética o conjugación química.

Como se usa en esta invención, "polipéptido de carga" se refiere a proteínas, polipéptidos, anticuerpos, péptidos o fragmentos o variantes de los mismos, que tienen una o más actividades terapéuticas y/o biológicas. Los polipéptidos de carga abarcados por la invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas, polipéptidos, péptidos, anticuerpos, sustratos o ligandos para proteínas diana terapéuticamente relevantes y productos biológicos. (Los términos péptidos, proteínas y polipéptidos se usan indistintamente en esta invención). Específicamente, el término "polipéptido de carga" abarca anticuerpos y fragmentos y variantes de los mismos. Por lo tanto, un heteromultímero descrito en esta invención puede contener al menos un fragmento o variante de un polipéptido de carga, y/o al menos un fragmento o variante de un anticuerpo. Además, en ciertas realizaciones, el término "polipéptido de carga" se refiere al correlato endógeno o natural de un polipéptido de carga.

Como ejemplo no limitativo, una "biomolécula de carga" es una biomolécula tal como, pero no restringida a, una proteína, a Dn o ARN que es útil para tratar, impedir o mejorar una enfermedad, afección o trastorno. Como ejemplo no limitativo, un "polipéptido de carga" puede ser uno que se une específicamente a un tipo de célula particular (normal (por ejemplo, linfocitos) o anormal, (por ejemplo, células cancerosas)) y, por lo tanto, puede usarse para alcanzar un compuesto (fármaco, o agente citotóxico) a ese tipo de célula específicamente.

En otro ejemplo no limitante, una "molécula de carga" es una molécula que tiene una actividad biológica, y en particular, una actividad biológica que es útil para tratar, impedir o mejorar una enfermedad. Una lista no inclusiva de actividades biológicas que puede ser poseídas por una molécula de carga, por ejemplo, un polipéptido de carga incluye mejorar la respuesta inmune, promover la angiogénesis, inhibir la angiogénesis, regular las funciones hematopoyéticas, estimular el crecimiento nervioso, mejorar una respuesta inmune, inhibir una respuesta inmune, o una o más de las actividades biológicas descritas en esta invención.

Los polipéptidos de carga correspondientes a una porción de polipéptido de carga de una proteína de heteromultímero descrita en esta invención, como la superficie celular y las proteínas secretoras, a menudo se modifican, mediante la unión de uno o más grupos oligosacáridos. La modificación, denominada glucosilación, puede afectar drásticamente las propiedades físicas de las proteínas y puede ser importante en la estabilidad, secreción y localización de proteínas. La glucosilación se produce en ubicaciones específicas a lo largo de la cadena principal del polipéptido. Por lo general, existen dos tipos principales de glucosilación: la glucosilación caracterizada por oligosacáridos unidos a O, que están unidos a residuos de serina o treonina; y glucosilación caracterizada por oligosacáridos unidos a N, que están unidos a residuos de asparagina en una secuencia Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. El ácido N-acetilneurámico (también conocido como ácido siálico) suele ser el residuo terminal de los oligosacáridos unidos a N y unidos a B. Variables como la estructura de la proteína y el tipo celular influyen en el número y la naturaleza de los conjuntos de carbohidratos dentro de las cadenas en diferentes sitios de glucosilación. Isómeros de glucosilación también son comunes en el mismo sitio dentro de un tipo celular dado.

La Tabla 2 proporciona una lista no exhaustiva de polipéptidos de carga que corresponden a una porción de polipéptido de carga de un heteromultímero descrito en esta invención. La columna "Polipéptido de carga" revela moléculas de polipéptido de carga seguidas de paréntesis que contienen nombres científicos y de marca que comprenden, o consisten de forma alternativa, esa molécula de polipéptido de carga o un fragmento o variante de la misma. En una realización, la molécula de carga es una molécula que se une a una proteína descrita en la columna "Polipéptido de carga", o en Zhu y col. (Nucleic Acids Res. 38 (1), D787-D791 (2009)); Wishart y col. (Nucleic Acids Res 36, D901-D906 (2008)); Ahmed y col. (Nucleic Acids Res 39, D960-D967 (2011)), o una proteína que pertenece a la clase de moléculas diana terapéuticas.

"Polipéptido de carga" como se usa en esta invención puede referirse a una molécula de polipéptido de carga individual (como se define por la secuencia de aminoácidos obtenible de los números de acceso ^cA^sy Genbank), o al grupo completo del polipéptido de carga asociado con una molécula de polipéptido de carga dada descrita en esta columna, o un polipéptido de carga que se une a una molécula de polipéptido descrita en esta columna.

Tabla 2: Lista no exhaustiva de polipéptidos de carga que corresponden a una porción de polipéptido de carga de un heteromultímero

En una realización, el polipéptido de carga es una construcción de polipéptido de unión a antígeno. En otra realización, el polipéptido de carga es una construcción de polipéptido de unión a antígeno que es un anticuerpo, o fragmento o variante del mismo. En una realización, la construcción de polipéptido de unión a antígeno es un fragmento Fab de un anticuerpo, o un scFv, o un anticuerpo de dominio único o fragmento del mismo.

En una realización, el polipéptido de carga se selecciona de entre una construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a CD3, CD19, CD20, HER2 o HER3. Ejemplos adecuados de construcciones de polipéptidos de unión a antígeno son conocidos en la técnica e incluyen los derivados de anticuerpos anti-CD3, anti-CD 19, anti-HER2 y anti-HER3.

Actividad Funcional

"Un polipéptido que tiene actividad funcional" se refiere a un polipéptido capaz de mostrar una o más actividades funcionales conocidas asociadas con la forma de longitud completa, pro-proteína y/o madura de un polipéptido de carga. Dichas actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad biológica, antigenicidad [capacidad de unirse (o competir con un polipéptido para unirse) a un anticuerpo anti-polipéptido], inmunogenicidad (capacidad de generar anticuerpo que se une a un polipéptido específico descrito en esta invención), capacidad de formar multímeros con los polipéptidos descritos en esta invención, y capacidad de unirse a un receptor o ligando para un polipéptido. En ciertas realizaciones, la actividad funcional incluye la capacidad de mejorar la expresión y la estabilidad de una proteína asociada.

"Un polipéptido que tiene actividad biológica" se refiere a un polipéptido que exhibe una actividad similar, pero no necesariamente idéntica a, una actividad de una proteína terapéutica descrita en esta invención, incluyendo formas maduras, según medido en un ensayo biológico particular, con o sin dependencia de la dosis. En el caso de que exista dependencia de la dosis, no necesita ser idéntica a la del polipéptido, sino bastante similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada en comparación con el polipéptido descrito en esta invención (es decir, el polipéptido candidato exhibirá mayor actividad o no más de aproximadamente 25 veces menos, o no más de aproximadamente diez veces menos actividad, o no más de aproximadamente tres veces menos actividad con respecto a un polipéptido descrito en esta invención, o presentado en la Tabla 2).

En ciertas realizaciones, un heteromultímero descrito en esta invención tiene al menos una actividad biológica y/o terapéutica asociada con la molécula de carga cuando dicha molécula de carga no está unida al polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, un heteromultímero descrito en esta invención tiene al menos una actividad biológica y/o terapéutica asociada con el polipéptido de carga cuando dicho polipéptido de carga no está unido al polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, una proteína heteromultimérica descrita en esta invención tiene al menos una actividad biológica y/o terapéutica asociada con la porción de polipéptido de carga (o fragmento o variante del mismo) cuando dicho polipéptido de carga no está unido al polipéptido basado en albúmina o aloalbúmina. Las proteínas heteromultiméricas descritas en esta invención pueden ensayarse para determinar su actividad funcional (por ejemplo, actividad biológica) usando o modificando rutinariamente ensayos conocidos en la técnica, así como los ensayos descritos en esta invención. Además, un experto en la materia puede ensayar de manera rutinaria fragmentos de una proteína que corresponde a una porción de proteína de carga de un polipéptido monomérico basado en albúmina o aloalbúmina, para actividad utilizando ensayos referenciados en su fila correspondiente de la Tabla 2 (por ejemplo, en la columna 3 de la Tabla 2) En ciertas realizaciones, se analizan fragmentos de una proteína de albúmina correspondiente a una porción de proteína de albúmina de un heteromultímero, para determinar la actividad utilizando ensayos conocidos en la técnica y/o como se describe en la sección de Ejemplos a continuación.

Por ejemplo, en una realización en la que se analiza la capacidad de una proteína heteromultimérica descrita en esta invención para unirse o competir con un polipéptido de carga para unirse a un anticuerpo de un polipéptido anti-carga y/o anticuerpo anti-albúmina, varios inmunoensayos conocidos en la matyeria puede usarse, incluidos, entre otros, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que utilizan técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzimas), inmunoensayos "sandwich", ensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipitación por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (utilizando etiquetas de oro coloidal, de enzimas o radioisótopos, por ejemplo), western blots, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación de complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una realización, la unión del anticuerpo es detectada detectando una etiqueta en el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario es detectado mediante la detección de unión de un reactivo o anticuerpo secundario al anticuerpo primario. En una realización adicional, el anticuerpo secundario está marcado. Se conocen en la técnica muchas maneras de detectar la unión en un inmunoensayo y estas se encuentran dentro del alcance de la presente invención. En ciertas realizaciones, donde se identifica una pareja de unión (por ejemplo, un receptor o un ligando) para una molécula de carga comprendida por un heteromultímero descrito en esta invención, la unión a esa pareja de unión por un heteromultímero descrito en esta invención se analiza, por ejemplo, por medios bien conocidos en la técnica, tal como, por ejemplo, cromatografía en gel reductora y no reductora, cromatografía de afinidad de proteínas y transferencia por afinidad. Ver en general, Phizicky y col., Microbiol. Rev. 59:94-123 (1995). En otra realización, la capacidad de los correlatos fisiológicos de una proteína heteromultimérica para unirse a sustrato(s) de polipéptidos correspondiente(s) a la porción de proteína de carga del heteromultímero se puede analizar de forma rutinaria usando procedimientos conocidos en la técnica.

Actividades Biológicas

En ciertas realizaciones, los heteromultímeros descritos en esta invención se usan en ensayos para evaluar una o más actividades biológicas. Si un heteromultímero exhibe una actividad en un ensayo particular, es probable que al menos una proteína de carga comprendida por uno o más monómeros del heteromultímero esté implicada en las enfermedades asociadas con la actividad biológica. Por lo tanto, el heteromultímero es útil en un tratamiento de la enfermedad asociada.

En ciertas realizaciones, se proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno que comprende administrar a un paciente en el que se desea dicho tratamiento, prevención o mejora, un heteromultímero descrito en esta invención, en una cantidad efectiva para tratar, impedir o mejorar la enfermedad o trastorno.

En esta invención se proporcionan proteínas de fusión basadas en albúmina o aloalbúmina monomérica producidas por una célula, donde dichas proteínas están codificadas por polinucleótidos, donde dichas proteínas monoméricas comprenden al menos una proteína de carga, y un polipéptido derivado de albúmina o aloalbúmina, de modo que dichos monómeros formen heteromultímeros en solución. En ciertas realizaciones, cuando los polinucleótidos se usan para expresar la proteína codificada de una célula, la secreción natural de la célula y las etapas de procesamiento producen una proteína que carece de al menos una secuencia de señal. La secuencia de aminoácidos específica de la secuencia de señal es bien conocida en la técnica.

En ciertas realizaciones, los heteromultímeros descritos en esta invención se usan en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos del sistema endocrino. En algunas realizaciones, los heteromultímeros descritos en esta invención se usan en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos del sistema nervioso.

En ciertas realizaciones, los heteromultímeros descritos en esta invención se usan en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos del sistema inmune. En algunas realizaciones, los heteromultímeros descritos en esta invención se usan en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos del sistema respiratorio.

En ciertas realizaciones, los heteromultímeros descritos en esta invención se usan en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos del sistema cardiovascular. En algunas realizaciones, los heteromultímeros descritos en esta invención se usan en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos del sistema reproductivo.

En ciertas realizaciones, los heteromultímeros descritos en esta invención se usan en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos del sistema digestivo. En ciertas realizaciones, las proteínas de heteromultímeros descritas en esta invención se usan en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades o trastornos relativos a la sangre.

En ciertas realizaciones, los heteromultímeros descritos en esta invención se usan en el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades y/o trastornos asociados con al menos un tejido en el que se expresa al menos un gen de interés, donde un heteromultímero descrito en esta invención comprende una molécula de carga que une dicho al menos un gen de interés.

En algunas realizaciones, los heteromultímeros descritos en esta invención y/o polinucleótidos que codifican los monómeros basados en albúmina/aloalbúmina que se asocian para formar heteromultímeros descritos en esta invención, se usan en el diagnóstico, detección y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos asociados con actividades que incluyen, pero no se limitan a, activación de prohormonas, actividad de neurotransmisores, señalización celular, proliferación celular, diferenciación celular y migración celular.

Usos Terapéuticos:

En un aspecto, los heteromultímeros descritos en esta invención están dirigidos a terapias basadas en anticuerpos que implican administrar heteromultímeros descritos que comprenden polipéptido(s) de carga que es un anticuerpo, un fragmento o una variante de un anticuerpo, a un paciente para tratar una o más de las enfermedades, trastornos o afecciones descritos. Los compuestos terapéuticos descritos en esta invención incluyen, entre otros, heteromultímeros descritos en esta invención, ácidos nucleicos que codifican heteromultímeros descritos en esta invención.

En una realización específica, son terapias basadas en anticuerpos que implican administrar heteromultímeros descritos en esta invención que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo a un paciente para tratar una o más enfermedades, trastornos o afecciones, incluyendo, sin limitación: trastornos neuronales, trastornos del sistema inmunitario, trastornos musculares, trastornos reproductivos, trastornos gastrointestinales, trastornos pulmonares, trastornos cardiovasculares, trastornos renales, trastornos proliferativos y/o enfermedades y afecciones cancerosas, y/o como se describe en otras partes de esta invención.

Un resumen de las formas en que las proteínas heteromultiméricas de la invención que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo se usan terapéuticamente incluye la unión local o sistémica en el cuerpo o por citotoxicidad directa del anticuerpo, por ejemplo, como mediada por complemento (CDC) o por células efectoras (ADCC). Algunas de estas estrategias se describen con más detalle a continuación. Armado con las enseñanzas proporcionadas en esta invención, un experto habitual en la materia sabrá cómo usar los heteromultímeros descritos en esta invención para fines de diagnóstico, monitorización o terapéuticos sin experimentación excesiva.

Los heteromultímeros descritos en esta invención, que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo, se pueden administrar solos o en combinación con otros tipos de tratamientos (por ejemplo, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia y agentes antitumorales). En general, se prefiere la administración de productos de un origen de especie o reactividad de especie (en el caso de anticuerpos) que es la misma especie que la del paciente. Por lo tanto, en una realización, los anticuerpos humanos, derivados de fragmentos, análogos o ácidos nucleicos, se administran a un paciente humano para terapia o profilaxis.

Terapia de Genes:

En una realización específica, los ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican proteínas de heteromultímeros descritas en esta invención se administran para tratar, inhibir o impedir una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante una proteína, a modo de terapia de genes. La terapia de genes se refiere a la terapia realizada por la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta realización de la invención, los ácidos nucleicos producen su proteína codificada que media un efecto terapéutico. Se puede usar cualquiera de los procedimientos para terapia de genes disponibles en la técnica.

Demostración de Actividad Terapéutica o Profiláctica:

Los heteromultímeros o composiciones farmacéuticas descritos en esta invención se prueban in vitro y a continuación in vivo para determinar la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de su uso en humanos. Por ejemplo, los ensayos in vitro para demostrar la utilidad terapéutica o profiláctica de un compuesto o composición farmacéutica incluyen el efecto de un compuesto sobre una línea celular o una muestra de tejido del paciente. El efecto del compuesto o composición sobre la línea celular y/o muestra de tejido se puede determinar utilizando técnicas conocidas por los expertos en la materia, que incluyen, pero no se limitan a, ensayos de formación de rosetas y ensayos de lisis celular. Según la invención, los ensayos in vitro que pueden usarse para determinar si está indicada la administración de un compuesto específico, incluyen ensayos de cultivo celular in vitro en los que una muestra de tejido del paciente se cultiva en cultivo, y se expone o se administra un heteromultímero, y se observa el efecto de dicho heteromultímero sobre la muestra de tejido.

Administración y Composición Terapéutica/Profiláctica

Se proporcionan procedimientos de tratamiento, inhibición y profilaxis por administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un heteromultímero o composición farmacéutica descrita en esta invención. En una realización, el heteromultímero está sustancialmente purificado (por ejemplo, sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados). En determinadas realizaciones, el sujeto es un animal que incluye, sin limitación, animales tales como vacas, cerdos, caballos, gallinas, gatos, perros, etc. y en determinadas modalidades, un mamífero y más preferentemente, un ser humano.

Se conocen varios sistemas de administración y pueden usarse para administrar una formulación de heteromultímero descrita en esta invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor (ver, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro, etc. Los procedimientos de introducción incluyen, pero no se limitan a, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los compuestos o composiciones se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, en ciertas realizaciones, es deseable introducir las composiciones de heteromultímeros descritas en esta invención en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede ser facilitada por un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya. La administración pulmonar también se puede emplear, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente aerosolizante.

En una realización específica, es deseable administrar los heteromultímeros, o composiciones descritas en esta invención localmente en el área que necesita tratamiento; esto puede lograrse, por ejemplo, y no a modo de limitación, mediante infusión local durante cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un apósito para heridas después de cirugía, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialasticas o fibras. Preferentemente, al administrar una proteína de la invención, incluyendo un anticuerpo, se debe tener cuidado de utilizar materiales que la proteína no absorba.

En otra realización, los heteromultímeros o la composición pueden administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (ver Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat y col., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317 327; ver generalmente ibid.)

En otra realización más, los heteromultímeros o la composición pueden administrarse en un sistema de administración controlada. En una realización, se puede usar una bomba (ver Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.

14:201 (1987); Buchwald y col., Surgery 88:507 (1980); Saudek y col., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). En otra realización, se pueden usar materiales poliméricos (ver Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); ver tembién Levy y col., Science 228:190 (1985); During y col., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard y col., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). En otra realización más, se puede colocar un sistema de administración controlada cerca de la diana terapéutica, por ejemplo, el cerebro, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

Otros sistemas de administración controlada se analizan en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).

En una realización específica que comprende un ácido nucleico que codifica un heteromultímero descrito en esta invención, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión de su proteína codificada, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiada y administrándolo de modo que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (ver Patente EE. UU. No. 4.980.286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o recubriendo con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes transfectantes, o administrándolo en unión a un péptido similar a homeobox que se sabe que ingresa al núcleo (ver, por ejemplo, Joliot y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 88: 1864-1868 (1991)), etc. Alternativamente, un ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula huésped para la expresión, por recombinación homóloga.

También se proporcionan en esta invención composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de EE. UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "vehículo" hace referencia a un diluyente, adyuvante, excipiente o medio con el cual se administra el agente terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluidos los de petróleo, origen animal, vegetal o sintético, como aceite de maní, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también pueden emplearse como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Excipientes farmacéuticamente aceptables también incluyen almidón, glucosa, lactosa, sucrosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes de tamponamiento del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de administración sostenida y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales, tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. En "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma para la administración adecuada al paciente. La formulación debe adecuarse al modo de administración.

En ciertas realizaciones, la composición que comprende el heteromultímero se formula según procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local como la lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o se mezclan en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente herméticamente cerrado, como una ampolla o una bolsita que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua o solución salina estéril de grado farmacéutico. Cuando la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.

En ciertas realizaciones, las composiciones descritas en esta invención se formulan como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como las derivadas de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con cationes tales como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, isopropilamina de hidróxido férrico, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

La cantidad de la composición descrita en esta invención que será efectiva en el tratamiento, inhibición y prevención de una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante de una proteína terapéutica puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. Además, es posible emplear ensayos in vitro opcionalmente para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosis exacta a ser empleada en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad o trastorno y se decidirá según el juicio del médico y de las circunstancias de cada paciente. Dosis efectivas son extrapoladas a partir de curvas de respuesta a la dosis derivada de sistemas de prueba en modelos animales o in vitro.

Procedimientos de Producción Recombinante y Sintética de Proteínas de Heteromultímeros:

En ciertas realizaciones, los heteromultímeros se producen como moléculas recombinantes por secreción de levadura, un microorganismo tal como una bacteria o una línea celular humana o animal. En realizaciones, los polipéptidos se secretan de las células huésped.

Las realizaciones incluyen una célula, tal como una célula de levadura transformada para expresar una proteína de heteromultímero descrita en esta invención. Además de las células huésped transformadas, se proporcionan cultivos de esas células, preferiblemente un cultivo monoclonal (clónicamente homogéneo), o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio nutriente. Si el polipéptido se secreta, el medio contendrá el polipéptido, con las células o sin las células si se han filtrado o centrifugado. Se conocen y pueden usarse muchos sistemas de expresión, incluyendo bacterias (por ejemplo, E. coli y Bacillus subtilis), levaduras (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris, hongos filamentosos (por ejemplo, Aspergillus), células vegetales, células animales y células de insectos.

Un heteromultímero descrito en esta invención se produce de manera convencional, por ejemplo, a partir de una secuencia de codificación insertada en el cromosoma del huésped o en un plásmido libre. Las levaduras se transforman con una secuencia de codificación para la proteína deseada en cualquiera de las formas habituales, por ejemplo, electroporación. Los procedimientos para la transformación de levadura por electroporación se describen en Becker y Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182.

Las células transformadas con éxito, es decir, las células que contienen una construcción de ADN de la presente invención, pueden identificarse mediante técnicas bien conocidas. Por ejemplo, las células resultantes de la introducción de una construcción de expresión pueden crecer para producir el polipéptido deseado. Las células se pueden recoger y lisar y examinar su contenido de ADN en busca de la presencia del ^aDⁿutilizando un procedimiento como el descrito por Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 o Berent y col. (1985) Biotech. 3, 208. Alternativamente, la presencia de la proteína en el sobrenadante se puede detectar usando anticuerpos.

Vectores útiles de plásmidos de levadura incluyen pRS403-406 y pRS413-416 y generalmente están disponibles en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California, 92037, EE. UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integradores de levadura (YIps) e incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, 7RP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos de centrómero de levadura (Ycps).

Se ha desarrollado una variedad de procedimientos para unir operativamente el ADN a los vectores a través de extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, se pueden agregar tractos de homopolímeros complementarios al segmento de ADN para insertarlos en el ADN del vector. El vector y el segmento de ADN se unen a continuación mediante enlaces de hidrógeno entre las colas honmopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante.

Los enlazadores sintéticos que contienen uno o más sitios de restricción proporcionan un procedimiento alternativo para unir el segmento de ADN a los vectores. El segmento de ADN, generado por la digestión de restricción de endonucleasas, se trata con la ADN polimerasa del bacteriófago T4 o la ADN polimerasa 1 de E. coli, enzimas que eliminan los extremos sobresalientes de cadena sencilla con sus actividades exonucleolíticas 3' 5' y rellenan los extremos 3' encastrados con sus actividades de polimerización.

La combinación de estas actividades, por lo tanto, genera segmentos de ADN de extremos romos. Los segmentos de extremos romos se incuban a continuación con un gran exceso molar de moléculas enlazadoras en presencia de una enzima que puede catalizar la ligadura de moléculas de ADN de extremos romos, como la ADN ligasa del bacteriófago T4. Por lo tanto, los productos de la reacción son segmentos de ADN que llevan secuencias de enlazadores poliméricos en sus extremos. A continuación, estos segmentos de ADN se cortan con la enzima de restricción apropiada y se unen a un vector de expresión que se ha cortado con una enzima que produce extremos compatibles con los del segmento de ADN.

Los enlazadores sintéticos que contienen una variedad de sitios de endonucleasa de restricción están disponibles comercialmente de varias fuentes, incluyendo International Biotechnologies Inc, New Haven, Connecticut, EE. UU. Géneros ejemplares de levadura contemplados para ser útiles en la práctica de la presente invención como hospedadores para expresar la albúmina, proteínas de fusión son Pichua (anteriormente clasificada como Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Zygosaccharomyces, Debaromyces, Trichoderma, Cephalosporium, Humicola, Mucor, Neurospora, Yarrowia, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, y similares. Géneros preferidos son aquellos seleccionados de entre el grupo que consiste en Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia y Torulaspora. Ejemplos de Saccharomyces spp. son S. cerevisiae, S. italicus y S. rouxii.

Ejemplos de Kluyveromyces spp. son K. fragilis, K. lactis y K. marxianus. Una especie de Torulaspora adecuada es T. delbrueckii. Ejemplos de Pichia (Hansenula) spp. son P. angusta (anteriormente H. polymorpha), P. anomala (anteriormente H. anomala) y P. pastoris. Procedimientos para la transformación de S. cerevisiae se enseñan generalmente en EP 251 744, EP 258067 y WO 90/01063.

Especies ejemplares preferidas de Saccharomyces incluyen S. cerevisiae, S. italicus, S. diastaticus y Zygosaccharomyces rouxii. Especies ejemplares preferidas de Kluyveromyces incluyen K. fragilis y K. lactis. Especies ejemplares preferidas de Hansenula incluyen H. polymorpha (ahora Pichia angusta), H. anomala (ahora Pichia anomala) y Pichia capsulata. Otras especies ejemplares preferidas de Pichia incluyen P. pastoris. Especies ejemplares preferidas de Aspergillus incluyen A. niger y A. nidulans. Especies ejemplares preferidas de Yarrowia incluyen Y. lipolytica. Muchas especies de levadura preferidas están disponibles en el ATCC. Por ejemplo, las siguientes especies de levadura preferidas están disponibles en ATCC y son útiles en la expresión de proteínas de fusión de albúmina: Saccharomyces cerevisiae, Hansen, cepa teleomorfa BY4743 mutante yap3 (número de acceso ATCC 4022731); Saccharomyces cerevisiae Hansen, cepa teleomorfa BY4743 hsp150 mutante (número de acceso ATCC 4021266); Saccharomyces cerevisiae Hansen, cepa teleomorfa BY4743 pmt1 mutante (número de acceso ATCC 4023792); Saccharomyces cerevisiae Hansen, teleomorfa (números de acceso ATCC 20626; 44773; 44774 y 62995); Saccharomyces diastaticus Andrews y Gilliland ex van der Walt, teleomorfa (número de acceso ATCC 62987); Kluyveromyces lactis (Dombrowski) van der Walt, teleomorfa (número de acceso ATCC 76492); Pichia angusta (Teunisson y col.) Kurtzman, teleomorfa depositada como Hansenula polymorpha de Morais et Maia, teleomorfa (número de acceso ATCC 26012); Aspergillus niger van Tieghem, anamorfa (número de acceso ATCC 9029); Aspergillus niger van Tieghem, anamorfa (número de acceso ATCC 16404); Aspergillus nidulans (Eidam) Winter, anamorfa (número de acceso ATCC 48756); y Yarrowia lipolytica (Wickerham y col.) van der Walt et von Arx, teleomorfa (número de acceso ATCC 201847).

Promotores adecuados para S. cerevisiae incluyen aquellos asociados con el gen PGKI, genes GAL1 o GAL10, CYCI, PH05, TRP1, ADH1, ADH2, los genes para gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, triosa fosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, glucoquinasa, feromona de factor de apareamiento alfa, [una feromona de factor de apareamiento], el promotor PRBI, el promotor GUT2, el promotor GPDI y promotores híbridos que involucran híbridos de partes de regiones reguladoras 5' con partes de regiones reguladoras 5' de otros promotores o con sitios de activación aguas arriba (por ejemplo, el promotor de EP-A-258067).

Promotores regulables convenientes para su uso en Schizosaccharomyces pombe son el promotor represible por tiamina del gen nmt como se describe por Maundrell (1990) J. Biol. Chem 265, 10857-10864 y el promotor del gen jbpl represible por glucosa como se describe por Hoffman y Winston (1990) Genetics 124, 807-816.

Procedimientos para transformar Pichia para la expresión de genes extraños se enseñan, por ejemplo, en Cregg y col. (1993), y varias patentes de Phillips (por ejemplo, Patente EE. UU. No. 4.857.467) y kits de expresión de Pichia están disponibles comercialmente en Invitrogen Bv , Leek, Países Bajos, e Invitrogen Corp., San Diego, California. Promotores adecuados incluyen AOX1 y AOX2. Gleeson y col. (1986) J. Gen. Microbiol 132, 3459-3465 incluyen información sobre vectores de Hansenula y transformación, siendo promotores adecuados MOX1 y FMD1; mientras que EP 361991, Fleer y col. (1991) y otras publicaciones de Rhone-Poulenc Rorer enseñan cómo expresar proteínas extrañas en Kluyveromyces spp., siendo ^pG^kI un promotor adecuado.

La señal de terminación de la transcripción es preferiblemente la secuencia flanqueante 3' de un gen eucariota que contiene señales apropiadas para la terminación de la transcripción y la poliadenilación. Secuencias flanqueantes 3' adecuadas pueden ser, por ejemplo, las del gen naturalmente unido a la secuencia de control de expresión utilizada, es decir, pueden corresponder al promotor. Alternativamente, pueden ser diferentes, en cuyo caso se prefiere la señal de terminación del gen ADHI de S. cerevisiae.

En ciertas realizaciones, la proteína de heteromultímero deseada se expresa inicialmente con una secuencia líder de secreción, que puede ser cualquier líder efectivo en la levadura elegida. Líderes útiles en S. cerevisiae incluyen el del polipéptido alfa del factor de apareamiento (MFa-1) y los líderes híbridos de EP-A-387319. Tales líderes (o señales) son cortados por la levadura antes de que la albúmina madura se libere en el medio circundante. Además, tales líderes incluyen los de S. cerevisiae invertasa (SUC2) descritos en JP 62-096086 (concedida como 911036516), fosfatasa ácida (PH05), la pre-secuencia de MFa-1, 0 glucanasa (BGL2) y toxina killer; S. diastaticus glucoamilasa Il; S.-carlsbergensis a-galactosidasa (MEL1); K. lactis toxina killer; y Candida glucoarnylase.

Se proporcionan vectores que contienen un polinucleótido que codifica una proteína heteromultimérica descrita en esta invención, células huésped y la producción de proteínas de heteromultímeros por técnicas sintéticas y recombinantes. El vector puede ser, por ejemplo, un vector de fago, plásmido, viral o retroviral. Vectores retrovirales pueden ser replicación competente o replicación defectuosa. En el último caso, la propagación viral generalmente se producirá solo en células huésped complementarias.

En ciertas realizaciones, los polinucleótidos que codifican las proteínas de heteromultímeros descritas en esta invención se unen a un vector que contiene un marcador seleccionable para propagación en un huésped. Generalmente, un vector plasmídico se introduce en un precipitado, como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, puede empaquetarse in vitro utilizando una línea celular de empaquetamiento apropiada y a continuación transducirse a células huésped.

En ciertas realizaciones, el inserto polinucleotídico está operativamente unido a un promotor apropiado, tal como el promotor fago lambda PL, los promotores E. coli lac, trp, phoA y rac, los promotores SV40 temprano y tardío y promotores de LTR retrovirales, por nombrar algunos. El experto en la materia conocerá otros promotores adecuados. Las construcciones de expresión contendrán además sitios para el inicio de la transcripción, la terminación y, en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para traducción. La porción de codificación de las transcripciones expresadas por las construcciones incluirá preferiblemente un codón de inicio de traducción al principio y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) colocado apropiadamente en el extremo del polipéptido a traducir.

Como se indica, los vectores de expresión incluirán preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Dichos marcadores incluyen dihidrofolato reductasa, G418, glutamina sintasa o resistencia a la neomicina para cultivo de células eucariotas, y genes de resistencia a la tetraciclina, kanamicina o ampicilina para el cultivo en E. coli y otras bacterias. Ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, tales como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura (p. ej., Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris (número de acceso ATCC 201178)); células de insectos tales como células Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS, NSO, 293 y células de melanoma de Bowes; y células vegetales. Medios de cultivo apropiados y condiciones para las células huésped descritas anteriormente se conocen en la técnica.

Entre los vectores preferidos para usar en bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles de QIAGEN, Inc.; vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A; pNH46A, disponibles de Stratagene Cloning Systems, Inc.; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia Biotech, Inc. Entre los vectores eucariotas preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles en Pharmacia. Vectores de expresión preferidos para uso en sistemas de levadura incluyen, pero no se limitan a pYES2, pYD1, pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K y PAO815 (todos disponibles en Invitrogen, Carlbad, Ca ). Otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para el experto en la materia.

En una realización, los polinucleótidos que codifican una proteína de heteromultímero descrita en esta invención se fusionan para señalar secuencias que dirigirán la localización de una proteína de la invención a compartimentos particulares de una célula procariota o eucariota y/o dirigirán la secreción de una proteína de la invención a partir de una célula procariota o eucariota. Por ejemplo, en E. coli, se puede desear dirigir la expresión de la proteína al espacio periplásmico. Ejemplos de secuencias señal o proteínas (o fragmentos de las mismas) a las que se fusionan las proteínas heteromultiméricas para dirigir la expresión del polipéptido al espacio periplásmico de las bacterias incluyen, pero no se limitan a, la secuencia de señal pelB, secuencia de señal de la proteína de unión a la maltosa (MBP), MBP, la secuencia de señal ompA, la secuencia de señal de la subunidad B de enterotoxina termolábil de E. coli y la secuencia de señal de fosfatasa alcalina. Varios vectores están disponibles comercialmente para la construcción de proteínas de fusión que dirigirán la localización de una proteína, como la serie de vectores pMAL (particularmente la serie pMAL-.rho) disponible de New England Biolabs. En una realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de polinucleótidos de la invención pueden fusionarse a la secuencia de señal de pectato liasa pelB para aumentar la eficacia de la expresión y purificación de tales polipéptidos en bacterias Gram negativas. Ver, Patente EE.UU. Nos. 5.576.195 y 5.846.818.

Ejemplos de péptidos señal que se fusionan con una proteína heteromultimérica para dirigir su secreción en células de mamífero incluyen, pero no se limitan a, la secuencia de señal MPIF-1 (por ejemplo, los aminoácidos 1-21 de número de acceso GenBank AAB51134), la secuencia de señal de estaniocalcina (MLQNSAVLLLLVISASA) y una secuencia de señal de consenso (MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG). Una secuencia de señal adecuada que puede usarse junto con sistemas de expresión basado en baculovirus es la secuencia de señal gp67 (p. ej., los aminoácidos 1-19 de número de acceso GenBank AAA72759).

Vectores que usan glutamina sintasa (GS) o DHFR como marcadores seleccionables pueden amplificarse en presencia de los fármacos metionina sulfoximina o metotrexato, respectivamente. Una ventaja de los vectores basados en glutamina sintasa es la disponibilidad de líneas celulares (por ejemplo, la línea celular de mieloma murino, NSO) que son negativas para la glutamina sintasa. Sistemas de expresión de glutamina sintasa también pueden funcionar en células que expresan glutamina sintasa (p. ej., células de ovario de hámster chino (CHO)) al proporcionar un inhibidor adicional para impedir el funcionamiento del gen endógeno. Un sistema de expresión de glutamina sintasa y componentes del mismo se detallan en publicaciones PCT: WO87/04462; WO86/05807; WO89/10036; WO89/10404; y WO91/06657. Además, vectores de expresión de glutamina sintasa se pueden obtener de Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH). La expresión y producción de anticuerpos monoclonales usando un sistema de expresión GS en células de mieloma murino se describe en Bebbington y col., Bio/technology 10: 169 (1992) y en Biblia y Robinson Biotechnol. Prog. 11:1(1995).

También se proporcionan células huésped que contienen construcciones de vectores descritas en esta invención, y adicionalmente células huésped que contienen secuencias de nucleótidos que están operativamente asociadas con una o más regiones de control heterólogas (por ejemplo, promotor y/o potenciador) usando procedimientos conocidos en la técnica. La célula huésped puede ser una célula eucariota superior, como una célula de mamífero (p. ej., una célula derivada de ser humano), o una célula eucariota inferior, como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariota, como una célula bacteriana. Se puede elegir una cepa huésped que modula la expresión de las secuencias de genes insertadas, o modifica y procesa el producto génico de la forma específica deseada. La expresión de ciertos promotores puede elevarse en presencia de ciertos inductores; por lo tanto, la expresión del polipéptido genéticamente modificado puede controlarse. Además, las diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación traduccional y postraduccional (por ejemplo, fosforilación, escisión) de proteínas. Se pueden seleccionar líneas celulares apropiadas para garantizar la modificación y el procesamiento deseados de la proteína extraña expresada.

La introducción de los ácidos nucleicos y las construcciones de ácido nucleico de la invención en la célula huésped puede efectuarse mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros procedimientos. Dichos procedimientos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, como Davis y col., Basic Methods In Molecular Biology (1986). Se contempla específicamente que los polipéptidos de la presente invención pueden expresarse de hecho por una célula huésped que carece de un vector recombinante.

Además de abarcar células huésped que contienen las construcciones de vectores discutidas en esta invención, la invención también abarca células huésped primarias, secundarias e inmortalizadas de origen vertebrado, particularmente origen mamífero, que han sido diseñadas para eliminar o reemplazar material genético endógeno (por ejemplo, la secuencia de codificación correspondiente a un polipéptido de carga se reemplaza con una proteína de heteromultímero correspondiente al polipéptido de carga), y/o para incluir material genético. El material genético asociado operativamente con el polinucleótido endógeno puede activar, alterar y/o amplificar polinucleótidos endógenos.

Además, procedimientos conocidos en la técnica pueden usarse para asociar operativamente polinucleótidos heterólogos (por ejemplo, polinucleótidos que codifican una proteína de albúmina, o un fragmento o variante de la misma) y/o regiones de control heterólogas (por ejemplo, promotor y/o potenciador) con secuencias de polinucleótidos endógenos que codifican una proteína terapéutica mediante recombinación homóloga (ver, por ejemplo, Pat. EE. UU. No. 5,641,670, publicada jun. 24, 1997; International Publication Number WO 96/29411; International Publication Number WO 94/12650; Koller y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); y Zijlstra y col., Nature 342:435-438 (1989).

Proteínas de heteromultímeros descritas en esta invención pueden recuperarse y purificarse de cultivos celulares recombinantes por procedimientos bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de interacción de carga hidrófoba y cromatografía de lectina. Más preferiblemente, se emplea cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") para la purificación.

En ciertas realizaciones, las proteínas de heteromultímeros de la invención se purifican usando cromatografía de intercambio aniónico que incluye, pero no se limita a, cromatografía sobre Q-sefarosa, DEAE sefarosa, poros HQ, poros DEAF, Toyopearl Q, Toyopearl QAE, Toyopearl DEAE, Resource/Source Q y columnas DEAE, Fractogel Q y DEAE.

En realizaciones específicas, las proteínas descritas en esta invención se purifican usando cromatografía de intercambio catiónico que incluye, sin limitación, SP-sefarosa, CM sefarosa, poros HS, poros CM, Toyopearl SP, Toyopearl CM, Resource/Source S y columnas CM, Fractogel S y CM y sus equivalentes y comparables.

Además, las proteínas de heteromultímeros descritas en esta invención pueden sintetizarse químicamente usando procedimientos conocidos en la técnica (por ejemplo, ver Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y. y Hunkapiller y col., Nature, 310: 105-111 (1984)). Por ejemplo, un polipéptido correspondiente a un fragmento de un polipéptido puede sintetizarse mediante el uso de un sintetizador de péptidos. Además, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos químicos de aminoácidos como una sustitución o adición en la secuencia de polipéptidos. Aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido 2,4diaminobutírico, ácido alfa-amino isobutírico, ácido 4aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, p-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos de diseño tales como p-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Na-metil aminoácidos y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser D (dextrógiro) o L (levógiro).

Se proporcionan heteromultímeros que se modifican de manera diferencial durante o después de la traducción, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera de numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas, que incluyen, pero no se limitan a, escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina; etc.

Modificaciones postraduccionales adicionales incluidas en esta invención incluyen, por ejemplo, cadenas de carbohidratos unidas a N o unidas a O, procesamiento de extremos N-terminales o C-terminales), unión de fracciones químicas a la cadena principal de aminoácidos, modificaciones químicas de cadenas de carbohidratos unidas a N o unidas a O, y adición o deleción de un residuo de metionina N-terminal como resultado de la expresión de células huésped procariotas. Las proteínas heteromultiméricas se modifican con una etiqueta detectable, como una etiqueta enzimática, fluorescente, isotópica o de afinidad para permitir la detección y el aislamiento de la proteína.

Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen yodo, carbono, azufre, tritio, indio, tecnecio, talio, galio, paladio, molibdeno, xenón, flúor.

En realizaciones específicas, las proteínas heteromultiméricas o fragmentos o variantes de las mismas están unidos a quelantes macrocíclicos que se asocian con iones de radiometales.

Como se mencionó, el heteromultímero descrito en esta invención se modifica mediante procedimientos naturales, tales como el procesamiento postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la materia. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en diversos grados en varios sitios en un polipéptido dado. Polipéptidos de la invención pueden ser ramificados, por ejemplo, debido a una ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificaciones. Polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden producirse como resultado de procedimientos naturales de postraducción o pueden obtenerse mediante procedimientos sintéticos. Modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una fracción hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de puentes de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de anclas de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia tal como arginilación y ubiquitinación; (Ver, por ejemplo, PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2a Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter y col., Meth. Enzymol.

182:626-646 (1990); Rattan y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)).

En ciertas realizaciones, proteínas heteromultiméricas también se pueden unir a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación de polipéptidos que se unen por, que se unen a o se asocian con proteínas de fusión de albúmina de la invención. Dichos soportes sólidos incluyen, sin limitación, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.

En realizaciones donde la proteína heteromultimérica comprende solo el dominio VH de un anticuerpo, puede ser necesario y/o deseable coexpresar la proteína con el dominio VL del mismo anticuerpo, de modo que la proteína de fusión a albúmina VH y la proteína VL se asociarán (covalentemente o no covalentemente) después de la traducción. En realizaciones donde la proteína heteromultimérica comprende solo el dominio VL de un anticuerpo, puede ser necesario y/o deseable coexpresar la proteína de fusión con el dominio VH del mismo anticuerpo, de modo que la proteína de fusión a albúmina VL y la proteína VH se asociarán (covalentemente o no covalentemente) después de la traducción.

También se proporcionan en esta invención derivados químicamente modificados de las proteínas heteromultiméricas que pueden proporcionar ventajas adicionales tales como mayor solubilidad, estabilidad y tiempo de circulación del polipéptido, o disminución de la inmunogenicidad (ver Pat. EE. UU. No. 4.179.337). Las fracciones químicas para la derivatización se pueden seleccionar entre polímeros solubles en agua como el polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico y similares. Las proteínas se pueden modificar en posiciones aleatorias dentro de la molécula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir uno, dos, tres o más fracciones químicas unidas.

El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. Para el polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que, en las preparaciones de polietilenglicol, unas moléculas pesarán más y otras menos que el peso molecular declarado) para facilitar el manejo y fabricación. Se pueden utilizar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración deseada de la liberación continuada, los efectos, si los hubiera, sobre la actividad biológica, la facilidad de manejo, el grado o la falta de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol sobre una proteína terapéutica o análogo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de aproximadamente 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 105.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000, o 100.000 kDa.

La presencia y la cantidad de proteínas heteromultiméricas descritas en esta invención pueden determinarse usando ELISA, un inmunoensayo bien conocido en la técnica. En un protocolo ELISA que sería útil para detectar/cuantificar heteromultímeros descritos en esta invención, comprende los pasos de recubrir una placa ELISA con un anticuerpo anti-albúmina sérica humana, bloquear la placa para evitar la unión no específica, lavar la placa ELISA, agregar un solución que contiene la proteína descrita en esta invención (en una o más concentraciones diferentes), agregando un anticuerpo secundario específico de polipéptido anti-carga acoplado a un marcador detectable (como se describe en esta invención o conocido en la técnica), y detectando la presencia del anticuerpo secundario. En una versión alternativa de este protocolo, la placa ELISA podría estar recubierta con el anticuerpo específico anti-polipéptido de carga y el reactivo secundario marcado podría ser el anticuerpo específico anti-albúmina humana.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: El procedimiento de División de Proteínas

La asociación específica de proteína-proteína es impulsada por una fuerte complementariedad de superficie entre las parejas que interactúan y los cambios estructurales y termodinámicos que la acompañan. La complementariedad de la superficie brinda la oportunidad de formar contactos que apoyan la creación de interacciones electrostáticas e hidrófobas favorables. Interacciones electrostáticas implican la formación de puentes salinos, enlaces de hidrógeno y las interacciones de dispersión generalizadas. La exclusión de solventes y la reorganización alrededor de grupos atómicos no polares en la interfaz y sus efectos entrópicos asociados juegan un papel en el componente hidrófobo de la termodinámica de unión. Residuos con geometrías optimizadas para la interacción hidrófoba entre sí formarán contactos (es decir, contactos de apilamiento, pi-pi, catión-pi favorables para estabilizar una interfaz proteína-proteína). Efectos termodinámicos similares controlan procedimientos de plegamiento de proteínas de múltiples etapas que implican la preorganización de conjuntos estructurales secundarios y dominios terciarios, a lo que sigue su asociación para formar el estado cuaternario plegado de la proteína. Un mecanismo alternativo para el plegamiento y unión de proteínas implica un procedimiento de plegado y unión de proteínas acopladas que finalmente resulta en el estado cuaternario de la proteína. Es razonable suponer que habría aspectos de ambos procedimientos en acción durante la formación de la estructura cuaternaria de una proteína compleja. En el contexto de alguna asociación proteína-proteína, los componentes proteicos individuales deben ser coexpresados o estar presentes en el mismo medio y cada uno de los componentes o monómeros se plegará de manera estable en su estado estructural final solo en asociación con su pareja obligada. (Fig. 6)

Como se describe en esta invención, la generación de una proteína dividida implica reconocer un sitio de segmentación en la proteína nativa, utilizando información de secuencia, estructura secundaria y pliegue que producirá al menos dos polipéptidos transportadores que forman eficientemente la estructura proteica cuasi-nativa mediante autoensamblaje para formar un heteromultímero juntos. Por ejemplo, estos polipéptidos transportadores de proteínas divididas se autoensamblan selectivamente y forman el estado cuasi-nativo cuando se coexpresan. Mientras se genera un par de polipéptidos transportadores complementarios de proteína dividida, en cierto modo, el intento es emular una serie de complejos proteína-proteína obligados que se presentan de manera natural y que exhiben su funcionalidad como complejo mientras no son funcionales en su estado no complejo. Una implementación exitosa de la estrategia da como resultado polipéptidos que se autoensamblan selectivamente para formar heteromultímeros entre sí, son solubles como entidades individuales y, por relevancia funcional, no perjudican el plegamiento, la unión y la actividad de otros componentes en el ambiente. La naturaleza intrínseca de los polipéptidos para reconstituirse entre sí tiene aplicaciones en el área de creación de entidades de fusión heteromultimérica a partir de moléculas de carga que no son eficientes para formar multímeros por sí mismas. En alguna realización, el papel funcional de los segmentos de proteína divididos es actuar como polipéptidos transportadores que impulsan la heteromultimerización y la localización espacial de las múltiples moléculas de carga fusionadas a los polipéptidos transportadores.

Los sitios de segmentación dentro de la albúmina sérica humana ideada en esta invención se diseñaron sobre la base de los siguientes criterios de decisión. (1) El sitio de segmentación debe residir en un lazo con SASA relativo alto y un conteo limitado de contacto de residuos con el resto de la proteína. El objetivo era maximizar las posibilidades de encontrar lazos flexibles y accesibles que tengan menos probabilidades de contribuir a la estabilidad del núcleo de la proteína y, por lo tanto, impactar la estabilidad de la estructura de albúmina cuasi-nativa ensamblada en relación con la albúmina sérica humana. (2) La interfaz debe ser rica en residuos de focos. Por 'foco' nos referimos a residuos individuales o grupales involucrados en redes de interacciones bien conectadas. Las interacciones podrían basarse en interacciones típicas observadas en proteínas tales como enlaces de hidrógeno, interacciones de residuos cargados como puentes salinos, contactos de van der Waals que muestran una fuerte complementariedad estructural y clusters de residuos hidrófobos. Eso es para maximizar la estabilidad de la interfaz e impedir que el complejo se disocie. (3) La interfaz debe ser lo más apolar, extensa e interdigitada posible. Nuevamente, eso fue para maximizar las posibilidades de que las dos cadenas existan como un complejo permanente y no se disocien en sus componentes individuales. (4) En una realización, nuestro objetivo era retener un enlace disulfuro natural presente en la albúmina de suero humano a través de las secciones segmentadas para conectar covalentemente las dos cadenas. El objetivo era aumentar aún más la estabilidad de la estructura heterodimerizante cuasi-nativa similar a proteína que se autoensambla a partir de los dos segmentos derivados después de la segmentación. Localizamos regiones de lazo en la estructura/secuencia de albúmina de suero humano que satisfacen los criterios de disulfuro descritos en esta invención, es decir, tienen un disulfuro muy cerca del sitio de segmentación en la región del lazo. Además de la ventaja obvia de la reticulación covalente de las dos cadenas, este disulfuro también podría servir como un sustituto para el lazo que se abre en la segmentación. (5) En una realización, diseñamos un enlace disulfuro a través de los dos segmentos mediante la introducción de mutaciones individuales de aminoácidos a cisteína en posiciones seleccionadas en cada uno de los dos segmentos derivados. (6) En una realización, diseñamos aminoácidos en la interfaz de los dos segmentos para aumentar o mejorar aún más los focos en la interfaz o mejorar la complementariedad estructural y fisicoquímica entre los dos segmentos en la estructura de albúmina cuasi-nativa ensamblada.

La Tabla 3 a continuación muestra los parámetros de la interfaz y las energías libres de asociación para andamios de AlbuCORE. El área de interfaz enterrada entre la estructura cuasi-nativa derivada del ensamblaje del primer y segundo segmento derivado de HSA puede calcularse utilizando un cálculo basado en estructura utilizando algoritmos conocidos en la técnica (por ejemplo, H. Edelsbrunner y P. Koehl. The weighted volume derivative of a space filling diagram. Proc. Natl. Acad. Sci. (uSa ) 100, 2203-2208 (2003)). El área calculada se puede clasificar además en área de superficie polar y apolar. El área apolar es un indicador de cadenas laterales de aminoácidos hidrófobos enterrados en la interfaz. El AAGassoc se refiere a la diferencia de energía libre calculada entre el estado asociado y el estado no asociado de las estructuras de dos segmentos. La energía libre calculada teóricamente explica los enlaces de hidrógeno y otras interacciones electrostáticas, el contacto de van der Waals, los efectos de desolvatación y la complementariedad de la superficie entre las dos superficies del segmento de contacto. Los procedimientos para calcular la energía libre de asociación son conocidos en la técnica (por ejemplo, Simonson T, Archontis G, Karplus M. Free energy simulations come of age: protein-ligand recognition. Acc Chem Res. (2002) 35, 430-7)

T l : P r m r in rf z n r í li r i i n r n mi Al RE

La Figura 32 muestra el gráfico de contactos de residuos realizado por un subconjunto de residuos en la albúmina de suero humano derivada de su estructura 3-dimensional. Contactos de residuos pueden definirse por la interacción entre residuos o cierta interacción átomo-átomo dentro de residuos que se encuentran dentro de un intervalo de distancia especificado y son de cierta naturaleza fisicoquímica. Residuos o grupos de residuos con fuertes contactos de residuos pueden reconocerse como focos. Tal análisis de contacto de residuos también puede emplearse para determinar residuos de lazo (o regiones estructurales secundarias no estructuradas en la estructura de la proteína 3D), tales como los que hacen contacto limitado de residuos. La gráfica también muestra un área de superficie accesible al solvente (SASA) residual que puede calcularse usando algoritmos conocidos en la técnica (por ejemplo, H.

Edelsbrunner y P. Koehl. The weighted volume derivative of a space filling diagram. Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.) 100, 2203-2208 (2003)).

La Figura 33 muestra un gráfico de la naturaleza de los contactos e interacciones logradas por residuos en focos seleccionados en albúmina de suero humano. La Figura 34 es una representación gráfica de residuos en focos o clusters (parches) de residuos en focos en albúmina de suero humano.

Tabla 4. Nuevos sitios de segmentación en HSA (AlbuCORE) y la naturaleza del lazo donde se introdujo la segmentación. La columna "longitud del lazo" se refiere a la longitud (en residuos de aminoácidos) del lazo que conecta los dos elementos de estructura secundaria más cercanos, y la columna "distancia str seg" muestra la distancia entre los carbonos Ca de los extremos N y C de esos mismos elementos de estructura secundaria (todas las hélices a en este caso). La interfaz S-S indica el enlace disulfuro en la interfaz de los segmentos derivados (polipéptidos transportadores .

Ejemplo 2: Preparación de proteínas de heteromultímeros basadas en HA/aloalbúmina

Se muestra un procedimiento para determinar el sitio de segmentación a lo largo de la secuencia y estructura de HSA que producirá cadenas de polipéptidos monoméricos que se pliegan de manera estable y se autoensamblan para formar una estructura cuaternaria cuasi-nativa de la proteína original. Uno de los requisitos críticos para dicha asociación estable es la formación de una gran área enterrada de complementariedad superficial en la interfaz entre las cadenas de polipéptidos. El pliegue nativo de la proteína original proporciona una indicación de la complementariedad natural de las regiones dentro de la proteína.

La Figura 2 muestra el área de superficie accesible al solvente enterrada en la interfaz de dos polipéptidos basados en albúmina que idealmente se pliegan en la estructura cuasi-nativa de HSA, cuando el punto de segmentación se mueve a lo largo de la secuencia de proteínas. La marca discontinua en la parte inferior indica las regiones estructurales secundarias helicoidales en la estructura de la proteína. El análisis indica que una gran área de superficie, del orden de aproximadamente 2000 A2 o mayor, está enterrada cuando la segmentación dividida se introduce en cualquier lugar entre los residuos 30 y 520, con algunas excepciones, conservando las interfaces hidrófobas. En alguna realización, el área superficial molecular calculada se emplea en lugar del área superficial accesible al solvente. En alguna realización, el área de superficie enterrada está en el intervalo de 2000 A2a 6000 A2. Se observó una interfaz enterrada más grande para el ABH1 no covalente. Además, el análisis también reveló que algunas regiones de lazo están relativamente expuestas a la superficie. La albúmina tiene un número excepcionalmente grande de puentes disulfuro que contribuyen a la estabilidad de la estructura proteica nativa. La sección de la proteína cerca de los residuos 110, 190, 300, 390 y 500 proporciona sitios para la segmentación que no divide los residuos implicados en un enlace disulfuro a través de los dos polipéptidos transportadores. La segmentación en otras regiones daría como resultado heterodímeros con un enlace disulfuro de reticulación entre los dos pares de polipéptidos transportadores. La Figura 3 presenta una representación modelo de una de estas estructuras de albúmina cuasi-nativa derivada de la eliminación del lazo de los residuos 294 a 303 en la secuencia HSA. El área de superficie enterrada total para los dos polipéptidos basados en albúmina de SEQ ID No. 2, y SEQ ID No: 3 mostrados en esta invención es aproximadamente 5500 Á2. Esto es considerablemente mayor que el promedio de 1910 - 3880 Á2 observado en varias estructuras cocomplejas heterodiméricas y homodiméricas de proteína-proteína [Bahadhur R.P. & Zacharias M. (2008) Cell Mol Life Sci 65, 1059-1072]. Esto sugiere que existe una gran probabilidad de que los dos polipéptidos se asocien selectivamente entre sí si la ruta de plegamiento de los dos polipéptidos es bastante independiente entre sí.

En un aspecto de esta invención, la formación selectiva de una estructura cuasi-nativa estable con los dos polipéptidos (el par formado por SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3 o el par transportador formado por SEQ ID No. 8 y S^eQ ID No. 10) nos da la oportunidad de emplear estos polipéptidos para impulsar la formación de moléculas biespecíficas u otras moléculas multifuncionales después de fusionar las proteínas de carga apropiadas de interés para el extremo N o C de los polipéptidos basados en albúmina empleados como polipéptidos transportadores. Se pueden diseñar otros patrones de segmentación alternativos que dan como resultado un heterodímero de pares de polipéptidos transportadores. Las proteínas de carga fusionadas pueden ser dominios de unión a antígeno u otras cargas útiles como quimiotoxinas, radiotoxinas o citocinas (como se representa en la Figura 4). Los heterodímeros resultantes tienen muchas de las propiedades favorables intrínsecas a HSA, incluidas propiedades como la vida media y la estabilidad en el suero, características de transporte de penetrabilidad tisular y baja inmunogenicidad. Enlazadores tradicionales como (Gly4Ser)x pueden usarse para la fusión de la proteína de carga con el polipéptido transportador. En otro aspecto de esta invención, cada uno de los polipéptidos transportadores basados en HSA se fusiona independientemente al extremo C de dos cadenas pesadas en una molécula de Fc biespecífica (como se representa en la Figura 5). El emparejamiento fuerte y selectivo de los dos polipéptidos transportadores (como SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3) impulsa la heterodimerización selectiva del Fc y también contribuye a su estabilidad y otras propiedades farmacocinéticas valiosas.

La secuencia NP_000468.1 GI 4502027 de preproteína de albúmina sérica de ARNm de NM_000477.5, Consensus CDS (CCDS) ID 3555.1

SEQ ID No. 4: Residuo 1-24 (EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAG) es la región de secuencia de señal de exportación N-terminal que se escinde. Esta secuencia cumple el mismo papel que la secuencia de señal natural pero está optimizada para líneas celulares de mamíferos y CHO.

SEQ ID No. 1: gi|4502027|ref|NP_000468.1| preproproteína de albúmina sérica [Homo sapiens] Entre paréntesis es la secuencia de exportación N-terminal que se escinde, lo que da como resultado albúmina sérica.

( E F A T M A V M A P R T L V L L L S G A L A L T Q T W A G ) D A H K S E V A H R F K D L G E E N F K A

L V L I A F A Q Y L Q Q C P F E D H V K L V N E V T E F A K T C V A D E S A E N C D K S L H T L F G D K

L C T V A T L R E T Y G E M A D C C A K Q E P E R N E C F L Q H K D D N P N L P R L V R P E V D V M C T

A F H D N E E T F L K K Y L Y E I A R R H P Y F Y A P E L L F F A K R Y K A A F T E C C Q A A D K A A C

L L P K L D E L R D E G K A S S A K Q R L K C A S L Q K F G E R A F K A W A V A R L S Q R F P K A E F A

E V S K L V T D L T K V H T E C C H G D L L E C A D D R A D L A K Y I C E N Q D S I S S K L K E C C E K

P L L E K S H C I A E V E N D E M P A D L P S L A A D F V E S K D V C K N Y A E A K D V F L G M F L Y E

Y A R R H P D Y S V V L L L R L A K T Y E T T L E K C C A A A D P H E C Y A K V F D E F K P L V E E P Q

N L I K Q N C E L F E Q L G E Y K F Q N A L L V R Y T K K V P Q V S T P T L V E V S R N L G K V G S K C

C K H P E A K R M P C A E D Y L S V V L N Q L C V L H E K T P V S D R V T K C C T E S L V N R R P C F S

A L E V D E T Y V P K E F N A E T F T F H A D I C T L S E K E R Q I K K Q T A L V E L V K H K P K A T K

E Q L K A V M D D F A A F V E K C C K A D D K E T C F A E E G K K L V A A S Q A A L G L SEQ ID No 5: Secuencia CCDS de nucleótidos de albúmina de suero humano (1852 nt)

G A A T T C G C C A C T A T G G C T G T G A T G G C C C C T A G G A C C C T G G T G C T G C T G C T G T C C G G A G C T C T G G C T C T G A C T C A G A C C T G G G C T G G A G A T G C A C A C A A G A G T G A G G T T G C T C A T C G G T T T A A A G A T T T G G G A G A A G A A A A T T T C A A A G C C T T G G T G T T G A T T G C C T T T G C T C A G T A T C T T C A G C A G T G T C C A T T T G A A G A T C A T G T A A A A T T A G T G A A T G A A G T A A C T G A A T T T G C A A A A A C A T G T G T T G C T G A T G A G T C A G C T G A A A A T T G T G A C A A A T C A C T T C A T A C C C T T T T T G G A G A C A A A T T A T G C A C A G T T G C A A C T C T T C G T G A A A C C T A T G G T G A A A T G G C T G A C T G C T G T G C A A A A C A A G A A C C T G A G A G A A A T G A A T G C T T C T T G C A A C A C A A A G A T G A C A A C C C A A A C C T C C C C C G A T T G G T G A G A C C A G A G G T T G A T G T G A T G T G C A C T G C T T T T C A T G A C A A T G A A G A G A C A T T T T T G A A A A A A T A C T T A T A T G A A A T T G C C A G A A G A C A T C C T T A C T T T T A T G C C C C G G A A C T C C T T T T C T T T G C T A A A A G G T A T A A A G C T G C T T T T A C A G A A T G T T G C C A A G C T G C T G A T A A A G C T G C C T G C C T G T T G C C A A A G C T C G A T G A A C T T C G G G A T G A A G G G A A G G C T T C G T C T G C C A A A C A G A G A C T C A A G T G T G C C A G T C T C C A A A A A T T T G G A G A A A G A G C T T T C A A A G C A T G G G C A G T A G C T C G C C T G A G C C A G A G A T T T C C C A A A G C T G A G T T T G C A G A A G T T T C C A A G T T A G T G A C A G A T C T T A C C A A A G T C C A C A C G G A A T G C T G C C A T G G A G A T C T G C T T G A A T G T G C T G A T G A C

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C A A G C T G C C T T A G G C T T A T G A

La secuencia de proteínas y nucleótidos de polipéptidos basados en albúmina útiles como polipéptidos transportadores son los siguientes:

Heteromultimer 1 basado en albúmina:

Polipéptido transportador basado en albúmina 1-Ver 1: SEQ ID No. 2:

D A H K S E V A H R F K D L G E E N F K A L V L I A F A Q Y L Q Q C P F E D H V K L V N E V T E F A K T C V A D E

S A E N C D K S L H T L F G D K L C T V A T L R E T Y G E M A D C C A K Q E P E R N E C F L Q H K D D N P N L P R

L V R P E V D V M C T A F H D N E E T F L K K Y L Y E I A R R H P Y F Y A P E L L F F A K R Y K A A F T E C C Q A

A D K A A C L L P K L D E L R D E G K A S S A K Q R L K C A S L Q K F G E R A F K A W A V A R L S Q R F P K A E F

A E V S K L V T D L T K V H T E C C H G D L L E C A D D R A D L A K Y I C E N Q D S I S S K L K E C C E K P L L E

K S H C I A E V

Secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido transportador basado en albúmina 1-Ver 1: SEQ ID No. 6:

G A T G C A C A C A A G A G T G A G G T T G C T C A T C G G T T T A A A G A T T T G G G A G A A G A A A A T T T C

A A A G C C T T G G T G T T G A T T G C C T T T G C T C A G T A T C T T C A G C A G T G T C C A T T T G A A G A T

C A T G T A A A A T T A G T G A A T G A A G T A A C T G A A T T T G C A A A A A C A T G T G T T G C T G A T G A G

T C A G C T G A A A A T T G T G A C A A A T C A C T T C A T A C C C T T T T T G G A G A C A A A T T A T G C A C A

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C C T G A G A G A A A T G A A T G C T T C T T G C A A C A C A A A G A T G A C A A C C C A A A C C T C C C C C G A

T T G G T G A G A C C A G A G G T T G A T G T G A T G T G C A C T G C T T T T C A T G A C A A T G A A G A G A C A

T T T T T G A A A A A A T A C T T A T A T G A A A T T G C C A G A A G A C A T C C T T A C T T T T A T G C C C C G

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G G A G A T C T G C T T G A A T G T G C T G A T G A C A G G G C G G A C C T T G C C A A G T A T A T C T G T G A A

A A T C A A G A T T C G A T C T C C A G T A A A C T G A A G G A A T G C T G T G A A A A A C C T C T G T T G G A A

A A A T C C C A C T G C A T T G C C G A A G T G T G A

Polipéptido transportador basado en albúmina 2-Ver1: SEQ ID No. 3:

S L A A D F V E S K D V C K N Y A E A K D V F L G M F L Y E Y A R R H P D Y S V V L L L R L A K T Y E T T L E K C

C A A A D P H E C Y A K V F D E F K P L V E E P Q N L I K Q N C E L F E Q L G E Y K F Q N A L L V R Y T K K V P Q

V S T P T L V E V S R N L G K V G S K C C K H P E A K R M P C A E D Y L S V V L N Q L C V L H E K T P V S D R V T

K C C T E S L V N R R P C F S A L E V D E T Y V P K E F N A E T F T F H A D I C T L S E K E R Q I K K Q T A L V E

L V K H K P K A T K E Q L K A V M D D F A A F V E K C C K A D D K E T C F A E E G K K L V A A S Q A A L G L

Secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido transportador basado en albúmina 2-Ver1: SEQ ID No. 7:

T C A T T A G C T G C T G A T T T T G T T G A A A G T A A G G A T G T T T G C A A A A A C T A T G C T G A G G C A

A A G G A T G T C T T C C T G G G C A T G T T T T T G T A T G A A T A T G C A A G A A G G C A T C C T G A T T A C

T C T G T C G T G C T G C T G C T G A G A C T T G C C A A G A C A T A T G A A A C C A C T C T A G A G A A G T G C

T G T G C C G C T G C A G A T C C T C A T G A A T G C T A T G C C A A A G T G T T C G A T G A A T T T A A A C C T

C T T G T G G A A G A G C C T C A G A A T T T A A T C A A A C A A A A T T G T G A G C T T T T T G A G C A G C T T

G G A G A G T A C A A A T T C C A G A A T G C G C T A T T A G T T C G T T A C A C C A A G A A A G T A C C C C A A

G T G T C A A C T C C A A C T C T T G T A G A G G T C T C A A G A A A C C T A G G A A A A G T G G G C A G C A A A

T G T T G T A A A C A T C C T G A A G C A A A A A G A A T G C C C T G T G C A G A A G A C T A T C T A T C C G T G

G T C C T G A A C C A G T T A T G T G T G T T G C A T G A G A A A A C G C C A G T A A G T G A C A G A G T C A C C

A A A T G C T G C A C A G A A T C C T T G G T G A A C A G G C G A C C A T G C T T T T C A G C T C T G G A A G T C

G A T G A A A C A T A C G T T C C C A A A G A G T T T A A T G C T G A A A C A T T C A C C T T C C A T G C A G A T

A T A T G C A C A C T T T C T G A G A A G G A G A G A C A A A T C A A G A A A C A A A C T G C A C T T G T T G A G

C T C G T G A A A C A C A A G C C C A A G G C A A C A A A A G A G C A A C T G A A A G C T G T T A T G G A T G A T

T T C G C A G C T T T T G T A G A G A A G T G C T G C A A G G C T G A C G A T A A G G A G A C C T G C T T T G C C

G A G G A G G G T A A A A A A C T T G T T G C T G C A A G T C A A G C T G C C T T A G G C T T A T G A

Heteromultímero basado en albúmina 2:

Polipéptido transportador basado en albúmina 1-Ver 2: SEQ ID No. 8:

K S H C I A E V E N D E M P A D L P S L A A D F V E S K D V C K N Y A E A K D V F L G M F L Y E Y A R A

Secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido transportador basado en albúmina 1-Ver 2: SEQ ID No. 9:

A A A T C C C A C T G C A T T G C C G A A G T G G A A A A T G A T G A G A T G C C T G C T G A C T T G C C T T C A

T T A G C T G C T G A T T T T G T T G A A A G T A A G G A T G T T T G C A A A A A C T A T G C T G A G G C A A A G

G A T G T C T T C C T G G G C A T G T T T T T G T A T G A A T A T G C A A G A G C A T G A

Polipéptido transportador basado en albúmina 2-Ver 2: SEQ ID No. 10:

S V V L L L R L A K T Y E T T L E K C C A A A D P H E C Y A K V F D E F K P L V E E P Q N L I K Q N C E L F E Q L

G E Y K F Q N A L L V R Y T K K V P Q V S T P T L V E V S R N L G K V G S K C C K H P E A K R M P C A E D Y L S V

V L N Q L C V L H E K T P V S D R V T K C C T E S L V N R R P C F S A L E V D E T Y V P K E F N A E T F T F H A D

I C T L S E K E R Q I K K Q T A L V E L V K H K P K A T K E Q L K A V M D D F A A F V E K C C K A D D K E T C F A

E E G K K L V A A S Q A A L G L

Secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido transportador basado en albúmina 2-Ver 2: SEQ ID No. 11:

Generación y expresión de heteromultímeros basados en HA o HAA

Los genes que codifican los monómeros de polipéptidos transportadores basados en HA de longitud completa y HA se construyeron mediante síntesis génica usando codones optimizados para la expresión humana/de mamífero. Las construcciones se diseñaron a partir de Preproteína de Albúmina Sérica Humana de longitud completa conocida (GENEBANK: NP_000468.1), después de la exclusión de la secuencia de señal EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAG. Los productos génicos finales se subclonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (NRC-BRI, Canadá) (Durocher y col.). Se realizó producción de proteína recombinante de alto nivel y alto rendimiento por transfección transitoria de CHO-3E7 humano en suspensión. Ver ^{Tabla 3} para límites de construcción de los dos andamios descritos en esta invención: heteromultímero 1 basado en albúmina (ABH1) y heteromultímero 2 basado en albúmina (ABH2). El heteromultímero 2 basado en albúmina comprende un enlace disulfuro entre los dos polipéptidos transportadores, mientras que el heteromultímero 1 basado en albúmina está formado completamente por interacciones no covalentes. Las Figuras 16A y 16B representan la estructura de la proteína y la representación simbólica de ABH1 y ABH2 respectivamente. Como demuestran las dos figuras, ambas construcciones ABH están compuestas por dos polipéptidos transportadores A y B, secuencias descritas en la ^{Tabla 3} .La Figura 6A proporciona un análisis de gel SDS-PAG^e(no reductor) de las dos construcciones de heteromultímero (ABH1 y ABH2), después de la coexpresión (se muestran diferentes proporciones de transfección de ADN). HSA de longitud completa w T se muestra como control. Como se esperaba, Ab H2 retiene el enlace disulfuro en SDS-PAGE no reductora, con un MW aproximadamente el doble que el ABH1 no unido por disulfuro. La Figura 6A también demuestra que la formación de heterodímeros en ABH2 depende de la relación de transfección de ADN, con 1: 1 produciendo el producto más heterodimérico. Finalmente, 6A demuestra que el fragmento A de ABH2, cuando se expresa como molécula independiente, es más susceptible a formar homodímeros y permanecer monomérico, un resultado también observado en la Figura 6B. La Figura 6B proporciona un análisis de gel nativo de las dos construcciones de heteromultímeros basadas en albúmina (ABH1 y ABH2), después de la coexpresión (nivel de ADN 1:1). HSA de longitud completa WT se muestra como control. ABH1 y ABH2 forman un complejo de masa esperada, comparable al WT HSA de longitud completa. Además, tras la expresión, ni los polipéptidos transportadores que forman ABH1 ni los que forman ABH2 se homodimerizan; más bien, preferiblemente forman un hetercomplejo estable. Ver la ^{Tab la 5} a continuación para detalles.

T a b l a 5 : C o n s t r u c c i o n e s d e h e t e r o m u l t í m e r o s b a s a d o s e n a l b ú m i n a

WT-HSA y los dos heteromultímeros basados en albúmina (ABH1 y ABH2) se expresaron en la línea celular CHO-3E7 cultivada en suspensión en medio FreeStyle F17 (Invitrogen) suplementado con plurónico al 0,1 % p/v y Glutamina 4 mM. El día de la transfección, la densidad celular debe ser de alrededor de 1.5-2 millones de células/ml y la viabilidad debe ser mayor que 97 %. La transfección se llevó a cabo como se describe en la solicitud de patente WO 2009/137911 usando una mezcla de ADN plasmídico hecho de plásmido pTTo-GFP al 5 % (proteína fluorescente verde para determinar la eficacia de la transfección, ^{Tab la} 4), 15 % plásmido pTT22-AKT, 21 % plásmidos HSA (10.63 % de cada uno), 68,37 % de ADN de esperma de salmón. Después de la transfección, el matraz de agitación que contenía células se colocó a continuación en un agitador orbital ajustado a 120 rpm en una incubadora humidificada con 5 % de CO2 a 37°C. Veinticuatro horas después de la transfección, se añadieron 1 % p/v de TN1 y 0,5 mM de VPA (ácido valproico) a los cultivos. Los cultivos se transfirieron a continuación en un agitador orbital (120 rpm) colocado en una incubadora humidificada con 5 % de CO2 ajustado a 32°C. A las 24-48 horas, las células positivas para GFP deben estar entre 30-60 % según lo determinado por citometría de flujo. Las células se recogieron 7 días después de la transfección y se centrifugaron a 4.000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se esterilizó por filtración (se aclaró) usando un filtro de 0,45 pm (Millipore). El sobrenadante se almacenó a 4°C para almacenamiento a corto plazo y a -80°C para almacenamiento a largo plazo. Antes de la purificación, el sobrenadante congelado se descongeló a 37°C, se filtró nuevamente y se desgasificó a través de un filtro de membrana de 0,45 pm al vacío durante 5 - 10 minutos.

^{T a b l a 6 :}Vi ili l l r n if r n x r i n r l n r i n WT ABH1.

P u r i f i c a c i ó n d e A B H 2 , H S A y h e t e r o m u l t í m e r o s .

Como se observa en la Figura 6A, la relación de transfección de ADN 1:1 de los dos polipéptidos transportadores produjo el nivel más alto de producto ABH2 heterodimérico. Las células de CHO que coexpresan transitoriamente esta proporción de los dos polipéptidos se cultivaron como se describió anteriormente. La posterior purificación del heterodímero se realizó como sigue. La albúmina humana natural se transfectó en células de CHO y se purificó de manera similar a la ABH2.

La purificación se realizó por flujo por gravedad usando una columna QIAGEN-tip 500 de laboratorio empaquetada con una matriz de Blue Sepharose (GE Healthcare). La matriz de Blue Sepharose se equilibró con 20 ml de PBS a pH 7,2. La muestra se cargó a una velocidad de flujo de 5 ml/min y posteriormente se lavó con 20 ml de PBS. La proteína se eluyó con Na2HPO40,1 M pH 7,2 suplementado con NaCl 1 M y se recogió en fracciones de 1 ml (20 ml en total). Fracciones que contenían HSA (según el ensayo de proteínas de Bradford) se agruparon y se aplicaron en una columna de filtración en gel HiLoad 16/60 Superdex 200 de grado de preparación acoplada a un sistema AKTA Express (GE Healthcare) usando un flujo de 1 ml/ml. Se recogió proteína con una pureza > 85 %; las fracciones que contenían muestra pura se agruparon y se concentraron mediante centrifugación usando una membrana Amicon Ultra con un peso de corte de 10000 MWCO. La Figura 6C muestra el análisis SDS-PAGE (no reductor) del heteromultímero ABH2 y WT HSA, ambos después de la etapa final de purificación. Ambas construcciones muestran el MW esperado. Los rendimientos de purificación fueron comparables a las HSA de longitud completa natural, a aproximadamente 10 mg/L. Este resultado también fue comparable a los 9 mg/L generados por el control V1087 realizado en células HEK. Los rendimientos se determinaron mediante nanodrop A280 medido después de Blue Sepharose y cromatografía de exclusión por tamaño.

Determinación de estabilidad de heteromultímeros basados en albúmina utilizando calorimetría de barrido diferencial (DSC)

Todos los experimentos con DSC se llevaron a cabo utilizando un instrumento GE o MicroCal VP-Capillary. Las proteínas se intercambiaron con tampón en PBS (pH 7,4) y se diluyeron a 0,3 a 0,7 mg/mL con 0,137 mL cargados en la célula de muestra y se midieron con una tasa de barrido de 1 °C/min de 20 a 100°C. Se analizaron los datos utilizando el software Origin (Ge Healthcare) substrayendo el fondo del tampón PBS. Consultar la Tabla 7 y la Figura 7 para conocer la temperatura de fusión resultante determinada.

Tabla 7: T m r r f i n r h r m lím r n l min

Evaluación de la unión de FcRn de HSA y ABH2 utilizando la resonancia por plasmones superficiales

Como se ve en las Figuras 8A-B, cuando HSA y un heteromultímero basado en HSA se inmovilizan en la superficie de SPR, la afinidad hacia FcRn parece ser comparable entre el WT de longitud completa HSA y ABH2, lo que indica que la funcionalidad de unión a FcRn de la albúmina es retenida por el heteromultímero formado por el autoensamblaje de polipéptidos transportadores basados en albúmina. La siguiente Tabla 8 ilustra los datos de unión de FcRn. Los valores entre paréntesis se refieren a la desviación estándar.

Tabla 8: Ajuste cinético y de equilibrio de la unión de FcRn de HSA y ABH2 utilizando resonancia de plasmones superficiales

Ejemplo 3: Generación y expresión de heteromultímeros basados en albúmina con mono y tetravalencia que comprenden fusiones bioactivas scFv anti-Her2/neu y anti-CD16.

El heteromultímero multivalente ABH2 se generó expresando sus polipéptidos transportadores monoméricos únicos, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10, fusionados en uno o ambos extremos a los polipéptidos de carga que son antiHer2scFv (4D5) y/o anti-CD16 scFv (NM3E). El término 4D5, como se usa en esta invención, se refiere a las secuencias humanizadas del anticuerpo 4D5 y corresponde a la secuencia de aminoácidos de los dominios variables en el anticuerpo contra trastuzumab junto con la región enlazadora entre los dominios V1 y Vh en el formato molecular scFv. Estos forman un conjunto de monómeros de construcción de base 8 basados en el polipéptido transportador 1 y monómeros de construcción de base 8 basados en el polipéptido transportador 2. Se combinaron diferentes combinaciones de estas construcciones de base tras la coexpresión para formar heteromultímeros que muestran todas las combinaciones de los dos polipéptidos de carga en cualquiera de las cuatro posiciones terminales de los dos polipéptidos transportadores, que van desde monovalentes a tetravalentes.

Como se muestra en la Figura 9, los polipéptidos de carga bioactivos se fusionaron con los polipéptidos transportadores de heteromultímeros a través de un enlazador GGSG, para el extremo N de un monómero y un enlazador 4GG más largo (GGS) para todos los demás extremos en el otro monómero.

La Tabla 9 ilustra las 16 construcciones de base (Construcción de base # 1-Construcción de base # 16) que se generaron fusionando los polipéptidos de carga 4D5 y NM3E en el extremo N o C del polipéptido transportador 1 (F1) o el polipéptido transportador 2 (F2). F1: corresponde a la SEQ ID 8 y F2 corresponde a la SEQ ID 10.

Tabla 9:

Se generaron construcciones multivalentes como se describe en el Ejemplo 2 usando el heteromultímero ABH2. Los productos génicos finales se subclonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (NRC-BRI, Canadá) (Durocher y col.). Se realizó producción de proteína recombinante de alto nivel y alto rendimiento por transfección transitoria de CHO-3E7 humano en suspensión. Detalles adicionales con respecto a la preparación y expresión de estas construcciones se encuentran en el Ejemplo 11.

La purificación se realizó mediante la aplicación del sobrenadante celular con proteína expresada a una columna QIAGEN-tip 500 empaquetada con matriz Blue Sepharose (GE Healthcare) acoplada a un sistema AKTA Express (GE Healthcare) utilizando un flujo de 1 ml/ml. La columna se equilibró con tampón de muestra compuesto por 20 ml de PBS pH 7,2, NaCl 300 mM. La muestra se cargó a una velocidad de flujo de 5 ml/min y posteriormente se lavó con tampón de muestra. La proteína se eluyó mediante la aplicación de un gradiente de NaCl que iba de 300 mM a 2000 mM. Fracciones que contenían HSA se agruparon y se aplicaron en una columna de filtración en ge1HiLoad 16/60 Superdex 200 de grado de preparación acoplada a un sistema AKTA Express (GE Healthcare) usando un flujo de 1 ml/ml. Se recogió proteína con una pureza > 85 %; las fracciones que contenían muestra pura se agruparon y se concentraron mediante centrifugación usando una membrana Amicon Ultra con un peso de corte de 10000 MWCO. Las Figuras 10A-10B muestran el análisis SDS-PAGE (no reductor) del heteromultímero ABH2 fusionado a diferentes polipéptidos de carga. La posición de esos polipéptidos en el heteromultímero con respecto a los polipéptidos transportadores se describe en la tabla 10 a continuación. Todas las construcciones mostraron el peso molecular esperado.

Tabla 10: Construcciones monovalentes, multivalentes y multiespecíficas que se generaron fusionando los polipéptidos de carga 4D5 y NM3 con el extremo N o C del polipéptido transportador 1 o el polipéptido transportador 2 de ABH2.

Unión SPR de ABH2 monovalente fusionado a un único antiCD16scFv

El heteromultímero ABH2 purificado fusionado a un único antiCD16scFv al extremo N del polipéptido transportador SEQ ID 10 (construcción v515) se usó en un experimento de unión usando resonancia de plasmones superficiales (SPR). El CD16 soluble se inmovilizó covalentemente sobre una superficie CM5 y se capturó ABH2 fusionado con antiCD16scFv y se determinó la cinética de unión.

^{S u m in is tro s de} SPR.Chips sensores de GLM, el kit de acoplamiento de amina Biorad ProteOn (EDC, sNHS y etanolamina) y tampones de acetato de sodio 10 mM se adquirieron de Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON). La proteína recombinante Her-2 se adquirió de eBioscience (San Diego, CA). El tampón HEPES, EDTA y NaCl se adquirieron de Sigma-Aldrich (Oakville, ON). La solución de Tween 20 al 10 % se adquirió de Teknova (Hollister, CA).

^{E n sa yo s de b io se n so re s de SPR.} Todos los ensayos de resonancia de plasmones superficiales se llevaron a cabo utilizando un instrumento BioRad ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)) con tampón corriente HBST (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM y Tween 20 al 0,05 % pH 7,4) a una temperatura de 25°C. La superficie de captura de CD 16 se generó usando un chip sensor de GLM activado por una dilución 1:5 de las soluciones estándar BioRad sNHS/EDC inyectadas durante 300 s a 30 pL/min en la dirección del analito (horizontal). Inmediatamente después de la activación, se inyectó una solución de 4,0 pg/mL de CD16 en NaOAc 10 mM pH 4,5 en la dirección del ligando (vertical) a una velocidad de flujo de 25 pL/min hasta que se inmovilizaron aproximadamente 3000 conjuntos de resonancia (RU). Los grupos activos restantes se apagaron mediante una inyección de 300 s de etanolamina 1 M a 30 pL/min en la dirección del analito, y esto también garantiza que se creen puntos intermedios activados por simulación para la referencia en blanco.

Se inyectó una serie de dilución triple de 500 nM de V515 sobre 3000 RU CD16aWT (L6) en comparación con el blanco (L5). Flujo de 50 uL/min durante 120s, con una fase de disociación de 240s. Las inyecciones se repitieron en tampón corriente estándar (DPBS/EDTA 3,4 mM/Tween20 al 0,05 %) y tampón corriente con 350 mM adicionales de NaCl. Los sensogramas se alinearon y se referenciaron dos veces utilizando la inyección en blanco del tampón y los puntos intermedios, y los sensogramas resultantes se analizaron con el software ProteOn Manager v3.0. Típicamente, los valores de K^dse determinaron a partir de isotermas de unión usando el modelo Equilibrium Fit. Para interacciones de alta afinidad con tasas de desaceleración lentas, los valores cinéticos y de afinidad se determinaron adicionalmente ajustando los sensoresgramas referenciados al modelo de unión Langmuir 1:1 usando Rmax local, y las constantes de afinidad (K^dM) se derivaron de las constantes de tasa resultantes (kds_1/ kaM'V). Todos los valores de K^dse informan como la media y la desviación estándar de tres corridas independientes.

Como se muestra en la Tabla 11, el heteromultímero ABH2 fusionado a un solo antiCD16scFv tiene actividad completa y se une a su diana con buena reproducibilidad y KD similar al anti CD 16 scFv libre (NM3E).

Tabla 11: Datos de SPR para ABH2 monovalente fusionado a un único antiCD16scFv.

Ejemplo 4. Preparación de proteínas de heteromultímeros basado en HA o HAA donde las proteínas de carga comprenden uno o más dominios similares a EGF-A.

La secuencia de péptidos del dominio EGF-A en la proteína PCSK9 u otra secuencia de polipéptidos homologa al dominio EGF-A, capaz de unirse específicamente al receptor de lipoproteínas de baja densidad (lDl -R) se deriva por secuenciación o de un base de datos como GenBank. El ADNc para el polipéptido de carga que comprende el dominio similar a EGF-A se aísla por una variedad de medios que incluyen, pero no exclusivamente, bibliotecas de ADNc, por RT-PCR y por PCR usando una serie de cebadores oligonucleotídicos sintéticos superpuestos, todos usando procedimientos estándar. En ciertos ejemplos, la proteína de carga está diseñada para mejorar la estabilidad, las características de unión a la diana u otras propiedades biofísicas o terapéuticamente relevantes. El polipéptido se emplea como proteína de carga en la creación de un heteromultímero con aplicación en el tratamiento de la hipercolesterolemia. La primera y segunda secuencia de polipéptidos de fusión monoméricos se derivan fusionando la secuencia de la proteína de carga directamente o con un péptido enlazador intermedio al extremo N y/o al extremo C del polipéptido transportador basado en HA o HAA, tal como las SEQ ID No: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10. Esta secuencia de proteínas de fusión monoméricas se traduce inversamente a su secuencia de ADN correspondiente para ser introducida en un vector de expresión, secuencia optimizada para la expresión en una línea celular particular de interés. Las proteínas de fusión monoméricas primera y segunda se transfectan y coexpresan en la línea celular de interés. En ciertos casos, la transfección está en relación 1:1 para los dos vectores. En algunos ejemplos, la relación se selecciona de entre 1,5:1, 2:1, 1:1,5, 1:2, etc.

Ejemplo 5. Preparación de proteínas heteromultiméricas basadas en HA o HAA donde las proteínas de carga son GLP-1 y/o Glucagón.

La secuencia de péptidos de GLP-1 u otra secuencia de polipéptidos homóloga a este péptido, capaz de unirse específicamente al receptor GLP-1 o actuar como un agonista de GLP-1 se deriva por secuenciación o de una base de datos como GenBank. Alternativamente, la secuencia de péptidos de Glucagón u otra secuencia de polipéptidos homóloga a este péptido, capaz de unirse específicamente al receptor de Glucagón o actuar como un agonista receptor de Glucagón se deriva por secuenciación o de una base de datos como GenBank. El ADNc para el polipéptido de carga que comprende GLP-1 o Glucagón se aísla por una variedad de medios que incluyen, pero no exclusivamente, bibliotecas de ADNc, por RT-PCR y por PCR usando una serie de cebadores oligonucleotídicos sintéticos superpuestos, todos usando procedimientos estándar. En ciertos ejemplos, estos polipéptidos de carga basados en GLP-1 o Glucagón están diseñados para mejorar la estabilidad, las características de unión a la diana u otras propiedades biofísicas o terapéuticamente relevantes. Estos polipéptidos basados en GLP-1 y Glucagón se emplean como una o más moléculas de carga en la creación de un heteromultímero con aplicación en el tratamiento de la diabetes tipo 2 u otra enfermedad relacionada con el metabolismo de la glucosa. La primera y segunda secuencia de polipéptidos de fusión monoméricos se derivan fusionando la secuencia de la proteína de carga directamente o con un péptido enlazador intermedio al extremo N y/o al extremo C del polipéptido transportador basado en HA o HAA, tal como las SEQ ID No: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10. Las proteínas de fusión pueden ser monoespecíficas con polipéptidos similares a GLP-1 o Glucagón o ser biespecíficas (coagonistas) con los polipéptidos similares a GLP-1 y Glucagón. Esta secuencia de proteínas de fusión monoméricas se traduce inversamente a su secuencia de ADN correspondiente para ser introducida en un vector de expresión, secuencia optimizada para la expresión en una línea celular particular de interés. Las proteínas de fusión monoméricas primera y segunda se transfectan y coexpresan en la línea celular de interés. En ciertos casos, la transfección está en relación 1:1 para los dos vectores. En algunos ejemplos, la relación se selecciona de entre 1,5:1, 2:1, 1:1,5, 1:2, etc.

Secuencia de la molécula de carga GLP-1

SEQ ID No: 12: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

Secuencia de la molécula de carga Glucagón

SEQ ID NO: 13: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT

Ejemplo 6: Proteína anexina se repite como un andamio multivalente con detección de membrana

La anexina se divide con una interfaz extensa para generar un andamio de heteromultímero multivalente que comprende dos polipéptidos transportadores. La anexina es una proteína de 346 residuos (PDB ID 1MCX). El heteromultímero que comprende dos polipéptidos transportadores basados en anexina dividida en la región entre el residuo 186 y 194 se muestra en la Figura 11. Cuando se coexpresa en solución, la gran área interfacial entre los dos polipéptidos transportadores conduce al autoensamblaje del heterodímero. El autoensamblaje de los dos conjuntos permite el diseño de una construcción multivalente con polipéptidos transportadores basados en el núcleo de anexina. Hay dos estructuras disponibles, de Cerdo y Humana. Las dos estructuras son superponibles con un rmsd de 0,6 A. El siguiente tramo de secuencia se puede eliminar de la secuencia de anexina humana DRSEDF (residuos 160 a 165). El truncamiento no rompe ningún elemento secundario de la estructura y no implica la introducción o eliminación de ningún residuo de Prolina.

Secuencia de WT de anexina humana

SEQ ID NO: 14:

GSAVSPYPTFNPSSDVAALHKAIMVKGVDEATIIDILTKRNNAQRQQIKAAYLQETGKPLD

ETLKKALTGHLEEVVLALLKTPAQFDADELRAAMKGLGTDEDTLIEILASRTNKEIRDINR

VYREELKRDLAKDITSDTSGDFRNALLSLAKGDRSEDFGVNEDLADSDARALYEAGERRK

GTDVNVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKHDMNKVLDLELKGDIEKCLTAIVKCATSKP

AFF AEKLHQ AMKGV GTRHKALIRIMV SRSEIDMNDIKAFY QKMY GISLCQ AILDETKGDY

EKILVALCGGN

Secuencia del polipéptido transportador basado en Anexina-1:

SEQ ID NO: 15:

SAVSPYPTFNPSSDVAALHKAIMVKGVDEATIIDILTKRNNAQRQQIKAAYLQETGKPLDE

TLKKALTGHLEEVVLALLKTPAQFDADELRAAMKGLGTDEDTLIEILASRTNKEIRDINRV

YREELKRDLAKDITSDTSGDFRNALLSLAKG

Secuencia del polipéptido transportador basado en Anexina-2:

SEQ ID NO: 16:

GVNEDLAD SD ARALYEAGERRKGTDVNVFNTILTTRS YPQLRRVF QKYTKYSKHDMNKV

LDLELKGDIEKCLTAIVKCATSKP AFF AEKLHQ AMKGVGTRHKALIRIMVSRSEIDMNDIK

AFY QKMY GISLCQ AILDETKGDYEKILVALCGGN

La Figura 12 muestra un gráfico del área de superficie accesible al solvente enterrada en la interfaz del polipéptido transportador basado en Anexina-1 (ABT-1) y el polipéptido transportador basado en anexina-2 (ABT-2). Una anexina dividida cerca de la posición del residuo 186 forma un heterodímero con aproximadamente 3200 Á2 de área de superficie enterrada. Los polipéptidos transportadores tales como ABT-1 y AbT-2 basados en anexina pueden usarse para unir biomoléculas de carga utilizando los mismos procedimientos descritos anteriormente para polipéptidos transportadores basados en albúmina.

Ejemplo 7: Transferrina como un andamio multivalente

Basado en la gran cantidad de propiedades terapéuticamente relevantes de la transferrina, esta proteína se presenta como una molécula de andamio interesante para el diseño de fármacos de fusión de proteínas multivalentes después de la creación de una proteína autoensamblable y su división en partes componentes. La estructura de la transferrina se muestra en la Figura 13 basada en la estructura cristalina (1H76) disponible en el banco de datos de proteínas [Hall DR y col. Acta Crystallogr D 2002, 58, 70-80]. La molécula de transferrina se compone de dos lóbulos estructuralmente similares, los lóbulos terminales N y C, conectados por un enlazador peptídico corto entre los residuos 333 y 342. Un heterodímero está diseñado en base a la proteína transferrina, dicho heterodímero comprende un primer polipéptido transportador que involucra los residuos 1-333 de transferrina y un segundo polipéptido transportador compuesto de residuos desde 342 hasta el extremo C de la secuencia original de transferrina. Cuando se coexpresan, los dos polipéptidos transportadores se pliegan independientemente y se emparejan para formar un andamio de cuasitransferrina capaz de mantener sus propiedades terapéuticamente relevantes. Además, dicho andamio de Transferrina permite la producción de moléculas de fusión multivalentes, por ejemplo, una fusión GLP-1 multivalente con polipéptidos transportadores basados en la transferencia. Estas fusiones pueden ser similares a los polipéptidos de fusión GLP-1 con polipéptidos transportadores basados en albúmina.

La Figura 13 muestra la estructura de la molécula de transferrina basada en la estructura PDB 1H76. Los dos polipéptidos transportadores monomerizantes derivados dividiendo la molécula de transferrina están codificados por color como conjuntos gris claro y gris oscuro. Los sitios de fusión para las moléculas de carga se representan como esferas.

La Figura 14 muestra un gráfico del área de superficie accesible al solvente enterrada en la interfaz de dos polipéptidos basados en transferrina. Una transferrina dividida cerca de la posición del residuo 330, tal como los dos polipéptidos transportadores que se muestran a continuación, forma un heterodímero con aproximadamente 1800 Á2 de área de superficie enterrada.

Secuencia del polipéptido transportador basado en Transferrina-1:

SEQ ID NO: 17:

MRLAVGALLY CAVLGLCLAV PDKTVRWCAV SEHEATKCQS FRDHMKSVIP

SDGPSVACVK KASYLDCIRA IAANEADAVT LDAGLVYDAY LAPNNLKPVV

AEFYGSKEDP QTFYYAVAVV KKDSGFQMNQ LRGKKSCHTG LGRSAGWNIP

IGLLYCDLPE PRKPLEKAVA NFFSGSCAPC ADGTDFPQLC QLCPGCGCST

LNQYFGYSGA FKCLKDGAGD VAFVKHSTIF ENLANKADRD QYELLCLDNT

RKPVDEYKDC HLAQVPSHTV VARSMGGKED LIWELLNQAQ EHFGKDKSKE

FQLFSSPHGK DLLFKDSAHG FLKVPPRMDA KMYLGYEYVT AIRNLREG.

Secuencia del polipéptido transportador basado en Transferrina-2:

SEQ ID NO: 18:ECKPVKWCALSHHE RLKCDEWSVN SVGKIECVSA ETTEDCIAKI

MNGEADAMSL DGGFVYIAGK CGLYPVLAEN YNKSDNCEDT PEAGYFAVAV

VKKSASDLTW DNLKGKKSCH TAVGRTAGWN IPMGLLYNKINHCRFDEFFS

EGCAPGSKKD SSLCKLCMGS GLNLCEPNNK EGYYGYTGAF RCLVEKGDVA

FVKHQTVPQN TGGKNPDPWA KNLNEKDYEL LCLDGTRKPV EEYANCHLAR

APNHAVVTRK DKEACVHKIL RQQQHLFGSN VTDCSGNFCL FRSETKDLLF

RDDTVCLAKL HDRNTYEKYL GEEYVKAVGN LRKCSTSSLL EACTFRRP

Ejemplo 8: Diseño de proteínas de heteromultímeros basadas en HA o HAA estabilizadas con disulfuro

Polipéptidos transportadores basados en albúmina se diseñaron donde, en comparación con la albúmina, se mutaron posiciones específicas a cisteína en cada uno de los polipéptidos transportadores para permitir la formación selectiva de un enlace disulfuro entre dos polipéptidos transportadores, lo que resultó en un heterodímero estable con una estructura monomérica de albúmina cuasi-nativa.

Los residuos para la introducción de cisteínas se seleccionaron teniendo en cuenta los siguientes factores:

a. Formar un enlace covalente entre los dos polipéptidos transportadores, aumentando así la estabilidad del heteromultímero y la forma monomérica cuasi-nativa resultante.

b. debe estar dentro de los límites específicos de CA-CA y CB-CB para formar un enlace disulfuro

c. no es probable que el entorno local compatible (que generalmente prefiere cadenas laterales hidrófobas más cortas en regiones parcialmente expuestas a solventes) interfiera con contactos polares existentes.

La mutagénesis se realizó mediante QuickChange, y la expresión y la purificación se realizaron como se presenta en los Ejemplos 1 y 2 anteriores.

La Tabla 12 a continuación identifica una serie de heteromultímeros basados en albúmina que comprenden cisteínas introducidas que fueron diseñadas. ABH3-8 fueron diseñadas en base al diseño ABH2, mientras que ABH9-12 se basaron en el diseño ABH1.

Tabla 12: Heteromultímeros basados en albúmina ue com renden cisteínas introducidas

Las variantes ABH3, ABH4, ABH5, ABH6, ABH7 y ABH8 se expresaron con una proporción de ADN 1:1 (Fragmento 1: Fragmento 2) en cultivos de CHO de 2 ml a pequeña escala. Un gel de expresión se muestra en Figura 35. WT-Albumina (v225) junto con las variantes anteriores AlbuCORE 1 y AlbuCORE 2 también se expresaron como controles. Las variantes a BH3, ABH5 y ABH7 se expresaron de manera similar a ABH2, mientras que las variantes restantes mostraron una expresión más baja y una posible codificación de disulfuro, notable por múltiples bandas en SDS PAGE no reductora, posiblemente debido a la presencia de las posiciones de disulfuro natural, así como a las mutaciones de cisteína introducidas. La recuperación de la expresión se puede lograr cambiando el sitio de corte (ver Ejemplo 9) o transfectando con diferentes proporciones de ADN. No hubo enlazadores presentes en los extremos de estas construcciones. Se espera que la introducción de las mutaciones de cisteína de enlace de disulfuro en variantes como ABH9, ABH10, ABH11 y ABH12 aborden este problema ya que carecen de una posición de enlace de disulfuro natural en la interfaz original.

Ejemplo 9: Diseño de proteínas heteromultiméricas basadas en HA o HAA basadas en diferentes sitios de segmentación

La Tabla 13 a continuación proporciona construcciones de heteromultímeros como se describe en esta invención que comprenden polipéptidos transportadores diseñados segmentando albúmina en varios sitios como se muestra en las Figuras 15A-15P y se enumeran en la Tabla 1. Diferente a las anteriores construcciones descritas en el Ejemplo 8 y las siguientes, todas las construcciones de AlbuCORE en el Ejemplo 9 se crearon con un enlazador GGGGS fusionado al extremo C del Fragmento 1 y al extremo N del fragmento 2. Esto se hizo por múltiples razones: 1) La presencia de un enlazador corto recrea una molécula de fusión típica y nos permite comprender la compatibilidad de los sitios de corte con la presencia de un enlazador. 2) La presencia de un enlazador también puede ayudar a estabilizar el entorno local que rodea el sitio de corte, incluido el blindaje de algunos parches hidrófobos expuestos. 3) La presencia de un enlazador reduce el número de variables en las fases posteriores, cuando una carga útil se fusiona con la molécula. Ver la Tabla 13 para resultados de expresión. La expresión se probó inicialmente en cultivos de CHO a pequeña escala con los dos fragmentos en cada variante de AlbuCORE realizada en diferentes combinaciones de proporciones. El gel en las Figuras 35A y B ilustra los resultados de expresión.

Tabla 13: Construcciones de heteromultímeros basados en albúmina basadas en diferentes segmentos de albúmina.

La expresión de las variantes seleccionadas se realizó como se describe en el Ejemplo 2, mientras que la purificación se realizó como se describe en el Ejemplo 17. Las características de estas moléculas con respecto a los enlazadores utilizados, los enlaces cruzados de disulfuro y un resumen de los resultados de la expresión se muestran en la Tabla 14.

T a b l a 14: R e s u l t a d o s d e la e x p r e s i ó n d e l a s v a r i a n t e s e n u m e r a d a s e n la T a b l a 13:

Ejemplo 10: Múltiples proteínas de carga

L a s p r o t e í n a s d e h e t e r o m u l t í m e r o s d e s c r i t a s e n e s t a in v e n c ió n ( p o r e j e m p lo , q u e c o n t i e n e n u n p o l ip é p t id o d e c a r g a (o f r a g m e n t o o v a r i a n t e d e l m i s m o ) f u s i o n a d a s al s e g m e n t o t r a n s p o r t a d o r d e a l b ú m i n a o v a r i a n t e d e l m i s m o ) p u e d e n f u s i o n a r s e a d i c i o n a l m e n t e a o t r a s p r o t e í n a s p a r a g e n e r a r " p r o t e í n a s d e m u l t i fu s ió n " . E s t a s p r o t e í n a s d e m u l t i fu s ió n s e p u e d e n u s a r p a r a u n a v a r i e d a d d e a p l i c a c i o n e s . P o r e j e m p lo , la f u s ió n d e l a s p r o t e í n a s d e s c r i t a s e n e s t a in v e n c ió n a d o m i n io s Ig G c o n e t i q u e t a H is y la p r o t e í n a d e u n ió n a m a l t o s a fac ili ta la p u r i f ic a c ió n . (V er, p o r e j e m p lo , E P A 394.827 ; T r a u n e c k e r y col. , N a t u r e 331 : 84 - 86 (1988 ) ) . S e ñ a l e s d e lo c a l i z a c ió n n u c l e a r f u s i o n a d a s a lo s p o l i p é p t i d o s p u e d e n dirigir la p r o t e í n a a u n a l o c a l i z a c ió n s u b c e l u l a r e s p e c í f i c a . A d e m á s , la f u s ió n d e s e c u e n c i a s d e p r o t e í n a s a d i c i o n a l e s a p r o t e í n a s d e s c r i t a s e n e s t a in v e n c ió n p u e d e a u m e n t a r a ú n m á s la s o lu b i l id a d y /o la e s t a b i l i d a d d e l h e t e r o m u l t í m e r o . L a s p r o t e í n a s d e h e t e r o m u l t í m e r o s d e s c r i t a s a n t e r i o r m e n t e p u e d e n p r e p a r a r s e u s a n d o o m o d i f i c a n d o r u t i n a r i a m e n t e p r o c e d i m i e n t o s c o n o c i d o s e n la t é c n i c a y /o m o d i f i c a n d o el s i g u i e n t e p ro to c o lo , q u e d e s c r i b e la f u s ió n d e u n p o l ip é p t id o a u n a m o l é c u l a d e IgG.

B r e v e m e n t e , la p o rc ió n F c h u m a n a d e la m o l é c u l a d e Ig G p u e d e a m p l i f i c a r s e p o r P C R , u s a n d o c e b a d o r e s q u e a b a r c a n lo s e x t r e m o s 5 ' y 3 ' d e la s e c u e n c i a q u e s e d e s c r i b e a c o n t i n u a c ió n . E s t o s c e b a d o r e s t a m b i é n d e b e r í a n t e n e r s i t io s d e e n z i m a s d e r e s t r i c c ió n c o n v e n i e n t e s q u e fac i l i ten la c lo n a c ió n e n u n v e c t o r d e e x p r e s i ó n , p r e f e r i b l e m e n t e u n v e c t o r d e e x p r e s i ó n d e m a m í f e r o o l e v a d u r a .

P o r e j e m p lo , si s e u s a p C 4 ( n ú m e r o d e a c c e s o A T C C 209646 ) , la p o rc ió n F c h u m a n a s e p u e d e l ig a r al si t io d e c lo n a c ió n B a m H I . T é n g a s e e n c u e n t a q u e el si t io 3 ' B a m H I d e b e s e r d e s t r u id o . A c o n t i n u a c ió n , el v e c t o r q u e c o n t i e n e la p o rc ió n F c h u m a n a s e v u e l v e a r e s t r in g i r c o n B a m H I , l i n e a l i z a n d o el v e c to r , y u n p o l in u c le ó t id o q u e c o d i f ic a u n a p r o t e í n a h e t e r o m u l t i m é r i c a d e s c r i t a e n e s t a in v e n c ió n ( g e n e r a d o y a i s l a d o u s a n d o p r o c e d i m i e n t o s c o n o c i d o s e n la t é c n i c a ) , s e liga e n e s t e s i t io B a m H I. T é n g a s e e n c u e n t a q u e el p o l in u c le ó t id o q u e c o d i f ic a la p r o t e í n a d e fu s ió n d e la i n v e n c ió n s e c l o n a s in u n c o d ó n d e p a r a d a ; d e lo c o n t r a r io , n o s e p r o d u c i r á u n a p r o t e í n a d e f u s ió n q u e c o n t e n g a Fc. Si la s e c u e n c i a d e s e ñ a l d e o r ig e n n a tu r a l s e u s a p a r a p r o d u c i r la p r o t e í n a h e t e r o m u l t i m é r i c a d e s c r i t a e n e s t a in v e n c ió n , p C 4 n o n e c e s i t a u n p é p t i d o d e s e g u n d a s e ñ a l . A l t e r n a t i v a m e n t e , si n o s e u s a la s e c u e n c i a d e s e ñ a l d e o r ig e n n a tu r a l , el v e c t o r p u e d e m o d i f i c a r s e p a r a inc lu ir u n a s e c u e n c i a d e s e ñ a l h e t e r ó l o g a . (V er, p o r e j e m p lo , P u b l i c a c ió n In t e r n a c i o n a l No. W O 96 / 34891. )

Ejemplo 11. Preparación de polipéptidos basados en albúmina cargados con carga mono-, a tetravalente, monoespecíficos, anti-Her2; polipéptidos basados en albúmina cargados con carga bivalente, bi-específicos anti-Her2 x Her3; y varios controles.

Se prepararon varios polipéptidos transportadores basados en albúmina cargados con carga como se describe en este ejemplo. Los scFv anti-HER2 descritos en la Tabla 8 del Ejemplo 3 se prepararon como sigue. Brevemente, ABH2 se cargó con scFv anti-Her2 en varias configuraciones cis y trans según los procedimientos descritos en esta invención. El polipéptido monoespecífico final varió de mono a tetravalente. Detalles de las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de los polipéptidos componentes también se muestran en la Tabla 8. De manera similar, ABH2 también se cargó con scFvs anti-Her2 y anti-Her3 en configuraciones cis y trans, produciendo moléculas bivalentes bi-específicas. Como controles utilizados en varios ejemplos, también se produjeron V1087, scFvs simples, Fcs de un brazo y Fcs bivalentes.

^{A B H 2 c a rg a d o con a n ti-H e r2 4 D 5 scF vL a s} diferentes configuraciones posibles de ABH2 cargado anti-Her2 se representan esquemáticamente en la Figura 17. Como muestra esta figura, se prepararon numerosas variaciones cis y trans dependiendo de si el scFv está unido a los extremos N o C de cualquiera de los fragmentos A o B de ABH2. Se diseñó un enlazador GGSG corto en el extremo N natural del fragmento 1 de ABH2 y se diseñó un enlazador GG4 más largo (GGS) en el extremo C del fragmento 1 de ABH2 y los extremos N y C del fragmento 2 de ABH2. Los productos génicos finales se subclonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (NRC-BRI, Canadá) (Durocher y col). Se realizó producción de proteína recombinante de alto nivel y alto rendimiento por transfección transitoria de CHO-3E7 humano en suspensión. La purificación se realizó mediante la aplicación del sobrenadante celular con proteína expresada a una columna QIAGEN-tip 500 empaquetada con matriz Blue Sepharose (GE Healthcare) acoplada a un sistema AKTA Express (GE Healthcare) utilizando un flujo de 1 ml/ml. La columna se equilibró con tampón de muestra compuesto por 20 ml de PBS pH 7,2, NaCl 300 mM. La muestra se cargó a una velocidad de flujo de 5 ml/min y posteriormente se lavó con tampón de muestra. La proteína se eluyó mediante la aplicación de un gradiente de NaCl que iba de 300 mM a 2000 mM. Fracciones que contenían HSA (según el ensayo de proteínas de Bradford) se agruparon y se aplicaron en una columna de filtración en gel HiLoad 16/60 Superdex 200 de grado de preparación acoplada a un sistema AKTA Express (GE Healthcare) usando un flujo de 1 ml/ml. Se recogió proteína con una pureza > 85 %; las fracciones que contenían muestra pura se agruparon y se concentraron mediante centrifugación usando una membrana Amicon Ultra con un peso de corte de 10000 MWCO. Las Figuras 10A-10B muestran el análisis SDS-PAGE (no reductor) del heteromultímero ABH2 fusionado a diferentes polipéptidos de carga. La posición de esos polipéptidos en el heteromultímero con respecto a los polipéptidos transportadores se describe en la Tabla 8 y en la Figura 17. Todas las construcciones mostraron el peso molecular esperado. El ABH2 monovalente fusionado a una fusión scFv 4D5 anti-Her2 se ejemplifica con las variantes 517, 518, 519, 520 como se describe en la Tabla 8. Las fusiones ABH2 bivalente y trivalente fusionadas a dos o tres fusiones scFv 4D5 anti-Her2 se ejemplifican con las variantes 525, 526, 527, 528, 531, 532, 540 como se describe en la Tabla 8. Todas estas variantes se produjeron por coexpresión de los dos fragmentos de Albúmina como se describe en el siguiente párrafo. Finalmente, al unir scFv anti-Her2 a los cuatro extremos posibles se formó la proteína de fusión tetravalente, denominada variante 542.

ABH2 cargado con anti-Her2 x anti-Her3 scFvs (variantes 1377,1378 y 1090).

Se prepararon diferentes versiones de heteromultímeros basados en albúmina fusionados con anti-HER2 y anti-HER3. Las cargas útiles anti-HER2 y anti-HER3 que se usaron apuntan a los mismos receptores que MM-111, siendo la principal diferencia la carga útil anti-HER2, que era la carga útil B1D2 no neutralizante utilizada en MM-111 o la carga útil 4D5 neutralizante.

El Fragmento 1 AlbuCORE_1 (ABH2) se fusionó con anti-HER3 en el extremo N a través de un enlazador GGGS y se unió en complejo con el fragmento 2 fusionado con antiHER2 (4D5) a través de un enlazador (GGSG )4GG colocado en el extremo N del fragmento 2 (produciendo la variante 1378, con cargas útiles en trans) o el extremo C del fragmento 2 (produciendo v1377, con cargas útiles en cis). Se formó un tercer tipo de molécula AlbuCORE_1 (ABH2) combinando el fragmento 1 fusionado con antiHER3 en su extremo N a través de un enlazador GGGS y el fragmento 2 fusionado con antiHER2 (B1D2) en su extremo C a través de un enlazador GGGS (número de variante 1090). Esta molécula tiene cargas útiles en cis y es casi idéntica a MM-111. Las principales diferencias entre el polipéptido MM-111 y el polipéptido basado en ABH2 son que 1) los enlazadores utilizados en el polipéptido MM-111 eran más hidrófobos, mientras que los enlazadores utilizados en los polipéptidos basados en ABH2 eran polyGLY) (S) y 2) Los polipéptidos basados en ABH2 carecen de la mutación C34S/N504Q introducida originalmente por Merrimack.

MM-111 y derivados (variante 1087, 1088 y 1089)

La molécula MM-111 es una proteína de fusión a polipéptido único de dos scFvs, anti-Her2 (B1D2) y anti-Her3 (H3), unidas a extremos C y N, respectivamente, de una proteína de albúmina sérica humana modificada, y es producida por Merrimack. La molécula resultante es biespecífica y bivalente. Como control, se construyó una variante de la molécula MM-111 en la que la carga útil anti-Her3 (H3) se fusionó con el extremo N de la albúmina mediante un enlazador AAS corto, mientras que el anti-Her2 (B1D2) se fusionó con el extremo C a través de un enlazador AAAL para crear la variante de control de referencia 1087. Esta variante de control carece de la mutación C34S/N504Q introducida originalmente por Merrimack en su molécula MM-111. Se construyeron moléculas adicionales relacionadas con MM-111: 1) albúmina fusionada solo a la carga útil anti-Her3 (H3) en el extremo N (v1088) y 2) el anti-Her2 (B1D2) fusionado al extremo C (v1089). En ambos casos, los enlazadores utilizados fueron idénticos a MM-111. Todas las moléculas se expresaron en una proporción 1:1 en células de CHO y se purificaron como se describe para las fusiones multiméricas 4D5.

Anti-Her2 scFvs Simple

El scFv humano anti-Her2 libre (v218) se expresó en células de CHO3E71L (v218). Una etiqueta (His)6 se fusionó al extremo C a través de un enlazador escindible que contiene un sitio de proteasa TEV. La proteína se purificó por afinidad metálica (Co2+) (volumen de columna = 1 mL) acoplada a un sistema de fractogel seguido de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200. Los rendimientos post-purificación fueron 3,6 mg de 4D5 scFv después de la afinidad por Co2+ y 1,38 mg después de la exclusión por tamaño.

La Figura 31A es una SDS-PAGE que representa la purificación de v218 después de la afinidad por Co2+. Se proporcionan el producto de expresión post-lavado, elución en columna y desalación. La Figura 31B es el perfil de cromatografía de la variante que sigue a la segunda purificación a través de la columna de exclusión por tamaño. Control de moléculas de Fc (878, 628 y 630):

Un único scFv humano anti-Her2 (4D5) se fusionó con un fragmento Fc para producir un producto de anticuerpo monovalente y monoespecífico. Con el fin de garantizar la formación del Fc heterodimérico, se incluyeron mutaciones heteroconductoras en la cadena Fc.

V878: OA4-scFv-B1D2, un anticuerpo anti-Her2 monovalente, donde el dominio de unión a Her2 es un scFv en la cadena A, y la región Fc es un heterodímero que tiene las mutaciones L351Y_F405A_Y407V en la cadena A y T366L_K392M_T394W en la cadena B.

V628: un anticuerpo bivalente anti-Her2, donde ambos dominios de unión a Her2 están en formato scFv, y la región Fc es un heterodímero que tiene las mutaciones L351Y_S400E_F405A_Y407V en la Cadena A y T366I_N390R_K392M_T394W en la Cadena B.

V630: un anticuerpo monovalente anti-Her2, donde el dominio de unión a Her2 es un scFv, y la región Fc es un heterodímero que tiene las mutaciones L351Y_S400E_F405A_Y407V en la Cadena A y T366I N390R K392M T394W en la Cadena B.

Ejemplo 12. Unión de diana a células SKOV por ABH2 fusionado a anti-Her24D5 scFvs en configuraciones multivalentes.

La afinidad de las proteínas de fusión ABH2 anti-Her2 a las células Her2+ se examinó en este Ejemplo. Las diversas configuraciones de unión a scFv se proporcionan en la Figura 17. El ABH2 (AlbuCORE ™) solo, el scFv anti-Her2 solo, una molécula Fc monovalente de un brazo y una molécula Fc bivalente de dos brazos se utilizaron como controles. Estos se resumen en el panel "Controles" de la Figura 17. La proteína ABH2 se construyó según el Ejemplo 2 y las proteínas de fusión se crearon según el Ejemplo 11.

Evaluación de Unión por FACS

La afinidad de unión de las diversas construcciones y controles anti-Her2 ABH2 a las células SKOV que expresan Her2 se evaluó mediante FACS. La detección se realizó utilizando un policlonal anti-HSA (marcado con FITC). Todos los K^ddeterminados son evidentes.

Unión a Célula Completa mediante Protocolo FACS:

Una vez que las células han alcanzado viabilidad suficiente (es decir, 2x106células/ml de células (> 80 % de viabilidad)) los medios se aspiraron del matraz de cultivo T75 y se lavaron con PBS frío, que posteriormente se aspiró. Se añadieron 3 ml de tampón de disociación por matraz y se contaron las células. La suspensión se centrifugó a 1050 rpm durante 5 minutos y las células se resuspendieron en medio RPMI que contenía 5 % de FBS a 1X10e5 células/100 pl. Se añadieron 100 ul de suspensión celular a tubos eppendorf con la posterior adición de 10 pl/tubo del anticuerpo primario (HSA anti-humano de cabra). Las células fueron a continuación incubadas durante 2 horas a 4°C en un soporte giratorio. Los tubos se centrifugaron a continuación durante dos minutos a 2000 rpm a temperatura ambiente. El medio se aspiró y el sedimento se lavó con 500 pl de medio RPMI que contenía 5 % de FBS y se volvió a centrifugar. El anticuerpo secundario (IgG anti-cabra conjugado con Alexa Fluor 488) se añadió para una concentración final de 2 pg/muestra. El sedimento se resuspendió en una solución de 100 ul, se incubó durante 1 hora a 4C en soporte giratorio y se centrifugó 2 minutos a 2000 rpm. Las células se lavaron a continuación con 500 ul de medio RPMI que contenía 5 % de FBS re-centrifugado y resuspendido en 500 ul por sedimento para análisis de citometría de flujo.

Los valores de K^dpara cada construcción se proporcionan debajo de la ilustración representativa en la Figura 17. Todos los K^ddeterminados son evidentes y los valores representan un promedio de seis concentraciones probadas por molécula, hasta 3 pM. Como muestra la figura, el aumento de la valencia tiende a aumentar la afinidad de unión, indicada por la disminución en el valor aparente de K^d. Generalmente, el scFv anti-Her2 unido al extremo N de cualquiera de los polipéptidos de fragmento exhibe una mayor afinidad por Her2 que uno unido al extremo C. En algunas realizaciones, esta propiedad de las especies multivalentes multiespecíficas para reducir la afinidad efectiva en la fusión en posiciones específicas se puede emplear para atenuar la afinidad y la actividad de algunas especies asociadas a la fusión.

Ejemplo 13. Unión biespecífica de ABH2 fusionado a scFvs anti-Her2 y anti-Her3.

Se evaluó la afinidad de unión de un ABH2 cargado en una configuración cis con scFvs anti-Her2 y anti-Her3 a las células MALME-3M y se comparó con el control v1087. Tanto la proteína de fusión como el control se construyeron según el Ejemplo 11.

Análisis FACS de unión biespecífica

La afinidad de unión de una variante de heteromultímero basado en albúmina ejemplar 1090 (anti-Her2 x anti-Her3 ABH2) a las células MALME-3M y SKOV se evaluó usando FACS con anticuerpos anti-HSA marcados con FITC, como se describe en el Ejemplo 12. Como se describe en el Ejemplo 11, v1090 comprende fusiones B1D2/H3, la longitud del enlazador Merrimack y el enlazador menos hidrófobo polyGLY) (S).

La Figura 18A representa la unión de las variantes 1088, 1089 y 1090 en comparación con el control 1087 en células S K O V . L a F ig u r a 18 B r e p r e s e n t a la u n ió n d e l a s v a r i a n t e s 1088 , 1089 y 1090 e n c o m p a r a c i ó n c o n el c o n t ro l 1087 e n c é l u l a s M A L M E -3M . L a T a b l a 16 a c o n t i n u a c i ó n p r o p o r c i o n a d a t o s c o n r e s p e c t o a la c a r a c t e r i z a c i ó n d e la u n ió n d e e s t a s v a r i a n t e s e n a m b o s t i p o s d e c é lu l a s . T o d o s lo s c o n j u n t o s e n la T a b l a 16 s o n nM a m e n o s q u e s e in d iq u e lo c o n t r a r io . L a u n ió n a l a s c é l u l a s M A L M E -3M p a r a 1087 y 1090 f u e d e 5 - 55 nM y 200 - 10 , 000 nM, r e s p e c t i v a m e n t e . La u n ió n a l a s c é l u l a s S K O V p a r a 1087 y 1090 f u e d e 10 nM y 9 ,4 nM, r e s p e c t i v a m e n t e .

T a b l a 16: D a t o s d e u n ió n a r a v a r i a n t e s e n c é l u l a s S K O V M A L M E -3M .

Ejemplo 14. Estabilidad sérica de ABH2 fusionado a anti-Her2.

L a e s t a b i l i d a d d e A B H 2 c a r g a d o c o n u n a n t i - H e r 2 e n s u e r o h u m a n o s e r e a l iz ó p a r a e v a l u a r la p o s i b l e e s c i s i ó n p ro t e o l í t i c a d e l e n l a z a d o r . S e p r o b a r o n c in c o v a r i a n t e s : v 517 , v 518 , v 519 y v 520

Incubación de sueros humanos y posterior análisis FACS.

L a s p r o t e í n a s d e fu s ió n a n t i - H e r 2 A B H 2 d e s c r i t a s a n t e r i o r m e n t e s e p r o b a r o n p a r a la u n ió n a c é l u l a s S K O V y a c o n t i n u a c i ó n s e i n c u b a r o n e n s u e r o s h u m a n o s p r e v i a m e n t e c o n g e l a d o s a 100 p g /m l ( S i g m a # H 4522 ) p a r a 24 h o r a s a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e , a n t e s d e v o lv e r a r e a l i z a r la p r u e b a d e u n ió n a la m i s m a r e s e r v a d e c é l u l a s S K O V . La d e t e c c i ó n s e r e a l iz ó u s a n d o a n t i c u e r p o a n t i - H S A p o l ic lo n a l m a r c a d o c o n F IT C d e c a b r a . L a a f in id a d d e u n ió n d e la p r o t e í n a d e fu s ió n a l a s c é l u l a s S K O V - 3 s e e v a l u ó u t i l i z a n d o F A C S , c o n p r o t e í n a s d e p r e i n c u b a c i ó n u t i l i z a d a s c o m o c o n tro l . L a s F i g u r a s 19 A a D r e p r e s e n t a n la c u r v a d e u n ió n d e l a s m u e s t r a s d e i n c u b a c ió n p r e v i a y p o s t e r i o r a la i n c u b a c i ó n d e l a s v a r i a n t e s p r o b a d a s .

C o m o s e m u e s t r a e n l a s F i g u r a s 19 A a D, t o d a s l a s f u s i o n e s p a r e c í a n e s t a b l e s y c a p a c e s d e u n i r s e al a n t í g e n o d i a n a d e s p u é s d e la i n c u b a c ió n d e l s u e r o .

Ejemplo 15. Unión de FcRn de ABH2 fusionado a scFvs anti-Her2 y anti-Her3.

L a a f in id a d d e A B H 2 c a r g a d o e n u n a c o n f i g u r a c i ó n t r a n s c o n s c F v s a n t i - H e r 2 y a n t i - H e r 3 s e e v a l u ó p a r a la u n ió n a F c R n y s e c o m p a r ó c o n H S A d e n a tu r a l y el c o n t ro l 1087.

P a r a e s t e e x p e r i m e n t o s e utilizó el c o n t ro l d e r e f e r e n c i a v 1087 y u n a d e l a s f u s i o n e s A l b u C O R E H E R 2 / H E R 3 (v 1378 ) . L a F ig u r a 20 A i lu s tra la c o n f i g u r a c i ó n t r a n s d e la fu s ió n v 1378.

Unión a FcRn.

F c R n h u m a n o ( h F c R n ) s e in m ov il izó e n la s u p e r f i c i e S P R y s e h ic ie ro n fluir a n t i - H e r 3 x H e r 2 A B H 2 ( v 1378 ) y v 1087 p u r i f i c a d o s a pH 6 ,0. L o s p r o c e d i m i e n t o s s o n i d é n t i c o s al E j e m p lo 2, e x c e p t o q u e s e invirtió la d i r e c c io n a l id a d de l e n s a y o .

L a s F i g u r a s 20 A y 20 B m u e s t r a n l a s d i f e r e n t e s c u r v a s d e u n ió n d e A n t i - H e r 2 x H e r 3 A B H 2 y V 1087 r e s p e c t i v a m e n t e . El A n t i - H e r 2 x H e r 3 A B H 2 s e u n ió a h F c R n c o n u n a KD d e 0 ,97 pM, m i e n t r a s q u e la m o l é c u l a V 1087 s e u n ió a h F c R n c o n u n a KD d e 2 , 76 pM. D e la s f i g u ra s , s e p u e d e v e r q u e t a n t o la fu s ió n A B H 2 c o m o la v 1087 s o n c o m p a r a b l e s e n a f in id a d d e u n ió n d e F c R n a H S A n a tu r a l (Kd = 1,4 pM a pH 5 ,5 , c o m o s e d e s c r i b e e n C h a u d h u r y , C y col. B io c h e m is t r y 2006, 45, 4983-4990;.

Ejemplo 16. Estabilidad en laboratorio de ABH2 y anti-Her2 ABH2 monovalente.

La estabilidad en laboratorio tanto del andamio ABH2 como de una proteína de fusión monovalente ABH2 anti-Her2 (v517) se evaluó durante un período de cinco días a tres temperaturas diferentes.

Estabilidad en Laboratorio

Las muestras de cada molécula se dividieron en nueve tubos, conteniendo cada tubo ~10 pg de proteína. Se colocó una cantidad inicial de material correspondiente a 10 pg de proteína en PBS a 1 mg/ml y se incubó a 37°C (baño), temperatura ambiente (TA) o 4°C (refrigerador); la estabilidad de la proteína se evaluó en el transcurso de cinco días. En cada momento se extrajo una alícuota y se mezcló 1:1 con tampón de carga Commassie Blue con posterior congelación. Después de la última etapa, todas las alícuotas se descongelaron y se cargaron en un gel nativo, junto con SDS-PAGE reductora y no reductora.

La Figura 21 es un gel nativo del andamio ABH2 y la fusión ABH2 anti-Her2 los días 1, 3 y 5. Como lo demuestra la figura, tanto el andamio ABH2 como el anti-Her2 ABH2 se mantuvo estable durante el período de 5 días. La banda doblete visible para la proteína de fusión probablemente representa dos estados de reducción diferentes del disulfuro. En presencia de agente reductor, las dos bandas de hecho colapsan en una.

Ejemplo 17. Optimización de la purificación utilizando el procedimiento AlbuPure®

Como alternativa a la purificación con Blue Sepharose descrita en el Ejemplo 2, que conduce a cierta cantidad de contaminantes residuales en la elución y la necesidad de una alta elución de sal, se empleó el procedimiento de purificación por afinidad basado en AlbuPure®. Los procedimientos de optimización consistieron en probar la unión a la matriz de Blue Sepharose tanto en modo discontinuo como directo, se probaron diferentes protocolos de elución, junto con diferentes pH y temperaturas. Finalmente, se probó una resina específica (es decir, AlbuPure®) adaptada a la purificación de albúmina y fusiones de albúmina. Se probaron diferentes condiciones de unión y elución usando AlbuPure®, que implican la unión en presencia de diferentes sales y elución usando un gradiente de pH o detergentes competidores.

Purificación de HSA natural: comparación de Blue Sepharose con AlbuPure®

La purificación con Blue Sepharose se realizó en HSA natural según los procedimientos descritos en el Ejemplo 2. La Figura 22A es un perfil de gel SDS-PAGE no reductor del flujo total, fracciones de lavado y elución obtenidas durante la purificación con Blue Sepharose. La Figura 22B representa el análisis LC de la fracción de elución con Blue Sepharose después de la filtración en gel (SEC). Como se puede ver en los numerosos picos en el cromatograma, hubo una contaminación significativa de proteínas e iones incluso después de la purificación.

La purificación con AlbuPure® se realizó en HSA natural como sigue. El sobrenadante celular que contiene HSA natural se solubilizó en PBS. Columnas AlbuPure® preempaquetadas (volumen de la columna: 1 mL) se equilibraron en acetato de sodio 50 mM a pH 5,3. Después de cargar el sobrenadante, la columna se lavó tres veces con soluciones que contienen acetato de sodio 50 mM, pero aumentando el pH (es decir, el 1° era pH 6; el 2° era pH 7). El lavado final se realizó en acetato de amonio, pH 8,0. La proteína de interés se eluyó a continuación usando una solución que contenía acetato de amonio 50 mM, pH 7,0 suplementado con octanoato de sodio 10 mM. El procedimiento con AlbuPure® solo requirió una etapa para obtener una cantidad comparable de proteína a la de Blue Sepharose. Rendimientos de proteínas de 500 ml de cultivo de CHO inicial se muestran en la Tabla 17 a continuación.

Tabla 17: R n imi n r ín l rifi i n.

La Figura 22C representa un análisis LC de la fracción de elución de la columna de afinidad de AlbuPure después de la filtración en gel (SEC). Una comparación de las Figuras 22B y 22C demuestra que el procedimiento de AlbuPure da como resultado una solución final con un nivel mucho más alto de pureza que la de Blue Sepharose junto con una cantidad menor de proteína de agregación de MW más alta.

Purificación de los AlbuCORE diseñados: Comparación de HSA natural y los AlbuCORE diseñados usando AlbuPure®

Los péptidos de dos fragmentos de AlbuCORE-1A, 3, 6 y 9 descritos en la Tabla 11 se expresaron de forma transitoria en células de CHO usando vectores separados. La proporción de ADN óptima para la expresión de los dos fragmentos que constituyen las diferentes moléculas de AlbuCORE fueron (fragmento 1:fragmento 2) AlbuCORE-1=1:1; AlbuCORE-3=1:2; AlbuCORE-6=1:1; AlbuCORE-9=2:1. Todas las expresiones fueron transitorias y se realizaron de manera idéntica a las moléculas de AlbuCORE anteriores. La HSA natural también se expresó transitoriamente en células de CHO. Rendimientos de expresión de las proteínas de fusión estaban dentro del 75 % de la WT-HSA (aprox.

50-70 mg/L). La cantidad de material se determinó por A280 después de purificación con albupura.

Después de la coexpresión, los andamios de AlbuCORE se purificaron utilizando el protocolo AlbuPure® descrito anteriormente. Para evaluar la pureza, el eluyente de la columna de afinidad AlbuPure® se procesó a través de un sistema de filtración en gel (SEC) y se analizó el flujo usando LC. Lo mismo se realizó para HSA natural. La Figura 23A representa el cromatograma de la HSA natural, mientras que las Figuras 23B, 23C, 23D y 23E son cromatogramas de AlbuCORE 1, 3, 6 y 9, respectivamente. Como demuestran estas figuras, los rendimientos de purificación de AlbuPure® son resultados comparables entre AlbuCORE natural y diseñado. Se determinó que los rendimientos en términos de mg de proteína purificada de 500 ml de cultivo de CHO inicial después de la purificación con AlbuPure® fueron: AlbuCORE-1 = 16 mg; AlbuCORE-3 = 25 mg; AlbuCORE-6 = 27; AlbuCORE-9 = 25 mg.

Ampliación de la Expresión y Purificación de AlbuCORE-1

AlbuCORE-1 se coexpresó transitoriamente en CHO usando el vector pTT5 en una proporción de 1:1 fragmento A:B, ver ejemplo 2. Los rendimientos purificados de AlbuCORE-1 en células de CHO fueron aprox. 10 mg/L, que es comparable al rendimiento de 9 mg/L de v1087 en células de CHO, calculado a partir de la misma cantidad de material de partida.

AlbuCORE-1 se purificó utilizando el protocolo AlbuPURE descrito anteriormente. El eluyente de la columna de afinidad se aplicó a un sistema de análisis de filtración-LC por gel. La Figura 24A representa el cromatograma de la purificación con AlbuPure. El pico principal representa la proteína de interés.

Las muestras purificadas también se analizaron mediante geles SDS-PAGE reductores y no reductores, representados en la Figura 24b . Como lo demuestra la figura, en condiciones no reductoras, el producto eluyente clave es la proteína AlbuCORE-1 completa; en condiciones reductoras, la proteína AlbuCORE-1 se separa en los dos fragmentos descritos anteriormente. Significativamente, hay poca contaminación, especialmente cuando se compara con la Figura 22A.

SDS-PAGE y análisis LC/MS de AlbuCORE-1 y WT HSA

El eluyente total, de flujo, de lavado y de las purificaciones HSA natural y AlbuCORE-1 se recogieron y analizaron mediante SDS-PAGE no reductor. Como se muestra en la Figura 25A, que representa los perfiles de gel mencionados anteriormente, se demuestra que hay poca contaminación después del procedimiento con AlbuPure (comparar la Figura 25A y la Figura 22A) y tampoco hay formación de homodímero.

La proteína purificada se analizó a continuación usando LC/MS. Las muestras de proteínas se analizaron por LC-MS usando un sistema HPLC Agilent 1100 acoplado a un espectrómetro de masas híbrido LTQ-Orbitrap XL (ThermoFisher Scientific) a través de una interfaz de electrospray de alto flujo. Las muestras (2,5 pg) se inyectaron en una columna Poros R2 de 2,1 x 10 mm (Applied Biosystems) y se eluyeron usando un gradiente de 2 mL/min de 20-90 % ACN, 0,1 % FA durante 3 minutos. El flujo se dividió después de la columna para dirigir 100 pL/min a la interfaz de electrospray. La columna y el solvente se calentaron a 80°C para mejorar la forma del pico de la proteína. El LTQ-Orbitrap XL se calibró utilizando la solución de calibración LTQ Positive Ion ESI de ThermoFisher Scientific (cafeína, MRFA y Ultramark 1621), y se ajustó utilizando una solución de BSA de 25 ug/ul. El voltaje del cono (configuración de fragmentación de fuente) fue de 40 V, la resolución FT fue de 7.500 y el intervalo de barrido fue m/z 400-4.000. Los espectros de proteínas se desconvolucionaron usando el software ThermoFisher's Promass (intervalo de entrada: m/z 2500-3050; intervalo de masa de salida: 100.000-160.000 Da; Ancho de pico: 1,5; Ancho de fusión: 0,5; Eliminación de línea base: 0,5 (bajo)). Las abundancias de las especies de anticuerpos hétero y homodímeros se determinaron directamente a partir de los perfiles de peso molecular resultantes. La linealidad de la respuesta se confirmó utilizando mezclas definidas de anticuerpos. Los límites de detección fueron aproximadamente del 2 %. La Figura 25B proporciona los espectrogramas de AlbuCORE-1 purificado y WT-HSA. Como lo demuestra el espectrograma para AlbuCORE-1, no hay formación de homodímero (como A:A o B:B). La variación del peso molecular teórico puede deberse a la unión de iones, ligandos misceláneos o glicación.

Ejemplo 18. Organización espacial de los extremos de polipéptidos basados en albúmina.

Polipéptidos basados en albúmina proporcionan un andamio alternativo a los anticuerpos para el suministro de moléculas de carga. Como lo demuestra la diferencia entre las Figuras 26A y 26B, los polipéptidos diseñados basados en albúmina tienen un mayor grado de libertad posicional en comparación con los anticuerpos regulares, ya que la separación espacial entre los cuatro extremos varía significativamente más. Las distancias se determinaron después de modelar la molécula de AlbuCORE en una de las estructuras cristalinas disponibles: PDBID = 4EMX. Además, los cuatro términos también están orientados en diferentes ángulos planos.

Finalmente, las distancias y ángulos entre los extremos pueden estar sujetos a una modulación adicional al elegir diferentes sitios de segmentación, dominios de unión y/o enlazadores. La Figura 26C muestra andamios alternativos de AlbuCORE disponibles para variar las distancias entre extremos para la optimización de la unión al antígeno en modos de unión multivalente.

Ejemplo 19. Estabilidad de polipéptidos adicionales basados en albúmina medidos por DSC

Para determinar la estabilidad y los puntos de fusión de polipéptidos AlbuCORE adicionales, se realizaron experimentos DSC en AlbuCORE-3, 6 y 9, así como los controles WT-Albumin y AlbuCORE-1 . Los experimentos de DSC se realizaron como se establece en el Ejemplo 2. La Figura 27 muestra la curva de fusión de cuatro andamios, en comparación con la de WT-HSA. Como muestra la Figura, los andamios 3, 6 y 9 poseen puntos de fusión muy similares a los 75°C demostrados por el natural. Además, se descubrió que AlbuCORE-6 era más estable térmicamente que la HSA natural, a 76°C. Se realizaron experimentos DSC adicionales en AlbuCORE 1A y 4. La Tm de AlbuCORE 1A fue de 66°C y la Tm de AlbuCORE-4 fue de 70°C. AlbuCORE-1A reduce la brecha entre los dos fragmentos en AlbuCORE 1 (ABH1) a un solo residuo y agrega un enlazador GGGGS a los términos no naturales N y C. Lo mismo se aplica a AlbuCORE 2 (ABH2) y AlbuCORE-2A.

Ejemplo 20: Preparación de construcciones de heteromultímero anti-CD3 x CD19.

Anti-CD3 y anti-CD 19 scFv se unieron a varias plataformas de anticuerpos diferentes de la siguiente manera. La plataforma de polipéptidos basada en albúmina fue AlbuCORE-1; los controles incluyeron WT-HSA, el andamio asimétrico (v873) y el control anti-CD3 x CD19 BiTE v891.

ABH2 cargado con scFvs anti-CD19 x anti-CD3 (1092, 1093, 1094 y 1095): Las secuencias para los scFvs anti-CD19 y anti-CD3 se eligieron entre dos moléculas que están actualmente en ensayos clínicos y están bien documentadas y probadas para estabilidad y producción. Los scFv anti-CD 19 y anti-CD3 se adoptaron directamente de la molécula BiTE blinatumomab. El scFv antiCD3 se eligió en la orientación VH-VL, consistente con lo que se usó en BiTE. La molécula de referencia fue BiTE. Fusiones AlbuCORE_1 (ABH2) CD3/CD19 se crearon uniendo la carga útil antiCD3 al extremo N natural del fragmento 1 y el antiCD19 al extremo C del fragmento 2 (v1092). Se creó una segunda molécula donde se invirtieron las cargas útiles (es decir, carga útil anti-CD 19 en el extremo N natural del fragmento 1 y el anti-CD3 en el extremo C del fragmento 2, v1093). Los enlazadores utilizados fueron idénticos a los utilizados para los experimentos de HER2 AlbuCORE multivalentes: GGGS en el extremo N del fragmento 1 y (GGSG)4GG en el extremo C del fragmento 2. La expresión y la purificación se realizaron como se describió previamente para e1HER2 multivalente. Las moléculas 1093 y 1094 fueron diseñadas para acomodar dos fusiones diferentes en sus extremos naturales. Las fusiones scFv se unieron a la molécula de albúmina a través de un enlazador GGS en el extremo N y un enlazador GGSG en el extremo C. La longitud de los enlazadores refleja los utilizados en la molécula MM-111, a pesar de tener un tipo de secuencia diferente. Representaciones esquemáticas de estas moléculas se muestran en la Figura 29.

Heteromultímeros de CD19 monovalentes y multivalentes adicionales y heteromultímeros de CD3 monovalentes basados en ABH2 en los que se cambiaron las posiciones relativas de los polipéptidos de carga se diseñaron con representaciones esquemáticas de algunos de estos heteromultímeros mostrados en la Figura 28B. Estos heteromultímeros se generaron expresando sus polipéptidos transportadores monoméricos simples, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10, fusionados en uno o ambos extremos a polipéptidos de carga que son antiCD19scFv (CD19) y/o anti-CD3 scFv (CD3). Se combinaron diferentes combinaciones de estas construcciones de base tras la coexpresión para formar heteromultímeros que muestran toda la combinación de los dos polipéptidos de carga en cualquiera de las cuatro posiciones terminales de los dos polipéptidos transportadores, que van desde monovalente a tetravalente. La Tabla 18 ilustra las construcciones de base (que se generaron fusionando los polipéptidos de carga CD3 y/o CD19 en el extremo N o C del polipéptido transportador 1 (F1) o el polipéptido transportador 2 (F2). F1: corresponde a la SEQ ID 8 y F2 corresponde a la SEQ ID 10.

Tabla 18: n r i n r n r i n m n v l n m liv l n D D1

Como se muestra en la Figura 28B, los polipéptidos de carga bioactivos se fusionaron con los polipéptidos transportadores de heteromultímeros a través de un enlazador GGSG, para el extremo N de un monómero y un enlazador más largo (GGS)4GG para todos los demás extremos en el otro monómero. Además, se creó una versión de cada proteína de fusión con un enlazador más corto en su extremo no natural (es decir, C' del Fragmento 1 y N' del Fragmento 2) formado por la secuencia GGSGGSG, reemplazando (GGS)4GG.

En la Tabla 19 se muestra un resumen de los heteromultímeros que se prepararon.

Tabla 19: Construcciones monovalentes, multivalentes y multiespecíficas que se generaron fusionando los polipéptidos de carga CD3 y CD19 con el extremo N o C del polipéptido transportador 1 o del polipéptido transportador 2 de ABH2.

Se generaron construcciones multivalentes como se describe en el Ejemplo 2 usando el heteromultímero ABH2. Los productos génicos finales se subclonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (NRC-BRI, Canadá) (Durocher y col.). La producción de proteínas recombinantes de alto nivel y alto rendimiento por transfección transitoria de CHO-3E7 humano en suspensión se realizó como se describe en el Ejemplo 2.

Los resultados de expresión se muestran en la Figura 28C. Las fusiones monovalentes de CD3 y CD19 se expresan a niveles similares. La expresión de CD3 y CD19 monovalentes tiene el mismo patrón (en términos de MW) que el observado con las fusiones de HER2, lo que indica que las variaciones en la migración en gel no reductor son independientes del tipo de carga útil.

Ejemplo 21: Capacidad del polipéptido basado en albúmina cargado con anti-CD3 x CD19 para unirse a células B y células T.

La capacidad de AlbuCORE-1 cargado con Anti-CD3 x CD19 (v1092 y 1093) a las células CD3+ y CD19+ se evaluó usando FACS y se comparó con WT-HSA cargado con el mismo anti-CD scFvs (1094 y 1095). Las construcciones AlbuCORE-1 se probaron adicionalmente contra Azymetric™ y BiTE MT-103 para la unión de células B y células T de la siguiente manera. El procedimiento se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 13, pero en células MALME-3M y células SKOV.

Los resultados se muestran en la Figura 29 que muestra los datos de K^dy HillSlope para las variantes probadas en las células Jurkat y Raji.

Ejemplo 22: Capacidad del polipéptido basado en albúmina cargado con anti-CD13 x CD19 para unirse a células B y células T.

La capacidad de las variantes 1092 y 1093 para puentear las células B y T se determinó como sigue.

Puenteo de Células Completas mediante FACS

1 x 106 células/ml suspendidas en RPMI se marcaron con 0,3 pM de la etiqueta □ CellTrace apropiada y se mezclaron e incubaron a 37°C en un baño de agua durante 25 minutos. Sedimentos fueron resuspendidos en 2 ml de L10 GS1 NaN3 a una concentración final 5x x106 células/ml. Las suspensiones celulares se analizaron (dilución 1/5) por citometría de flujo para verificar el etiquetado celular apropiado y la configuración del láser. Se usaron fluorosferas de verificación de flujo y de ajuste de flujo para verificar la estandarización del instrumento, la alineación óptica y la fluidez. Después de la verificación de citometría de flujo, y antes del puenteo, cada línea celular se mezcló en la proporción deseada, a una concentración final de 1x106células/ml.

El puenteo T:T se evaluó con Jurkat-violeta Jurkat-RojoLejano, □ B:B se evaluó con RAJI-violeta RAJI-RojoLejano □ y T:B se evaluó con Jurkat-violeta RAJI-RojoLejano.

Las variantes de anticuerpos se diluyeron a 2x en L10+GS1+NaN3 a temperatura ambiente y a continuación se agregaron a las células seguido de una mezcla suave y una incubación de 30 minutos.

Después de la incubación de 30 minutos, se añadieron 2 pl de yoduro de propidio, se mezclaron lentamente y se analizaron inmediatamente por citometría de flujo.

El % de puenteo se calculó como el porcentaje de eventos que se etiquetan simultáneamente como violeta y rojo lejano. □

La Figura 30A compara la capacidad de v1093, un anticuerpo bi-específico CD3/CD19 (v873) y el control similar a BiTE v891 para unir las células T Jurkat CD3 (cuadrante inferior derecho) con células B Raji CD19 (cuadrante superior izquierdo) por FACS. Las células de T-B puenteadas aparecen en el cuadrante superior derecho. Este resultado demuestra que a concentraciones tan bajas como 0,3 nM v1093 es capaz de unir específicamente las células Jurkat T y las células Raji B en un grado similar (31 % de las células totales) como BiTE (21 % de las células totales) y un anticuerpo CD3/CD19 bi-específico con un Fc heterodimérico (25 %).

La Figura 30B compara la capacidad de v1092 con los controles v891, v873 y v221. Esta figura muestra que v1092 puede puentear células T Jurkat y células Raji B en un grado similar al v891 (BITE).

SECUENCIAS:

1. SEQ ID NO: 91 (v438: NM32 scFv NT)

T CAAGCGAGCT GACCCAGG ACCCCGCCGT GAGCGT CGC ACT GGGGC AG ACCGTGCGC A

T CAC AT GCCAGGGAG AT AGCCT GCG AT CCTACT AT GC AT CTT GGT ACCAGCAGAAGCC A

GGACAGGCACCTGTGCTGGTCATCTATGGGAAAAACAATAGACCATCAGGCATCCCCG

AC AGGTT CAGCGGAAGCTCCT CT GGCAAC AC AGCTT CT CT GACCATT ACAGGCGCACAG

GCCG AGG ACG AAGC AG ATT ACT ATT GCAACAGT CGGG AT AGTT CAGGG AAT C ACGT GG

T CTTT GGAGG AGGAACT AAGCT G ACCGTGGGAGGAGGAT C AGGAGGAGGAAGCGGAG

GAGGCAGCGGAGG AGGAT CT GGAGGAGGAAGT GGAGAGGT GCAGCT GGT CGAAAGCG

GAGG AGGAGT GGT CCGACCT GGAGGGT CACT GCG ACT G AGCT GT GC AGCTT CCGGCTT

CACATTT GACGATT ACGGGATGT CAT GGGT GAG AC AGGCCCCAGGGAAAGGACT GGAA

T GGGT CT CCGGC AT C AACT GGAAT GGAGGCT CT ACT GGAT ACGCCG AC AGT GT GAAGG

GC AGGTT C ACC ATTT CCCGCG AT AAC GCT AAAAATT CTCT GT AT CT GC AG AT G AAC AGT

CT GAGGGCCG AGG AC ACT GCCGT GT ACT ATTGT GCCCGGGGCAG AT CCCT GCT GTTT GA

TT ACT GGGGCC AGGGG AC ACT GGT G ACT GT CTCT CGCGGC AGT GAAAAT CT GT ATTTT C

AG

2. SEQ ID NO: 92 (v438: NM32 scFv AA)

SSEETQDPAVSVAEGQTVRITCQGDSERSYYASWYQQKPGQAPVEVIYGKNNRPSGIPDRFS

GSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHWFGGGTKLTVGGGSGGGSGGGSGGG

SGGGSGEVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINW

NGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSFYFQMNSFRAEDTAVYYCARGRSFFFDYWGQGTF

VTVSRGSENEYFQ

3. SEQ ID NO: 93 (V218: 4D5 scFv NT)

GACATCCAGAT GACCCAGT CT CC ATCCT CCCT GT CT GCAT CTGTAGG AG AC AGAGT CAC CAT C ACTT GCCGGGC AAGT C AGG ACGTT AAC ACCGCT GT AGCTT GGT AT C AGC AG AAA CCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCTTTTTGTACAGTGGGGTCCC AT C AAGGTTC AGT GGC AGT CG AT CT GGG ACAG ATTT CACT CT CAC CAT C AGC AGT CTGC AACCT G AAG ATTTT GC AACTT ACT ACT GT CAAC AGC ATT AC ACT AC CCC ACCC ACTTT C GGCCAAGGGACCAAAGT GGAGAT C AAAGGT GGTT CT GGT GGT GGTT CT GGT GGT GGTT CTGGT GGTGGTT CT GGTGGT GGTT CT GGT GAAGTGC AGCT GGT GG AGT CT GGGGG AGGC TT GGT ACAGCCT GGCGGGTCCCTGAGACT CT CCT GT GCAGCCT CT GGATT CAACATT AA AG AT ACTT AT AT CC ACT GGGT CCGGC AAGCT CC AGGG AAGGGCCT GG AGT GGGT CGC A CGT ATTT AT CCC AC AAAT GGTT AC AC ACGGT AT GCGG ACT CT GT GAAGGGCCG ATT CAC CAT CTCCGCAGACACTTCCAAGAAC ACCGCGTAT CT GC AAATGAAC AGT CT GAG AGCT GAGGACACGGCCGTTTATTACTGTTCAAGATGGGGCGGAGACGGTTTCTACGCTATGGA CT ACT GGGGCCAAGGGACCCT GGT CACCGT CT CCT CAGGCAGCGAG AACCT GT ATTTT C AG

D NO: 94 (V218: 4D5 scFv AA) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRF SGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGG GSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGY TRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTL VTVSSGSENLYFQ

D NO: 95 (Construcción base # 1)

AGTAGCGAACTGACACAGGACCCCGCAGTGAGCGTCGCACTGGGACAGACAGTGCGAATC ACTT GCC AGGGGG ACT C ACT GCGG AGCT ACT ATGCCTC CTGGT ACC AGC AG AAACC AGGC CAGGCT CCCGT GCT GGTCAT CT AT GGC AAG AACAATAGGCCT AGTGGGATT CCAGAT CGCT TTT CAGGGAGCT CCT CT GGAAACACT GCAAGT CT GACCATT ACAGGCGCTCAGGCAGAGG ACGAAGCCGATTACTATTGCAACAGCAGGGACAGTTCAGGGAATCACGTGGTCTTCGGAG GAGGAACT AAGCT GACCGTGGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGAT CT GGAGGAGGAAGT GGA GGAGGATC AGGAGGAGGAAGCGGAGAGGT GCAGCT GGT CGAAAGCGGAGGAGGAGTGGT CCGGCC AGG AGGGT CCCT G AGACT GT CTT GT GCCGCT AGT GGATT CACTTTT GACG ATT AC GGAAT GT C AT GGGTCCGGCAGGCACCT GGCAAGGGACTGGAGT GGGT GAGCGGCATCAAC TGGAATGGAGGCTCCACAGGGTACGCTGATTCTGTGAAAGGACGCTTTACTATTAGCCGAG AC AACGC C AAG AAC AGCCT GT AT CT GC AG AT G AACT CTCT G AG AGCT G AGG AT ACCGC AG TGT ACT ATT GCGCC AGGGGCCGCT CTCTGCTGTT CGACT ACTGGGG AC AGGGC AC ACT GGT GACTGT CTCACGCGGGGGAAGCGGGGATGCTCACAAGTCCGAGGTCGCACATCGATTCAA AG ACCT GGG AG AGG AAAATTTT AAGGCCCT GGT GCT GAT CGCCTT CGCT C AGT AT CT GCAG CAGT GCCCTTTT GAAGACCACGT GAAACTGGT CAACGAGGT GACCGAGTT CGCCAAGACA T GCGT GGCCG ACG AG AGT GCT GAAAATT GT GAT AAAT C ACT GC AT ACCCT GTTT GGAGAT A AGCT GT GT ACCGT GGC C AC ACT GCGGG AG AC AT ACGGCG AAAT GGC AGACT GCT GT GCC A AACAGGAGCCTGAAAGAAACGAGTGCTTCCTGCAGCACAAGGACGATAACCCCAATCTGC CT CGACT GGT GCGGCC AG AAGT GG ACGT C AT GT GT ACT GCTTT CCACG AT AAT G AGG AAAC CTTTCTGAAGAAATACCTGTATGAGATTGCCCGGAGACATCCATACTTTTATGCCCCCGAA CT GCT GTT CTTTGCT AAGCGCT AT AAAGC AGCCTTCACCG AGTGCT GT CAGGCT GC AG AT A AGGCCGCTT GCCT GCT GCCAAAACT GGACGAGCT GAGAGAT GAAGGCAAAGC AAGCT CCG CC AAGCAGAGGCT GAAAT GT GCAAGCCT GCAGAAGTT CGGCGAGAGGGCCTTTAAAGCAT GGGCCGT GGCT AGACT GT CTCAGAGGTT CCCCAAGGCT GAGTTT GCAGAAGT CAGT AAGCT GGT GACT GACCT GACCAAAGT GCACACAGAGT GCTGT CAT GGCGACCT GCTGGAAT GCGC CGACGAT CGCGCCGAT CT GGCT AAGT AC AT CT GT GAGAACC AGGACT CCATTT CTAGT AAG CT GAAAG AGT GCT GT GAAAAGCC ACT GCT GG AG AAAT CT CATT GCAT CGCT GAGGT GG AA AATGACGAAATGCCCGCAGATCTGCCTAGCCTGGCAGCCGACTTCGTCGAGTCCAAGGAT GT GT GT AAAAACT AT GC CG AGGCT AAAGAT GT GTTT CT GGGAAT GTTT CT GT AT GAGT AT G CAAGAGCATGAGGATCC

ID NO: 96 (Proteína de Construcción base # 1)

S SELT QDPAV S VALGQTVRIT CQGDSLRS YY AS WY QQKPGQ APVLVIY GKNNRPS GIPDRFS GS SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHWFGGGTKLTVGGGSGGGSGGGSGGGSGGG SGEVQLYESGGGVYRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTG YADSVKGRFTISRDNAKNSFYFQMNSFRAEDTAVYYCARGRSFFFDYWGQGTFVTVSRGGSG DAHKSEVAHRFKDLGEENFKAFVFIAFAQYFQQCPFEDHVKFVNEVTEFAKTCVADESAENC DKSFHTFFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMC TAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRE) EGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGD LLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEYENDEMPADLPSLAADFVESK DV CKNY AE AKDVFLGMFLYE Y ARA

ID NO: 97 (Construcción base # 2 NT)

GAT GCT C AT AAAT CT G AGGT CGCT C ACCGGTT CAAGG AT CT GGGCG AGG AAAACTTT AAAG CACTGGT GCT GAT CGCTTT CGC AC AGT ACCT GCAGC AGT GCCCCTTT GAGG ACC ACGT G AA GCT GGT CAACGAGGT GACAGAGTT CGCCAAAACTT GCGT CGCCGACGAGT CTGCT GAAAA TT GT GAT AAG AGT CT GC AT AC ACT GTTT GGAG AT AAACT GT GT ACT GT GGCC ACCCT GAGA GAG ACTT AT GGCG AAAT GGC AG ACT GCT GT GCCAAGC AGG AGCCT G AAAGGAACG AGT GC TTCCT GCAGC AT AAAG ACG AT AACCCC AAT CT GCCT AGGCT GGT GCGCCC AG AAGT GG AC GT CAT GT GTACCGCCTTCCACGAT AAT GAGGAAAC ATTT CT GAAGAAAT ACCT GT ATGAGA TT GCCCGG AGAC AT CC AT ACTTTT AT GC ACCCG AACT GCT GTT CTTT GCCAAG AG AT ACAA AGCCGCTTT CACCG AGT GCT GT C AGGC AGCCG AT AAGGCT GCAT GCCTGCT GCC AAAACT G GACGAGCT GCGAGAT GAAGGGAAGGCCAGCTCCGCT AAGCAGCGGCT GAAATGT GCT AGC CT GCAGAAGTT CGGAGAGCGAGCCTT CAAGGCAT GGGCT GT GGC ACG ACT GTCCCAGCGG TT CCCC AAAGC AG AGTTTGCCGAAGT CT CT AAGCT GGT GAC AG ACCT G ACT AAAGT GC ACA CCG AGT GCT GT CAT GGCG ACCT GCT GGAAT GCGCCGACG AT CG AGCT GAT CT GGC AAAGT AC AT CTGT GAG AAT C AGG AC AGC ATTT CT AGT AAGCT G AAAG AGT GCT GT GAAAAGCCT CT GCT GGAG AAAT CCCACTGCAT CGCCGAGGT GGAAAACGACGAAATGCCAGCT GAT CT GCC T CACT GGCCGCT GACTTT GT CGAG AGC AAGGAT GT GT GT AAAAATT AT GCCG AAGCT AAG GAT GT GTTCCTGGGC ATGTTTCT GT ACG AGT AT GC AAGGGC AGG AGGGTCCGG AGGCTCTG GAGGAAGTGGAGGGTCAGGAGGCTCAAGCGAACTGACTCAGGACCCCGCTGTGAGCGTCG CACTGGGACAGACT GT GAGGAT CACCT GCCAGGGGGACAGCCTGCGCTCCT ACT AT GCATC CTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCCCCAGTGCTGGTCATCTATGGCAAAAACAATCG GCCCT CAGGG ATT CCT GAT CGGTT C AGCGGGT CCTCT AGT GGAAAC AC AGCTT CT CT GACC ATTAC AGGCGCTCAGGC AGAGGACGAAGCCGATT ACT ATT GCAACAGCCGCGACT CAAGC GGGAAT CAT GT GGT CTTCGGAGGAGGAACCAAGCTGACAGT GGGAGGAGGCT CT GGAGGA GGCAGTGGGGGAGGCTCAGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGCTCCGGAGAGGTCCAGCTGGT GGAAAGCGG AGG AGG AGT GGT CCGC CC AGGAGG AT CT CT GCG ACT GAGTTGT GCAGC CTC AGGATTCACCTTTGACGATTACGGAATGAGTTGGGTCCGGCAGGCACCTGGAAAGGGACT GGAGT GGGT GAGCGGCAT CAACT GGAATGGCGGGAGCACT GGGTACGCT GATT CCGT GAA GGG AAG ATT CACC ATTT CCAGGG AC AACGCC AAAAATT CTCT GT ATCTGC AG AT G AAT AGT CTGAGAGCCGAGGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAGGGGGAGGTCTCTGCTGTTCGACT ACTGGGGGCAGGGCACTCT GGTCACTGTGTCAAGATGAGGATCC

D NO: 98 (Proteína de Construcción base # 2)

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENC DKSLHTLFGDBCLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMC TAFEIDN EETFLKKY LYEIARRHP YE Y APELLFFAKRY KAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRD EGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAYARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGD LLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESK DVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARAGGSGGSGGSGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQG DSLRS YY AS WYQQKPGQAPVLVIY GKNNRP SGIPDRFSGS SS GNTASLTIT GAQAEDE ADYY C NSRDSSGNHWFGGGTKLTYGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGWRPGGSLRLS CAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARGRSLLFDYWGQGTLVTVSR

D NO: 99 (Construcción base #3 NT)

T CCT CCGAGCT GACCCAGGACCCT GCCGT GT CCGTCGCTCT GGGACAGACCGT GCGGAT CA CAT GC C AGGG AG AT AGCCT G AG AT CCT ACT AT GCT AGCT GGT ACC AGC AG AAACCCGGCC AGGCACCTGTGCTGGTCATCTATGGGAAGAACAATCGCCCATCTGGCATCCCCGACCGATT CAGTGGAAGCTCCTCTGGCAACACAGCCTCTCTGACTATTACCGGCGCTCAGGCAGAGGAC GAAGCTGATTACTATTGCAACAGCAGGGATAGTTCAGGGAATCACGTGGTCTTTGGAGGA GGAACT AAGCT G ACCGT GGG AGG AGG AT CT GGAGG AGG AAGT GGCGGGGG AT C AGG AGG AGGAAGCGGAGGAGGCAGCGGAGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGAGGAGGAGTGGTCA GACCAGGAGGGTCTCT GAGGCT GAGTT GT GCCGCTTCAGGCTT CACCTTT GACGATT ACGG AAT GT CTT GGGT GCGGC AGGC ACCT GG AAAGGG ACT GG AGT GGGT GAGT GGC AT C AAC T G GAATGGAGGCAGCACAGGATACGCAGACTCCGTGAAAGGCCGATTCACTATTTCACGGGA TAACGCCAAGAATAGCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCAGAGGACACAGCCGT GT ACT ATT GT GCCAGGGGCCGCT CT CT GCT GTTT GATT ACT GGGGGCAGGGAAC ACT GGTG ACT GT C AGCCGAGGAGGAT CT GGAGGGAGTGGAGGCT CAGGAGGAAGCGGAGGGT CCGT GGTCCT GCT GCT GCGACT GGCT AAAACTT ACGAG ACC AC ACT GGAAAAGT GCTGT GCAGCC GCT GACCCCC AT GAGT GCT AT GC AAAAGT GTT CGAT GAGTTCAAGCCT CTGGT CG AGG AAC CACAGAACCT GAT CAAACAGAATT GT GAGCT GTTCGAACAGCTGGGCGAGT ACAAGTTT C AGAACGCCCTGCTGGTGAGATATACCAAGAAAGTGCCCCAGGTCTCTACACCTACTCTGGT GGAGGT CAGTAGGAAT CT GGGCAAAGTGGGGT CAAAAT GCT GT AAGCACCC AGAGGCT AA GCGCAT GCCCT GCGCAGAAGACT ACCT GAGCGT GGT CCTGAACCAGCTGT GT GT GCT GCAT GAG AAAACT CCAGT GT CCG AT AGGGT CACT AAGT GCT GT AC CG AAAGCCT GGT GAACCGG AGACCTTGCTT CT CCGCCCT GGAGGTGGACGAAACCT AT GTCCCAAAAGAGTTTAAT GCCG AAACCTTC AC ATTT CACGCT GAT AT CT GT ACCCT GT CCG AG AAGGAACGCC AG ATT AAG AA ACAGACAGCT CT GGT GGAGCT GGT CAAGCAT AAACCCAAGGCAACAAAAGAACAGCT GAA GGCCGTGATGGACGATTTCGCAGCCTTTGTGGAGAAATGCTGTAAGGCCGACGATAAGGA AACTT GCTTTGCT GAAG AAG G G AAG AAACT GGTCGCCGC AT C ACAGGCT GCT CT GGG ACT GTGAGGATCC

ID NO: 100 (Proteína de Construcción base # 3)

S SELT QDPAV S VALGQTVRIT CQGDSLRS YY AS WY QQKPGQ APVLVIY GKNNRPS GIPDRFS GS SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHWFGGGTKLTVGGGSGGGSGGGSGGGSGGG SGEVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTG YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRSLLFDYWGQGTLVTVSRGGSG GSGGSGGSGGSWFFFRFAKTYETTFEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPFVEEPQNFIKQNCEF

FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVV LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQA ALGL

ID NO: 101 (Construcción base # 4)

AGCGTCGTCCTGCTGCTGAGACTGGCTAAAACATACGAGACCACACTGGAAAAGTGCTGT GCCGCT GC AG ACCCT C ACG AGT GCT AT GCC AAAGT GTT CG AT GAGTT CAAGCCT CT GGT CG AGGAACCACAGAACCTGATCAAACAGAATTGTGAGCTGTTCGAACAGCTGGGCGAGTACA AGTTT CAGAACGCCCT GCT GGT GAGGT ATACTAAG AAAGT GCCCCAGGT CAGT ACT CCT AC CCT GGT GGAGGT CTCACGGAAT CT GGGG AAAGT GGGAAGCAAAT GCT GTAAGCACCC AGA GGCAAAGAGAATGCCCTGCGCCGAAGACTACCTGAGCGTGGTCCTGAACCAGCTGTGTGT GCT GC AT GAG AAAACTCC AGT GAGCG AT AGGGT CAC AAAGT GCT GT ACT GAATCC CTGGT GAACCGGAGACCTT GCTT CTCTGCCCT GGAGGT GGACGAAACCT ATGT CCCAAAGGAGTTT AAT GCT G AAAC ATT C ACTTTT CAC GC AG AT AT CT GT AC ACT G AGCG AG AAGG AACGCC AGA TT AAG AAAC AG ACT GCCCT GGT GG AGCTGGT CAAGC AT AAACC C AAGGCC ACC AAAG AAC AGCT GAAGGCT GT GAT GGACGATTT CGCCGCTTTTGT CGAGAAATGCT GTAAGGCAGACGA TAAGG AAAC AT GCTT CGCCG AGG AAGGG AAG AAACT GGT GGC AGC AAGCC AGGCT GC ACT GGGACTGGGAGGGT CTGGAGGC AGT GGAGGAT CAGGAGGGAGCGGAGGCAGCT CCGAGC TGACCCAGGACCCCGCT GT GAGCGT CGCACT GGGACAGACCGT GCGCAT CACAT GTCAGG GCGATT CCCTGCGAT CTTACTAT GCTTCCT GGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGGCACCTGT GCT GGT CAT CT ATGGAAAGAACAAT AGACCAAGT GGCATT CCCGACAGGTT CT CAGGCTCT AGTTCAGGGAACACCGCCT CCCT GACCATTACAGGCGCACAGGCCGAGGACGAAGCT GAT TACT ATT GC AACT CT CGGGAT AGCT CCGGC AAT CAT GT GGT CTTTGGGGGAGGC ACT AAGC TGACCGTGGGGGGAGGCAGTGGGGGAGGCTCAGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGCTCCGGA GGAGGCT CT GGCGAGGT GCAGCT GGT CGAAT CCGGAGGAGGAGT GGT CCGACCAGGAGGA AGT CT GCG ACT GT CAT GT GCCGCT AGCGGGTT CACCTTT GACGATT ACGG AAT G AGTTGGG T GCGAC AGGC ACCT GG AAAGGG ACT GG AGT GGGT GT CT GGCAT C AACT GG AAT GGCGGGT CCACTGGCTACGCAGACTCTGTGAAAGGGAGGTTTACCATTAGCCGCGATAACGCCAAGA AC AGCCT GT AT CT GC AGAT GAAC AGCCT GCGCGCCG AGG ACAC AGCT GT GT ACT ATTGCGC

CAGGGGG AGGT C ACT GCT GTTT GATT ACT GGGGGC AGGGG ACT CT GGT CACT GT GT CACGG TGAGGATCC

ID NO: 102 (Construcción base de Proteína # 4) SWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQ NALLVRYTKKVPQ V S TPTLVE V SRNLGKV G S KCCKHPE AKRMP C AED YLS VVLNQLCVLHEK TPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVE LVKHKPKAT'KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGGSG GSGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSG IPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHWFGGGTKLTVGGGSGGGSGGGS GGGSGGGSGEVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIN WNGGSTGY AD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT AVYY CARGRSLLFDY WGQGTLV TVSR

ID NO: 103 (Construcción base 5)

GAC ATT CAG AT GAC AC AGT CCCC AAGCT C CCT GAGCGCTTCCGT CGGCG AT CG AGT G ACT A TCACCTGCCGAGCCTCTCAGGACGTCAACACTGCTGTGGCATGGTACCAGCAGAAGCCTGG GAAAGC ACC AAAGCT GCT G AT CT ACT CT GCC AGTTTT CT GT ATT CT GGAGT GCCC AGT AGA TT CT CAGGAAGCAGGT CCGGCACCGATTTTACACT GACT AT CT CT AGT CT GCAGCCT GAGG ACTTCGCCACATACTATTGCCAGCAGCACTATACCACACCCCCTACATTTGGACAGGGCAC TAAAGTGGAAATTAAGGGCGGGTCAGGCGGAGGGAGCGGAGGAGGGTCCGGAGGAGGGT CT GGAGG AGGG AGT GG AG AGGT GC AGCT GGT CGAATCCGG AGG AGGACT GGT GCAGCCT G GAGGCT C ACT G AGGCT G AGCT GTGCCGCTTCCGGCTT C AAC AT CAAGG AT ACCT ACATT C A TT GGGT CAGAC AGGCT CCT GGG AAAGG ACT GGAGT GGGT GGC AAGG AT CT AT CC AACC AA T GGGT AC AC ACGGT AT GC CGAT AGCGT G AAGGG AAG ATT CACT ATTT CT GCTGAC ACT AGT AAAAACACCGCATACCTGCAGATGAATAGCCTGAGGGCAGAGGACACCGCCGTGTACTAT TGCTCCCGCTGGGGGGGAGACGGCTTTTACGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGGACCCTGG TGACAGTCTCAAGCGGCGGGT CAGGAGAT GCAC ACAAAAGCGAGGT CGCCCAT CGCTT CA AGGACCTGGGCGAGGAAAATTTTAAAGCCCTGGTGCTGATTGCCTTCGCTCAGTACCTGCA GCAGT GCCCATT CGAAGACCACGT GAAGCT GGT CAACGAGGT GACCGAATTT GCC AAAAC

ATGCGT CGCTGACGAGT CCGCAGAAAATT GTGATAAGTCT CTGCATACACTGTTCGGCGAT AAACTGTGTACTGTGGCCACCCTGCGCGAGACTTATGGGGAAATGGCCGACTGCTGTGCTA AGCAGGAGCCAGAACGAAACGAGT GCTTTCT GCAGCACAAGGACGAT AACCCAAAT CTGC CAAGGCT GGT GCGCCC AG AAGT GG ACGT CAT GT GT ACT GCTTT CCACG AT AAT G AGG AAAC CTTT CT GAAGAAAT ACCT GTAT GAGAT CGCCCGGAGACAT CCATACTT CTAT GCCCCCGAA CT GCT GTT CTTTGCTAAACGGT ACAAGGCAGCCTTTACCGAGT GCT GT CAGGCT GCAGATA AAGCCGCTT GCCT GCT GCCT AAGCT GGACGAGCT GCGAGAT GAAGGCAAGGCATCCT CT G CCAAACAGCGGCT GAAGT GT GCCAGCCTGCAGAAATT CGGGGAGCGGGCTTTTAAGGCAT GGGCCGT GGCT CG ACT GT CT C AGCGGTT CCCAAAGGCT G AGTTT GCAG AAGT CAGT AAACT GGT GAC AG ACCT GACT AAGGT GC AC AC AG AGT GCT GT CAT GGCGAC CT GCT GG AAT GCGC CGACGATAGAGCCGATCTGGCTAAGTACATCTGTGAGAACCAGGACAGCATTAGTTCAAA GCT GAAAGAGT GCT GT GAAAAACCT CTGCT GGAG AAG AGCC ACT GCAT CGC AGAGGT GGA AAATGACGAAATGCCCGCCGATCTGCCTAGTCTGGCAGCCGACTTCGTCGAGTCAAAAGAT GT GT GT AAG AACT ACGC C G AAGC AAAAG AT GT GTTT CT GGG AAT GTTT CT GT AT GAGT AT G CCCGAGC CT GAGG AT CC

ID NO: 104 (Proteína de Construcción base 5)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSG SRS GTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQHYTTPPTF GQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGS GE VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADS VKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGSG DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENC DKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEYDYMC TAFHDNEETFLKKYLYETARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRD EGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGD LLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESK DVCKNYAE AKDVFLGMFLYEY ARA

ID NO: 105 (Construcción base # 6)

GACGCAC AT AAGTCCGAGGT CGCT CACAGGTT CAAAGAT CT GGGCGAGGAAAACTTTAAG GCCCT GGT GCT GATCGCTTT CGCACAGT ACCT GCAGC AGT GCCCATT CGAAGACCACGT GA AACT GGT CAACGAAGT GACT GAATTT GCCAAGACCT GCGT CGCCGACGAGTCCGCTGAAA ATT GT GAT AAAT CT CT GC AT ACT CT GTT CGGGGAT AAGCTGT GT ACCGT GGCC ACACTGCG CGAGACCTAT GGAGAAAT GGC AGACTGCT GT GCC AAAC AGGAGCCAGAACGAAACGAGT GCTTT CT GCAGCAT AAGGACGATAACCC AAAT CT GCCAAGGCTGGTGCGCCCAGAAGT GG ACGT CAT GT GTACCGCCTTCC ACGAT AAT GAGGAAACATTT CTGAAGAAAT ACCT GTAT GA GATT GCCCGGAGACAT C C AT ACTT CT AT GCCCCCG AACT GCT GTT CTTT GCT AAGCGCT ACA AAGCCGCTTTTACCGAGT GCT GT CAGGCAGCCGAT AAAGCT GCAT GCCT GCT GCCT AAGCT GGACGAGCTGAGGGATGAAGGAAAGGCCAGCTCCGCTAAACAGCGCCTGAAGTGTGCCTC TCT GCAGAAATT CGGCGAGCGGGCTTTT AAGGCAT GGGCT GT CGCACGACT GAGCCAGCG GTT CCCAAAGGC AG AGTTTGCCG AAGT CT CCAAACT GGT GACT G ACCT G ACC AAGGT GC AC ACCGAGT GCT GT CATGGCGACCT GCTGGAAT GCGCCGACGAT AGAGCT GAT CT GGCAAAG TACAT CTGT GAGAACCAGGACAGCATTT CT AGT AAGCT GAAAGAGTGCT GT GAAAAACCC CT GCT GGAGAAGAGCCACT GCAT CGCAGAGGT GGAAAACGACGAAATGCCT GCCGAT CT G CC AAGT CT GGCCGCT G ACTT CGT CG AGT C AAAAG AT GT GT GT AAGAATT AT GCCG AAGCT A AGGATGT GTT CCTGGGCAT GTTT CT GTACGAGT AT GCACGAGCAGGAGGGAGCGGAGGCT CCGGAGGATCTGGCGGGAGTGGAGGCGACATCCAGATGACTCAGTCCCCTTCAAGCCTGA GTGCTTCAGTCGGCGATCGCGTGACTATTACCTGCCGAGCCTCTCAGGACGTCAATACAGC TGTGGCATGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAAGCTCCTAAGCTGCTGATCTACAGCGCATCC TTT CT GT ATT C AGGGGT GCCCAGC AG ATT CT CT GGCAGT AG AT CAGGG AC AG ATTTT AC AC T GACT ATTT CCT CT CT GCAGC CT GAGGACTTCGCC ACTT ACT ATT GCC AGC AGC ACT AT ACC ACACCCCCT ACATTTGGAC AGGGCACT AAAGT GGAAATCAAGGGAGGCAGCGGAGGAGG AT CT GG AGG AGG AAGT GGAGG AGG AT C AGGAGG AGG AAGCGG AG AGGT CC AGCT GGT GG AAAGCGG AGG AGG ACT GGT GC AGCCT GGAGGGT CCCT G AG ACT GT CTT GT GCAGCC AGT G GCTT CAAC AT CAAAGAT ACCT AC ATT C ATT GGGT CAG AC AGGCT CCT GGG AAGGG ACT GGA GT GGGT GGCAAGG AT CT AT CC AAC AAATGGAT ACACT CGGT AT GCCGAT AGCGT G AAAGG CCGGTTCACCATTTCAGCAGACACCAGCAAGAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCT GCG AGCT G AGG AC AC AGC AGT GT ACT ATT GC AGT CGGT GGGGCGGCG AT GGCTTTT ACGCT AT GG ACT ATT GGGGGCAGGGG ACACT GGT GACT GT GAGTT CTTGAGGAT CC

ID NO: 106 (Construcción base de Proteína # 6)

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENC DKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMC TAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRD EGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGD LLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEYENDEMPADLPSLAADFYESK DVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARAGGSGGSGGSGGSGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCR ASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA S GFNIKDT YIFIWVRQ APGKGLE WVARIYPTN GYTRY AD S VKGRFTIS ADT S KNT AYLQMN S LR AEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS

ID NO: 107 (Construcción base # 7)

GAC ATT CAG AT G ACAC AG AGCCC AAGCTCCCT GT CCGC AT CT GT GGGCG AC CG AGT CACA AT C ACTT GCCGGGCCTCCCAGGAT GT GAACACT GCTGT CGCATGGT ACCAGCAGAAACCAG GGAAGGCT CCCAAACT GCT GATCTACAGT GCAT C ATTCCT GTATAGT GGCGT GCCAT CAAG GTTT AGCGGCT CCCG AT CT GG AACCGACTT CACCCT G AC AAT CTCT AGT CT GC AGCCCG AG GATTTTGCCACATACTATTGCCAGCAGCACTATACCACACCCCCTACTTTCGGGCAGGGAA CCAAGGT GGAGAT CAAGGGAGGGAGCGGAGGAGGGT CCGGAGGAGGGT CT GGAGGCGGG AGT GGAGGAGGGTC AGGAGAGGT GC AGCT GGT CGAAAGCGGAGGAGGACTGGT GCAGCC T GGAGGC AGCCT GCG ACT GT CCT GT GCCGCTT CTGGCTTT AAC AT C AAGG AC ACCT AC ATT CATT GGGT GCGGC AGGCAC CT GGC AAAGG ACT GG AGT GGGT GGCT AGAAT CT ATCC AACT AAT GG AT AC ACC AG AT AT GCT GAC AGCGT GAAGGGC AGGTTT ACT AT C AGT GCT G AT ACAT CAAAG AAC ACT GCAT ACCT GC AG AT G AAT AGCCT GCGCGCCG AGG AT ACCGCT GT GT ACT ATTGTAGCCGATGGGGGGGAGACGGCTTCTACGCCATGGATTATTGGGGACAGGGCACCC T GGT GAC AGT CT C AAGC GG AGGG AGT GG AGGCT C AGGAGGAAGCGGAGGGT CCGG AGGC TCTGTGGTCCTGCT GCT GAGACT GGCT AAG ACCT ACG AG ACT ACCCT GG AAAAAT GCTGT G CAGCCGCT GACCCCCACGAGT GCTAT GC AAAGGT GTTCGAT GAGTT CAAGCCT CT GGT CGA GGAACC AC AG AACCT GAT C AAGC AG AATT GT GAGCT GTTCG AAC AGCT GGGCG AGT ACAA GTTT CAGAACGCCCT GCT GGT GAGGTAT ACAAAGAAAGT GCCCCAGGT CAGCACT CCT ACC CTGGT GGAGGT CT CC AGG AAT CT GGGG AAGGT CGGAT CT AAGT GCT GT AAAC ACCC AG AG GCAAAACGC ATGCCCTGCGCCGAAGACT ACCTGTCCGTGGT CCTGAATCAGCTGTGTGTGC T GCAT G AGAAG ACCCCT GT GT CT GATCG AGT CACC AAAT GCT GTAC AG AAAGT CT GGT GAA CCGG AG ACCCT GCTTTT CT GCCCT GGAGGT GGACG AAAC AT AT GT CCCT AAGG AGTT CAAT GCCGAAAC ATT CACTTTT CACGCT GATATCTGTACACT GT CCGAGAAGGAACGCCAGATTA AGAAACAG ACT GCT CT GGT GGAGCT GGT C AAGC AT AAACC AAAGGCAACC AAGGAAC AGC T GAAAGC CGT G AT GGACG ATTT CGCAGCCTTT GT CGAG AAGT GCT GTAAAGCCG ACG AT AA GGAAACTTGTTTCGCCGAGGAAGGCAAAAAACTGGTCGCAGCATCACAGGCAGCACTGGG ACT GT G AGG AT CC

ID NO: 108 (Proteína de Construcción base # 7)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSG SRS GTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQHYTTPPTF GQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGS GE VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADS VKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGSG GSGGSGGSGGSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVV LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLBvAVMDDFAAFVEKCCBCADDKETCFAEEGKKLVAASQA ALGL

ID NO: 109 (Construcción base # 8)

T CCGT CGT CCT GCTGCT GAGACT GGCT AAG ACCT ACG AGACC ACACT GG AAAAAT GCT GTG CCGCT GC AG ACCCCC ACG AGT GCT AT GCC AAGGT GTTCG AT GAGTT CAAGCCT CT GGT CGA GGAACCAC AG AACCT GAT C AAGCAG AATT GT GAGCT GTT CG AAC AGCT GGGCGAGT ACAA ATTT CAGAACGCCCT GCT GGTGAGGTAT ACAAAGAAAGT GCCCCAGGT CT CT AC ACCT ACT CT GGT GGAGGT C AGT AGG AAT CT GGGC AAGGT CGGGT CAAAAT GCTGT AAGC ACCC AGAG GCC AAAC GCAT GCCCTGCGCT G AAG ACT ACCT GT CT GT GGTCCT GAACC AGCT GT GTGTGC TGCAT GAGAAGACCCCTGT GAGCGAT CGAGT CACCAAAT GCT GTACAGAAAGCCT GGT GA AT CGG AG ACCCT GCTTTT CCGCT CT GGAGGT GGACGAAAC AT AT GT CCCT AAGG AGTT CAA T GCAG AAACCTT C AC ATTT CACGCCG AT AT CT GT ACT CT GT CCGAG AAGG AACGCC AG ATT AAGAAACAGACCGCCCTGGTGGAGCTGGTCAAGCATAAACCAAAGGCTACTAAGGAACAG CT GAAAGC AGT GAT GGACGATTT CGCCGCTTTTGTCGAGAAAT GCTGT AAGGC AGACGAT A AGGAAACCT GCTTT GCCGAGGAAGGCAAGAAACT GGTGGCAGCCAGCCAGGCT GCACT GG GACTGGGAGGGT CCGGAGGCT CT GGAGGAAGTGGAGGGT CAGGAGGCGACAT CCAGAT G ACACAGAGCCCAAGCTCCCTGTCAGCAAGCGTGGGCGACCGAGTCACTATTACCTGTCGG GCCTCCCAGGATGTGAATACTGCAGTCGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGAAAGGCTCCC AAACT GCT GAT CT ACT CCGC AT CTTT CCT GT AT AGCGGCGT GC CAT CC AGGTTT AGT GG AT C ACGCAGC GGCACAGACTT C ACACTGACT ATTT CTAGT CT GCAGCCCGAGGATTTTGCCACT T ACT ATT GCC AGC AGC ACT AT ACT ACCCCCCCT ACCTT CGG ACAGGGC AC AAAGGT GG AGA TCAAGGGAGGAT CT GGAGGAGG AAGT GGAGGAGGAT CAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGC AGCGGAG AGGT GC AGCT GGTCG AAT CT GGAGG AGGACT GGT GC AGCCT GG AGGGT CTCTG CGACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCTTTAACATCAAGGACACCTACATTCATTGGGTGCGGC AGGCACCTGGGAAGGGACT GGAGT GGGT CGCTAGAAT CT AT CC AACTAATGGGT ACACCA GAT AT GCCG AC AGCGT G AAGGG AAGGTT CACC ATT AGCGCCG AT AC AT CC AAAAAC ACT G CTTACCT GC AG AT GAAC AGCCT GCGCGCT G AGG AT AC AGC AGT GT ACT ATTGC AGT CG AT G GGGCGGCGAT GGGTT CT ACGC AAT GG ACT ACT GGGGAC AGGGG ACT CT GGT CACCGT CAG CAGCT GAGGAT CC

ID NO: 110 (Proteína de Construcción base # 8) SWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQ NALLVRYTKKVPQ V S TPTLVE VSRNLGKV G S KC CKHPE AKRMP C AEDYLS WLNQLCVLHEK TPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVE LVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGGSG GSGGSGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYS GVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGG GSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNG YTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVT VSS

ID NO: 111 (Construcción base # 9)

TCAAGCGAACTGACTCAGGACCCCGCTGTGAGCGTCGCACTGGGACAGACTGTGCGGATC ACCTGCCAGGGGGACTCCCTGAGATCTTACTATGCCTCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGCC AGGCTCCCGT GCT GGT C AT CT AT GGC AAG AAC AAT AG ACCTT CCGGG ATT CC AG AT AGGTT TTCTGGAAGCTCCTCTGGCAACACAGCTAGCCTGACCATTACAGGAGCCCAGGCTGAGGAC GAAGC AG ATT ACT ATT GC AACTCC AGGG AC AGTT CAGGC AAT C ACGT GGT CTT CGGCGGGG GAACAAAGCTGACTGTGGGAGGAGGATCAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCAGCGGAGGA GGAT CT GGAGGAGGAAGT GGAGAGGT GCAGCT GGTCGAAAGCGGAGGAGGAGT GGT CAG GCCTGGAGGGT CACT GCGACTGAGCT GTGCCGCTT CCGGATTCACATTTGACGATT ACGGA AT GT CTT GGGT CCGGC AGGCACC AGG AAAGGGACT GG AGT GGGT GAGT GGC AT C AACT GG AAT GGAGGCT CTAC AGGGT ACGCT GAT AGT GT GAAAGGACGCTTTACTATT AGT CGAGACA ACGCC AAG AAC AGCCT GT AT CT GCAG AT G AAC AGCCT G AG AGCCG AGG AT ACT GCT GT GT ACT ATTGT GCC AGGGGCCGCT CCCT GCT GTT CGACT ACT GGGGGC AGGG AACCCT GGT G AC AGT CT CT AGGGGGGGAAGTGGCGAT GCT CAC AAGAGCGAGGT CGCAC ATCGCTT CAAAGA CCT GGGGGAGGAAAATTTT AAGGCCCT GGT GCT GAT CGCATTCGCCCAGT ATCTGCAGCAG TGCCCTTTT G AAG ACCACGT G AAACTGGTCAACG AGGTG ACCG AGTT CGCC AAG ACATGC GT GGCAG ACG AGT CCGCCG AAAATT GT GAT AAAT CT CT GCAT ACT CTGTTT GGGGATAAGC T GT GT ACT GT GGCC ACCCT GCGGG AG AC CT AC GG AG AAAT GGCT GACT GCT GT GC AAAAC AGGAGCCAGAAAGAAAC GAGT GCTT CCT GCAGCAC AAGG ACG AT AAC CC C AAT CT GCCTC GACT GGT GCGGCCCG AAGT GG ACGT C AT GT GT ACT GCCTT CC ACGAT AAT G AGG AAACCTT T CT G AAG AAAT ACCT GT AT GAG ATT GCCCGGAG AC AT CCCT ACTTTT AT GCCCCT GAACT G CT GTT CTTTGCT AAGCGGT ACAAAGC AGCCTT CACCG AGT GCT GT CAGGCT GC AG AT AAGG CCGCTTGCCTGCT GCC AAAACTGGACGAGCTGCGAGATGAAGGGAAAGCTAGCTCCGC AA AGCAGAGACT GAAAT GT GCAAGCCT GCAGAAGTT CGGCGAGAGGGCCTTTAAAGCTT GGG CAGT GGCCAGACT GAGCCAG AGGTT CCCCAAGGCCGAGTTTGCTGAAGT CT C CAAGCT GGT GACAGACCTGACTAAAGT GC ACACCGAGT GCT GT CATGGCGACCT GCT GGAAT GCGCCGA CG ATCGCGC AG AT CT GGCC AAAT AC AT CT GT GAG AACC AGGACT CT ATTT CT AGT AAGCT G AAAG AGT GCTGT GAAAAGCCT CT GCT GGAGAAAAGCC ACT GCAT CGCT G AGGT GG AAAAC GACGAAATGCCCGCAGATCTGCCTAGTCTGGCAGCCGACTTTGTCGAGTCAAAGGATGTGT GT AAAAATT AT GCT G AAGC AAAGG AT GT GTT CCT GGGC AT GTTT CT GT ACGAGT AT GC AC G AGCTGGAGGGAGTGGAGGCTCAGGAGGAAGCGGCGGGTCCGGAGGCTCAAGCGAACTGA CCCAGGACCCCGCCGTGT CTGTCGCT CTGGGACAGACAGTGAGGATCACTT GCCAGGGCG ACT CT CT GCGCAGTTACT ATGCAAGTT GGTATCAGCAGAAGCCT GGCCAGGCCCCT GT CCT GGT CAT CT AT GGCAAGAAT AAT CGCCCT AGT GGGATTCCAGAT CGATTTTCAGGGT CCT CT AGTGGAAACACAGCTTCT CTGACT ATT ACCGGCGCACAGGCCGAGGACGAAGCCGATTAC TATTGCAACAGCAGAGACTCAAGCGGCAATCATGTGGTCTTCGGAGGAGGAACCAAGCTG ACAGTGGGAGGAGGCTCAGGCGGCGGCAGCGGAGGAGGCTCCGGGGGAGGCTCTGGAGG AGGCAGT GGAGAGGT CCAGCT GGT GGAAT CCGGAGGAGGAGT GGT CCGACCAGGAGGATC ACT G AG ACT GT CCT GT GCT GCAT CCGG ATT CACCTTCG AT G ATT ACGG AAT G AGCT GGGT C AGGCAGGCACCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGGCATCAACTGGAATGGCGGGTCA ACCGGGT ACGCT GAT AGCGTGAAAGGACGGTT CACAATTAGC AGGGAT AAT GCT AAG AAC AGCTT ATAT CT GCAAAT GAACAGCCTGCGCGCAGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCC CGGGGGCGGAGCCT GCT GTTT GATTACTGGGGGC AGGGCAC ACTGGT GACCGT CT CTCGGT GAGGATCC

ID NO: 112 (Proteína de Construcción base # 9)

S SELT QDPAV S VALGQTVRITCQGDSLRSYYAS WYQQKPGQ APVLVIY GKNNRPS GIPDRFS GS SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHWFGGGTKLTVGGGSGGGSGGGSGGGSGGG SGEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTG YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRSLLFDYWGQGTLVTVSRGGSG DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLTAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENC DKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMC TAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRD EGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGD LLECAE>DRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAAE>FVESK DYCKNYAEAKDYFLGMFLYEYARAGGSGGSGGSGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTYRITCQG DSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSG1PDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYC NSRDSSGNHWFGGGTKLTVGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGWRPGGSLRLS CAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDT AVYY CARGRSLLFDY WGQGTLVTVSR

ID NO: 113 (Construcción base # 10)

AGTAGCGAACTGACCCAGGACCCCGCAGTGAGCGTCGCACTGGGGCAGACAGTGAGAATC ACTT GCC AGGG AG ATT CTCT GAGG AGTT ACT AT GCCT CCTGGT ACC AGC AG AAACCCGGCC AGGCTCCT GT GCT GGT CAT CT AT GGGAAGAACAAT AGGCC AAGCGGCATCCCCGACCGCTT CTCCGGCAGCTCCTCTGGGAACACAGCTAGCCTGACTATTACCGGCGCTCAGGCAGAGGAC GAAGCAGATTACTATT GC AACTCCAGGGAT AGTT CAGGCAAT C ACGT GGTCTTT GGCGGGG GAACAAAGCTGACTGTGGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCAGCGGAGGGGGATCTGGAGGA GGAAGTGGAGGAGGATCAGGAGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGAGGAGGAGTGGTCCG CCCTGGAGGGAGCCTGCGACTGTCCTGTGCCGCTTCTGGCTTCACCTTTGACGATTACGGA AT GAGCTGGGT GCGGCAGGCACCAGGGAAGGGACT GGAGT GGGTGTCCGGCAT CAACT GG AATGGAGGCTCCACAGGATACGCAGACTCTGTGAAAGGCCGATTCACTATTTCTCGGGATA ACGCC AAG AATAGT CT GT AT CT GCAG AT G AAC AGCCT G AG AGCT G AGG AC ACT GC AGT GT ACT ATTGT GCC AGGGGC CGC AGCCT GCT GTTT GATT ACT GGGGCC AGGG AACCCT GGT GAC AGTCTCCAGGGGAGGATCAGGAGGGAGCGGAGGCTCCGGAGGATCTGGAGGGAGTGTGGT CCT GCT GCT GCG ACT GGCT AAAACCT ACG AGACC ACACT GG AAAAGT GCT GT GCAGCCGCT GACCCT CAT G AGT GCT AT GCC AAAGT GTTCGAT G AGTTC AAGCC ACTGGT CGAGG AACCCC AG AACCT G AT C AAAC AG AATT GT GAGCT GTTCGAAC AGCT GGGCGAGT AC AAGTTT CAGA ACGCCCTGCT GGT GCGCTAT ACCAAGAAAGTGCCT CAGGT CAGCACACCAACT CT GGT GGA AGTCTCCCGGAATCTGGGGAAAGTGGGATCTAAATGCTGTAAGCACCCCGAGGCTAAGAG AAT GCCTT GCGC AG AAG ACT ACCT GT CT GT GGTCCT GAACC AGCT GT GT GT GCT GCAT GAG AAAACCCCAGTGAGCGATAGGGTCACCAAGTGCTGTACAGAAAGTCTGGTGAACCGGAGA CCATGCTTCTCAGCCCTGGAGGTGGACGAAACATATGTCCCCAAAGAGTTTAATGCCGAAA CCTT CAC ATTT C ACGCT GAT AT CT GT ACTCT GT CCGAG AAGG AACGCC AG ATT AAG AAAC A GACCGCCCT GGT GGAGCT GGT CAAGCAT AAACCCAAGGCAACAAAAG AAC AGCT GAAGGC CGTGATGGACGATTTCGCAGCCTTTGTCGAGAAATGCTGTAAGGCTGACGATAAGGAAACT TGCTTCGCAGAGGAAGGAAAGAAACT GGT GGCTGCAAGCCAGGCAGCT CT GGGACT GGGA GGCTCAGGAGGAAGCGGCGGGTCCGGAGGCTCTGGGGGAAGCTCCGAGCTGACCCAGGAC CC AGCCGT GT CT GT CGCT CT GGGCC AG ACT GT GCGC AT C ACCT GT C AGGGGGAT AGT CT GC GATCAT ACT ATGCAAGTTGGTATCAGCAGAAACCTGGCCAGGCCCCAGTCCTGGTCATCT A TGGGAAG AAT AAT CGACCTTCCGGCATCCCCGACCGGTT CTCCGGATCTAGTT CAGGCAAC ACAGCCTCTCTGACTATTACCGGCGCCCAGGCTGAGGACGAAGCTGATTACTATTGCAACA GCAGGGATAGCTCCGGAAACCACGTGGTCTTTGGAGGAGGAACTAAGCTGACCGTGGGAG GAGGAAGTGGCGGGGGATCAGGCGGCGGAAGCGGCGGCGGCAGCGGAGGAGGATCTGGC GAAGT GC AGCT GGT CG AAT CT GGCGG AGG AGT GGT CCGGCC AGG AGGG AGT CT G AG ACT G T CAT GT GC AGCC AGCGGCTT CAC ATT CG AT GATT ACGG AAT GTCTTGGGT GCGGCAGGC AC CT GGAAAGGGCCT GGAAT GGGT GAGTGGCAT CAACT GGAACGGCGGCAGT ACCGGATACG CT GACT C AGT GAAAGGC AG ATT C AC AATTTCT AG AG AC AAT GCT AAG AAT AGTTT AT AT CT GC AAAT G AAC AGCCT G AG AGC AG AGG AC ACT GCCGT GT ACT ATT GCGCCCGGGGG AGGT C ACT GCTGTT CG ATT ACT GGGGGC AGGGC ACT CT GGT C ACT GT GT CAAGGT GAGG AT CC

ID NO: 114 (Proteína de Construcción base # 10) SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGS S S GNTASLTIT GAQ AEDE ADYY CNSRD S SGNH WFGGGTKLTVGGGS GGGSGGGSGGGS GGG SGEVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTG YADSVKGRFTISRDNAKNSFYFQMNSFRAEDTAVYYCARGRSFFFDYWGQGTFVTVSRGGSG GSGGSGGSGGSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVV LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADTCTLSEKE RQIKKQTALVELYKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQA ALGLGGSGGSGGSGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPV LVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHWFGGGTKLTVG GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAP GKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRSLL FDYWGQGTLVTVSR

ID NO: 115 (Construcción base # 11)

GAT ATTCAG AT G ACT C AGT CT CCT AGCT CC CTGT CAGCT AGCGT CGGCGAT CGGGT G ACAA TCACTTGCAGAGCCAGCCAGGACGTCAACACAGCCGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCG GAAAAGCACCTAAGCTGCTGATCTACTCCGCCTCTTTTCTGTATTCTGGCGTGCCCAGTAGA TT CAGT GGATCAAGGAGCGGCACCGATTTTACCCTGAC AAT CT CT AGT CTGCAGCCT GAGG ACTTTGCC AC AT ACT ATTGCCAGC AGC ACT AT ACC AC ACCCCCTACTTTCGGGC AGGGAAC CAAGGTGGAAAT CAAAGGCGGGT CAGGCGGAGGGAGCGGAGGAGGGT CCGGAGGAGGGT CT GGAGGAGGGAGT GGAGAGGT GCAGCTGGTCGAAT CT GGAGGAGGACT GGT GC AGCCAG GAGGCT C ACT GCGGCT GAGCTGT GCCGCTT CCGGCTT CAACAT CAAAGAT ACCT ACATT CA TT GGGT CCGACAGGCACC AGGCAAGGGACTGGAGT GGGT GGCT AGAAT CTATCCC ACCAA TGGCTACACACGATATGCCGATAGCGTGAAAGGGCGGTTTACAATTTCTGCAGACACTAGT AAGAACACCGCCT ACCT GCAGAT GAACAGCCT GCGCGCT GAGGACACTGCAGT GT ACT AT TGTAGTCGATGGGGGGGAGACGGCTTCTACGCCATGGATTATTGGGGACAGGGCACCCTG GT GAC AGT CT C AAGCGG AGGGTCCGGCG AT GCAC AC AAGT CT G AGGT CGCT C AT AG ATT C AAAGACCTGGGGGAGGAAAATTTTAAGGCCCTGGTGCTGATTGCATTCGCCCAGTACCTGC AGCAGTGCCCCTTT GAAGACCACGT GAAACTGGTCAACGAGGT GACAGAGTT CGCCAAGA CTT GCGT CGCCG ACG AG AGT GCT GAAAAT T GT GAT AAAT C ACT GCAT AC ACT GTTT GGGG A TAAGCT GT GTACT GT GGCC ACC CTGCGGG AGACTT AT GGAG AAAT GGC AGACT GCT GT GCC AAACAGGAGCCTGAAAGAAACGAGTGCTTCCTGCAGCACAAGGACGATAACCCTAATCTG CC AAGGCT GGT GCGCCC AG AAGT GG ACGT CAT GT GT ACT GCCTT CC ACG AT AAT GAGG AA ACCTTTCTGAAGAAATACCTGTATGAGATCGCCCGGAGACATCCCTACTTTTATGCTCCTGA ACT GCT GTT CTTTGCAAAACGGTACAAGGCAGCCTT CACCGAGT GCT GT CAGGCT GCAGAT AAGGCCGCTTGCCTGCTGCCCAAACTGGACGAGCTGCGGGATGAAGGCAAGGCTTCCTCT GCAAAGCAGAGACT GAAAT GTGCAAGCCT GCAGAAGTT CGGGGAGAGGGCCTTTAAAGCT TGGGCAGTCGCACGACTGAGCCAGCGATTCCCTAAGGCCGAGTTTGCTGAAGTCTCCAAGC T GGT GAC AG ACCT G ACT AAAGT GCAC ACC GAGT GCT GT CAT GGCGACCT GCT GG AAT GCG CCG ACG AT CGCGC AGAT CT GGCC AAGT AC AT CT GT GAG AACC AGG AC AGC ATT AGTT CAA AGCT GAAAG AGT GCT GT GAAAAGCC ACT GCT GGAG AAAT CCC ACT GC ATT GCT GAGGT GG AAAACGACGAAATGCCAGCAGATCTGCCCAGCCTGGCAGCCGACTTCGTCGAGTCCAAGG AT GT GT GT AAAAATT AT GCT G AAGC AAAGGAT GT GTT CCT GGGC AT GTTTCT GT ACG AGT A TGCCAGGGCTGGAGGCAGTGGAGGATCAGGAGGGAGCGGAGGCTCCGGAGGAGACATCC AGATGACCCAGAGCCCAAGCTCCCTGTCCGCTTCTGTCGGCGATAGGGTGACTATTACCTG CCGCGCCTCCCAGGACGTCAATACAGCAGTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGGAAGGC TCCAAAACTGCTGATCTACAGTGCATCATTCCTGTATTCAGGAGTGCCAAGCCGCTTTAGC GGGT CCCG AT CT GG AACTG ATTT CAC ACT GACT AT CT CT AGT CT GC AGCCCG AGG ACTTT G CCACCTATTACTGCCAGCAGCACTACACTACCCCACCCACCTTCGGGCAGGGAACAAAGGT GGAAATCAAAGGGGGGTCCGGCGGCGGGTCTGGCGGAGGGAGTGGAGGAGGGTCAGGCG GCGGGAGCGGCGAGGTCCAGCTGGTGGAATCCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGCT CCCT GCG ACT GT CTTGT GCT GCAAGT GGCTTT AAC AT CAAGG AC ACTT AC ATT C ATT GGGT C AGGCAGGCT CCT GGCAAGGGC CT GG AAT GGGT GGC ACG AAT CT AT CC AAC AAAT GG AT AC ACT AGGT ACGCCGAT AGCGTGAAAGGCAGGTT CACCATTT CAGCCGACACCAGC AAGAAC AC AGCTT ACCT GC AAAT G AAC AGCCT G AGGGCT GAGG AC AC AGC AGT GT ACT ATT GC AGC CGCTGGGGCGGGG ACGGGTT CT AT GCT AT GGACT ATT GGGGGC AGGGC ACT CT GGT C ACT G TGTCAAGCTGAGGATCC

ID NO: 116 (Proteína de Construcción base # 11) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSG SRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGE VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADS VKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGSG DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENC DKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEYDVMC TAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRD EGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSICLVTDLTKVHTECCHGD LLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESK DVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARAGGSGGSGGSGGSGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCR ASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLTYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTTSSLQPEDFATYYC QQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA S GFNIKDT YIH WVRQ APGKGLE WYARIYPTN GYTRY AD S VKGRFTIS ADT S KNT AYLQMN S LR AEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLYTVSS

ID NO: 117 (Construcción base # 12)

GACATT CAGAT GACT CAGAGCCCAAGCTCCCTGAGCGCAT CCGTGGGCGACAGAGT CACC ATCACATGCAGGGCCTCCCAGGATGTGAACACCGCTGTCGCATGGTACCAGCAGAAACCT GGGAAGGCT CC AAAACT GCT GAT CT ACT CT GC AAGTTT CCT GT AT AGT GG AGT GCC AT CAA GGTTTTCAGGCAGCCGCTCCGGGACCGACTTCACTCTGACCATCTCTAGTCTGCAGCCCGA GGATTTCGCCACATACTATTGCCAGCAGCACTATACCACACCCCCTACCTTTGGCCAGGGG ACAAAAGTGGAAATTAAGGGAGGGAGCGGAGGAGGGTCCGGAGGAGGGTCTGGAGGCGG GAGTGGAGGAGGGTCAGGAGAGGTGCAGCTGGTCGAATCCGGAGGAGGACTGGTGCAGC CAGGAGGCAGCCT GCGGCT GT CCT GT GCCGCTT CT GGCTT CAACAT C AAAG AC ACCT AC AT TCATTGGGT GCGCCAGGCTCCAGG AAAGGGACTGGAGT GGGT CGCACG AAT CT AT CCCAC TAATGGGTACACCCGGTATGCCGATTCCGTGAAAGGAAGATTCACAATTAGTGCAGATACA T CAAAG AAC ACT GCCT ACCT GC AG AT GAAC AGCCT GCG AGC AGAGG AT ACT GCCGT GT AC TATTGTAGTCGGTGGGGGGGAGACGGCTTTTACGCCATGGATTATTGGGGGCAGGGAACCC TGGTGACAGTCTCAAGCGGAGGGTCAGGAGGCAGCGGAGGCAGCGGAGGGTCTGGAGGC AGT GT GGT CCTGCT GCT G AGGCT GGCT AAAACCT ACGAG ACT ACCCT GG AAAAGT GCT GT G CAGCCGCTGACCCCCACGAGTGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAGTTCAAGCCACTGGTCGA GGAACCC C AG AACCT GAT C AAAC AG AATT GT G AGCT GTT CG AAC AGCT GGGCG AGT ACAA GTTT CAGAACGCCCT GCT GGT GCGCT AT ACCAAG AAAGT GCCT C AGGT CT CT AC ACCAACT CTGGTGGAGGTCAGTAGGAATCTGGGGAAAGTGGGATCAAAGTGCTGTAAACACCCCGAG GCC AAGC GC AT GCCTTGCGCT G AAG ACT ACCTGT CT GT GGTCCT GAACC AGCT GTGTGTGC TGCATGAGAAAACCCCCGTGAGCGATCGGGTCACCAAGTGCTGTACAGAAAGCCTGGTGA ACCGGAG ACCCT GCTTCTCCGCTCT GGAGGT GGACG AAAC AT ATGT CCCT AAGG AGTTT AA TGCT GAAACCTT CAC ATTT CACGC AG AT AT CT GT AC ACT GT CCGAGAAGG AAAG ACAG ATT AAG AAAC AGACT GCCCT GGT GGAGCT GGT CAAGCAT AAACCTAAGGCCACAAAAGAACAG CT GAAGGCT GTGAT GGACGATTT CGCAGCCTTTGT CGAGAAGTGCT GTAAAGCCGACGAT A AGG AAACTTGCTT CGCT GAGG AAGG AAAG AAACT GGT GGCT GCAAGCC AGGC AGCT CT GG GCCTGGGAGGATCAGGAGGGAGCGGAGGCTCCGGAGGAT CTGGAGGGGACAT CCAGAT G ACCC AGT CT CCTT CCT CT CT GT CT GCT AGT GT GGGCGACCGC GT CACT ATT ACCT GT CGAGC CAGCCAGGATGTGAATACAGCCGTCGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAAGCACCTAA GCTGCT GAT CT ACT C AGCC AGCTTTCT GT AT AGCGGGGT GCCTT CCCG ATT CT CCGG AT CTC GGAGTGGC ACTGACTTTACACT GACT AT CAGTT CACT GCAGCCAGAGGATTTCGCCACCT A TTACTGCCAGCAGCACTACACAACTCCACCCACTTTTGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATC AAGGGAGGCT CTGGAGGAGGCAGT GGAGGAGGCT CAGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGCT C CGGCGAAGTGCAGCT GGT CGAAT CT GGCGGCGGCCT GGTCCAGCCAGGAGGAT CT CT GAG GCT GAGTT GT GC AGCCT C AGGCTT C AAC AT CAAGG AT ACTT ACATT C ATT GGGT GCGGC AG GC ACCT GG AAAGGGCCT GG AAT GGGT CGCT AGAAT CT ATCCAACT AAT GGCT AC ACC AG A TATGCCGACAGCGTGAAAGGGCGCTTTACCATTAGCGCAGATACATCCAAAAATACCGCTT ACCTGCAGATGAATAGCCTGAGAGCTGAGGATACAGCAGTGTACTATTGCTCCAGATGGG GCGGCG AT GGGTTTT ACGC AAT GG ACT ACT GGGG ACAGGG AAC ACT GGT C ACCGT CTCTTC TTGAGGATCC

ID NO: 118 (Proteína de Construcción base # 12)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSG SRS GTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQHYTTPPTF GQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGS GE VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADS VKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGSG GSGGSGGSGGSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVV LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQA ALGLGGSGGSGGSGGSGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAP KLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGS GGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGL EWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYA MDY WGQGTLVTVS S

ID NO: 119 (Construcción base # 13)

AGTTCT GAGCT GACCCAGGACCCCGCT GT GAGCGTCGCACT GGGACAGACAGT GCGGAT C ACTT GCC AGGGCG AC AGCCT GAG AT C CT ACT AT GCT AGCT GGT ACC AGC AG AAGCCTGGCC AGGCACC AGT GCT GGT CAT CT AT GGAAAAAAC AATAGACCCAGCGGCATT CCT GAT AGGTT CT CCGGGAGCTCCTCTGGAAACACAGCT AGCCT GACTATTACCGGCGCCCAGGCTGAGGAC GAAGCCGATTACTATT GC AAC AGC AGGGACAGTTCAGGGAAT C ACGT GGT CTTTGGAGGA GGAACTAAGCTGACCGTGGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAAGTGGAGG AGGATCAGGAGGAGGAAGCGGAGAGGT GCAGCT GGT CGAAAGCGGAGGAGGAGT GGT C A GGCCAGGAGGGT CCCT GCG ACT GT CTTGT GCCGCT AGT GGGTT CACTTTT GACGATT ACGG AAT GAGTTGGGT CAGGCAGGCACCAGGAAAGGGACT GGAGT GGGT GAGCGGC AT CAACT G GAATGGAGGCAGTACAGGCTACGCTGATTCAGTGAAGGGGCGCTTCACTATTTCTCGAGAC AACGCC AAAAAT AGT CT GT AT CT GC AG AT GAACT C ACTGCGCGCCG AGG AT AC AGCT GTGT ACTATTGCGCCAGGGGCCGCTCCCTGCTGTTTGACTACTGGGGGCAGGGAACACTGGTGAC TGTCTCACGGGGGGGAAGCGGAGATGCACACAAATCTGAGGTCGCCCATAGATTCAAGGA CCT GGGCGAGGAAAATTTTAAAGCCCT GGT GCT GAT CGCATT CGCCCAGT ATCTGCAGCAG T GCCCTTT CGAAG AC C ACGT G AAGCTGGT CAACG AGGT G AC AG AATTT GCC AAAACTT GCG TCGCAGACGAGAGCGCCGAAAATTGT GAT AAGT CCCT GCAT ACCCT GTTCGGCGAT AAACT GT GTACCGT GGCCACACT GAGGGAGACAT ACGGGGAAAT GGCT GACTGCT GTGCAAAGCA GGAGCCCGAACGCAACGAGTGCTTTCTGCAGCACAAAGACGATAACCCAAATCTGCCCCG ACT GGT GCGGCCT G AAGT GG ACGT CAT GT GT ACT GCCTTCC ACG AT AAT G AGG AAACCTTT CTGAAGAAATACCTGTATGAGATTGCCCGGAGACATCCCTACTTCTATGCTCCTGAACTGC TGTT CTTT GCAAAGCGGT AC AAAGCAGC CTTT ACCGAGT GCT GT CAGGCT GC AG AT AAAGC CGCTTGCCTGCTGCCTAAGCTGGACGAGCTGAGGGATGAAGGCAAGGCTAGCTCCGCAAA AC AGCGC CT G AAGT GT GCT AGCCT GC AG AAATT CGGCG AGCGGGCCTT CAAGGCTT GGGC AGT GGCC AG ACT GT CACAG AGGTT CCC AAAGGCCG AGTTT GCT GAAGT C AGC AAACTGGT GACT GACCT GACCAAGGT GCAC ACCGAGT GCT GT CAT GGCGACCT GCT GGAAT GCGCCGA CGATAGAGCAGATCTGGCCAAGTACATCTGTGAGAACCAGGACTCCATTTCTAGTAAGCTG AAAG AGT GCT GT GAAAAACCC CT GCT GG AGAAGT CT C ATT GCAT CGCCG AGGT GGAAAAC GACGAAATGCCAGCTGATCTGCCCTCTCTGGCAGCCGACTTCGTCGAGAGTAAAGATGTGT GT AAGAATT AT GCT G AAGC AAAGG AT GT GTT CCT GGGC AT GTTT CT GT ACGAGT AT GCAC G AGCT GGAGGGT CT GGAGGCAGT GGAGGAT CAGGAGGGAGCGGAGGCGACAT CCAGATGA CCC AGT CCCCTT C AAGC CT GAGT GCTT C AGT CGGCG AT CG AGT G AC AATT ACTT GCCGGGC CT CT CAGGACGT C AAT AC AGC AGT GGCTT GGT AT C AGC AG AAGCCT GGG AAAGC ACC AAA GCTGCTGATCTACAGCGCCTCCTTTCTGTATTCCGGAGTGCCTTCTCGGTTCTCTGGCAGTA GAT C AGGG ACT G ATTTT ACCCT G AC AATTTCCT CTCT GC AGCC AG AGG ACTT CGCC ACCT A CT ATTGCC AGC AGC ACT AT ACC AC ACC CCCT ACCTTT GGCC AGGGG AC AAAAGT GG AAAT C AAGGGGGGAAGTGGCGGGGGATCAGGCGGCGGAAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGATC TGGAGAGGTCCAGCTGGTGGAAAGCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGGAGTCTGA GACT GT CAT GT GCT GC AAGC GGCTT C AAC AT CAAGG AT AC CT AC ATT C ACT GGGT CAGGC A GGCCCCAGGAAAAGGCCT GGAGT GGGT GGCCCGCAT CT AT CCC ACCAATGGGTACACACG CTAT GCCGATT CCGT G AAGGGACGATT CACAATTTCCGCCGACACTT CTAAAAACACCGCT T ACCT GC AG AT GAAC AGC CT GCG AGCCG AGGAC ACT GCT GTGT ACT ATT GTTCT AGAT GGG GCGGGGACGGGTTTTACGCAAT GGACT ACT GGGGGCAGGGGACT CT GGTCACT GT CAGCA GCTGAGGATCC

ID NO: 120 (Proteína de Construcción base # 13)

S SELT QDPAV SVALGQTVRITCQGDSLRSYY AS WY QQKPGQ APVLVIY GKNNRPS GIPDRFSGS SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHWFGGGTKLTVGGGSGGGSGGGSGGGSGGG SGEVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTG YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRSLLFDYWGQGTLVTYSRGGSG DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENC DKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEYDVMC TAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRD EGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSICLVTDLTKVHTECCHGD LLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESK DVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARAGGSGGSGGSGGSGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCR ASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLTYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTTSSLQPEDFATYYC QQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA S GFNIKDT YIH WVRQ APGKGLE WVARIYPTN GYTRY AD S VKGRFTIS ADT S KNT AYLQMN S LR AEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS

ID NO: 121 (Construcción base # 14)

GAC ATT CAG AT G ACCC AGTCCCC AAGCT CCCTGT CT GCT AGT GTCGGCG AT CGGGT GACT A T CACCT GC AGAGC CT CT C AGG ACGT C AAC AC AGCCGT GGCTT GGT ACC AGC AGAAGCCT G GCAAAGCACCAAAGCT GCT GAT CT ACT CAGCCAGCTTT CTGTATAGCGGGGTGCCTTCCAG ATT CT CCGGCT CT AGG AGT GGG ACT GATTTT AC ACT GACT AT CT CT AGT CTGC AGCCAG AG GACTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTATACCACACCCCCTACATTTGGGCAGGGAA CTAAAGT GGAAATT AAGGGAGGGT CT GGAGGAGGGAGT GGAGGAGGGT CAGGCGGAGGG AGCGGAGGAGGGTCCGGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGAGGAGGACTGGTGCAGCC T GGAGGCT CT CT G AGGCT G AGTT GT GCCGCTT CAGGCTT C AAC AT C AAGG AT ACCT AC ATT CATT GGGT CCGACAGGCT CCAGGCAAAGGGCT GGAGTGGGT GGCAAGAAT CTATCCCACA AATGGCTACACTAGATATGCCGATAGCGTGAAGGGGAGGTTCACAATTAGCGCTGACACC T CCAAAAAC AC AGC AT ACCT GC AG AT G AAT AGT CT GCGGGCT G AGG AC ACT GC AGT GT AC TATT GTAGC AG AT GGGGGGG AG ACGGCTTTT ACGCC AT GG ATT ATT GGGGAC AGGGC ACT C TGGTGACCGTCTCAAGCGGAGGGAGCGGGGATGCACACAAATCCGAGGTCGCCCATCGCT TCAAGGACCT GGGAGAGGAAAATTTTAAAGCCCT GGT GCT GATTGCATTCGCCCAGT ACCT GCAGCAGTGCCCCTTCGAAGACCACGTGAAGCTGGTCAACGAGGTGACCGAATTTGCCAA AAC AT GCGT CGCC G ACG AGT C AGCT GAAAATTGT GAT AAG AGCCT GC AT ACCCT GTT CGGA GAT AAACT GT GT AC AGT GGCC ACT CT G AGGGAG AC AT AT GGCG AAAT GGC AG ACTGCT GT GCCAAGCAGGAGCCCGAACGCAACGAGTGCTTTCTGCAGCACAAAGACGATAACCCAAAT CT GCCCAGGCT GGT GCGCCCT GAAGT GGACGTCAT GTGT ACT GCCTT CCACGAT AAT GAGG AAACCTTTCTGAAGAAATACCTGTATGAGATCGCCCGGAGACATCCCTACTTCTATGCCCC T GAACT GCT GTT CTTT GCTAAACGGT AC AAGGCAGCCTTT ACCGAGT GCT GT C AGGCT GC A GAT AAAGC CGCTT GCCT GCT GCCT AAGCT GGACGAGCT GAGGGATGAAGGAAAGGCTT CC TCT GCAAAACAGCGCCT GAAGT GT GCCT CCCT GCAGAAATTCGGCGAGCGGGCTTTTAAGG CTT GGGCAGTGGC ACGACT GT CCCAGCGATT CCCAAAGGCCGAGTTT GCT GAAGT CT CT AA ACT GGT GACCGACCT GAC AAAGGTGCAC ACCGAGT GCT GT CAT GGCGACCTGCTGGAAT G CGCCGACGAT AGAGCAGAT CTGGCCAAGT ACAT CT GT GAGAACC AGGACT CCATT AGTT C AAAGCT GAAAGAGT GCT GT GAAAAACCCCT GCT GGAGAAGTCTCACT GCAT CGCAGAGGT GGAAAACGACGAAATGCCAGCAGATCTGCCTTCCCTGGCAGCAGACTTCGTCGAGTCTAA AGAT GT GT GTAAG AATT AT GCT G AAGC AAAGG AT GT GTTCCT GGGC AT GTTTCT GT ACGAG TATGCACGAGCTGGAGGCTCAGGAGGAAGCGGAGGGTCCGGAGGCTCTGGGGGAAGCTCC GAACTGACCC AGGACCCCGCT GT GAGCGTCGCACT GGGAC AGACT GT GCGCATT ACCT GCC AGGG AG AC AGT CT GCG AT C AT ACT AT GCTTCCT GGT ACC AGC AGAAGCC AGGC C AGGC AC CCGTGCTGGTCATCTATGGGAAAAACAATCGACCTTCCGGCATCCCCGATCGGTTCTCTGG AT CT AGTT CAGGCAAC ACAGCT AGCCT GACCATCACAGGGGC ACAGGCCGAGGACGAAGC CG ATT ACT ATT GCAAC AGC AG AG ACAGCT CCGGC AAT C AT GT GGT CTTT GGAGG AGG AACT AAGCTGACCGTGGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAAGTGGCGGGGGATCAGGAGGAGGAAG CGGAGGAGGCAGCGGAGAGGTCCAGCTGGTGGAAAGCGGAGGAGGAGTGGTCAGGCCAG GAGGGT CTCT GCGACT G AGTT GT GCT GCAT CAGGCTT C ACTTTT GACG ATT ACGG AAT GAG CTGGGTCAGGCAGGCACCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTGAGCGGCATCAACTGGAATG GAGGCTCTACAGGAT ACGCTGAT AGT GTGAAGGGCCGCTTCACTATTAGT CGAGAC AACGC CAAAAATTCACTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGCGCCGAGGACACAGCTGTGTACTAT T GCGCC AG AGGAAGGT C ACT GCT GTTT G ATT ATT GGGGGC AGGGCAC ACT GGT C AC CGT CT CCCGCTGAGGATCC

ID NO: 122 (Proteína de Construcción base # 14)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSG SRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGE V QLVE S GGGLV QPGG S LRLS C AASGFNIKDT YIH WVRQ APGKGLE WVARIYPTN GYTRY AD S VKGRFTIS ADTSKNT AYLQMNSLRAEDTAVYY CSRWGGDGFY AMDYWGQGTLVT V S SGGSG DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENC DKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMC TAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRD EGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGD LLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESK DVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARAGGSGGSGGSGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQG DSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVTYGKNNRPSGTPDRFSGSSSGNTASLTTTGAQAEDEADYYC NSRDSSGNHWFGGGTKLTVGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGVYRPGGSLRLS CAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDT AVYY CARGRS LLFDY WGQGTLVTVSR

ID NO: 123 (Construcción base # 15)

TCTT CAGAACT GACCCAGGACCCCGC AGT GAGCGTCGCACT GGGCCAGACCGT GAGAAT C AC AT GCC AGGGGG ATT CCCT GAGGT CTT ACT AT GCT AGCT GGT ACC AGC AG AAGC C AGGCC AGGCACCCGTGCTGGTCATCTATGGCAAAAACAATAGGCCTTCAGGGATTCCAGACCGCTT TAGCGGAAGCTCCTCTGGCAACACAGCAAGCCTGACAATTACTGGCGCTCAGGCAGAGGA CGAAGCC GATTACTATTGCAAC AGC AGGGAT AGTT CAGGC AAT CACGT GGT CTTCGGAGG AGGAACT AAGCTGACCGT GGGAGGAGGAT CT GGAGGAGGAAGT GGCGGGGGATC AGGAG GAGG AAGCGG AGG AGGC AGCGG AG AGGT GC AGCT GGT CG AAAGCGGAGG AGG AGT GGT C CGCCC AGGAGGGT CTCT GCGACT GAGTT GTGCCGCTT CAGGATT CACCTTT GACGATTACG GAAT GT CCT GGGT GAGGC AGGCACC AGGG AAGGG ACTGG AGT GGGTCT CT GGC AT C AACT GGAATGGAGGCTCTACAGGGTACGCTGACAGTGTGAAGGGACGGTTCACCATTTCCCGGG AT AACGCCAAAAATTCT CT GTATCT GCAGAT GAAT AGT CT GCGCGCT GAGGACACCGCAGT GT ACT ATT GT GCCAGGGGCCGC AGT CT GCTGTT CGATT ACT GGGGCC AGGGAAC ACT GGT G ACT GT CAGCCGAGGAGGAAGT GGAGGGT CAGGAGGCAGCGGAGGCAGCGGAGGGT CTGT GGT CCT GCT GCT GAG ACT GGCTAAGACAT ACGAGACCACACT GGAAAAATGCT GT GCAGC CGCT G ACCCCC AT G AGT GCT AT GCC AAGGT GTT CGAT GAGTT CAAGCC ACT GGT CG AGG AA CCCCAG AACCT G AT C AAGC AG AATT GT GAGCT GTT CGAAC AGCT GGGCG AGT AC AAATTT C AGAACGCCCT GCT GGT GCGCT ATACC AAGAAAGT GCCT CAGGT CT CAACCCCAACACT GGT GGAGGTCAGCAGGAATCTGGGCAAGGTCGGGTCCAAATGCTGTAAGCACCCCGAGGCAAA ACGCAT GCCTT GCGCCGAAGACT ACCT GT CCGT GGTCCT GAACCAGCT GT GT GT GCT GCAT GAGAAGACACCTGTGTCTGATCGGGTCACTAAATGCTGTACCGAATCTCTGGTGAACCGGA GACCTTGCTTT AGT GCCCT GG AGGT GG ACG AAACTT AT GT CCC AAAGG AGTT CAAT GCT G A AACTTTCACCTTT CACGCAGAT AT CT GTACCCT GAGCGAGAAGGAAAGAC AGATTAAGAA ACAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTCAAGCATAAACCAAAGGCCACCAAGGAACAGCTGAA AGCT GT GAT GG ACG ATTT CGC AGCCTTT GT CG AG AAAT GCT GT AAGGCT G ACG AT AAGG AA ACAT GCTT CGCAGAGGAAGGGAAGAAACT GGT GGCT GCATCCCAGGCAGCT CT GGGACTG GGAGGCAGTGGAGGATCAGGAGGGAGCGGAGGCTCCGGAGGAGACATCCAGATGACTCA GTCCCCAAGCTCCCTGTCAGCAAGCGTGGGCGACCGGGTCACAATTACTTGTAGAGCTTCT CAGGATGTGAAT ACCGCCGTCGCTTGGT ACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCT AAACTG CTGATCTACTCCGCTTCTTTCCTGTATAGCGGAGTGCCATCCCGGTTCAGCGGGTCAAGGA GCGG AACT GACTT CACCCT GAC AATTT CT AGT CTGCAGCCT G AGG ATTTT GCC ACCT ACT AT TGCCAGCAGCACTATACTACCCCCCCTACTTTCGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAA GGAGGGT CT GGAGGAGGGAGT GGAGGAGGGT CAGGCGGAGGGAGCGGAGGAGGGT CCGG CGAAGTCCAGCT GGTCGAATCCGGAGGAGGACT GGT GCAGCCT GGAGGCT CT CT GAGGCT GAGTT GT GC AGCCT C AGGCTTT AAC AT C AAGGAC ACCT AC ATT C ATT GGGT GCGGC AGGCA CC AGGGAAAGG ACT GG AGT GGGT GGCC AG AAT CT AT CCCAC AAATGG AT ACACT CG AT AT GCCG ACT CT GT G AAGGGC CGGTT CACAATT AGCGC AG AT AC CTCCAAAAACAC AGCCT AC CTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGATACTGCTGTGTACTATTGCAGCCGATGGGGC GGGGACGGCTT CTACGCT AT GGACT ATTGGGGGCAGGGGACT CT GGTGACAGT GAGCAGC TGAGGATCC

ID NO: 124 (Proteína de Construcción base # 15)

S SELT QDPAV S VALGQTVRIT CQGDSLRS YY AS WY QQKPGQ APVLVIY GKNNRPS GIPDRFS GS S SGNTASLTITGAQ AEDEADYYCNSRD S SGNH WFGGGTKLTVGGGS GGGSGGGSGGGS GGG SGEVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTG YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRSLLFDYWGQGTLVTVSRGGSG GSGGSGGSGGSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKYFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVV LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQA ALGLGGSGGSGGSGGSGGDIQMTQSPSSLSASYGDRVTITCRASQDYNTAVAWYQQKPGKAP KLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGS GGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGL EWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYA MDYWGQGTLVTVSS

ID NO: 125 (Construcción base # 16)

GAT ATT CAG AT GACCC AG AGCCC AAGCT C CCT GAGT GC AT C AGT GGGCG AC AG AGT CACA AT C ACTT GC AGGGCT AGCC AGG AT GT G AAC AC AGCT GTCGC AT GGT ACC AGC AG AAACCA GGCAAGGCTCCCAAACT GCT GAT CT ACAGCGCAT CCTT CCTGTATT CCGGCGT GCCCT CTA GGTTTT CT GGGAGTCGCT C AGG AACT G ACTT CACCCT GAC AAT CT CT AGT CT GC AGCCT GA GGATTTTGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCCCCTACTTTCGGCCAGGGG ACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGGAGTGGAGGCGGGTCAGGCGGAGGGAGCGGAGGAGG GT CCGG AGG AGGGT CT GGCG AGGT GC AGCT GGT CGAAAGCGG AGGAGG ACT GGT GC AGCC T GGAGGC AGT CT GCGGCT GT C AT GT GCCGCT AGCGGCTTCAAC AT CAAGG AC ACCT AC ATT CATT GGGT GCGCCAGGCACCAGG AAAAGGCCTGGAGTGGGT CGCCCG AAT CTATCCCACC AATGGGTACACAAGATATGCCGACTCCGTGAAGGGACGCTTTACAATTTCCGCTGATACTT CT AAAAAC ACCGCAT ACCTGC AG AT GAAT AGT CT GAG AGC AGAGG AT ACT GCCGT GT ACT ATT GT AGC AG AT GGGGGGG AG ACGGCTT CTACGCC AT GG ACT ACT GGGGCC AGGGC ACT C T GGT GACCGT CT C AAGCGG AGGG AGCGG AGGCT CCGGAGG AT CT GG AGGG AGT GGAGGCT CAGT GGT CCTGCTGCT GAGGCT GGCT AAG ACCT ACG AG ACT ACCCT GGAAAAAT GCTGTGC AGCCGCT G ACCCCC ACG AGT GCT AT GCC AAGGT GTT CG AT GAGTT C AAGCC ACT GGT CGAG GAACCCC AG AACCT GAT C AAGCAG AATT GT GAGCT GTT CGAACAGCT GGGCG AGT AC AAA TTT CAGAACGCCCT GCT GGT GCGCT ATACAAAGAAAGT GCCTCAGGTCAGT ACTCCAACCC TGGTGGAAGTCTCACGGAATCTGGGAAAGGTCGGCAGCAAGTGCTGTAAACACCCCGAGG CAAAAAG AAT GCCTT GCGCCGAAG ACT ACCT GAGCGT GGTCCT GAAT CAGCTGT GT GT GCT GCATGAGAAGACACCTGTGAGCGATAGGGTCACAAAATGCTGTACTGAATCCCTGGTGAA CCGGAGACCTT GCTTTT CT GCT CT GGAGGT GGACGAAACTT AT GTCCCAAAGGAGTT CAAT GCCGAAAC ATT CACTTTT CACGCT GATAT CT GT ACCCT GAGCGAGAAGGAACGCCAGATT A AG AAAC AG AC AGCC CT GGT GGAGCT GGT CAAGC AT AAACCAAAGGCAACT AAGG AAC AG CT GAAAGCCGT GAT GG ACGATTT CGC AGC CTTT GT CG AGAAGT GCT GT AAAGCCG ACG AT A AGG AAACCT GCTTT GCT GAGG AAGGC AAG AAACT GGT GGCT GC AAGCCAGGC AGCT CT GG GACT GGG AGG AAGCGG AGGGT CCGG AGGCT CT GGGGGAAGT GG AGGGTCCT CT GAGCT GA CCCAGGACCCCGCTGTGTCCGTCGCACTGGGACAGACCGTGCGAATTACATGTCAGGGCG ATTCACTGCGGAGCTACTATGCTTCTTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCACCAGTGCT GGT CAT CT AT GG AAAAAAC AAT CGGCCC AGT GGCATT CCT G ACAG ATTTT CAGGC AGTT C A AGCGGG AAC ACCGCAT CCCT GACCAT CACAGGCGCCCAGGCTGAGGACGAAGCCGATT AC T ATT GCAACT CT AGGG ATT CCT CT GGCAAT CAT GT GGT CTTCGGAGGCGGG AC AAAGCT GA CT GT GGGAGGAGGGAGT GGCGGAGGGT CAGGCGGCGGGAGCGGCGGCGGGT CCGGCGGC GGGTCT GGAG AAGT GC AGCT GGT CG AAT CCGGAGG AGG AGT GGT CCGCCC AGG AGGC AGT CT GCGACT GT CAT GT GCAGCCAGCGGGTTCACCTTT GACGATTACGGAATGT CCT GGGT GC GGCAGGC ACCAGGCAAGGGACTGGAGT GGGTGT CT GGCAT CAACT GGAAT GGGGGCAGCA CAGGCT ACGCT GACT CT GTGAAGGGGCGATTCACT ATT AGCCGGGAT AACGCCAAAAATTC CCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAG GGGGCGGT C ACT GCTGTTT GATT ATTGGGGGCAGGG AACT CT GGT CACT GT CT CT AGGT GA GGATCC

ID NO: 126 (Proteína de Construcción base # 16) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSG SRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKYEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGE VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADS VKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGSG GSGGSGGSGGSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVV LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQA ALGLGGSGGSGGSGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPV LVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHWFGGGTKLTVG GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAP GKGLE WVS GIN WNGGSTGYADS VKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT AYYY CARGRSLL FDYWGQGTLVTVSR

ID NO: 127 (Secuencia para v593)

GAC ATT CAG AT G AC AC AG AGCCC AAGCTCCCT GT CT GCAAGT GT CGGCG AT CGAGT G AC A AT CACTT GCCGGGCTTCCCAGGACGT C AACACT GCCGT GGCTTGGTACCAGCAGAAACCT G GGAAGGCCCCAAAACT GCT GAT CT ACT CAGCTAGCTTT CT GTATAGCGGAGTGCCCTCCCG GTT CT CCGGAT CT AGAAGT GGC ACCG ATTTT ACCCTGAC AAT CT CTAGT CT GC AGCCT G AG GACTTCGCCACATACTATTGCCAGCAGCACTATACCACACCCCCTACCTTTGGGCAGGGAA CAAAGGT GGAAAT CAAAGGAGGGT CTGGAGGAGGGAGT GGAGGAGGGTCAGGCGGAGGG AGCGGAGGAGGGTCCGGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGAGGAGGACTGGTGCAGCC T GGAGGCT CT CT G AGGCT G AGTT GT GCCGCTT CAGGCTT C AAC AT C AAAG AT ACCT AC ATT CATT GGGT CCGCCAGGCT CCAGGC AAGGGACT GGAGT GGGT GGCACGAATCT ATCCCACA AATGGATACACTCGGTATGCCGATTCCGTGAAAGGCAGATTCACTATTAGCGCTGACACCT CCAAGAAC ACAGCATACCT GCAGAT GAAT AGT CT GCGAGCAGAGGAC ACCGCCGT GT ACT ATT GCT CACGGT GGGGGGGAGACGGCTTTTACGCCAT GGATTATT GGGGAC AGGGCACT CT GGT GACCGT CT CAAGCGGAGGGAGCGGAGAT GCACACAAGTCCGAGGT CGCT CAT CGCTT CAAAGACCT GGGCGAGGAAAACTTTAAGGCCCT GGT GCT GATT GCATT CGCCCAGTACCT G CAGC AGT GCCC ATT CG AGG ACC ACGT G AAACT GGT C AACG AAGT G ACT G AATTT GCCAAG ACCTGCGTGGCTGACGAGTCAGCAGAAAATTGTGATAAAAGCCTGCATACACTGTTCGGCG AT AAGCT GT GT ACAGT GGCC ACT CT GAGGGAG ACTT ATGGGG AAAT GGCCG ACT GCTGT GC TAAACAGGAGCCAGAACGCAACGAGTGCTTTCTGCAGCACAAGGACGATAACCCAAATCT GCCCAGACT GGT GAGGCCCGAAGTGGACGT CAT GT GTACAGCCTT CCACGAT AAT GAGGA AACTTTTCTGAAGAAATACCTGTATGAGATCGCTCGGAGACATCCCTACTTCTATGCCCCTG AACTGCTGTTCTTTGCTAAGAGGTACAAAGCAGCCTTTACCGAGTGCTGTCAGGCTGCAGA TAAGGCCGCTTGCCTGCTGCCAAAACTGGACGAGCTGAGAGATGAAGGCAAGGCATCCTC TGCCAAGCAG AGGCTG AAAT GTGCCTCCCTGCAG AAGTTCGGGG AG AGGGCTTTT AAAGC TT GGGCAGT GGCACGACT GAGCCAGCGATTCCCAAAGGCT GAGTTT GCAGAAGT CT CCAA GCT GGT GACCGACCT GAC AAAAGTGCACACCGAGT GCT GT CAT GGCGACCTGCTGGAAT G CGCCGACGAT CGCGCCGAT CT GGCT AAGT ACAT CT GTGAGAACCAGGACAGCATTAGTT CA AAGCT GAAAG AGT GCT GT GAAAAGCCT CT GCT GGAG AAAT CCC ACT GCATT GC AG AGGT G GAAAACGACGAAATGCCAGCAGATCTGCCTTCCCTGGCAGCAGACTTCGTCGAGTCTAAG GAT GT GT GT AAAAATT ACGCT G AAGCAAAGGAT GT GTT CCT GGGC AT GTTTCT GT ACG AGT AT GCC AGGCGCC ACCCT G ACT AC AGCGT GGT CCT GCTGCT GCGGCT GGCT AAAAC CT AT G A GACT ACCCT GG AAAAGT GCT GT GCT GC AGCCG AT CC AC AT GAGT GCT ATGCC AAGGT CTT C GACG AGTT C AAGCC ACT GGT GGAGG AACCCC AG AACCT G AT C AAACAG AATT GT GAGCTG TTT GAAC AGCT GGGCG AGT AC AAGTT CC AGAACGCC CTGCTGGT GAG AT AT AC AAAG AAA GTCCCT C AGGT GAGT ACT CC AACCCT GGTGG AAGT CT C ACGG AAT CT GGGCAAAGT GGGG AGC AAGT GCT GTAAAC ACC CCG AGGC AAAGAG AAT GCCTT GCGCCGAAG ATT ACCT GT CT GT GGT C CT GAAT C AGCT GT GT GT GCT GCAT GAG AAAACT CCT GT CAGCG ACCGGGT GACT A AGTGCTGTACCGAATCCCTGGTGAACCGACGGCCTTGCTTCTCTGCCCTGGAGGTCGATGA AAC AT AT GT GCC AAAGG AGTTT AAT GC AG AAAC ATT CACTTTT CACGCCG AC AT CT GT ACT CTGAGCGAGAAGGAAAGACAGATTAAGAAACAGACCGCCCTGGTCGAGCTGGTGAAGCAT AAACCAAAGGCTACCAAGGAACAGCTGAAAGCAGTCATGGACGATTTCGCTGCATTTGTG GAG AAGT GCT GT AAAGC AGACGAT AAGGAAAC AT GCTT CGCCG AGG AAGGGAAG AAACT GGTGGCAGCTAGCCAGGCAGCACTGGGACTGGGAGGCTCAGGAGGAAGCGGAGGGTCCG GAGGCTCTGGAGGAAGCTCCGAGCTGACCCAGGACCCCGCAGTGTCTGTCGCACTGGGAC AG AC AGT G AGG ATT ACTT GT C AGGGGG AC AGT CTGCGCT C AT ACT AT GCT AGCT GGT ACCA GCAGAAACC AGGCCAGGCACCCGT GCTGGTCAT CT AT GGCAAG AACAAT CGCCCTTCCGG GATTCCAGATCGATT CT CT GGGT CTAGTT CAGGAAACACCGC AT CT CT GACCATCACAGGC GCCCAGGCTGAGGACGAAGCTGATTACTATTGCAACAGCAGAGACAGCTCCGGCAATCAC GT GGTCTTT GGAGGAGGAACTAAGCT GACCGT GGGAGGAGGAT CT GGAGGAGGAAGT GGC GGGGGATCAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCAGCGGAGAGGTCCAGCTGGTGGAAAGCGG AGG AGGCGT GGT CAG ACC AGG AGGGT CTCT GAG ACT GT CCT GT GCT GCAT C AGG ATT C ACC TTT GACGATT ACGGC AT GT CTT GGGTCAGGCAGGCACCT GGG AAGGGCCTGGAATGGGT G AGTGGCATCAACTGGAATGGAGGCTCTACCGGGTACGCCGATAGTGTGAAAGGAAGGTTC ACAATTAGTCGCGACAACGCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGCGCT GAGGACACAGCAGTGTACTATTGCGCCAGGGGGAGGTCACTGCTGTTTGATTATTGGGGGC AGGG AACT CT GGT C ACT GT GT CACGGT GAGGAT CC

ID NO: 128 (Secuencia de Proteínas para v593) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSG SRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTRVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGE VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADS VKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGSG DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENC DKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMC TAFHDNEETFLKKYLYE1ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRD EGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVIITECCIIGD LLECADDRADLAKYTCENQDSTSSKLKECCEKPLLEKSHCTAEVENDEMPADLPSLAADFVESK D V CKNY AE AKD VFLGMFLYE Y ARRHPD Y S WLLLRLAKTYETTLEKCC AAADPHE CY AKVF DEFKPLVEEPQNLIKQN CELFE QLGE YKF QNALLVRYTKKVP Q VSTPTLVEVSRNLGKV GS KC CKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK EFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADD KETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGGSGGSGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSL RS YY AS WY QQKPGQ AP VL VIY GKNNRP SGIPDRFSGSSS GNT AS LTIT GAQ AEDE AD YY CN S R DSSGNHWFGGGTKLTVGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAA SGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGTNWNGGSTGYADSVKGRFTTSRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCARGRSLLFDYWGQGTLVTVSR

ID NO: 129 (Secuencia para v594)

AGT AGCG AACT G ACC C AGG AC CCCGC AGT GAGCGT CGC ACT GGGGC AG AC AGT GCG AAT C ACTT GCC AGGG AGAC AGCCT GCGGTCCT ACT ATGCTT CCTGGT ACC AGC AG AAACCT GGCC AGGCACC AGT GCTGGT CAT CTAT GGGAAGAACAAT CGGCCCAGCGGCAT CCCCGAT AGAT TCTCCGGCAGCTCCTCTGGGAACACCGCCTCTCTGACAATTACTGGGGCCCAGGCTGAGGA CGAAGCT GATTACT ATTGCAACAGCAGGGACAGTT CAGGAAAT CACGT GGT CTTT GGAGG AGGAACTAAGCTGACCGTGGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAAGTGGAG GAGGAT C AGG AGG AGG AAGCGG AG AGGT GC AGCT GGT CG AAAGCGGAGG AGG AGT GGT C AG ACCT GG AGGGT CC CT G AGGCT GTCTTGTGCCGCT AGT GGCTT C ACCTTT GACG ATT ACG GAAT GAGTTGGGTCCGGC AGGCACCAGGAAAGGGACT GGAGT GGGTGT CAGGCAT CAACT GGAATGGAGGCAGTACCGGATACGCCGATTCAGTGAAAGGCAGGTTCACAATTTCTCGCG AC AACGCT AAG AAT AGT CT GT AT CT GC AG AT G AACT C ACT GAG AGCT GAGGAT AC AGC AG T GT ACT ATT GCGCC AG AGGC AGGT CTCTGCTGTTT GACT ACT GGGGGC AGGG AAC ACT GGT GACTGTCTCACGAGGAGGAAGCGGCGATGCACACAAGTCCGAGGTCGCTCATAGATTCAA AG ACCT GGGGG AGGAAAATTTT AAGGCCCT GGT GCT GAT CGC ATT CGCCC AGT AT CT GC AG CAGT GCCCATT CGAGGACC ACGT GAAACT GGT CAACGAGGTGACCGAATTT GCCAAGACA TGCGT GGCCG ACG AGAGCGCT GAAAATT GT GAT AAAT CCCT GC AT AC ACT GTT CGGGGAT A AGCT GT GT ACCGT GGC CAC ACT GAGGG AG ACTT ACGG AG AAAT GGC AG ACT GCT GT GCCA AACAGGAGCCAGAACGCAACGAGTGCTTTCTGCAGCACAAGGACGATAACCCAAATCTGC C ACG ACT GGT GCG ACC AG AAGT GG ACGT C AT GT GT AC AGCCTTCCACG AT AAT G AGGAAA CTTTT CT GAAGAAAT ACCTGT AT GAGATCGCCCGGAGACAT CCCT ACTT CTAT GCT CCT GAA CTGCTGTTCTTTGCAAAACGGT AC AAGGCAGCCTTT ACCGAGTGCT GTCAGGCTGCAGAT A AGGCCGCTTGCCTGCTGCCAAAACTGGACGAGCTGAGAGATGAAGGCAAGGCAAGCTCCG CCAAGCAGAGGCTGAAATGTGCTAGCCTGCAGAAGTTCGGGGAGAGGGCCTTCAAGGCTT GGGCAGTGGCACGACTGTCACAGAGATTCCCCAAGGCTGAGTTTGCAGAAGTCAGCAAGC TGGT GACT G ACCT G AC CAAAGT GCAC ACC GAGT GCT GT C AT GGCGACCT GCT GG AAT GCGC CGACGAT CGCGCCGAT CT GGCT AAGT ACATCT GT GAGAACCAGGACAGCATTT CTAGTAAG CT GAAAGAGT GCT GTGAAAAGCCT CT GCT GGAGAAAT CCC ACTGC ATCGCCGAGGT GGAA AACG ACG AAAT GCC AGCT GAT CT GCCCT CTCT GGC AGCCG ACTT CGTCGAG AGT AAGG AT G T GT GT AAAAATT ACGCT G AAGC AAAGG AT GT GTT CCT GGGC AT GTTTCT GT ACGAGT AT GC AAGGCGACACCCAGACTACTCCGTGGTCCTGCTGCTGCGGCTGGCTAAAACCTATGAGACC ACACT GGAAAAGT GCT GT GCTGCAGCCGAT CCT CATGAGT GCT ATGCCAAGGT CTT CGACG AGTT C AAGC C ACT GGT GG AGG AACCCC AG AACCT GAT CAAGC AGAATT GT G AGCT GTTTG AACAGCTGGGCGAGTACAAGTTCCAGAACGCCCTGCTGGTGAGATATACAAAGAAAGTCC CT CAGGT GT CAACCCC AACACT GGT GGAGGTCAGCCGGAAT CTGGGGAAAGT GGGC AGCA AAT GCT GTAAGCACCCCGAGGCAAAGAGAAT GCCTT GCGCCGAAGATTACCT GT CTGT GGT CCT GAACC AGCT GT GT GT GCT GCAT G AG AAAACT CCTGT C AGT GAC AGGGT G ACC AAGT GC T GT AC AG AAT CT CT GGT GAACCG ACGGCCTT GCTT C AGT GCCCT GG AGGT CG AT G AAAC AT AT GTGCC AAAGGAGTTT AAT GCCGAAACTTT CACCTTTCACGCT GACAT CT GTACT CT GAG CGAGAAGGAACGCCAGATTAAGAAACAGACCGCCCT GGT CGAGCT GGT GAAGCAT AAACC AAAGGCAAC AAAGG AAC AGCT G AAAGC C GT C AT GGACG ATTTCGCT GC ATTT GT GG AG AA AT GCT GTAAGGCCGACGAT AAGGAAACTT GCTT CGCTGAGGAAGGAAAGAAACT GGT GGC AGCTT CCC AGGC AGC ACT GGG ACTGGG AGGGT CT GGAGGC AGT GGAGG ATC AGG AGGG AG CGGAGGCG ACAT CCAGAT GACCCAGTCCCCCT CAAGCCT GAGTGCCT CAGT CGGCGAT CGC GTGACAATTACTTGTCGAGCTTCTCAGGACGTCAATACAGCCGTGGCTTGGTATCAGCAGA AGCCT GGAAAGGCACCAAAACT GCT GAT CTACAGCGCCTCCTTTCT GT ATT CCGGCGT GCC CT CT CGATTCT CT GGAAGT CGGT CAGGCACCGATTTTACCCTGACAATTT CCTCT CT GCAGC

CT GAGGACTTCGCCACAT ACT ATTGCCAGC AGCACT AT ACTACCCCCCCTACTTTT GGCCA

GGGGACCAAGGT GGAAAT CAAAGGGGGAAGTGGCGGGGGAT C AGGCGGCGGAAGCGGCG

GCGGCAGCGGCGGCGGAT CT GGAGAGGTCCAGCT GGT GGAAAGCGGAGGAGGACTGGTG

C AGCCT GG AGGG AGT CT GCG ACT GT CAT GT GCT GCAAGCGGCTT CAAC AT C AAAG AT ACCT

AC ATT C ATT GGGT C AGGC AGGCCCCTGG AAAGGGCCT GGAAT GGGT GGC ACG AAT CT AT C

CCACT AAT GGCT ACACCAGAT AT GCCGATT CCGT GAAAGGGCGCTTCACT ATTTCCGCTGA

CACATCTAAGAACACTGCATACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCTGAGGACACCGCAGT

GT ACT ATTGCT CT CGAT GGGGCGGCG ACGGCTT CT ACGC AAT GG ACT ACT GGGGGC AGGGG

AC ACT GGT GACT GT GAGC AGCT GAGG AT C C

40. SEQ ID NO: 130 (Secuencia de Proteínas para v594)

SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGS

SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHWFGGGTKLTVGGGSGGGSGGGSGGGSGGG

SGEVQLVESGGGYVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTG

YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRSLLFDYWGQGTLVTVSRGGSG

DAHKSEVAHRFBCDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENC

DKSLHTLFGDBCLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMC

TAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRE)

EGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGD

LLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESK

D VCKNY AE AKD VFLGMFLYE Y ARRHPD Y S WLLLRLAKT YETTLEKCC AAADPFtE C Y AKVF

DEFKPLVEEP QNLIKQN CELFE QLGEYKF QN ALLVRYTKKVP QV STPTLVEVSRNLGKV GS KC

CKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK

EFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCBCADD

KETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGGSGGSGGSGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ

DVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQH

YTTPPTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF

NIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAE

DTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS

41. SEQ ID NO: 19 (Secuencia de señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYLOOCP

FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKXCTVATLRETYGEMADCCAKQEPE

RNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR

YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVCRLSQR

FPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEK

SHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARA

42. SEQ ID NO: 55 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 19)

CL #1042 HSA-1 337 DSS CH-A A217C

GCC ACT AT GGCT GT GAT GGCCCCT AGGACCCT GGTGCTGCTGCT GT CCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GG AG AT GC AC ACAAG AGT GAGGTT GCT C AT CGGTTT A

AAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTT GGT GTTGATTGCCTTT GCT CAGTAT CTTCA

GC AGT GT CC ATTT GAAG AT C AT GT AAAATT AGT G AAT G AAGT AACT G AATTT GCAAAAACA

TGT GTTGCT GAT GAGT CAGCT GAAAATTGT GACAAAT CACTT CATACCCTTTTTGGAGACA

AATT AT GC AC AGTT GC AACT CTTCGT GAAACCT AT GGT G AAAT GGCT GACT GCT GT GC AAA

AC AAG AAC CT GAG AGAAAT G AAT GCTTCTT GCAAC AC AAAG AT GAC AACC C AAACCT CCC

CCG ATTGGT GAG ACC AG AGGTT GAT GT GAT GT GCACT GCTTTT CAT GAC AAT G AAG AG ACA

TTTTTG AAAAAAT ACTT ATAT G AAATTGCCAG AAG ACAT CCTTACTTTTATGCCCCGG AACT

CCTTTT CTTT GCT AAAAGGT AT AAAGCT GCTTTT AC AG AAT GTT GCCAAGCT GCT GAT AAAG

CTGCCTGCCTGTT GCC AAAGCT CG AT G AACTT CGGGAT G AAGGG AAGGCTT CGT CT GCCAA

ACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGC

AGT AT GCCGCCTGAGCC AGAGATTT CCCAAAGCT GAGTTTGCAGAAGTTT CCAAGTTAGT G

AC AG ATCTT ACC AAAGT CC AC ACGGAATGCT GCC AT GG AGAT CT GCTT GAAT GT GCT GAT G

AC AGGGCGG ACCTT GCC AAGT AT AT CT GT GAAAAT C AAG ATT CGAT CTCC AGT AAACT GAA

GGAAT GCTGT G AAAAACCT CT GTT GGAAAAAT CCC ACT GC ATT GCCGAAGT GGAAAAT GA

T GAG AT GCCTGCT G ACTT GCCTT C ATTAGCT GCT GATTTT GTT GAAAGT AAGG AT GTTT GCA

AAAACTAT GCT GAGGCAAAGGAT GT CTTCCT GGGCAT GTTTTTGTAT GAATAT GCAAGAGC

ATGA

43. SEQ ID NO: 20 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGSCVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDE

FKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCK

HPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF

NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDK

ETCFAEEGKKLVAASQAALGL

44. SEQ ID NO: 56: (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 20)

CL_#1045_HSA-342_585_DSS_CH-B_V343C

CGCCACT ATGGCT GT GAT GGCCCCT AGGACCCT GGTGCTGCTGCT GT CCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GG AT CTTGCGT GCTGCTGCT GAG ACTT GCC AAG ACAT

AT G AAAC C ACTCT AG AG AAGT GCTGTGCCGCT GC AG AT CCTC ATG AAT GCT ATGC C AAAGT

GTTCGAT GAATTT AAACCT CTTGT GGAAG AGCCT CAG AATTT AAT CAAAC AAAATT GT GAG

CTTTTT GAGC AGCTT GG AG AGT AC AAATTCCAG AAT GCGCT ATTAGTTCGTT AC ACC AAG A

AAGT ACC CC AAGT GT CAACT CC AACT CTTGT AG AGGT CT C AAG AAACCT AGG AAAAGTGG

GC AGC AAAT GTT GT AAAC ATCCT GAAGC AAAAAG AAT GCCCTGT GCAG AAG ACT AT CT AT

CCGTGGT CCT G AACCAGTT AT GT GT GTT GCAT G AG AAAACGCC AGT AAGT GAC AG AGT C AC

CAAATGCTGCAC AG AAT C CTT GGT GAAC AGGCG ACC ATGCTTTT CAGCT CT GGAAGT CGAT

GAAAC AT ACGTT CCC AAAG AGTTT AATGCT GAAAC ATT C ACCTT CC AT GC AGAT AT AT GCA

CACTTTCT GAG AAGG AGAGAC AAAT C AAG AAAC AAACT GC ACTTGTT GAGCT CGT GAAAC

AC AAGCC CAAGGC AAC AAAAG AGC AACT GAAAGCT GTT AT GGAT GATTT CGC AGCTTTT GT

AG AG AAGT GCT GC AAGGCT GAC GAT AAGG AG ACCT GCTTT GCCGAGG AGGGT AAAAAACT

TGTT GCT GCAAGTC AAGCT GCCTT AGGCTT AT G A

45. SEQ ID NO: 21 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYLOOCP

FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPE

RNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR

YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRE)EGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQ

RFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLE

KSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFCYEYARA

46. SEQ ID NO: 57: (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 21) CL_#1043_HSA-1_337_DSS_CH-A_L331C

GCC ACT AT GGCT GT GAT GGCCCCT AGGACCCT GGTGCTGCTGCT GT CCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GG AG AT GC AC ACAAG AGT GAGGTT GCT C AT CGGTTT A

AAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTT GGT GTTGATTGCCTTTGCT CAGTAT CTTCA

TGT GTTGCT GAT GAGT CAGCT GAAAATTGT GACAAAT CACTT CATACCCTTTTTGGAGACA

AATT AT GC AC AGTT GC AACT CTTCGT GAAACCT AT GGT G AAAT GGCT GACT GCT GT GC AAA

AC AAG AAC CT GAG AGAAAT G AAT GCTTCTT GCAAC AC AAAG AT GAC AACC C AAACCT CCC

CCG ATTGGT GAG ACC AG AGGTT GAT GT GAT GT GCACT GCTTTT CAT GAC AAT G AAG AG ACA

TTTTTG AAAAAAT ACTT ATAT G AAATTGCCAG AAG ACAT CCTTACTTTTATGCCCCGG AACT

CCTTTT CTTT GCT AAAAGGT AT AAAGCT GCTTTT AC AG AAT GTT GCC AAGCT GCT GAT AAAG

CT GCCT GCCT GTT GCC AAAGCT CG AT G AACTT CGGGAT G AAGGG AAGGCTT CGT CT GCCAA

ACAGAGACTCAAGTGT GCC AGT CT CCAAAAATTT GGAGAAAGAGCTTT CAAAGCAT GGGC

AGT AGCTCGCCT GAGCCAGAGATTT CCCAAAGCTGAGTTT GC AGAAGTTT CCAAGTTAGT G

ACAGAT CTTACCAAAGT CCACACGGAATGCT GCCAT GGAGAT CT GCTTGAAT GT GCT GAT G

AC AGGGCGG ACCTT GCC AAGT AT AT CT GT GAAAAT C AAG ATT CGATCTCC AGT AAACT GAA

GGAAT GCTGT G AAAAACCT CT GTT GGAAAAAT CCCACT GC ATT GCCGAAGT GGAAAAT GA

T GAG AT GCCTGCT G ACTT GCCTT CATT AGCT GCT GATTTT GTT GAAAGT AAGG AT GTTT GCA

AAAACT AT GCT G AGGC AAAGG AT GT CTT C CT GGGCAT GTTTTGCTAT GAAT AT GC AAGAGC

ATGA

47. SEQ ID NO: 22 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGSWLLLRLCKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDE

FKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCK

HPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF

NAETFTFHADICTLSEKERQIBCKQTALVELVKHKPBCATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDK

ETCFAEEGKKLVAASQAALGL

48. SEQ ID NO: 58 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 22)

CL_#1047_HSA-342_585_DSS_CH-B_A350C

GCC ACT AT GGCT GT GAT GGCCCCT AGGACCCT GGTGCTGCTGCT GT CCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GG AT CT GT CGT GCTGCTGCT GAG ACTTT GC AAG ACAT

AT G AAAC C ACT CT AG AG AAGT GCT GT GCC GCT GC AG AT CCT C ATG AAT GCT ATGC C AAAGT

GTTCGAT GAATTT AAACCT CTTGT GGAAG AGCCT CAG AATTT AAT CAAAC AAAATT GT GAG

CTTTTT GAGC AGCTT GG AG AGT AC AAATTCCAG AAT GCGCT ATTAGTTCGTT AC ACC AAG A

AAGT ACC CC AAGT GT CAACT CC AACT CTTGT AG AGGT CT C AAG AAACCT AGG AAAAGTGG

GC AGC AAAT GTT GT AAAC ATCCT GAAGC AAAAAG AAT GCCCTGT GCAG AAG ACT AT CT AT

CCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCAC

CAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGAT

GAAAC AT ACGTT CCC AAAG AGTTT AATGCT GAAAC ATT C ACCTT CC AT GC AGAT AT AT GCA

CACTTTCT GAG AAGG AGAGAC AAAT C AAG AAAC AAACT GC ACTTGTT GAGCT CGT GAAAC

AC AAGCC CAAGGC AAC AAAAG AGC AACT GAAAGCT GTT AT GGAT GATTT CGC AGCTTTT GT

AG AG AAGT GCT GC AAGGCT GAC GAT AAGG AG ACCT GCTTT GCCGAGG AGGGT AAAAAACT

T GTT GCT GCAAGTC AAGCT GCCTT AGGCTT AT G A

49. SEQ ID NO: 23 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYLOOCP

FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPE

RNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR

YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVCRLSQR

FPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEK

SHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARA

50. SEQ ID NO: 59 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 23)

CL_#1042_HSA-1_337_DSS_CH-A_A217C

GCC ACT AT GGCT GT GAT GGCCCCT AGG ACCCT GGTGCTGCTGCT GT CCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GG AG AT GC AC ACAAG AGT GAGGTT GCT C AT CGGTTT A

AAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTT GGT GTTGATTGCCTTTGCT CAGTAT CTTCA

TGT GTTGCT GAT GAGT CAGCT GAAAATTGT GACAAAT CACTT CATACCCTTTTTGGAGACA

AATT AT GC AC AGTT GC AACT CTTCGT GAAACCT AT GGT G AAAT GGCT GACT GCT GT GC AAA

AC AAG AAC CT GAG AGAAAT G AAT GCTTCTT GCAAC AC AAAG AT GAC AACC C AAACCT CCC

CCG ATTGGT GAG ACC AG AGGTT GAT GT GAT GT GCACT GCTTTT CAT GAC AAT G AAG AG ACA

TTTTT G AAAAAAT ACTT AT AT G AAATT GCC AG AAGAC AT CCTT ACTTTTAT GCCCCGG AACT

CCTTTT CTTT GCT AAAAGGT AT AAAGCT GCTTTT AC AG AAT GTT GCCAAGCT GCT GAT AAAG

CTGCCTGCCTGTT GCC AAAGCT CG AT G AACTT CGGGAT G AAGGG AAGGCTT CGT CT GCCAA

ACAGAGACTCAAGTGT GCC AGT CT CCAAAAATTT GGAGAAAGAGCTTT CAAAGCAT GGGC

AGT AT GCCGCCTGAGCC AGAGATTT CCCAAAGCT GAGTTTGCAGAAGTTT CCAAGTTAGT G

AC AG ATCTT ACC AAAGT CC AC ACGGAATGCT GCC AT GG AGAT CT GCTT GAAT GT GCT GAT G

AC AGGGCGG ACCTT GCC AAGT AT AT CT GT GAAAAT C AAG ATT CGAT CTCC AGT AAACT GAA

GGAAT GCT GT G AAAAACCT CT GTT GGAAAAAT CCC ACT GC ATT GCCGAAGT GGAAAAT GA

TGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCA

AAAACT AT GCT GAGGCAAAGGAT GT CTTCCT GGGCAT GTTTTTGTAT GAATAT GCAAGAGC

ATGA

51. SEQ ID NO: 24 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGSWLCLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDE

FKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCK

HPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF

NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDK

ETCFAEEGKKLVAASQAALGL*

52. SEQ ID NO: 60 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 24)

CL_#1046_HSA-342_585_DSS_CH-B_L346C

GCC ACT AT GGCT GT GAT GGCCCCT AGG ACCCT GGTGCTGCTGCT GT CCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GG AT CT GT CGT GCTGTGCCT GAG ACTT GCC AAG AC AT

AT G AAAC C ACT CT AG AG AAGT GCT GT GCC GCT GC AG AT CCTC ATG AAT GCT AT GC C AAAGT

GTTCGAT G AATTT AAACCT CTTGT GGAAG AGCCT CAG AATTT AAT CAAAC AAAATT GT GAG

CTTTTT GAGC AGCTT GG AG AGT AC AAATTCCAG AAT GCGCT ATTAGTTCGTT AC ACC AAG A

AAGT ACC CC AAGT GT CAACT CC AACT CTTGT AG AGGT CT C AAG AAACCT AGG AAAAGTGG

GC AGC AAAT GTT GT AAAC ATCCT GAAGC AAAAAG AAT GCCCTGT GCAG AAG ACT AT CT AT

CCGTGGT CCT G AACCAGTT AT GT GT GTT GCAT G AG A AAACGCC AGT AAGT GAC AG AGT C AC

CAAATGCTGCAC AG AAT C CTTGGT GAAC AGGCG ACC ATGCTTTT CAGCT CT GGAAGT CGAT

G AAAC AT ACGTT CCC AAAG AGTTT AAT G CT G AAAC ATT C ACCTT CC AT GC AG AT AT AT G C A

CACTTTCT GAG AAGGAGAGAC AAAT C AAG AAAC AAACT GC ACTTGTT GAGCT CGT GAAAC

AC AAGCC CAAGGC AAC AAAAG AGC AACT GAAAGCT GTT AT GGAT GATTT CGC AGCTTTT GT

AGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAAC

TT GTT GCT GCAAGT C AAGCTGCCTT AGGCTT AT GA

53. SEQ ID NO: 25 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYLOOCP

FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPE

RNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR

YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKACAVARLSQR

FPKAEFAEYSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEK

SHCIAE VENDEMP ADLP S LAADFVE S KDV CKNY AE AKD VFLGMFLYE Y ARA

54. SEQ ID NO: 61 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 25)

CL_#1041_HSA-1_337_DSS_CH-A_W214C

GCC ACT AT GGCT GT GAT GGCCCCT AGGACCCT GGTGCTGCTGCT GT CCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GG AG AT GC AC ACAAG AGT GAGGTT GCT C AT CGGTTT A

AAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTT GGT GTTGATTGCCTTTGCT CAGTAT CTTCA

TGT GTTGCT GAT GAGT CAGCT GAAAATTGT GACAAAT CACTT CATACCCTTTTTGGAGACA

AATT AT GC AC AGTT GC AACT CTTCGT G AAACCT AT GGT G AAAT GGCT GACT GCT GT GC AAA

AC AAG AAC CT GAG AGAAAT G AAT GCTTCTT GCAAC AC AAAG AT GAC AACC C AAACCT CCC

CCG ATTGGT GAG ACC AG AGGTT GAT GT GAT GT GCACT GCTTTT CAT GAC AAT G AAG AG ACA

TTTTT GAAAAAAT ACTT AT AT G AAATT GCC AG AAGAC AT CCTT ACTTTTAT GCCCCGG AACT

CCTTTT CTTT GCT AAAAGGT AT AAAGCT GCTTTT AC AG AAT GTT GCC AAGCT GCT GAT AAAG

CT GCCTGCCT GTT GCC AAAGCT CG AT G AACTT CGGGAT G AAGGG AAGGCTT CGT CT GCCAA

ACAGAGACTCAAGTGT GCC AGT CT CC AAAAATTT GGAGAAAGAGCTTT CAAAGC AT GCGC

AGT AGCT CGCCT G AGCC AG AG ATTT CCC AAAGCT GAGTTTGC AG AAGTTT CCAAGTT AGT G

AC AG ATCTT ACC AAAGT CC AC ACGGAATGCT GCC AT GG AGAT CT GCTT GAAT GT GCT GAT G

ACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAA

GGAAT GCT GT G AAAAACCT CT GTT GGAAAAAT CCC ACT GC ATT GCCGAAGT GGAAAAT GA

T GAG AT GCCTGCT G ACTT GCCTT C ATTAGCT GCT GATTTT GTT GAAAGT AAGG AT GTTT GCA

AAAACT AT GCT G AGGC AAAGG AT GT CTTC CT GGGC AT GTTTTT GTAT GAATAT GC AAG AGC

ATGA

55. SEQ ID NO: 26 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGSCVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDE

FKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCK

HPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF

NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDK

ETCFAEEGKKLVAASQAALGL

56. SEQ ID NO 62: (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 26)

CL #1045 HSA-342 585 DSS CH-B V343C

GCCACTATGGCTGTGATGGCCCCTAGGACCCTGGTGCTGCTGCTGTCCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GG AT CTTGCGT GCTGCTGCT GAG ACTT GCC AAG AC AT

AT G AAAC C ACT CT AG AG AAGT GCT GT GCC GCT GC AG AT CCT C ATG AAT GCT AT GC C AAAGT

GTTCGAT GAATTT AAACCT CTTGT GGAAG AGCCT C AG AATTT AAT C AAAC AAAATT GT GAG _{CTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGA}

AAGT ACC CC AAGT GT CAACT CC AACT CTTGT AG AGGT CT C AAG AAACCT AGG AAAAGTGG

GC AGC AAAT GTT GT AAAC ATCCT GAAGC AAAAAG AAT GCCCTGT GCAG AAG ACT AT CT AT

CCGTGGT CCT G AACCAGTT AT GT GT GTT GCAT G AG AAAACGCC AGT AAGT GAC AG AGT C AC

CAAATGCTGCAC AG AAT C CTT GGT GAAC AGGCG ACC ATGCTTTT CAGCT CT GGAAGT CGAT

GAAAC AT ACGTT CCC AAAG AGTTT AATGCT GAAAC ATT C ACCTT CC AT GC AGAT AT AT GC A

CACTTTCT GAG AAGGAGAGAC AAAT C AAG AAAC AAACT GC ACTTGTT GAGCT CGT GAAAC

AC AAGCC CAAGGCAACAAAAG AGC AACT GAAAGCT GTT AT GGAT GATTT CGC AGCTTTT GT

AGAGA AGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAA A AAAC

TT GTT GCTGCAAGT C AAGCTGCCTT AGGCTT AT GA

57. SEQ ID NO: 27 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYLOOCP

FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPE

RNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR

YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQ

RFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLE

KSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYCRA

58. SEQ ID NO: 63 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 27)

CL_#1044_HSA-1_337_DSS_CH-A_A335C

GCC ACT ATGGCT GT GAT GGCCCCT AGG ACCCT GGTGCT GCT GCT GT CCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GG AG AT GC AC AC AAG AGT G AGGTT GCTC ATCGGTTT A

AAG ATTTGGGAG AAG AAAATTTCAAAGCCTT GGTGTT GATTGCCTTT GCT CAGT AT CTTCA

GC AGT GT CC ATTT GAAG AT CAT GT AAAATT AGT G AAT G AAGT AACT GAATTT GCAAAAACA

TGT GTTGCT GAT GAGT CAGCT GAAAATTGT GAC AAAT C ACTT CATACCCTTTTTGGAGACA

AATT AT GC AC AGTT GC AACT CTTCGT GAAACCT AT GGT G AAAT GGCT GACT GCT GTGC AAA

ACAAGAACCT GAG AG AAAT GAAT GCTT CTT GCAACACAAAGAT GAC AACCCAAACCTCCC

CCG ATTGGT GAG ACC AG AGGTT GAT GT GAT GT GCACT GCTTTT CAT GAC AAT G AAG AG ACA

TTTTT GAAAAAAT ACTT AT AT G AAATT GCC AG AAGAC AT CCTT ACTTTTAT GCCCCGG AACT

CCTTTT CTTT GCT AAAAGGT AT AAAGCT GCTTTT AC AG AAT GTT GCC AAGCT GCT GAT AAAG

CTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAA

ACAGAGACTCAAGTGT GCC AGT CT CCAAAAATTT GGAGAAAGAGCTTT CAAAGCAT GGGC

AGT AGCT CGCCT G AGCC AG AG ATTT CCC AAAGCT GAGTTTGC AG AAGTTT CCAAGTT AGT G

AC AG ATCTT ACC AAAGT CC AC ACGGAATGCT GCC AT GG AGAT CT GCTT GAAT GT GCT GAT G

ACAGGGCGG ACCTT GCC AAGT AT AT CT GT GAAAAT C AAG ATT CGAT CTCC AGT AAACT GAA

GGAAT GCTGT G AAAAACCT CT GTT GGAAAAAT CCC ACT GC ATT GCCGAAGT GGAAAAT GA

T GAG AT GCCTGCT G ACTT GCCTT C ATTAGCT GCT GATTTT GTT GAAAGT AAGG AT GTTT GCA

AAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATTGCAGAGC

ATG A

59. SEQ ID NO: 28 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGSWLCLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKYFDE

FKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCK

HPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF

NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDK

ETCFAEEGKKLVAASQAALGL

60. SEQ ID NO: 64 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 28)

CL_#1046_HSA-342_585_DSS_CH-B_L346C

GCC ACT AT GGCT GT GAT GGCCCCT AGGACCCT GGTGCTGCTGCT GT CCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GG AT CT GT CGT GCTGTGCCT GAG ACTT GCC AAG AC AT

AT G AAAC C ACTCT AG AG AAGT GCTGTGCCGCT GC AG AT CCTC ATG AAT GCT ATGC C AAAGT

G CTTTTT CT GTAGTA GGACAATGTTC ATTAGAGCACGT CATGTTGATC GAGAAAATGT ACCGACGCTA CA ATGG ACAGTCTTTA ATATTACG ATATCAGCT ATAAACAATCTC GATA GGAAG

AAGT ACC CC AAGT GT CAACT CC AACT CTTGT AG AGGT CT C AAG AAACCT AGG AAAAGTGG

GC AGC AAAT GTT GT AAAC ATCCT GAAGC AAAAAG AAT GCCCTGT GCAG AAG ACT AT CT AT

CCGTGGT CCT G AACCAGTT AT GT GT GTT GCAT G AG AAAACGCC AGT AAGT GAC AG AGT C AC

CAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGAT

GAAAC AT ACGTT CCC AAAG AGTTT AATGCT GAAAC ATT C ACCTT CC AT GC AGAT AT AT GC A

CACTTTCT GAG AAGGAGAGAC AAAT C AAG AAAC AAACT GC ACTTGTT GAGCT CGT GAAAC

AC AAGCC CAAGGCAACAAAAG AGC AACT GAAAGCT GTT AT GGAT GATTT CGC AGCTTTT GT

AG AG AAGT GCT GC AAGGCT GAC GAT AAGG AGACCT GCTTT GCCGAGG AGGGT AAAAAACT

TGTT GCT GCAAGTC AAGCT GCCTT AGGCTT AT G A

61. SEQ ID NO: 29 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYLOOCP

FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPE

RNECFLQHBCDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR

YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRE)EGKASSAKQRCKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQ

RFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLE

KSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEABCDVFLGMFLYEYARA

62. SEQ ID NO: 65 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 29)

CL_#1040_HSA-1_337_DSS_CH-A_L198C

GCC ACT AT GGCT GT GAT GGCCCCT AGGACCCT GGTGCTGCTGCT GT CCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AGACCT GGGCT GG AG AT GC AC ACAAG AGT GAGGTT GCT C AT CGGTTT A

AAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTT GGT GTTGATTGCCTTTGCT CAGTAT CTTCA

GCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACA

TGT GTTGCT GAT GAGT CAGCT GAAAATTGT GAC AAAT CACTT CATACCCTTTTTGGAGACA

AATT AT GC AC AGTT GC AACT CTTCGT GAAACCT AT GGT G AAAT GGCT GACT GCT GT GC AAA

AC AAG AAC CTGAGAG AAAT G AAT GCTTCTT GC AAC AC AAAG AT GAC AACC C AAAC CT C CC

CCG ATTGGT GAG ACC AG AGGTT GAT GT GAT GT GCACT GCTTTT CAT GAC AAT G AAG AG ACA

TTTTT GAAAAAAT ACTT AT AT G AAATT GCC AG AAGAC AT CCTT ACTTTTAT GCCCCGG AACT

CCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAG

CT GCCT GCCT GTT GCC AAAGCT CG AT G AACTT CGGGAT G AAGGG AAGGCTT CGT CT GCCAA

ACAGAGAT GCAAGT GT GCCAGT CT CCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTT CAAAGCAT GGGC

AGT AGCT CGCCT G AGCC AG AG ATTT CCC AAAGCT GAGTTTGC AG AAGTTT CCAAGTT AGT G

AC AG ATCTT ACC AAAGT CC AC ACGGAATGCT GCC AT GG AGAT CT GCTT GAAT GT GCT GAT G

ACAGGGCGG ACCTT GCC AAGT AT AT CT GT GAAAAT C AAG ATT CGAT CTCC AGT AAACT GAA

GGAAT GCTGT G AAAAACCT CT GTT GGAAAAAT CCC ACT GC ATT GCCGAAGT GGAAAAT GA

T GAG AT GCCTGCT G ACTT GCCTT C ATTAGCT GCT GATTTT GTT GAAAGT AAGG AT GTTT GCA

AAAACTAT GCT GAGGCAAAGGAT GT CTTCCT GGGCAT GTTTTTGTAT GAATAT GCAAGAGC

ATG A

63. SEQ ID NO: 30 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDE

FKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCK

HPEAKRMPCAEDYLSCVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF

NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDK

ETCFAEEGKKLVAASQAALGL

64. SEQ ID NO: 66 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 30)

CL_#1048_HSA-342_585_DSS_CH-B_V455C

GCCACT AT GGCT GT GAT GGCCCCT AGGACCCT GGT GCT GCT GCT GT CCGGAGCT

CTGGCT CTGACTC AGACCT GGGCT GG AT CT GT CGTGCT GCT GCT GAGACTT GCC AAG AC AT

AT G AAAC C ACT CT AG AG AAGT GCT GT GCC GCT GC AG AT CCT C ATG AAT GCT AT GCC AAAGT

G CTTTTTCTGTAGTA GGACAATGTTC ATTAGAGCACGT CATGTTGATC GAGAAAATGT ACCGACGCTA CA ATGG ACAGTCTTTA ATATTA CG ATATCAGCT ATAAACAATCTC GATA GG AAG

AAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGG

GC AGC AAAT GTT GT AAAC ATCCT GAAGC AAAAAG AAT GCCCTGT GCAG AAG ACT AT CT AT

CCT GCGT CCT G AACC AGTT AT GT GT GTT GCAT G AG AAAACGCC AGTAAGT GAC AG AGT CAC

CAAATGCTGCAC AG AAT C CTTGGT GAAC AGGCG ACC ATGCTTTT CAGCT CT GGAAGT CGAT

GAAAC AT ACGTT CCC AAAG AGTTT AATGCT GAAAC ATT C ACCTT CC AT GC AGAT AT AT GC A

CACTTTCT GAG AAGG AG AG AC AAAT C AAG AAAC AAACT GC ACTTGTT GAGCT CGT G AAAC

AC AAGCC C AAGGC AAC AAAAG AGC AACT GAAAGCT GTT AT GGAT GATTT CGC AGCTTTT GT

AGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACT

TGTT GCT GCAAGTC AAGCT GCCTT AGGCTT AT G A

65. SEQ ID NO: 31 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYLOOCP

FEDHYKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPE

RNECFLQHKDDNPNLPRLYRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR

YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQBCFGERAFBCAWAVCRLSQR

FPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECAE)DRAE>LAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEK

SHCIAEY

66. SEQ ID NO: 67 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 31)

CL #1051 HSA-1 293 CH-A A217C

GCCACTATGGCTGTGATGGCCCCTAGGACCCTGGTGCTGCTGCTGTCCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCTGG AG AT GC AC ACAAG AGT GAGGTT GCT C AT CGGTTT A

AAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTT GGT GTTGATTGCCTTTGCT CAGTAT CTTCA

GC AGT GT CC ATTT GAAG AT C AT GT AAAATT AGT G AAT G AAGT AACT G AATTT GC AAAAACA

TGT GTTGCT GAT GAGT CAGCT GAAAATTGT GACAAAT CACTT CATACCCTTTTTGGAGACA

AATT AT GC AC AGTT GC AACT CTTCGT GAAACCT AT GGT G AAAT GGCT GACT GCT GT GC AAA

AC AAG AAC CT GAG AGAAAT G AAT GCTTCTT GCAAC AC AAAG AT GAC AACC C AAACCT CCC

CCG ATTGGT GAG ACC AG AGGTT GAT GT GAT GT GCACT GCTTTT CAT GAC AAT G AAG AG ACA

TTTTT GAAAAAAT ACTT AT AT G AAATT GCC AG AAGAC AT CCTT ACTTTTAT GCCCCGG AACT

CCTTTTCTTTGCT AAAAGGT AT AAAGCT GCTTTT AC AG AAT GTT GCC AAGCT GCT GAT AAAG

CT GCCT GCCT GTT GCC AAAGCT CG AT G AACTT CGGGAT G AAGGG AAGGCTT CGT CT GCCAA

ACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGC

AGT AT GCCGCCTGAGCC AGAGATTT CCCAAAGCT GAGTTTGCAGAAGTTT CCAAGTTAGT G

AC AG AT CTT ACC AAAGT CC AC ACGGAATGCT GCC AT GG AGAT CT GCTT GAAT GT GCT GAT G

ACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAA

GGAAT GCTGT G AAAAACCT CT GTT GGAAAAAT CCC ACT GC ATT GCCGAAGT GT GA

67. SEQ ID NO: 32 (Secuencia de Señal subrayada)

ATM AYM APRTLVLLLS GAL ALT OT WAGS LAADFVE S KD V CKNY AE AKD VFLGMFLYE Y CRR

HPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE

YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCV

LHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQT

ALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

68. SEQ ID NO: 68 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 32)

CL_#1053_HSA-304_585_CH-B_A335C

GCCACTATGGCTGTGATGGCCCCTAGGACCCTGGTGCTGCTGCTGTCCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GGAT C ATT AGCT GCT GATTTTGTT GAAAGT AAGG AT G

TTT GCAAAAACT AT GCT GAGGC AAAGG AT GT CTTCCT GGGCAT GTTTTT GT AT GAAT ATT GC

AGAAGGC AT CCT G ATT ACT CT GT CGT GCTGCTGCT GAG ACTT GCCAAG AC AT AT G AAACC A

CT CT AG AG AAGT GCT GT GCCGCT GC AG AT CCT CAT GAAT GCT AT GCC AAAGT GTTCGAT GA

ATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAG

CAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAAT GCGCTATTAGTT CGTTACACC AAGAAAGT ACCCC

AAGT GT C AACTCC AACT CTT GT AG AGGT CT C AAG AAACCT AGG AAAAGT GGGC AGC AAAT

GTT GT AAACATCCT GAAGCAAAAAGAAT GCCCT GT GCAGAAGACTAT CT ATCCGT GGTCCT

GAACC AGTT AT GT GT GTT GCAT G AG AAAACGCC AGT AAGT GACAGAGT C ACC AAAT GCTG

CACAGAAT CCTT GGT GAACAGGCGACCAT GCTTTT CAGCT CT GGAAGT CGAT GAAACATAC

GTT CCCAAAG AGTTT AAT GCT GAAAC ATTCACCTT CCAT GC AG AT AT AT GC AC ACTTT CT GA

GAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAA

GGC AAC AAAAG AGCAACT GAAAGCT GTT AT GGAT G ATTT CGCAGCTTTT GT AG AG AAGT G

CT GCAAGGCT G ACG AT AAGG AG ACCT GCTTTGCCGAGG AGGGT A AAAAACTT GTT GCTGC

AAGT C AAG CTGCCTTAGGCTT AT G A

69. SEQ ID NO: 33 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYLOOCP

FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPE

RNECFLQHKDDNPNLPRLYRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR

YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVCRLSQR

FPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEK

SHCIAEV

70. SEQ ID NO: 69 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 33) CL_#1051_HSA-1_293_CH-A_A217C

GCC ACT ATGGCT GT GAT GGCCCCT AGG ACCCT GGTGCT GCT GCT GT CCGGAGCT

CT GGCT CT GACT C AG ACCT GGGCT GG AG AT GC AC AC AAG AGT G AGGTT GCT C AT CGGTTT A

AAG ATTTGGGAG AAG AAAATTTC AAAGCCTT GGTGTT GATTGCCTTTGCT CAGT AT CTT CA

GC AGT GT CC ATTT GAAG AT CAT GT AAAATT AGT G AAT G AAGT AACT G AATTT GC AAAAACA

TGT GTTGCT GAT GAGT CAGCT GAAAATTGT GAC AAAT C ACTT CATACCCTTTTTGGAGACA

AATT AT GC AC AGTT GC AACT CTTCGT GAAACCT AT GGT G AAAT GGCT GACT GCT GT GC AAA

AC AAG AAC CT GAG AGAAAT G AAT GCTTCTT GCAAC AC AAAG AT GAC AACC C AAACCT CCC

CCG ATTGGT GAGACCAG AGGTT GAT GT GAT GT GCACT GCTTTT CAT GAC AAT G AAG AG ACA

TTTTT GAAAAAAT ACTT AT AT G AAATT GCC AG AAGAC AT CCTT ACTTTTAT GCCCCGG AACT

CCTTTTCTTTGCT AAA AGGT AT A A AGCTGCTTTT ACAGA ATGTTGCCAAGCTGCTGAT AAAG

CT GCCT GCCT GTT GCC AAAGCT CG AT G AACTT CGGGAT G AAGGG AAGGCTT CGT CT GCCAA

AC AGAGACTC AAGTGT GCC AGT CTCC AAAAATTT GGAGAAAGAGCTTT CAAAGC AT GGGC

AGT AT GCCGCCTGAGCC AGAGATTT CCCAAAGCT GAGTTTGCAGAAGTTT CCAAGTTAGT G

AC AG ATCTT ACC AAAGT CC AC ACGGAATGCT GCC AT GG AGAT CT GCTT GA AT GT GCT GAT G

AC AGGGCGG ACCTT GCC AAGT AT AT CT GT GAAAAT C AAG ATT CGAT CTCC AGT AAACT GAA

GGAAT GCT GT GAAAAACCT CT GTT GGAAAAATCCC ACT GC ATTGCCG AAGT GT G A

71. SEQ ID NO: 34 (Secuencia de Señal subrayada)

ATM AYM APRTLVLLLS GAL ALT OT WAGS LAADFVE S KD VCKNY AE AKD VFLGMF CYE Y ARR

HPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE

YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCV

LHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQT

ALVELVKHKPKATKEQLBvAYMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

72. SEQ ID NO: 70 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 34)

CL_#1052_HSA-304_585_CH-B_L331C

GCC ACT AT GGCT GT GAT GGCCCCT AGG ACCCT GGTGCT GCTGCT GT CCGGAGCT

CT GGCT CT GACT CAG ACCT GGGCT GG AT C ATT AGCT GCT GATTTTGTT GAAAGT AAGG AT G

TTT GCAAAAACT AT GCT GAGGC AAAGG AT GT CTTCCT GGGCAT GTTTT GCT AT GAAT AT GC

AAG AAGGCAT CCT G ATT ACT CT GT CGTGCTGCTGCT GAG ACTT GCC AAG AC AT AT G AAACC

ACT CT AG AG AAGT GCT GT GCCGCT GC AG AT CCT CAT GAAT GCT AT GCC AAAGT GTT CGAT G

AATTT AAACCT CTT GT GGAAG AGCCT CAG AATTT AAT CAAAC AAAATT GT G AGCTTTTTGA

GC AGCTTGGAG AGT AC AAATTCC AG AAT GCGCT ATT AGTT CGTT AC ACC AAG AAAGT ACCC

CAAGT GT CAACT CC AACT CTT GT AG AGGT CT CAAG AAACCT AGG AAAAGT GGGC AGC AAA

T GTT GT AAAC ATCCT G AAGC AAAAAG AAT GC CCT GT GC AG AAG ACT AT CT AT CCGT GGT CC

T GAACC AGTT AT GT GT GTT GCAT GAG AAAACGCC AGT AAGT G AC AG AGT C ACC AAATGCT

GC ACAG AAT CCTT GGT G AACAGGCG ACC AT GCTTTT CAGCT CT GG AAGT CGAT G AAAC AT A

CGTT CCC AAAG AGTTT AAT GCT G AAAC ATT CACCTT CC AT GC AG AT AT ATGC AC ACTTT CT G

AG AAGG AGAGAC AAAT CAAGAAACAAACTGCACTT GTTGAGCT CGT GAAACACAAGCCCA

AGGC AAC AAAAG AGC AACT GAAAGCT GTT AT GG AT GATTT CGCAGCTTTT GT AG AG AAGT

GCT GC AAGGCT G ACG AT AAGG AG ACCT GCTTTGCCGAGG AGGGT AAAAAACTT GTTGCTG

CAAGT C AAGCT GCCTT AGGCTT AT G A

73. SEQ ID NO: 35 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYLOOCP

FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPE

RNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR

YKAAFTECCQAADKAACLLPBCLDELRDEGKASSAKQRCKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQ

RFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLE

KSHCIAEV

74. SEQ ID NO: 71 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 35)

CL_#1050_HSA-1_293_CH-A_L198C

GCCACTATGGCTGTGATGGCCCCTAGGACCCTGGTGCTGCTGCTGTCCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GG AG AT GC AC ACAAG AGT GAGGTT GCT C AT CGGTTT A

AAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTT GGT GTTGATTGCCTTTGCT CAGTAT CTTCA

TGT GTTGCT GAT GAGT CAGCT GAAAATTGT GACAAAT CACTT CATACCCTTTTTGGAGACA

AATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAA

AC AAG AAC CT GAG AGAAAT G AAT GCTTCTT GCAAC AC AAAG AT GAC AACC C AAACCT CCC

CCG ATTGGT GAG ACC AG AGGTT GAT GT GAT GT GCACT GCTTTT CAT GAC AAT G AAG AG ACA

TTTTT GAAAAAAT ACTT AT AT G AAATT GCC AG AAGAC AT CCTT ACTTTTAT GCCCCGG AACT

CCTTTT C.TTT GCT AAAAGGT AT AAAGCT GCTTTT AC AG AAT GTT GCCAAGCT GCT GAT AAAG

CTGCCTGCCTGTT GCC AAAGCT CG AT G AACTT CGGGAT G AAGGG AAGGCTT CGT CT GCCAA

ACAGAGAT GCAAGT GT GCCAGT CT CCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTT CAAAGCAT GGGC

AGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTG

AC AG ATCTT ACC AAAGT CC AC ACGGAATGCT GCC AT GG AGAT CT GCTT GAAT GT GCT GAT G

AC AGGGCGG ACCTT GCC AAGT AT AT CT GT GAAAAT C AAG ATT CGAT CTCC AGT AAACT GAA

GGAAT GCT GT GAAAAACCT CT GTT GGAAAAAT CCC ACT GC ATT GCCG AAGT GT GA

75. SEQ ID NO: 36 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTTATIYSGAEAETOTWAGSTAADFVESKDVCKNYAFAKDVFEGMFFYEYARR

HPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE

YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLCQLCV

LHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQT

ALYELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFYEKCCKADDKETCFAEEGKXLYAASQAALGL

76. SEQ ID NO: 72 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 36)

CL #1055 HSA-304 585 CH-B N458C

GCCACTATGGCTGTGATGGCCCCTAGGACCCTGGTGCTGCTGCTGTCCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GGAT C ATT AGCT GCT GATTTTGTT GAAAGT AAGG AT G

TTT GCAAAAACT ATGCT GAGGC AAAGG AT GTCTTCCT GGGCAT GTTTTT GT AT GAAT AT GC

AAG AAGGC AT CCT G ATT ACT CT GT CGT GCTGCTGCT GAG ACTT GCC AAG AC AT AT G AAACC

ACT CT AG AG AAGT GCTGT GCCGCT GC AG AT CCT CAT GAAT GCT AT GCC AAAGT GTT CG AT G

AATTT AAACCT CTT GT GGAAGAGCCT CAGAATTTAAT CAAACAAAATT GT GAGCTTTTTGA

GCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCC

C AAGT GT CAACT CC AACT CTT GT AG AGGT CT CAAG AAACCT AGG AAAAGT GGGC AGC AAA

T GTT GT AAACAT CCT G AAGC AAAAAG AAT GCCCTGT GC AG AAG ACT AT CT AT CCGT GGT CC

T GT GC C AGTT AT GT GT GTT GCAT G AG AAAACGCC AGT AAGT G AC AGAGT C AC C AAATGCT G

CACAGAAT CCTT GGT GAACAGGCGACCAT GCTTTT CAGCT CT GGAAGTCGAT GAAACATAC

GTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGA

GAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAA

GGC AAC AAAAG AGCAACT GAAAGCT GTT AT GGAT G ATTT CGCAGCTTTT GT AG AG AAGT G

CTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGC

AAGT CAAG CTGCCTTAGGCTT AT G A

77. SEQ ID NO: 37 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYLOOCP

FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPE

RNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR

YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELREIEGKASSCKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQR

FPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECAE)DRAE)LAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEK

SHCIAEY

78. SEQ ID NO: 73 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 37)

CL_#1049_HSA-1_293_CH-A_A194C

GCCACTATGGCTGTGATGGCCCCTAGGACCCTGGTGCTGCTGCTGTCCGGAGCT

CTGGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GG AG AT GC AC ACAAG AGT GAGGTT GCT CAT CGGTTT A

AAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTT GGT GTTGATTGCCTTTGCT CAGTAT CTTCA

GC AGT GT CC ATTT GAAG AT CAT GT AAAATT AGT GAAT G AAGT AACT G AATTT GCAAAAACA

TGT GTTGCT GAT GAGT CAGCT GAAAATTGT GACAAAT CACTT CATACCCTTTTTGGAGACA

AATT AT GC AC AGTT GC AACT CTTCGT GAAACCT AT GGT G AAAT GGCT GACT GCT GT GC AAA

ACAAG AAC CT GAG AGAAAT GAAT GCTTCTT GCAAC AC AAAG AT GAC AACC C AAACCT CCC

CCG ATTGGT GAG ACC AG AGGTT GAT GT GAT GT GCACT GCTTTT CAT GAC AAT G AAG AG ACA

TTTTT GAAAAAAT ACTT AT AT G AAATT GCC AG AAGAC AT CCTT ACTTTTAT GCCCCGG AACT

CCTTTTCTTTGCT AAAAGGT AT AAAGCT GCTTTT AC AG AAT GTT GCC AAGCT GCT GAT AAAG

CT GCCT GCCT GTT GCC AAAGCT CG AT G AACTT CGGGAT G AAGGG AAGGCTT CGT CTT GC AA

ACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGC

AGT AGCT CGCCT G AGCC AG AG ATTT CCC AAAGCT GAGTTTGC AG AAGTTT CCAAGTT AGT G

AC AGGGCGG ACCTT GCC AAGT AT AT CT GT GAAAAT CAAG ATT CGAT CT CC AGT AAACT GAA

GGAAT GCTGT G AAAAACCT CT GTT GGAAAAAT CCC ACT GC ATT GCCGAAGT GT GA

79. SEQ ID NO: 38 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTEVEEESGAEAETOTWAGSEAADEVESKDVCKNYAEAKDVFEGMFEYEYARR

HPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE

YKFQNALLVRYTKXVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSCVLNQLCV

LHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQT

ALYELVKHBCPKATKEQLKAVMDDFAAFYEKCCKADDKETCFAEEGKKLYAASQAALGL

80. SEQ ID NO: 74 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 38)

CL_#1054_HSA-304_585_CH-B_V455C

GCC ACT AT GGCT GT GAT GGCCCCT AGG ACCCT GGTGCT GCTGCT GT CCGGAGCT

CT GGCT CT GACT CAG ACCT GGGCT GG AT C ATT AGCT GCT GATTTTGTT G AAAGT AAGG AT G

TTT GCAAAAACT AT GCT GAGGC AAAGG AT GT CTTCCT GGGCAT GTTTTT GT AT GAAT AT GC

AAG AAGGCAT CCT G ATT ACT CT GT CGT GCTGCTGCT GAG ACTT GCC AAG AC AT AT G AAACC

AATTT AAACCT CTT GT GGAAG AGCCT C AG AATTT AAT C AAAC AAAATT GT G AGCTTTTTGA

GC AGCTTGGAG AGT AC AAATTCC AG AAT GCGCT ATT AGTT CGTT ACACC AAG AAAGT ACCC

CAAGT GT CAACT CCAACT CTT GT AG AGGT CT CAAG AAACCT AGG AAAAGT GGGC AGC AAA

T GTT GT AAAC ATCCT G AAGC AAAAAG AAT GC CCT GT GC AG AAG ACT AT CT AT CCT GCGTCC

T GAACC AGTT AT GT GT GTT GCAT GAG AAAACGCC AGT AAGT G AC AG AGT C ACC AAATGCT

GC ACAG AAT CCTT GGT G AACAGGCG ACC AT GCTTTT CAGCT CT GG AAGT CGAT G AAAC AT A

CGTT CCC AAAG AGTTT AAT GCT G AAAC ATT CACCTT CC AT GC AG AT AT AT GC AC ACTTT CT G

AGAAGGAGAGAC AAAT CAAGAAACAAACTGCACTT GTTGAGCT CGT GAAACACAAGCCCA

AGGC AAC AAAAG AGC AACT GAAAGCT GTT AT GG AT GATTT CGCAGCTTTT GT AG AG AAGT

GCT GC AAGGCT G ACG AT AAGG AG ACCT GCTTTGCCGAGG AGGGT AAAAAACTT GTTGCTG

CAAGT C AAGCT GCCTT AGGCTT AT G A

81. SEQ ID NO: 39 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYLOOCP

FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPE

RNECFLQHBCDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR

YKAAFTECCQAAE)KAACLLPKLDELRE)EGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQ

RFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLE

KSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEABCDVFLGMFLYEYARRHPGGGGS

82. SEQ ID NO: 75 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 39).

GCC ACT ATGGCT GT GAT GGC ACCT AG AAC ACT GGTCCT GCTGCT GT C AGGGGC A

CT GGC ACT GACT CAG ACTT GGGCT GGAG AT GCT CAT AAG AGCG AGGT CGCT C AC AGGTT C

AAGGAT CTGGGGGAGGAAAACTTTAAAGCCCT GGT GCTGAT CGCATT CGCCCAGT ACCT G

CAGCAGT GCCCCTTT GAGGACCACGT GAAGCTGGT CAACGAGGT GACAGAGTTCGCCAAA

ACTT GCGT CGCCGACGAGT CAGCT GAAAATTGT GATAAGAGCCTGCATACT CT GTTT GGG

GAT AAACT GT GC ACCGT GGCC AC ACT G AGGG AG ACCT AT GGAG AAAT GGC AG ACT GCT GT

GCCAAGC AGGAGCCCGAACGCAACGAGTGCTT CCT GCAGCATAAAGACGAT AACCCCAAT

CTGCCT CG ACT GGTGCGGCCT GAAGTGG ACGT CAT GTGT ACCGCTTT CC ACG AT AAT GAG

GAAAC ATTT CT GAAG AAAT ACCT GT AT GAGATT GCCCGG AG AC AT CCTT ACTTTT AT GCT CC AG AACT GCTGTTCTTT GCAAAGCGGT AC AAAGCCGCTTT CACAG AGT GCT GT C AGGC A GCCG AT AAGGCT GC AT GC CTGCT GCC AAAACT GG ACG AGCT GCGCGAT G AAGGC AAGGCC AGCTCCGCT AAGC AGCG ACT GAAAT GTGCCTCTCT GCAG AAGTT CGGGG AGCGGGCTTTT AAAGCTT GGGCAGT CGCC AGACT GAGT CAGAGGTT CCCCAAGGCAGAGTTT GCCGAAGTC T CAAAGCT GGT GACT G ACCT G ACC AAAGT GC AC ACCG AGT GCTGT C AT GGAG ACCT GCT G GAAT GCGCCG ACG ATAG AGCT G AT CT GGCAAAGT AC AT CT GT G AGAAT C AGG AC AGC ATT T CT AGT AAGCT G AAAG AGT GCT GT GAAAAGCCT CT GCT GG AG AAAT CCC ACT GC AT CGC A GAGGT GGAAAACGACGAAAT GCCAGCAGAT CTGCC ATCCCT GGCAGCT GACTTT GT CGAG TCTAAGGATGTGTGTAAAAATTATGCTGAAGCAAAGGATGTGTTCCTGGGCATGTTTCTG T ACGAGT AT GCAAGGCG AC AT CC AGG AGG AGG AGGCT CCT G A

ID NO: 40 (Secuencia de Señal subrayada) ATMAVMAPRTEVEEESGAEAETOTWAGGGGGSDYSWEEEREAKTYETTEEKCCAAADPFtE CYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLG KVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEV DETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVE KCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

ID NO: 76 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 40).

GCCACT AT GGCT GT GAT GGCACCT AGAACCCT GGTCCT GCT GCT GAGCGGCGCA CT GGCACT GACACAGACTT GGGCT GGGGGGGGGGGGGGGAGCGACT ACT CCGT GGT CCTG CTGCTGCGGCTGGCAAAAACTTATGAGACCACACTGGAAAAGTGCTGTGCCGCTGCAGAC CCT C ACGAGT GCTACGCCAAAGT GTTCGAT GAGTT C AAGCCCCTGGTCGAGGAACCT CAG AACCT GAT C AAACAGAATT GT GAGCT GTT CGAACAGCT GGGGGAGT ACAAGTTT CAGAAC GCCCT GCT GGT GCGGT AT AC AAAG AAAGT GCC AC AGGT CTCT ACT CCC AC CCT GGT GGAG GTCAGTAGGAATCTGGGCAAAGTGGGGTCAAAATGCTGTAAGCACCCTGAGGCCAAGCGC ATGCC ATGCGCTGA AGACT ACCTGTCTGTGGTCCTGA ACC AGCTGTGTGTGCTGCATGAG AAAACCC C AGT GAGT G ATCG AGT C ACC AAGT GCT GT AC AG AG AGCCT GGT G AACCGG AGA CCCT GCTT CTCCGCTCT GG AGGT GGACG AAAC AT AT GT CCCT AAGG AGTTT AAT GC AG AA AC ATT C ACTTTT CACGCCG AT AT CT GT ACT CT GT CCGAGAAGG AAAG ACAG ATT AAG AAA CAGACCGCCCT GGT GGAGCT GGT CAAGCAT AAACCCAAGGCTAC AAAAGAAC AGCT GAAG

GCAGT GAT GGACG ATTT CGCCGCTTTTGT GGAG AAAT GCT GTAAGGCCGACGATAAGGAA ACTT GCTTCGCT GAGGAAGGAAAGAAACT GGT GGCAGCCAGCCAGGCT GCACTGGGCCT G TGA

ID NO: 41 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYLOOCP FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPE RNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRE>EGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQ RFPKAEFAEVSBCLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLE KSHCIAEVENDEMPAGGGGS

ID NO: 77 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 41).

GCC ACT ATGGCCGT G AT GGC ACCT AG AAC ACT GGTCCTGCTGCT G AGCGGGGC A CT GGC ACT G AC AC AG ACTTGGGCT GG AGACGC AC AC AAAT CT GAGGT CGCT C AC CGGTTC AAGGATCTGGGCGAGGAAAACTTTAAAGCCCT GGT GCTGATCGCCTTCGCT CAGTACCT G CAGC AGT GCCCTTTT GAGGACC ACGT GAAGCT GGT CAACG AGGT GAC AG AGTTCGCC AAA ACTTGCGTCGCAGACGAGTCAGCCGAAAATTGTGATAAGAGCCTGCATACTCTGTTTGGG GATAAACTGTGTACCGTGGCCACACTGCGCGAGACCTATGGAGAAATGGCTGACTGCTGT GCAAAGCAGGAGCCCGAACGAAACGAGTGCTTCCTGCAGCATAAAGACGATAACCCCAAT CT GCCT AGGCT GGT GCGCCCT GAAGT GG ACGT CAT GT GT ACCGCTTT CC ACGAT AAT G AG GAAAC ATTT CT GAAG AAAT ACCT GT AT GAGATT GCCCGG AGAC AT CC AT ACTTTT ATGCC CCCG AACT GCT GTT CTTT GCT AAG AGAT AC AAAGCCGCTTT CAC AG AGT GCT GT C AGGCA GCCG AT AAGGCT GC AT GC CT GCT GCC AAAACT GG ACGAGCT G AGAGAT G AAGGC AAGGCA AGCTCCGCCAAGCAG AGGCT GAAAT GT GCAAGCCT GCAGAAGTT CGGGGAGAGGGCCTTT AAAGCAT GGGCAGT CGCTCGACT GT CCCAGCGATTCCCC AAGGCTGAGTTT GCAGAAGT C TCT AAGCT GGT G ACT GAT CT GACC AAAGTGC AC AC CG AGT GCTGT CAT GGCG ACCT GCT G GAAT GCGCCG ACGAT CGCGCCG AT CT GGCT AAGT AT AT CT GT GAG AACC AGG AC AGT ATT T CT AGT AAGCT G AAAG AGT GCT GT GAAAAGCCT CT GCT GG AG AAATC AC ACTGC AT CGCT GAGGTGGAAAATGACGAAATGCCAGCAGGCGGGGGAGGCTCCTGA

ID NO: 42 (Secuencia de Señal subrayada) ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGGGGGSDLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVF LGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQN LIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRM PCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAET FTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPBCATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKET CFAEEGKKLVAASQAALGL

ID NO: 78 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 42).

GCCACTATGGCCGTGATGGCACCTAGAACCCTGGTCCTGCTGCTGAGCGGGGCA

CT GGCACT GACACAGACTTGGGCT GGGGGGGGGGGGGGCAGCGACCTGCCATCCCT GGCA GCTGACTTCGTGGAGTCAAAAGATGTCTGCAAGAACTACGCAGAAGCCAAGGACGTGTTC CTGGGGATGTTTCTGTACGAGTATGCTCGGAGACACCCAGATTACAGCGTGGTCCTGCTG CT GCGCCT GGCCAAAACTTAT GAGACC AC ACT GGAAAAGT GCT GT GCAGCCGCT GACCCC CAT G AGT GCT AT GCC AAAGT GTTCGAT G AGTT CAAGCCCCT GGT CG AGG AACCT C AG AAC CT GAT CAAACAGAATT GT GAGCT GTT CGAACAGCT GGGCGAGT ACAAGTTT CAGAACGCC CT GCT GGT GCGAT AT ACAAAG AAAGT GCC AC AGGT CT CT ACTCCC ACCCT GGT GG AGGT C AGT CGAAAT CT GGGCAAAGT GGGGT CAAAAT GCT GTAAGCACCCTGAGGCT AAGCGGAT G CC ATGCGC AG AAGACT ACCT GT CT GT GGT CCT GAAT C AGCT GT GT GT GCT GCAT GAG AAA ACCCCTGTGAGTGATAGAGTCACCAAGTGCTGTACAGAAAGCCTGGTGAACAGGCGACCA TGCTTCT CCGCACT GGAGGT GGACG AAAC AT AT GT CCCT AAAG AGTTT AAT GCCG AAACA TT CACTTTT CACGCT GAT AT CT GT ACT CT GT CCG AG AAGGAAAGGC AG ATT AAG AAACAG ACCGCCCT GGT GGAGCT GGTCAAGCAT AAACCAAAGGCAACAAAAGAAC AGCTGAAGGCC GT GAT GGACG ATTT CGC AGCCTTT GT GGAGAAAT GCT GT AAGGCT GACG AT AAGG AAACT T GTTTT GCAG AGG AAGG AAAG AAACT GGT GGCT GCAT CT C AGGCCGCT CTGGGCCT GT G A

ID NO: 43 (Secuencia de Señal subrayada) ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYL QQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADES AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCC AKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYA PELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAF KAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSI S SKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLP SLAADFVE SKDVCKNYAEAKD VFLGMFLYEY ARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAAGGGGS

ID NO: 79 Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 43

GCC ACT ATGGCT GT GAT GGCTC C AAG AACCCT GGTCCT GCT GCT GT CCGGGGC ACT GGCT C T GACT C AG AC AT GGGCT GGGG AT GCT C AT AAGT CT G AGGT CGCCCACCG ATT C AAGGAT CT GGGGG AGG AAAACTTT AAAGCT CT GGT GCT GAT CGC ATT C GCCCAGT ACCT GC AGC AGT GC CCCTTTGAGGACCACGTGAAGCTGGTCAACGAGGTGACCGAGTTCGCCAAAACATGCGTC GCCGACGAGTCAGCTGAAAATTGTGATAAGAGCCTGCATACACTGTTTGGGGATAAACTGT GC ACT GT GGCC ACCCT GCGGG AG ACTT AT GGAG AAAT GGC AGACT GCT GT GCC AAGC AGG AGCCCGAAAGAAACGAGTGCTT CCT GCAGCAT AAAGACGAT AACCCCAAT CT GCCT CGAC TGGT GCGGCCT GAAGT GG ACGT C AT GT GT ACT GCCTT CC ACG AT AAT G AGG AAACCTTT CT GAAGAA ATACCTGT ATGAGATTGCCCGGAGAC ATCCTT ACTTTTAT GCT CCAGAACTGCTGTTCTTTGCAAAGCGCTACAAAGCCGCTTTCACCGAGTGCTGTCAGGCAG CCG AT AAGGCT GC AT GCCTGCT GCC AAAACT GGACG AGCT GCGCG AT G AAGGCAAGGC CA GCT CCGCT AAGCAGCGACTGAAATGT GCC AGCCT GCAGAAGTTCGGGGAGAGGGCTTTTA AAGCTTGGGCAGTGGCCAGACTGAGTCAGAGGTTCCCCAAGGCAGAGTTTGCCGAAGTCT CAAAGCT GGT G ACAG ACCT GACT AAAGTGCAC AC AG AGT GCT GT CAT GGAG ACCT GCTGG AAT GCGCCGACGAT CGCGCT GAT CT GGCAAAGT ACAT CT GT GAGAAT CAGGACAGCATTTC T AGT AAGCT G AAAG AGT GCT GT G AAAAGCCT CTGCT GGAG AAAT CCC ACT GCAT CGC AG A GGT GGAAAACGACGAAATGCCAGCT GAT CT GCCCT CCCT GGCCGCTGACTTT GT CGAGT CT AAGGATGTGTGTAAAAATTATGCTGAAGCAAAGGATGTGTTCCTGGGCATGTTTCTGTACG AGTATGCCAGGCGCCATCCAGACTACTCTGTGGTCCTGCTGCTGAGACTGGCCAAG ACCT AT G AG ACC AC ACT GG AAAAAT GCTGT GCAGCCGCT GGC GGGGG AGGCAGTT GA

ID NO: 44 (Secuencia de Señal subrayada) ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGGGGGSDPHECYAKVFDEFKPLVEEPONLIKO NCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFH ADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAE EGKKLVAASQAALGL

ID NO: 80 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 44).

GCCACT AT GGCT GT GAT GGC ACCT AGAAC CCT GGTCCT GCT GCT GT CCGGGGCA

CT GGCACT GACT CAGACTT GGGCTGGGGGAGGCGGGGGCAGCGACCCT C ACGAGT GCTAC GC AAAAGT GTT CGAT GAGTTC AAGCCCCT GGT CGAGG AACCT C AGAACCT GAT C AAAC AG AATT GT GAGCT GTT CGAAC AGCT GGGGG AGT AC AAGTTT C AG AACGCT CTGCT GGT GCGG T AT ACC AAG AAAGT GCC AC AGGT C AGC ACCCCC AC ACT GGTGGAGGT CT CC AGG AAT CT G GGC AAAGT GGGGTCT AAAT GCT GT AAGC ACCCT G AGGC C AAGCGC AT GCC AT GCGCT GAA GACT ACCT G AGCGT GGT CCT G AACC AGCT GT GT GT GCT GCAT GAGAAAAC AC C AGT GT CC GATCGAGT CAC AAAGT GCT GTACT GAGAGT CT GGT GAACCGGAGACCCTGCTT CT CAGCC CT GGAGGT GGACG AAACTT AT GT CCCT AAGGAGTTT AAT GC AG AAACTTT C ACCTTT CAC GCCG AT ATCTGT ACCCT GT CT GAG AAGG AAAG AC AG ATT AAG AAAC AGAC AGC CCT GGTG GAGCT GGT C AAGC AT AAAC C C AAGGCT ACT AAAGAAC AGCT G AAGGC AGT GAT GG ACG AT TTCGCCGCTTTT GT CGAG AAAT GCT GT AAGGCCG ACG AT AAGG AAACCTGCTT CGCT GAG GAAGG AAAG AAACT GGT GGCAGCC AGCC AGGCT GC ACT GGGCCT GT G A

ID NO: 45 (Secuencia de Señal subrayada)

ATM AYM APRTLYLLLS G ALALT OT WAGD AHKS E Y AFIRFKDLGEENFKAL VLIAF AO YLO QCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCA KQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPE LLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKA WAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSK LKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVE SKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECY AKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLG KVGSKCCKHPGGGGS

ID NO: 81 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 45).

GCCACT AT GGCT GT GAT GGC ACCT CGC ACCCT GGTCCT GCT GCTGTCCGGGGCACT GGC ACT G ACT C AG ACTT GGGCT GGAGAT GCT CAT AAGT CT G AGGT CGCT CAC AGATT CAAGG AT CT GGGCGAGGAAAACTTTAAAGCACTGGT GCT GAT CGC ATT CGCCC AGT ACCT GCAG CAGT GCCCCTTTGAGG ACCACGT GAAGCT GGT CAACGAAGT GACTG AGTTCGCCAAA ACCTGCGT CGCCGACG AGT C AGCT GAAAATTGT GATAAGAGCCTGCAT ACCCT GTTT GG CG ATAAACT GT GCACAGT GGCC ACT CT GCGGGAG AC AT AT GGGGAAAT GGC AG ACTGC T GT GCCAAGC AGGAGCCT GAAAGAAACGAGT GCTT CCT GCAGC ATAAAG ACGAT AACC CCAAT CT GCCTCGACT GGT GCGGCCAGAAGT GGACGT CAT GT GT AC AGCCTTCCACGAT AATGAG GAAACTTTT CT GAAGAAAT ACCT GTAT G AGATT GCT CGGAGACATCCTTACTTTT AT GC T CCAGAACT GCT GTT CTTT GCAAAGAGGTACAAAGCCGCTTT CACCGAGT GCT GT C AGG CAGCCG AT AAGGCT GC AT GCCT GCT GCC AAAACT GGACGAGCT GCGCGAT GAAGGAAA GGCC AGCTCCGCT AAGC AGCG ACT G AAAT GT GCC AGCCT GC AGAAGTT CGGCG AGC G A GCTTTT AAAGCTT GGGCAGT GGCC AG ACT GT CCC AGAGGTT CCCCAAGGCAGAGTTTGCCGAAG TCTCTAAGCTGGTGACCGACCTGACAAAAGTGCACACCGAGTGCTGTCATGGGGACCT GCT GGAAT GCGCCG ACGAT CGCGCT GATCTGGCAAAGT AC AT CT GTGAGAAT CAGGAC AGT ATTT CTAGTAAGCT GAAAG AGT GCT GT GAAAAGCCT CT GCT GGAGAAAT CAC ACT

GCATCGCA GAGGT GGAAAACG ACGAAAT GCC AGC AG AT CTGCC ATCCCTGGC AGCT GACTTCGTCG AGT CT AAGG AT GT GT GT AAAAATTACGCT GAAGCAAAGG AT GT GTT CCT GGGG AT GTTT CTGT ACG AGT AT GCCAGGCGCC ACCCCGACT AC AGT GT GGT CCT GCT GCT GCGGCT GGC T AAG ACTT AT G AG ACC AC ACT GG AAAAAT GCTGT GCAGCCGCT GAT CCT CAT G AGT GCT ATGCC AAGGT CTT CGACG AGTT CAAGCCCCTGGT GGAGGAACCT C AGAACCT GATT AAGC AG A ATT GT GAGCT GTTT GAAC AGCT GGG AG AGT AC AAATT CC AG AACGCCCT GCT GGT G AG GTATACAAAGAAAGT GCC AC AGGT GAGT ACTCCCACCCT GGT GGAAGT CT C ACGCAAT T GGGGA AGGT CGG AAGC AAGT GCT GT AAAC ACC C AGGCGGGGG AGGCT CCT GA ID NO: 46 (Secuencia de Señal subrayada) ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGGGGGSEAKRMPCAEDYLSWLNOLCVLHEKT PVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQT ALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

ID NO: 82 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 46).

GCCACT AT GGCT GT GAT GGCACCT AGAAC ACT GGT CCT GCT GCT G AGCGGGGC A CTGGC ACT G AC AC AG ACTTGGGCT GG AGGGGGAGGGGGGT CT GAGGCC AAAAGG ATG CCA T GCGCT GAAG ACT ACCT G AGT GT GGTCCT GAACC AGCT GT GT GT GCT GC ACG AG AAAA CT CCCGT GT CAGAT CGCGT CACTAAGT GCT GT ACCG AGAGCCT GGT GAACCGG AG ACCCT GC TTCT CCGCCCTGG AGGTGGACGAAAC AT AT GT CCCT AAAGAGTTTAAT GCAGAAACCTT C ACATTTCACGCCGATATCTGTACACTGAGCGAGAAGGAACGACAGATTAAGAAACAGA CT GCCCT GGT GGAGCT GGT C AAGC AT AAACCC AAGGCT ACC AAAGAAC AGCTGAAGGC AG TG

AT GG ACG ATTT CGCCGCTTTT GT CGAGAAAT GCT GT AAGGCCG ACG AT AAGGAAAC AT GC T CGCT GAGGAAGGCAAGAAACT GGT GGCAGCCT CT C AGGCT GCACT GGGGCT GT GA

ID NO: 47 (Secuencia de Señal subrayada) ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYLO QCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETGGGGS

ID NO: 83 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 47).

GCCACT AT GGCT GT GAT GGCTCCAAGAAC ACT GGT CCT GCT GCT GTCCGGGGCACT GGC ACT G ACT C AG ACCT GGGCTGGGG AT GCT C AT AAAT CT GAGGT CGCT CACCGGTT CAAGG ACCTGGGGGAGGAAAACTTT AAAGC ACT GGT GCTGAT CGCCTTCGCT CAGT ACCT GCAG CAGT GCCCCTTT GAAG AT CACGTGAAGCTGGT CAACGAAGT GACT G AGTTCGCCAAAA CCT GCGT CGC AG ACGAG AGCGCCGAAAATTGT GAT AAGT CCCTGCAT ACACT GTTT GGC GACAAACT GT GT ACCGT GGCT AC ACT G AG AG AGACCGGCGGGGG AGGC AGCT G A

ID NO: 48 (Secuencia de Señal subrayada) ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGCjGGGSGEMADCCAKOEPERNECFLOHKDDNP NLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQA ADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEY SKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEV ENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKT YETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTK KVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRV TKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKH KPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

Q ID NO: 84 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 48).

GCCACT AT GGCT GT GAT GGCACCT AGAACCCT GGT CCT GCT GCT GAGCGGGGCA CT GGCACT GACACAG ACTTGGGCT GGGGGGGGGGGGGGCAGCGGCGAGAT GGCT G ACT GC T GT GCAAAAC AGG AGCC AGAAAGGAACGAAT GCTT CCT GC AGCACAAGG ACGAT AACC CC AAT CT GCCT AG ACT GGT GAGGCCCG AGGT GG ACGT C AT GT GT AC AGCCTT CC ACGAT AA T GAGGAAACTTTT CT GAAGAAATACCT GT AT GAG AT CGCCCGG AG AC ATCCTT ACTT CT A GC ACC AG AACT GCT GTT CTTT GCC AAACGCT AC AAGGCCGCTTTT ACCG AGT GCT GT C A G GC AGCCGAT AAAGCT GC AT GCCT GCT GCC AAAGCT GGACG AGCT GCGAGAT GAAGGG A AG GCT AGCT CCGC AAAAC AG AG ACT G AAGT GT GCT AGCCT GC AG AAATT CGG AG AGCG AG CC TTCAAGGCATGGGCAGTGGCTCGACTGTCCCAGCGATTCCCTAAGGCCGAGTTTGCTGA A GTGTCT AAACT GGT C ACCG ACCT G AC AAAGGT GCAC ACCG AGT GCT GT CAT GGCG ACCT G CT GGAAT GCGCCGACGAT CGCGC AG AT CT GGCCAAGT ACAT CT GTG AGAACC AGGAC A GC ATTT CT AGT AAGCT G AAAG AGT GCT GT G AAAAACCT CT GCT GGAG AAGT CC C ACT GC AT C GCCG AGGT GGAAAACGACGAAAT GCC AGCT GAT CT GCCCT CACT GGCCGCT GACTTT GT G GAGAGCAAAGAT GT CT GTAAGAATT ACGC AGAAGCCAAGG AT GT GTT CCT GGGCAT GT TT CT GT ACGAGT AT GCCAGGCGCCACCCT GACT ACTCCGT GGT CCTGCT GCT GAGGCT GGC T AAAACCT AT G AG ACC AC ACT GG AAAAGT GCT GT GCAGCCGCT GAT CC AC AT G AGT GCT AT GCCAAAGT GTT CGACGAGTTCAAGCCCCT GGT CGAGGAACCT CAGAACCT GAT CAAGC AG AATT GT GAGCT GTTCGAACAGCT GGGGGAGT ACAAGTTT CAGAACGCCCT GCT GGT GA GA TATACAAAGAAAGTGCCACAGGTCTCCACTCCCACCCTGGTGGAGGTCTCTAGGAATCT G GGCAAAGT GGGGAGT AAAT GCT GTAAGCACCCT G AGGCCAAGCGCAT GCCAT GCGCT G AA GATT ACCT GAGT GT GGT CCT GAAT C AGCT GT GT GT GCT GCAT GAG AAAAC ACCAGT GT C A GACCGGGT CACT AAGT GCT GT ACCGAAT CACT GGT GAACCGACG ACCAT GCTTC AGCG CA CT GG AGGT GG AT GAAACTT AT GTCCCT AAGG AGTTT AAT GCT G AAACATT CACTTTT C A C GC AG AC AT CT GC ACCCT GT CT GAG AAGG AAAG ACAG ATT AAG AAAC AG AC AGCCCT GG TG GAGCT GGT CAAGC AT AAAC CC AAGGCC ACT AA AG AAC AGCT G AAGGCT GT GAT GGACG AT TT CGCAGCCTTT GT CGAGAAAT GCT GTAAGGCAGACG AT AAGGAAACCT GCTTCGCCG AG GAAGGAAAG AAACT GGT GGCT GCAAGT C AGGCCGCT CT GGGCCT GT GA

Q ID NO: 49 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYLO

QCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCA

KQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPE

LLFFAKRYKAAFTECCQAGGGGS

Q ID NO: 85 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 49).

GCCACT AT GGCCGT G AT GGCACCT CGAAC ACT GGT CCT GCT GCT GTCCGGGGCA CT GGC ACT G ACT C AG ACCT GGGCT GG AG AT GCT C AT AAAT CT G AGGT CGCT C ACCGGTT C AAGG ACCT GGGCG AGGAAAACTTTAAAGC ACT GGT GCT GAT CGC ATT CGCCCAGT ACC TG CAGC AGT GCCCCTTT GAGG AT C ACGT G AAGCT GGT CAACG AAGT G ACT G AGTT CGC AA AA ACCTGCGT CGCT G ACGAGAGCGC AGAAAATT GT GAT AAGT CCCTGCAT ACCCT GTTT GG G GAC AAACT GT GT ACCGT GGCT AC ACT GC G AG AG AC AT AT GGAG AAAT GGCCG ATT GCT GT GCTAAGC AGGAGCCT GAAAGAAACG AGT GCTTCCT GCAGC ATAAAG ACGAT AACCCC A AT CTGCCTAGGCT GGT GCGCCC AGAAGT GG ACGT CAT GT GT AC AGCCTT CC ACGAT AAT GA G GAAACTTTT CT GAAG AAAT ACCT GT AT G AG ATT GCT CGG AG AC ATCC AT ACTTTT AT GC A CCCGAACT GCT GTT CTTT GCCAAGCGGT ACAAAGCCGCTTT CACCGAGTGCT GT CAGGC C GGCGGGGGAGGCAGCT G A ID NO: 50 (Secuencia de Señal subrayada) ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGGGGGSADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKOR LKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDR

ADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK NYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEF KPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKC CKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETY VPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEK CCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

ID NO: 86 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 50).

GCCACT ATGGCT GT GAT GGCTCCTAGAACCCT GGTCCT GCT GCT GT CCGGGGCACT GGC ACT G ACT CAGACTT GGGCT GGGGGGGGGGGGGGGT CT GCCG AT AAAGCCGCTT GCCT G CT GCCCAAGCT GGACGAGCT GAG AGAT GAAGGGAAGGCCAGCT CCGCTAAACAGAGG CT GAAGT GT GCAAGT CT GC AGAAATT CGG AG AG AGGGCCTTT AAGGCTT GGGC AGT GG CACGACTGTCCCAGCGATTCCCTAAGGCAGAGTTTGCCGAAGTGTCTAAACTGGTCACC GACCT G ACAAAGGT GC AC ACCG AGT GCT GT C AT GGCG ACCTGCTGGAAT GCGCCG ACG AT CGC GCT GAT CT GGC AAAGT AC AT CT GT GAG AACC AGG AC AGC ATTT CT AGT AAGCT G AAAG AGT GCT GT GAAAAACCT CT GCT GGAGAAGTCCC ACT GC ATCGCT G AGGT GGAAA ACGACGAAAT GCCCGC AG AT CTGCCTT C ACT GGCAGCCG ACTTCGT GGAGAGC AAAG A TGTCTGTAAG AATT ACGCT G AAGC AAAGG AT GT GTTCCT GGGC AT GTTT CT GT ACG AGT AT GCCCGG AG AC ACCCT GACT ACTCCGT GGT CCT GCT GCT GAGGCT GGCTAAAACAT AT G AG ACCACAC T GGAAAAGT GCT GT GCT GC AGCCG AT CC ACAT G AGT GCT AT GCC AAAGT GTT CG ACG A GTT CAAGCCACT GGTCG AGGAACCCCAGAACCT GAT CAAGC AGAATT GT GAGCT GTTC GAAC AGCT GGGGGAGT ACAAGTTTCAGAACGCCCT GCT GGT GCGGTAT ACT AAGAAAG T GCCT CAGGT CT CC ACT CCAACCCT GGT GGAGGT CT CT CGCAAT CT GGGCAAAGT GGGG AGT AAAT GCT GT AAGC ACCCCG AGGCC AAGCG AAT GCCTTGCGCT GAAG ATT ACCT G A GTGTGGT CCT GAAT C AGCT GT GT GT GCT GCAT G AG AAAACT CC AGT GT C AG ACCGGGT C ACT AAGT GCT GT ACCG AGT C ACT GGT G AACAGGCG ACC ATGCTT C AGCGC ACT GG AGG T GGAT G AAACCT AT GT CCCC AAGG AGTTT AAT GC AG AAAC ATT CACTTT CCACGCCG AC AT CT GT AC ACT G AGC GAG AAGG AAAG ACAG ATT AAG AAAC AG ACT GCCCTGGT GG AGCT GGT C AAGC AT AAA CCCAAGGCTACCAAAGAACAGCTGAAGGCAGTGATGGACGATTTCGCTGCATTTGTCG AGAAAT GCT GT AAGGCCG ACGAT AAGGAAACATGCTTT GCT GAGGAAGGAAAGAAAC T GGT GGCCGCT AGCC AGGC AGCCCT GGGCCT GT GA

Q ID NO: 51 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYL

QQCPFEDHYKLVNEYTEFAKTCYADESAENCDKSLHTLFGDKLCTYATLRETYGEMADCC

AKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYA

PELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAF

KAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSI

SSKLKECCEKGGGGS

Q ID NO: 87 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 51).

GCC ACT AT GGCCGT G AT GGC ACCT AG AAC CCTGGTCCT GCTGCT GAGCGGGGC A CTGGC ACT G ACACAGACTT GGGCT GGGG AT GCAC AT AAAAGCG AGGT CGCT C ACCGGT TC AAGGAT CT GGGCGAGGAAAACTTTAAAGC ACT GGT GCT G AT CGCCTT CGCT CAGT ACCT G CAGCAGT GCCCCTTT GAAG ACCACGT GAAGCT GGT CAACGAGGT GACAGAGTTCGCC A AA ACTT GCGT CGC AG ACG AGT C AGCCG AAAATT GT G AT AAG AGCCT GC AT ACT CTGTTTGG G GAT AAACT GT GT ACCGT GGCC AC ACT GCGCG AG ACCT ATGG AGAAAT GGCT G ACT GCT GT GCAAAGC AGGAGCCT GAACGAAACG AGT GCTT CCT GCAGCATAAAGACGAT AACCCC A AT CTGCCTAGGCT GGT GCGCCCAGAAGT GG ACGT CAT GT GT ACCGCTTT CC ACGAT AAT G A G GAAAC ATTT CT GAAGAAAT ACCT GT AT GAGATT GCCCGG AG ACAT CCATACTTTT ATGC C CCCGAACT GCT GTT CTTT GCT AAG AG AT ACAAAGCCGCTTT CAC AG AGT GCT GT CAGGC A GCCG AT AAGGCT GC AT GC CTGCT GCCC AAACT GG ACG AGCT G AG AG AT G AAGGC AAGG CA AGCTCCGCCAAGCAGAGGCT GAAAT GT GCAT CT CT GC AGAAGTTCGGGGAGAGGGCCT TT AAAGC AT GGGC AGT GGCTCG ACT GT CCC AGCG ATT CCCT AAGGCTG AGTTT GCAGAAG TC

T CT AAGCT GGT GACT G ACCT G ACCAAAGT GC ACACCG AGT GCTGT CAT GGCG ACCT GCT G GAAT GCGCCG ACG ATCGCGCCGAT CT GGCT AAGT AT AT CT GT GAGAAT C AGG AC AGT A TT CT AGT AAGCT G AAAG AGT GCT GT GAAAAGGGCGGGGG AGGCT CCT G A

Q ID NO: 52 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGGGGGSPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAA DFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPH ECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVS RNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVYLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPC FSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAV MDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

Q ID NO: 88 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 52).

GCC ACT AT GGCTGT GAT GGCTCC AAG AAC CCTGGTGCT GCTGCTGTCCGGGGCT CTGGCT CT GACT CAGACCT GGGCCGGGGGGGGGGGGGGAAGCCCCCT GCT GG AGAAGT CC CACTGCAT CGCCGAGGT GGAAAACG ACG AAAT GCCCGCT GAT CTGCCTT CT CT GGCCGC T GACTT CGT GG AG AGT AAAG AT GT CT GT AAGAATT ACGC AG AAGCC AAGG ACGT GTT CC TG GGGAT GTTTCT GT ACG AGT AT GC ACGGAGACACCCT GATT ACTCCGT GGT CCT GCT GCT G CGCCT GGCCAAAACTT ATGAG ACCACACT GGAAAAGT GCT GT GCAGCCGCT GACCCAC AT GAGT GCT AT GCT AAAGT GTT CGAT GAGTTCAAGCC ACT GGTCGAGGAACCCCAGAACC TG ATCAAGC AGAATT GT GAGCT GTT CGAAC AGCT GGGCG AGT AC AAGTTT CAGAACGCCC TG

CT GGT GCGAT AT ACAAAGAAAGT GCCT CAGGT CT CAACTCCAACCCTGGT GGAGGT CA GC CGAAAT CT GGGC AAAGT GGGGT CCAAATGCT GTAAGC ACCCCG AGGCT AAGCGGAT GC CT T GCGC AG AAG ACT ACCT GT CAGT GGTCCT G AACC AGCT GTGTGT GCT GC AT G AG AAAA CC CCCGT G AGCG AT AG AGT C ACC AAGT GCTGT AC AG AGT CTCTGGT GAAC AGGCGC CC AT GC TTCAGTGCCCT GGAGGT GG ACGAAACAT AT GT CCCCAAAGAGTTTAAT GCCGAAACATT C ACTTTT CACGCT G AT AT CT GT ACT CT GT CCGAGAAGGAAAGGCAGATT AAGAAACAGA CC GCCCT GGT GG AGCT GGT C AAGC AT AAACCT AAGGC AAC AAAAG AACAGCT G AAGGCCG TG AT GG ACGATTT CGC AGCCTTT GT CGAG AAAT GCT GTAAGGCT GACGAT AAGGAAACTT GC TTT GCAGAGGAAGGAAAGAAACT GGT GGCTGCAT CT C AGGCCGCTCT GGGCCT GT GA Q ID NO: 53 (Secuencia de Señal subrayada) ATMAVMAPRTLVLLLSGALALTOTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAOYL QQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCC AKQEPERNECFFQHKDDNPNFPRGGGGS

Q ID NO: 89 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 53).

GCC ACT AT GGCT GT C AT GGCT CC AAG AAC ACT GGTCCTGCTGCTGT CCGGGGC A CT GGCACTGACT C AG ACCT GGGCT GGGGAT GCT CACAAGT CT GAGGT CGCCCACAGGTT C AAGG ACCT GGGCG AGG AAAACTTT AAAGCT CT GGTGCT G ATCGCCTT CGCT CAGT ACCT G CAGC AGT GCC C ATTT GAAG AT C ACGT G AAGCT GGT CAACG A AGT G ACT G AGTT CGCC A

ID NO: 54 (Secuencia de Señal subrayada)

ATMAVMAPRTLVLLLS GAL ALT OT WAGGGGGSLVRPEVD VMCT AFHDNEETFLKKYLYE IARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK YTCENQDSTSSKLKECCEKPLLEKSHCTAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKD VFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEP QNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR MPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAET FTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKET CFAEEGKKLVAASQAALGL

ID NO: 90 (Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 54).

GCCACT AT GGCT GT GAT GGCACCT AGAAC ACT GGT CCT GCT GCT G AGCGGGGC A CTGGCACTGACACAGACTTGGGCCGGGGGAGGGGGAGGGAGCCTGGTGAGGCCCGAG GTG GACGT C AT GT GCACAGCCTT CCACGAT AACGAGGAAACTTTT CT GAAGAAAT ACCT GT A

GAGAT CGCCCGG AG AC AT CCATACTT CT AT GCCCCCG AACT GCT GTT CTTT GCT AAACG C TACAAGGCCGCTTTT ACCGAGTGCT GTCAGGC AGCCGAT AAAGCTGC ATGCCTGCTGCC A AAGCT GGACGAGCT GCGCG AT GAAGGGAAGGCTAGCT CCGCAAAAC AGCG ACT GAAG TGT GCAAGCCTGCAGAAATTCGGAGAGCGAGCTTTTAAGGCATGGGCCGTGGCTAGACTGT CC CAG AGGTTCCCC AAGGCC G AGTTT GCT G AAGT GT CT AAACT GGT CACCG ACCT G AC AA AG GT GCAC ACCG AGT GCT GT CAT GGCGACCT GCT GGAAT GCGCCGACGAT CGCGC AGATC TG GCC AAGT AC AT CT GT G AG AAT C AGG AC AGC ATTT CT AGT AAGCT GAAAG AGT GCT GT G AA AAACCT CT GCT GGAGAAGT CCC ACT GCATCGCCG AGGT GGAAAACGACGAAATGCCCG CT GAT CT GCCTT C ACT GGCCGCT G ACTT CGT GGAG AGC AAAG AT GT CT GT AAG AATT ACGC A GAAGCCAAGG AT GT GTT CCT GGGCAT GTTTCT GT ACGAGT AT GCAAGGCG AC ACCC AG AC T ACT CCGTGGTCCTGCT GCT G AGGCT GGCTAAAACCT AT G AG ACCAC ACT GG AAAAGT G C T GT GCAGCCGCT GATCCT CAT G AGT GCT AT GCCAAAGT GTT CGACG AGTT CAAGCCT CT G GT CGAGGAACCACAGAACCT GAT CAAGCAGAATT GT GAGCT GTT CGAAC AGCT GGGGG AG T AC AAGTTT C AG AACGC CCTGCTGGT GCGCT AT AC AAAG AAAGT GCCCC AGGT CT CC AC T CCT ACCCT GGT GG AGGT CT CTCGG AAT CTGGGC AAAGT GGGG AGT AAAT GCT GT AAGC AC CC AG AGGCTAAG AGAAT GCCCT GCGC AGAAG ATT ACCT GAGT GT GGTCCT GAACC AGC TG T GT GT GCT GC AT GAG AAAAC ACCT GT GT CAGACCGGGT C ACT AAGT GCTGT ACCG AAT C A CT GGT GAACCGACGGCCTTGCTT CAGCGCCCT GGAGGTGG AT GAAACTTAT GT CCCAA AG

GAGTTTAAT GCAGAAAC ATTC ACTTTTCACGCCGAC AT CT GT ACCCT GT CT GAGAAGG A

A

AGACAGATTAAGAAACAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTCAAGCATAAACCAAAGGCTA

CT

AAAGAACAGCT GAAGGC AGT G AT GG ACG ATTTCGCAGCCTTT GTCGAG AAAT GCT GT A

AG

GCCG ACGAT AAGG AAACCT GCTT CGCT GAGGAAGGAAAGAAACT GGTGGCT GCAAGT C

AG

GCCGCT CT GGGCCT GT GA

ID NO: 131 (CD19_scFv_BiTE AA)

DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIP PRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGG GSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGD TN YN GKFKGKATLT ADE S S ST AYMQLS SLAS ED S AVYF C ARRETTT V GRYYY AMD Y W GQ GTTVTVSS

ID NO: 132 (CD3_scFv_VH-VL_BiTE AA)

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNY NQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSV EGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSP KRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLE LK

ID NO: 133 (V1094 NT)

GAATT CGCG ACC AT GGCCGT GAT GGCACCT AGAAC ACT GGT CCTGCT GCT GAGCGGGG CA CT GGC ACT G AC AC AG ACTT GGGCT GG AG AC ATT AAGCT GC AGC AG AGC GG AGCT G AGC TG GC ACG AC C AGG AGC AAGT GT G AAAAT GT C AT GC AAG AC AAGCGGCT AT ACTTTT ACC A GG T AC ACT AT GC ACT GGGT GAAGC AGCG ACC AGG AC AGGG ACT GG AGT GG AT CGGGT ACA TT AACCCTTCCAGAGG AT AT ACCAACT ACAAT CAGAAGTTC AAAGAT AAGGCCACCCT G A CC ACAGAC AAG AGCT CCT CT AC AGCCT AT AT GC AGCT G AGTT C ACT GACTT CCG AGG ATT C T GCCGT GT ACT ATTGCGCT AGGT ACT AT G ACGAT C ATT ATT GTCT GGACT ACT GGGGGC A G

GGAACT ACCCT GACAGT GAGCT CCGT CG AGGGAGGGAGT GGAGGCT CAGGAGGAAGC GGA GGGT CCGG AGG AGT GG AC G AT ATCC AGCT GACT C AGT CTCCT GCAATT AT GT C AGCC AG C CC AGGCGAGAAGGT C ACAAT GACTT GCCGCGCCT CT AGTT CAGTGT CCT AT AT GAATT G G T ACC AGC AG AAAT CT GGC ACC AGTCCC AAG AG AT GG AT CT AT G AT AC AT CC AAGGT CG CC T CTGGGGT GCCTT AC AGGTTTTCCGGCT CT GGGAGT GGAACTT CAT AT AGCCT G ACC AT T AGCTCC AT GGAGGCT GAAGACGCCGCT ACCT ACT ATTGCCAGCAGT GGT CT AGT AACCC C CT GAC ATT CGGCGCCGGGACT AAACT GG AGCT GAAGGGGGGAT CT G ACGC AC ACAAAA GT GAAGTCGCCCATCGGTT CAAGG AT CT GGGCGAGGAAAATTTT AAAGCCCT GGT GCT GA TC GCCTT CGCT C AGTACCT GC AGCAGT GCCCTTTT GAGGACC ACGTGAAGCT GGT CAACG A G GTGACCGAGTTCGCT AAAACATGCGTGGCTGATGAGTCT GC AGAAAATTGT GACAAGA GT CT GCAT ACACTGTTTGGGGAT AAACT GT GT ACCGTGGCCAC ACT GCGCG AGACTT ACGG A GAAAT GGC CG ACT GCT GT GCT AAGC AGG AGCCT G AACG AAACG AGT GCTTCCT GC AGC AC AAAG ACG AT AACCCT AAT CT GCC ACGCCT GGT GCG ACC AG AAGT GG AT GT CAT GT GT A CT GCTTTCCACG ACAAT G AGG AAACCTTT CT GAAG AAAT AT CT GT ACGAG AT CGCCCGG A GA CATCC ATATTTTTACGCACCCGAACT GCT GTT CTTT GCCAAAAGAT ACAAGGC AGCCTT C ACCG AGT GCT GT C AGGCT GCAG AT AAAGCCGCTT GCCT GCT GCCT AAGCT GG AT GAGCT G CG AG ACG AAGG AAAGGCCT C AAGCGCTAAAC AGCGGCT GAAGT GT GCT AGCCT GCAG A AA TT CGGAGAGCG AGCCTT CAAGGCAT GGGCAGT GGCT CGGCT GT CT CAGAG ATT CCCAA AG GC AG AGTTT GCCGAAGT C AGC AAACT GGT GACT GACCT G ACC AAGGT GCAC ACCG AGT GC T GT CAT GGCGAT CT GCT GGAAT GCGCCG ACGAT AGAGCT GACCTGGCAAAGT AC AT CT GT GAGAACC AGGATAGCATTT CCTCT AAACT GAAGGAGT GCT GT GAAAAACCT CT GCT GG AG AAGTCCCACT GCATCGCCG AGGT GGAAAACGAT GAAAT GCCCGCT GACCT GCCTTC ACT G GCAGCCGATTTCGTCGAGAGCAAAGACGTGTGTAAGAATTACGCAGAAGCCAAGGATG TG

TT CCT GGGCAT GTTTCT GTAT GAGTACGCT AGGCG AC ACCC AGACT ACAGCGT GGT CCT G CT GCT GCGGCT GGCCAAGACAT AT G AG ACAACT CT GGAAAAAT GCT GT GCT GCAGCCG AC CCT C AT GAGT GCT AT GCC AAAGT CTT CGAT G AGTT C AAGCCT CT GGT GG AGG AACC AC A G AACCT G ATT AAGC AG AATTGT GAGCT GTTT GAAC AGCT GGGCG AGT AT AAATTCC AG A AC GCCCT GCT GGT G AG AT ACACCAAG AAAGT CCCCCAGGT GTCCACCCCT AC ACT GGT GG AA GT CT CT CGGAAT CT GGGAAAGGT CGGC AGT AAAT GCT GTAAGCACCCAGAGGCT AAAA GA AT GCCCT GCGC AG AAG ATT ACCT GTCCGTGGTCCT G AACC AGCT GT GT GT GCT GCAT G A G AAG AC ACC AGT CT CT GAC AGGGT G ACC AA AT GCT GT AC AG AAT CCCTGGT GAACCG AC GG CCTT GCTTTTCTGCCCT GGAGGT CGAT G AAACCT AT GT GCC AAAGG AGTT C AAT GCT GA A ACTTTC ACCTTT CACGC AG AC AT CT GT ACT CT GAGCG AG AAAG AACGCC AG ATT AAG AA A CAGACCGCCCT GGT CGAGCT GGT GAAACAT AAGCCCAAAGCCACAAAAGAACAGCT G A AG GCT GT CAT GG ACGATTTCGCT GCATTT GT GGAGAAAT GCT GTAAGGCAGACG AT AAGG AA ACCTGCTT CGCCGAGGAAGGCAAGAAACT GGT GGCCGCT AGCCAGGCAGCACTGGGAC TG GGAGGGTCCGGGG AT AT CC AGCT GACCCAGT CACCAGCCAGCCT GGCT GT CT CACT GG GG CAG AGGGCC AC AATT AGTT GT AAGGCTTCCC AGT CT GT GGACT ACG AT GG AGACT CCT A T CT GAACT GGT ACCAGCAGATCCC AGGACAGCCACCTAAACT GCT GAT CTACG ACGCCA GT AAT CT GGT GT CAGGCAT CCC ACCCCGCTTTAGT GG AT CAGGCAGCGGG AC AG ACTT CAC T CT GAAC ATT C ACCC AGT CG AG AAGGT GG AT GCT GCAACCT ACC ATT GCC AGC AG AGC A CT GAGG ACCCCT GGACCTTT GGAGGCGGG ACAAAACT GGAAAT CAAGGG AGGCGGGGGA TCA GGCGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGAGGGTCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGAGCA GAG CT GGT C AGGCC AGGG AGTT CAGT G AAAATT AGCT GT AAGGC AT CCGGGT AT GC CTT CA GC T CCT ACT GGAT GAATTGGGT CAAAC AG AG ACCT GGCC AGGGCCTGG AGT GGATCGGAC AG ATTT GGCCCGGGG AT GG AG AC ACT AACT AC AAT GGG AAGTTT AAAGG AAAGGCT AC AC TG

ACT GC AG AT GAAT CT AGTTCAACCGCCT AC AT GC AGCT GAGCT CCCT GGCATCCGAGG A C T CTGCCGT CTATTT CT GCGCT AGAAGGGAAACCACAACT GT GGGC AGGT ACT ATTACGC C AT GG ACT ATT GGGGCCAGGGG ACCACAGT GACCGT CT CTAGTTGAGG AT CC

ID NO: 134 (V1094 AA)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTR YTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDS AVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSAS PGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTIS SMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIA FAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGE MADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRH PYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKF GERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICE NQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFL GMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLI KQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKYPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPC AEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTF HADICTLSEKERQIKKQTALYELYKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFYEKCCKADDKETCFA EEGKKLVAASQAALGLGGSGDIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWY QQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFG GGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNW VKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFC ARRETTTVGRYYYAMD Y WGQGTT VT VS S *GS

ID NO: 135 (V1095)

GAATT CGCGACCAT GGCCGT GAT GGC ACCTAGAACACT GGT CCTGCT GCT GAGCGGGG CA CT GGC ACT GAC AC AGACTTGGGCT GG AG ACATT C AGCT G AC ACAGTCCCC AGCTT CT CT G GC AGT CT C ACT GGGCC AGCGGGCAACT AT CAGCT GC AAGGCCT CACAG AGCGTGGACT AC GAT GG AG AC AGCT AT CT G AACT GGT ACC AGC AG AT CCC AGG AC AGCC ACCT AAACT GC TG AT CT ACGACGCCAGTAAT CT GGTGT C AGGCAT CCCACCC AGATTTT CCGGAT CT GGC AG

GGG ACCG ACTT CAC ACT G AAC ATT C ACC C AGT GG AG AAGGTCGAT GCCGCT AC CT ACC AT T GCCAGCAGAGCACTG AGGACCCCT GGACCTTT GGCGGGGGAACAAAACT GGAAAT C A AG GGCGG AGG AGGCT CT GGAGG AGG AGGGAGT GGAGG AGG AGGAT CAC AGGT GCAGCT G CAG

CAGTCCGG AGCAG AGCT GGT C AGGCCAGGCAGCT CCGT GAAAATTAGCT GTAAGGCAT CC GGGT AT GCCTTCTCT AGTT ACT GG AT GAATTGGGT GAAGC AGCG ACC AGG AC AGGG AC TG GAGT GG AT CGG AC AG ATTT GGCCT GGGG AT GG AG AC ACT AACT ACAAT GGGAAGTTT A AA GGAAAGGCT ACT CT G ACCGCAGAT GAAT CAAGCTCC ACCGCCTACATGCAGCT GT CTA GT CT GGCC AGT G AGGACT C AGCT GT CT ATTT CT GCGC ACGG AG AGAAACC ACAACT GT GG GC CG AT ACT ATT ACGCC AT GG ATT ACT GGGGCC AGGGG ACC AC AGT GACCGT CT C AAGCG GC GGGAGCGAT GCT CACAAAT CCGAGGT CGC ACAT AGATT CAAGGACCT GGGGGAGGAAA AC TTT AAAGCCCT GGT GCT G AT CGCCTT CGCT CAGT AT CT GCAGCAGT GCCCCTTTGAAGA C CACGT GAAGCT GGT CAACGAAGT GACT GAGTT CGCTAAAACCT GCGT GGCCG AT GAGT CT GCT GAAAATT GT GAC AAG AGT CT GC AT AC CCTGTTT GGGGAT AAACT GT GT ACT GTGGC C ACCCT GCGCG AGACAT ACGGAGAAAT GGCAGACT GCT GT GCCAAGC AGG AGCCT GAAC GA AACG AGT GCTT CCT GC AGCACAAAG ACGATAACCCTAAT CT GCCACGCCTGGT GCG AC CA GAAGT GG AT GT C AT GT GT ACT GCTTT CCACG ACAAT G AGG AAACCTTT CT GAAG AAAT A T CT GT ACGAGATT GCCAGGCGCCAT CCAT ATTTTT ACGCACCCGAACT GCT GTT CTTT GCC AAAAGGTAC AAGGCAGCCTT C ACCG AGT GCT GT CAGGCT GCAGATAAAGCCGCTT GCC TG CTGCCT AAGCT GG AT G AGCT GCG AG ACG AAGG AAAGGCCT CCT CT GCT AAAC AGCGGC TG AAGT GT GCT AGCCT GC AGAAATT CGGCGAGAGGGCCTT CAAGGC ATGGGC AGTGGCT C GA CT GT CT CAG AGATT CCCAAAGGC AG AGTTTGCCGAAGT C AGCAAACT GGT GAC AG ACC TG ACT AAGGT GC ACACCGAGT GCT GT C AT GGCG AT CT GCT GGAAT GCGCCGACG AT CGCG CT GACCT GGCAAAGT AC AT CT GT GAGAACCAGGAT AGC ATT AGTTCAAAACT GAAGG AGT GC T GT GAAAAACCT CT GCT GGAGAAGT CCCACT GCAT CGCCGAGGTGGAAAACG AT GAAA TG CC AGCT GACCT GCCTTCCCT GGC AGC AG ATTT CGT CG AGT CT AAAG ACGT GT GT AAG AA T T ACGC AG AAGCC AAGG AT GTGTTCCT GGGC AT GTTTCT GT AT GAGT ACGCT CG ACGGC A C

CCCG ACT ACT CCGT GGTCCTGCT GCT G AGGCT GGCC AAG AC AT AT G AG ACT ACCCT GG A A AAAT GCTGT GCT GC AGC CG ACCCT C AT G AGT GCT AT GCC AAAGT CTT CG AT G AGTT CAA G CCT CT GGT GGAGG AACC AC AG AACCT G ATT AAGC AG AATT GT G AGCT GTTT GAAC AGC TG GGCG AGT AT AAATTCCAGAACGCCCT GCT GGT GCGCTACACC AAG AAAGT CCCCC AGG TG AGT ACACCT ACT CT GGT GGAAGT CT C ACGGAAT CT GGG AAAGGT CGGCAGT AAAT GCT GT AAGC ACCC AG AGGCCAAAAGAATGCCCTGCGCT GAAGATTACCT GT CCGT GGTCCT GA AC CAGCT GT GT GT GCTGCAT G AG AAG AC ACC CGT CT CT G ACCGGGT G ACC AAAT GCT GT AC A GAAAGCCT GGT G AAC AG AAGGCCTT GCTTTTCCGCCCT GG AGGT CGAT G AAAC CT AT GT G CCAAAGGAGTT C AAT GCT GAAACCTT CAC ATTT CACGC AGACAT CT GT ACT CT G AGCG A G AAAGAAAG AC AG ATT AAGAAAC AG ACCGCCCT GGTCGAGCT GGTGAAACAT AAGCCC AAA GCC AC AAAAG AAC AGCT G AAGGCT GT C AT GGACG ATTT CGCT GCATTT GT GGAG AAAT GC T GT AAGGC AG ACGAT AAGG AAACTT GCTTCGCCGAGGAAGGCAAGAAACT GGT GGCAG CT T CCC AGGC AGCACTGGGACT GGGAGGCTCCGGGGACAT CAAGCT GCAGC AGT CT GGAG CA GAGCT GGCTAGGCCT GGAGCCT CT GT GAAAAT G AGTT GT AAGACAT C AGGCT ATACTTT T ACCAGGT ACACTATGCACT GGGT CAAACAGAGACCT GGCCAGGGCCT GGAGT GGAT CG GC TACATTAATCCCAGCCGCGGGTATACCAACTACAATCAGAAGTTCAAAGATAAGGCAA CC CT GAC AACT GAC AAG AGCT CCT CT AC AGC CT AT AT GC AGCT G AGTT C ACT G ACT AGCG A G GATT CCGCCGT GT ATT ACT GCGCT CGGT ATT ACG ACGAT C ATT ATT GT CT GG ACT ACT GG GGGCAGGGAACCACACTGACAGTCAGCTCCGTGGAGGGAGGATCTGGAGGGAGTGGA GGC T C AGG AGG AAGCGG AGGGGT GG ACG AT AT CC AGCT GAC CC AGT CT CCTGCT ATT AT GT CA GCAAGCCC AGGCGAGAAGGT CAC AAT GACTT GCAGAGCCT CTAGTT C AGT GTCCTAT AT G AATT GGTAT CAGC AGAAAT CCGGCACCT CT CCCAAGAGAT GGAT CT AT G AT ACAAGCA AG GT CGCCT CCGGGGT GCCTT AC AGGTTTTCCGGCT CT GGGAGT GGAAC AT C AT AT AGCCT G ACT ATT AGCT CC AT GG AGGCT G AAG ACGCTGCAACCT ATT ACT GCC AGC AGT GGT CT AG

T

AAT CCCCT G ACCTT CGGCGCCGGG ACAAAACT GG AGCT GAAGT GAGG AT CC

Q ID NO: 136 (V1095 AA)

EF ATM AVMAPRTL VLLLS GAL ALT QT WAGDIQLT Q SP AS LAV S LGQRATIS CICAS Q S VD YD

GDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQ

STEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAF

S S YWMN WVKQRPGQGLE WIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADE S S ST AYMQLS SLAS

EDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFK

ALVLTAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLR

ETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEYDVMCTAFHDNEETFLKKYLYE

IARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS

LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKYHTECCHGDLLECADDRADLAK

YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKD

VFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEP

QNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR

MPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAET

FTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKET

CFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHW

VKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCA

RYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVT

MTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAED

AATYY CQQ WS SNPLTF G AGTKLELK*GS

119. SEQ ID NO: 137 (V1092, CD3, NT)

CL_#1072_antiCD3_1_HSA-1_337_DSS>

GAATT CGCG ACC AT GGCT GT G AT GGCT CCT AG AACCCT GGT GCTGCT GCTGTCCGGCGC

T

CT GGCTCT GACT C AG ACCT GGGCT GGGGAT AT CAAACT GCAGC AGT CT GGAGCT GAGCT

G

GC ACG AC C AGG AGCC AGT GT C AAAAT GT C AT GC AAG ACT AGCGGCT AC ACCTT C ACC A

GA

TAT ACCATGCACT GGGT GAAGCAGAGGCC AGGACAGGGACT GGAATGGAT CGG AT AT A

TT

AACCCC AGCCGCGGCT AC ACAAACT AT AAT CAGAAGTT CAAAG ACAAGGCT AC ACT G A

CC

AC AG AT AAGAGCTCCTCT ACT GC AT AC ATGCAGCT GAGTTC ACTGACC AGCG AGGATT C

C

GCCGT GTACTATTGCGCT AGGT ACT AT GACGAT CATT ACT GT CT GGACT ATT GGGG AC A

G

GGCACT ACCCT GACT GT GAGCT CCGT CGAAGGAGGGT CTGGAGGCAGT GGAGG AT C AG

GA

GGGAGCGGAGG AGT GGACG AT AT CCAGCT GACCC AG AGCCCCGCCATTAT GAGT GCTT CA CCT GGCGAGAAGGT C ACCAT G AC AT GCCGCGCCT CT AGTT CAGTGTCCT ACAT GAATT G G T AT C AGC AG AAATCCGGC AC AT CT CCT AAGCGGT GGAT CT ACG AT ACTT CCAAAGT CGC C T CTGGGGT GCCAT AT CGGTT CAGCGGGT CCGGAT CT GGC ACCAGTTACT CACT GACAAT T AGCTCC AT GG AGGCTGAAG ACGCCGCT ACCT ACT ATT GT CAGCAGT GGT CTAGT AACCC T CT GACTTT CGGGGCCGGAACCAAACT GGAGCT GAAGGGGGGAAGT GAT GCACACAAAT CA GAAGTCGCCC AT AGGTT CAAGGACCT GGGCGAGGAAAATTTTAAAGCCCT GGT GCT GA TC GCTTTCGC AC AGT AT CT GC AGC AGT GCCC ATTT GAGG AT C ACGT GAAGCT GGT C AACG A G GT GAC AG AGTT CGCC AAAACTT GCGT CGC AG ACG AG AGCGCCG AAA ATT GT GAT AAGT CC CT GCAT ACCCT GTTTGGGGAT AAACT GT GTACT GT GGCC ACCCT GAGGGAGACAT ACGG A GAAAT GGCT G ACT GCT GT GCAAAGCAGGAGCCCGAACGC AACG AGT GCTT CCT GC AGC AC AAAG ACGAT AACCCCAAT CT GCCTAGGCT GGT GCGCCCT GAAGT GG ACGT CAT GT GTA CC GCTTTCCACG AT AAT G AGGAAAC ATTT CTGAAGAAAT ACCTGTATGAG ATTGCCCGGAG A CATCCTTACTTTTAT GCTCC AGAACT GCT GTTCTTT GCAAAACGGT ACAAGGC AGCCTT C AC AG AGT GCT GT CAGGCT GCAGAT AAAGCCGCTTGCCTGCT GCCAAAGCT GG ACGAGC TG CGCGATGAAGGAAAGGCCTCAAGCGCTAAACAGCGACTGAAGTGTGCCTCCCTGCAGA AA TT CGGCGAGCGGGCTTTTAAGGC AT GGGCT GT GGCACGACT GAGCC AGCGGTTCCCCA AG GC AG AGTTT GCCGAAGT CT CC AAACT GGT GAC AG ACCT GACT AAGGT GC AC AC CG AGT GC T GT CAT GGGG ACCT GCT GGAAT GCGCCG ACG AT AG AGCT GAT CT GGC AAAGT AT AT CT GT GAGAACCAGGACTCTATTTCCTCTAAACTGAAGGAGTGCTGTGAAAAACCTCTGCTGGA G AAGAGCCACT GCAT CGC AG AGGT GGAAAACGACGAAAT GCCAGCCGAT CT GCCCT CT C TG GC AGCCG ACTT CGT CG AG AGT AAAG AT GT GT GT AAG AATT ACGCCG AAGCT AAGG ACG TG TT CCT GGGCAT GTTTCT GTACGAGTAT GCAAGAGCCT GAGG AT CC

Q ID NO: 138 (V1092 AA)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTR YTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDS AVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSAS PGEKVTMTCRASSSYSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGYPYRFSGSGSGTSYSLTIS SMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIA FAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGE MADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRH PYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKF GERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICE NQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFL GMFLYEYARA*GS

EQ ID NO: 139 (CL_#1079_HSA-342_585_DSS_antiCD19_2 nt)

GAATT CGCGACCATGGCCGT GAT GGCTCCCCGAAC ACTGGT GCTGCTGCT GT CCGGCGC T CT GGCTCT GACT C AG ACTT GGGCTGGCT CCGT GGT GCT GCT GCT GCGGCT GGCCAAGAC C T AT G AG ACC AC ACT GG AAAA AT GCTGTGCCGCT GC AG AT CC AC ACG AGT GCT ACGCT A AG GT GTT CGACGAGTT C AAGCCT CT GGT CGAGGAACC AC AGAACCT GAT CAAGCAGAATT GT GAGCT GTTCGAAC AGCT GGGCGAGT AT AAATTT CAGAACGCCCT GCTGGT GAG ATACA CA AAG AAAGTGCCCC AGGT CT CT AC ACCT ACT CT GGT GGAAGT C AGT CG AAAT CT GGG AA AG GT CGGCT CAAAGT GCT GTAAACACCCAGAGGCAAAACGG AT GCCCT GCGCCGAAG ACT AT CT GAGCGT GGT CCT GAACC AGCT GT GT GT GCT GCAT G AGAAGACACCCGT GT CCGAT AG G GT CAC C AAAT GCT GT AC AG AAT CT CT GGT GAACCGG AG ACCCT GCTT C AGT GCCCT GG A G GT GGACGAAACTTACGTCCCT AAGG AGTTTAAT GCCGAAACCTT CACATTT CACGCT G A T AT CT GT ACT CT GT CCG AG AAAG AACGCC AGATT AAG AAAC AG ACCGCCCT GGT GG AGC TG GT CAAGC ATAAACCT AAGGCAACT AAGGAACAGCT GAAAGCCGT GAT GGACGATTTCG CC GCTTTTGT CGAG AAGT GCT GT AAAGCT G ACG AT AAGG AAACCT GCTT CGC AG AGG AAG GC AAGAAACTGGTGGCAGCCTCTCAGGCTGCACTGGGACTGGGAGGGAGCGGGGACATCC AG CT GAC ACAGTCCCCT GCAT CT CT GGCCGT GAGCCT GGGACAGCGAGCT ACT ATTT CCT G T AAGGCAT CCC AGT CT GT GGACT AT GAT GGGGAC AGCT AT CT GAACTGGTACCAGCAG A TC

CC AGGAC AGCCCCCT AAGCTGCT GAT CT ACGAT GCCAGC AAT CTGGT GT CCGGC ATCCC A CCCCGATT CAGT GG AT C AGGCAGCGGGACAGATTTTACT CT GAAC ATTC ACCCAGT GG A G AAGGTCGACGCCGCT ACCT ACCATT GCC AGCAGT CT ACTGAGGACCCCT GGACCTT CGG A GGCGGGACAAAGCT GGAAAT CAAAGGAGGCGGGGG AT C AGGCGGAGG AGGCAGCGG A GGA GGAGGGT CCCAGGT GCAGCT GC AGC AGAGCGGAGC AGAGCT GGTGAG ACCT GGCAGCT CC GT CAAG ATTT CTT GTAAAGCT AGTGGCTAT GC ATTTT CTAGTTACT GGAT GAATT GGGT G AAGC AGAGGCCT GGACAGGG ACT GG AGT GGAT CGG ACAG ATTT GGCC AGGGGAT GGA GAC ACC AACT AT AAT GGGAAATTCAAGGGAAAAGCC ACT CT G ACCGCT G ACGAGT C AAGCT CC AC AGCCT AT AT GCAGCT GT CT AGT CT GGC AAGT GAGO ATTC AGCCGT GT ACTTTTGCGC T AGGCGCGAAACTACCACAGTCGGCAGGTACTATTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGG GG ACT ACCGTGACCGTCTCAAGCTGAGG AT CC

ID NO: 140 (CL_#1079_HSA-342_585_DSS_antiCD19_2 AA)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAK VFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKV GSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEV DETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAF VEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGDIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKAS QSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAA TYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQYQLQQSGAELVRPGSSVKISC KASGYAFSSYWMNWYKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAY MQLS S L ASED S AYYF C ARRETTT V GRYYY AMD Y WGQGTT YT Y S S * GS

ID NO: 141 (CL_#1075_HSA-342_585_DSS_antiCD3_2)

GAATT CGCG ACC AT GGCT GT GAT GGCT CCTAGAAC ACT GGT GCT GCTGCT GT CCGGGGC

CT GGCT CT GACT C AG ACCT GGGCT GG AAGCGT GGT GCTGCT GCTGCGGCT GGCAAAG A CA T AT GAG ACC AC ACT GGAAAAATGCT GT GCCGCT GC AG ACCCT CACG AGT GCT ACGCC A AG GT GTT CGAT GAGTT CAAGCCCCT GGT CGAGGAACCT C AGAACCT GAT C AAGC AGAATT GT

GAGCT GTTCGAAC AGCT GGGCG AGT ACAAATTTCAGAACGCCCT GCT GGT GAGATAT A CC AAGAAAGTGCC AC AGGT CT C AACCCCCACACT GGT GGAAGT CAGCAGAAAT CT GGGC A AG GT CGGGT CCAAGT GCT GTAAACACCCT G AGGCAAAAAGG AT GCC AT GCGCCGAAG ACT AC CT GT CCGTGGTCCT GAACC AGCT GT GT GT GCT GC AT G AG AAG AC ACC AGT GT CT GAT AG G GT CACT AAAT GCT GT ACCGAAAGCCT GGT GAACCGGAGACCTTGCTT CAGCGCCCT GG A G GT GGACGAAACCT ACGTCCCAAAGGAGTTT AATGCT GAAACTTT CACCTTT CACGC AG A T AT CT GT ACCCT GT CCG AG AAAG AACGCC AG ATT AAG AAAC AG AC AGCCCT GGT GG AGC TG GT CAAGC ATAAACCAAAGGCC ACT AAGGAAC AGCT GAAAGCT GT GAT GGACGATTTCG CC GCTTTTGT CG AG AAGT GCT GT AAAGC AG ACG AT AAGG AAACCT GCTT CGCCG AGG AAG GG AAG AAACT GGT GGC AGC AT CT C AGGCT GC ACT GGG ACT GGG AGGGT CT GGCG AC ATT A AG CT GCAGCAG AGT GGAGCAGAGCT GGC ACG ACCAGG AGC AT CAGT GAAGAT GAGCT GT A AA ACTTCCGGCTACACATTCACTAGGTATACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGACCAGGAC AG GG ACT GG AGT GGAT CGGCT AT ATT AAT C CCAGCCG AGGGT AC ACC AACT AT AAT CAGA AG TT CA AGG ACAAAGCT AC ACT G ACT ACCG AT AAG AGCTCCT CT ACT GC AT AC AT GC AGCT G AGTT CACT G ACCTCCG AGG ACT CTGCCGTGT ACT ATTGCGCT AGGT ACT AT G ACG AT C A T T ACT GT CT GG ATT ATT GGGGAC AGGGC AC AACT CT G AC AGT GAGCT CCGT CGAAGG AG GC AGT GGAGGAT C AGGAGGG AGCGGAGGCT CCGGAGGAGT GG ACGAT ATCCAGCT GACT CAG AGCCCCGCT ATTAT GT CAGCAAGCCCT GGCGAGAAGGT GACCATG ACAT GCCGGGCTT CT AGTT CAGT C AGCT ACAT G AACT GGT AT C AGCAG AAGT CT GG AAC AAGTCCC AAACG AT GG AT CT ACG AC ACTTCT AAGGT GGCC AGT GGCGTCCCTT AT CGGTTCT CCGGGTCT GG AAG T GGCACAT CAT ACAGCCT GACT ATTAGCTCC AT GG AGGCCGAAG AT GCCGCT ACCT ACT A T T GCCAGCAGT GGT CT AGT AAT CCCCT GACCTTT GGGGCT GGAACAAAGCT GG AGCT GA AA TGAGGATCC

Q ID NO: 142 (CL_#1075_HSA-342_585_DSS_antiCD3_2 AA)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAK VFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKV GSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEV DETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAF VEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTS GYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSS LTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSP AIMSASPGEKYTMTCRASSSYSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKYASGYPYRFSGSGSGT SYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK*GS

Q ID NO: 143 CL_#1076_antiCD19_1_HSA-1_337_DSS NT

GAATT CGCGACC AT GGCCGT GAT GGCACCTCGCACCCT GGT CCT GCT GCTGAGCGGGGC A CT GGCACT GACACAG ACTTGGGCT GGAGAT ATT CAGCT GACTCAGAGCCCT GCTT CCCT G GC AGTC AGCCTGGGACAGCGAGCAACCATCT CCTGCAAGGCCAGCC AGTCCGTGGACT AT GAT GGCGACT CCT AT CT GAACT GGT ACCAGCAG AT CCC AGGGCAGCCCCCT AAACT GCT G AT CT ACGAT GCCT CAAAT CT GGTGAGCGGCAT CCC ACCC AG ATTTT CT GGAAGTGGCT C A GGGAC AG ACTT C ACT CT G AAC ATT C AC CCCGT GGAG AAGGT CG ATGCCGCT ACCT ACC A T T GCCAGCAGAGCACAGAGG ACCCTT GGACTTTT GGCGGGGGAACCAAACT GGAAAT C A AG GGAGGAGGAGGC AGT GGCGGAGGAGGGT CAGGAGG AGGAGGAAGCCAGGT GC AGCT G CAG CAGAGCGGAGC AG AGCT GGT CAGGCCAGGAAGCT CCGT GAAAATTTCCT GTAAGGCCT CT GGCT AT GCTTTCT CT AGTT ACT GG AT G AATTGGGT G AAGC AGCG ACCT GGAC AGGG ACT G GAGT GG AT CGGGC AG ATTT GGCC AGGGG AT GG AG AC ACC AACT ACAAT GG AAAGTTT A AA GGCAAGGCAACT CT GACCGCCGAT GAAT CAAGCTCCAC AGCCT AT AT GCAGCT GT CTA GT CT GGC AT CT G AGG AC AGT GCCGTCT ACTT CTGCGCT CGG AG AG AAACC AC AACT GTGG GA CG AT ACT ATT ACGCC AT GG ATT ATT GGGGCC AGGGG ACC AC AGT GACCGT CT C AAGCG GC GGGT CCGAT GCT CACAAAT CTGAGGT CGC AC ATCGCTT CAAGGACCT GGGGG AGGAAA AC TTT AAAGCCCT GGT GCT GAT CGCTTT CGCACAGT ACCT GCAGCAGT GCCCCTTT GAAGA C

CACGT GAAGCT GGT CAACGAGGT G AC AGAGTT CGCCAAAACTT GCGT CGCT G AT GAGA GT GC AGAAAATTGT GACAAGT C ACT GCAT ACACT GTTT GGAGAT AAACT GT GT ACCGT GGC C ACACT GCGGGAGACTTAT GGCGAAAT GGCCGACT GCT GT GCT AAGCAGGAGCCAGAAA GA AACG AGT GCTT CCT GC AGC ACAAAGACG ATAACCCTAAT CT GCCACGACT GGT GCGGC CC GAAGT GG AT GT CAT GT GT ACCGCCTT CC ACGACAAT GAGGAAACATTT CT GAAGAAAT AT CT GT ACGAGATT GCT AGGCGCCATCC AT ATTTTT ACGCCCCCGAACTGCT GTT CTTT GCT AAAAGGT AC AAGGCAGCCTT CACT GAGTGCT GTCAGGCT GC AGATAAAGCCGCTT GCC TG CT GCCCAAGCTGG AT GAGCT GCGCGACGAAGGGAAGGCCTCCT CT GCTAAAC AGCGAC TG AAGT GT GCAT CT CT GCAGAAATT CGG AG AGAGGGCTTTT AAGGCCT GGGCT GT GGCAA GA CT GAGCCAG AGGTT CCCTAAGGCAGAGTTTGCCGAAGT C AGCAAACT GGT GACT GACC TG ACC AAGGT GC AC AC AG AGT GCTGT CAT GGCG AT CT GCT GGAAT GCGCCG ACG AT CGCG CT GACCT GGC AAAGT AT AT CTGT GAG AAT C AGGATT CC ATT AGTT C AAAACT GAAGG AGT GC T GT GAAAAACCT CT GCT GG AGAAGT CT CACT GCAT CGCCGAGGT GGAAAACG AT GAAA TG CCCGCT GACCTGCCTT CT CT GGCAGCCG ATTT CGT CGAGAGT AAAGACGT GTGTAAGAA T T ACGC CG AAGCT AAGG ACGT GTTCCT GGGC AT GTTTCTGT AT GAGT ACGC AAG AGCCT G A GGATCC

ID NO: 144 (CL_#1076_antiCD19_1_HSA-1_337_DSS AA)

EF ATM AVM APRTL VLLLS GAL ALT QT WAGDIQLT Q SP AS LAV S LGQRATIS CKAS Q S VD YD GDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQ STEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAF S S YWMN WVKQRPGQGLE WIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADE S S ST AYMQLS SLAS EDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFK ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLR ETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYE IARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKD VFLGMFLYEYARA*GS

ID NO: 145 (CL #1070_HER2_scFv_Fc_L351Y_F405A_Y407V NT)

GAATT CGCCACCAT GGCCGT G AT GGC ACCTAGAACACT GGT CCT GCT GCTGAGCGGAGC C CT GGC ACT GACAC AGACTTGGGCCGGACAGGT CCAGCT GGTGCAG AGCGGGGCAGAGG TC AAGAAACCCGG AGAAAGT CT GAAGAT CT CAT GC AAAGGGAGT GG AT ACT CATT CACC A GC T ATT GGATT GCCTGGGT G AGGC AG AT GC CT GGC AAGGGGCT GGAAT AC AT GGGCCT G AT C TATCC AGGGGACAGCG AT AC AAAAT ACTCCCCCT CTTT CCAGGGCCAGGT CACAATTT C C GT GGAC AAG AGT GT CT CAACT GCCT AT CT GC AGT GGAGCT CCCT GAAACCT AGCG ATT C C GC AGT GT ACTTTT GT GCC AGGC ACG ACGT CGGGT ATT GC AC AG AT CGC ACTT GT GCT AA G T GGCC AG AGT GGCT GGG AGT GT GGGG AC AGGGAACC CT GGT CAC AGT GT CT AGT GG AG GA GGAGGCT CAAGCGG AGG AGGCT CT GGAGGAGGAGGGT CT CAGAGTGT GCT GACT CAGC CA CCTT C AGT C AGCGC AGCT CCT GG AC AG AAGGT GACC AT CT CCTGCTCT GGC AGCT CT AG T AAC ATT GGCAACAATT ACGT GAGCT GGTAT CAGC AGCT GCCT GGCACCGCCCCAAAGCT G CT GAT CT ACG ACC AC AC AAAT CGGCCCGCTGGGGTGCCT GAT AGATT C AGT GGGT C AAA A AGCGG AACCT CCGCTT CT CT GGCAATTAGCGGCTTT CGCT CCGAGGACGAAGCT G ATTA C T ATT GT GCAT CTTGGGACT AC AC ACT G AGT GGCTGGGTGTT CGG AGGCGGG ACT AAGCT G ACCGT GCT GGGGGCAGCCG AACCAAAGT CAAGCGATAAAACT C ATACCT GCCC ACC AT GT CCT GC ACC AG AGCT GCT GGG AGG ACCTT C CGTGTTCCTGTTTCCT CCAAAGCC AAAAG A C ACCCT GAT GAT C AGCC G AAC ACC AG AAGT GACTT GCGT GGT CGT GGACGT CT CCC ACG A G GACCCCGAAGT GAAGTTT AACT GGT ACGT GGAT GGCGT CG AGGT GCATAAT GCCAAGA CC AAACCCCG AG AGG AAC AGT AC AACT C AACTT AT CGGGTCGT GAGCGT CCT G ACCGT GCT G CACCAGGACT GGCT GAACGGG AAAG AGT ATAAGTGCAAAGT GT CTAAT AAGGCCCT GC CC GCTCCTATCGAGAAAACAATTAGCAAGGCAAAAGGCCAGCCAAGAGAACCCCAGGTGT AC ACTT AT CCCCCTTCT AGGGACGAGCT GACCAAGAACC AGGT GAGCCT GAC AT GT CT GGT C AAAGGATTTTACCCCAGT GAT ATT GCT GT GGAGT GGGAATCCAATGGCCAGCCT GAAAA c

AATT AT AAG ACC AC ACC ACCCGT GCT GG ACT CCG ATGG AT CTTTCGCTCT GGT GTCCAA G CT G ACT GT CG AT AAAT CTCGGT GGC AGC AGGGC AACGT GTTT AGTT GTTC AGT C AT GC A T GAGGCACT GC ACAATC ATTAC AC AC AGAAGAGCCT GT CCCT GT CT CCCGGC AAAT G AG GA TCC

Q ID NO: 146 (CL #1070_HER2_scFv_Fc_L351Y_F405A_Y407V AA)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGQVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTS YWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPGDSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSA YYECARHD YGY CTDRT C AKWPE WLGVWGQGTLVTV S SGGGGS S GGGSGGGGSQS VLT QP PSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDHTNRPAGVPDRFSGSKSG TSASLAISGFRSEDEADYYCASWDYTLSGWYFGGGTKLTVLGAAEPKSSDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTYPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS

Q ID NO: 147 (CL_#1039)

GAATT CGCT AC AAT GGC CGT G AT GGC ACC CCG AAC ACT GGTCCT GCT GCT GAGCGGCGC A CT GGC ACT G AC AC AG ACTTGGGCT GG AG AAC CT AAG AGCT CCG AC AAAACCC AC AC AT GC CCCCCTT GT CCAGCT CCAGAACTGCT GGGAGGACCATCCGT GTT CCT GTTT CC ACCCAA G CCCAAAGAT ACACT G AT GAT CT CT CG AACT CCCG AGGT CACCT GCGTGGT CGT GGACGT C AGT CACGAGGACCCCGAAGT CAAGTT CAACT GGTACGT GGACGGCGT CGAAGT GCAT A AT GCAAAG ACT AAACCACGGGAGGAAC AGT AC AACT CAACAT AT AGAGT CGT GAGCGTCC TG ACT GT GCT GCAT C AGG ATT GGCT G AACGGCAAGG AGT AT AAGT GCAAAGT G AGC AAT A AG GCCCT GCCT GCTCC AAT CGAGAAAACCATTAGCAAGGCAAAAGGGCAGCCCAGGG AAC CT CAGGT GT AC ACCCT GCCT CC AAGCCGC G ACG AGCT G AC AAAG AACC AGGT CTCCCTGCT G T GT CT GGT GAAAGG ATT CT AT CCT AGT GAT ATTGCCGT GGAGT GGGAATCAAAT GGCCA G CCAGAG AAC AATT AC AT G ACTT GGCCCC CTGTGCT GG ACT CT GAT GGG AGTTT CTTTCTG T ATT CC AAGCT G ACC GT GGAC AAAT CT AG AT GGC AGC AGGG AAACGT CTTTT CTT GT AG T GT GAT GC ACGAAGCCCT GC AC AAT C ATT ACAC AC AG AAGT C ACT G AGCCT GT CCCCT GG

C

AAAT G AGG ATCC

ID NO: 148 (CL_#1039, AA)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLLCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYMTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK*GS

Q ID NO: 149 (CL_#719_scFv_FD5_Fc_IGG1_CH-A_L351Y_S400E_F405A_Y407V, NT>

GAATT CGCC ACC AT GGCCGT G AT GGCT CCT AG AACCCT GGTGCT GCT GCT GT CT GG AGC T CT GGCT CT GACT C AGACCT GGGCT GGAGACATCCAG AT GACCCAGT CTCCAT CCTCCCT G T CTGCAT CT GTAGGAG ACAGAGT CACCAT C ACTT GCCGGGC AAGT CAGGACGTTAACAC C GCT GT AGCTT GGT AT C AGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCT AAGCTCCT GAT CT ATT CT GC A TCCTTTTT GT ACAGT GGGGT CC C AT C AAGGTT C AGT GGC AGT CG AT CT GGG AC AG ATTT C ACT CT CACCAT C AGC AGT CT GC AACCT GAAGATTTT GCAACTT ACT ACT GT CAAC AGC A T TAC ACT ACCCC ACCC ACTTT CGGCCAAGGG ACC AAAGT GGAGAT CAAAGGT GGTTCT GG T GGTGGTTCTGGTGGT GGTTCTGGT GGT GGTT CT GGTGGT GGTT CTGGT GAAGT GC AGCT G GT GGAGT CT GGGGG AGGCTT GGTAC AGCCT GGCGGGTCCCT GAGACT CT CCT GT GCAGC C T CTGG ATT CAAC ATT AAAGAT ACTT AT ATCCACT GGGT CCGGC AAGCT CC AGGG AAGGG C CT GGAGT GGGT CGC ACGT ATTT ATCCC AC AAAT GGTT AC AC ACGGT AT GCGG ACT CT GT G AAGGGCCGATT CACCATCT CCGCAG ACACTT CCAAGAAC ACCGCGT AT CT GCAAAT G AA C AGT CT GAG AGCT GAGGACACGGCCGTTT ATTACT GTT CAAG AT GGGGCGG AGACGGTTT C TACGCT AT GGACT ACT GGGGCCAAGGGACCCT GGT CACCGT CT CCT CAGCCGCCG AGCC C AAG AGC AGC GAT AAG ACCC AC AC CTGCCCTCCCTGT CC AGCT CC AG AACT GCT GGG AG GA CCTAGCGT GTTCCT GTTT CCCCCTAAGCC AAAAGACACT CT GAT GATTT CCAGG ACT CCC GAGGT G AC CTGCGTGGTGGT GG ACGT GTCT CACG AGG ACCCCG AAGT GAAGTT C AACT GG

T ACGT GG AT GGCGT GG AAGT GC AT AAT GCT AAG AC AAAACC AAG AG AGG AAC AGT ACA AC T CCACTT AT CGCGT CGT GAGCGT GCT GACCGT GCT GCACC AGGACTGGCT GAACGGGAA G GAGT AT AAGT GCAAAGT CAGT AAT AAGGCCCT GCCT GCTCCAATCGAAAAAACC AT CT C T AAGGCCAAAGGCCAGCCAAGGGAGCCCCAGGTGTACACATACCCACCCAGCAGAGACG AA CT GAC C AAG AACC AGGT GT CCCT G AC AT GTCTGGT GAAAGGCTT CT AT CCT AGT G AT AT T GCT GT GGAGTGGGAAT CAAAT GGAC AGCCAGAGAAC AATTACAAGACC ACACCT CCAG TG CT GGACG AGG AT GGC AGCTT CGCCCT GGT GT CCAAGCT G AC AGTGGAT AAAT CT CG AT G G CAGC AGGGG AACGT GTTT AGTT GTT CAGT GAT GC AT G AAGCCCT GC AC AAT C ATT AC AC T C AGAAG AGCCT GTCCCT GT CT CCCGGC AAAT G AGG AT CC

ID NO: 150 (CL_#719_scFv_FD5_Fc_IGG1_CH-A_L351Y_S400E_F405A_Y407V, AA)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTA VAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTP PTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNI KDT YIH WVRQ APGKGLE WVARIYPTN GYTRY AD S VKGRFTIS ADT SKNT AYLQMN S LRAE DTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAAEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTYPPSRDELTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDEDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS

ID NO: 151 (CL_#720_scFv_FD5_Fc_IGG1_CH-B_T366I N390R K392M T394W)

GAATT CGCC ACC AT GGCCGT GAT GGCT CCT AG AACCCT GGTGCT GCT GCT GT CT GG AGC T CT GGCT CT GACT C AGACCT GGGCT GGAGACATCCAG AT GACCCAGT CTCCAT CCTCCCT G T CTGCAT CT GTAGGAG ACAGAGT CACCAT C ACTT GCCGGGCAAGT CAGGACGTTAACAC C GCT GT AGCTT GGT AT C AGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCT AAGCTCCT GAT CT ATT CT GC A TCCTTTTTGT ACAGT GGGGTCC C AT C AAGGTT CAGT GGC AGT CG AT CT GGG AC AG ATTT C ACT CT CACCAT CAGC AGT CT GC AACCT GAAGATTTT GCAACTT ACT ACT GT CAAC AGC A T TAC ACT ACCCC ACCC ACTTT CGGCCAAGGG ACC AAAGT GGAGAT CAAAGGT GGTTCT GG

GGTGGTTCTGGTGGT GGTTCTGGT GGT GGTT CT GGTGGT GGTT CTGGT GAAGT GC AGCT

GT GGAGT CT GGGGGAGGCTT GGTACAGCCT GGCGGGT CCCT GAGACT CT CCT GT GCAGC

C

T CTGGATTCAACATTAAAGAT ACTT ATATCCACT GGGT CCGGCAAGCTCCAGGGAAGGG

C

CT GGAGT GGGT CGC ACGT ATTT ATCCC AC AAAT GGTT AC AC ACGGT AT GCGG ACT CT GT

G

AAGGGCCG ATT CACCAT CT CCGCAGACACTT CCAAGAACACCGCGT AT CT GCAAAT GAA

C

AGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTTCAAGATGGGGCGGAGACGGTTT

C

TACGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCGCCGAGCC

C

AAGAGCAGCGATAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAG

GA

CCT AGCGT GTTCCT GTTTCCCCCT AAGCC AAAAG AC ACT CT G AT G ATTT CC AGG ACT CCC

GAGGT GACCT GCGT GGTGGT GGACGT GT CT CACG AGG ACCCCGAAGT GAAGTT CAACT

GG

T ACGT GG AT GGCGT GG AAGT GC AT AAT GCT AAG AC AAAACC AAG AG AGG AAC AGT ACA

AC

T CCACTT AT CGCGT CGT G AGCGT GCTGACCGT GCT GCACCAGGACTGGCT GAACGGGAA

G

GAGT AT AAGT GCAAAGT CAGT AAT AAGGCCCT GCCT GCT CCAAT CGAAAAAACCAT CT C

T

AAGGCCAAAGGCCAGCCAAGGGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCACCCAGCAGAGACG

AA

CT GAC C AAG AACC AGGT GT CCCT G AT CT GT CT GGT GAAAGGCTT CT AT CCT AGT GAT AT

T

GCT GT GGAGT GGG AAT C AAAT GG AC AGCC AG AGAAC AG AT AC AT GACCT GGCCT CC AG

TG

CT GGAC AGCG AT GGC AGCTTCTT CCT GT ATT CC AAGCT GAC AGT GGAT AAAT CT CG AT G

G

CAGCAGGGGAACGTGTTTAGTTGTTCAGTGATGCATGAAGCCCTGCACAATCATTACAC

T CAGAAG AGCCT GT CCCT GT CT CCCGGC AAAT GAGGAT CC

134. SEQ ID NO: 152 (CL_#720_scFv_FD5_Fc_IGG1_CH-B_T366I N390R K392MT394W, AA)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTA

VAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTP

PTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNI

KDT YIH WYRQ APGKGLE WV ARIYPTN GYTRY AD S VKGRFTIS ADT SKNT AYLQMN S LRAE

DTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAAEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL

FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEYKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV

VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV

SLICLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENRYMTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS

135. SEQ ID NO: 153 (CL #719_scFv_FD5_Fc_IGG1_CH-A_L351Y_S400E_F405A_Y407V) -> ver arriba

CL #716 Fc IGG1 CH-B T366I N390R K392M T394W>

GAATT CGCCACC AT GGCCGT GAT GGCT CCT AGAACCCT GGT GCT GCT GCT GT CT GGAGC T CT GGCT CT GACTCAGACCT GGGCT GG AGAGCCCAAGAGC AGCGATAAGACCCAC ACCT GC CCTCCCT GT CC AGCT CCAGAACT GCT GGGAGGACCT AGCGT GTT CCT GTTT CCCCCTAAG CC AAAAG AC ACT CT GAT G ATTT CC AGG ACT CCCG AGGT G ACCTGCGT GGT GGT GGACGT G T CT C ACG AGG ACCCCG AAGT GAAGTT C AACT GGT ACGT GG AT GGCGT GG AAGTGC AT A AT GCTAAGACAAAACCAAGAGAGGAACAGTACAACTCCACTTATCGCGTCGTGAGCGTGC TG ACCGT GCT GCACCAGGACT GGCT GAACGGGAAGGAGT AT AAGT GCAAAGT CAGTAAT A AG GCCCTGCCT GCTCC AAT CG AAAAAACC AT CTCT AAGGC C AAAGGCC AGCC AAGGG AGC CC CAGGT GT ACACACT GCC ACCCAGC AGAGACGAACT GACCAAGAACC AGGT GT CCCT GA TC TGTCTGGT GAAAGGCTTCT AT CCT AGT GAT ATT GCT GT GG AGTGGGAAT C AAAT GG AC A G CC AGAGAAC AGAT AC AT GACCT GGCCT CC AGT GCT GGAC AGCGAT GGCAGCTT CTT CCT G T ATT CC AAGCT G AC AGT GG AT AAAT CT CG AT GGC AGC AGGGG AACGT GTTT AGTT GTTC A GT GAT GC AT GAAGCCCT GC ACAAT CATT ACACT CAGAAG AGCCTGT CCCT GT CT CCCGG C AAAT G AGGATCC

Q ID NO: 154 (CL_#719_scFv_FD5_Fc_IGG1_CH-A_L351Y_S400E_F405A_Y407V)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTV LHQDWLNGKEYKCKYSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQYYTLPPSRDELTKNQVSLICLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENRYMTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK*GS

Q ID NO: 155 (CL_#1102_MM-111)

GAATT CGCG ACC AT GGCCGT GAT GGCTCCT CGGACACT GGT GCTGCTGCT G AGT GGGGC T CTGGCTCT GAC AC AG ACTT GGGCT GG AC AGGT GCAGCT GC AGG AGT CCGG AGG AGG AC TG GT GAAGC C AGG AGGGTCCCT G AG ACT GTCTTGCGCCGCTAGT GGCTT CAC CTTT AGCT C C TACT GG AT GT CTT GGGT GAGGCAGGC ACCT GGCAAGGG ACTGGAGT GGGTGGCAAAC A TC AATCGCGACGGATCAGCCAGCTACTATGTGGATAGCGTCAAGGGCAGGTTTACAATTAG T CGCGACGATGCTAAAAACT CACT GT ACCT GCAGAT GAAT AGCCTGCGGGCAGAGGAT A CT GCCGT GT ACT ATTGCGCC AG AG AC AGGGG AGT CGGCT ATTTCGAT CT GT GGGGG AG AG GA ACT CT GGT GACCGT CT CTAGT GCT AGCACCGGAGGCGGGGGATCTGGCGGAGGAGGCA GT GGAGGAGGAGGGT CCCAGT CT GCT CT GAC AC AGCC AGCAAGT GT GT CAGGCAGCCCCG GG CAGT CAAT CACT ATT AGCT GT ACT GGCACCT CAAGCG ACGT GGGAGGCT AC AACTTT GT C AGCT GGT ATCAGCAGCACCCT GGAAAAGCCCCAAAGCT GAT GAT CT ACGACGTGAGCG AT CGACCTTCCGGCGT CT CT GAT CGGTT CTCCGGGT CTAAG AGT GGAAAT ACT GCCTCCCT G AT C ATTT CT GGGCT GCAGGCT GACGAT GAGGC AGACT ACT ATT GCTCCT CTTAT GGAAG T T CAAGC ACCCATGT GAT CTTCGGGGG AGGCACAAAAGT GACT GTCCT GGGCGC AGCCT C A GAT GCT CACAAAAGCGAGGT GGCACAT CGGTT CAAGGACCT GGGGGAGGAAAACTTTA AA GCCCT GGT GCT GATT GCATTCGCCC AGT ACCT GC AGC AGAGCCCATTTGAGGACCACGT G AAGCT GGT CAACGAGGT G ACCGAGTT CGCCAAAACAT GCGT GGCCGACGAGT CCGCTG AA AATT GT GAT AAGT CT CT GC AT ACT CT GTTT GG AG AT AAACT GT GC ACCGT GGCC AC ACT G CGAGAG ACCTACGGCGAAATGGCAGACTGCT GT GCCAAGCAGGAGCCAGAAAGAAAC GAG T GCTTCCT GCAGCACAAAGACGATAACCC AAAT CTGCCACGACT GGT GCGACCAGAAG TG GACGT C AT GT GT ACT GCTTT CC ACG AT AAT GAGO AAAC CTTT CT GAAG AAAT ACCT GT A T GAG ATCGCCCGG AGACATCCCT ACTTTT AT GCACCT GAACT GCT GTTCTTT GCCAAAAG A TAC AAGGCT GC ATT CACCGAGT GCT GT C AGGCCGCT GAT AAAGC AGCCT GCCT GCT GCC A AAGCT GGACGAGCT GCGAGAT GAAGGCAAGGCCTCCT CT GCT AAAC AG AGACT GAAGT GT GCCAGCCTGCAGAAATTCGGCGAGAGGGCTTTTAAGGCTTGGGCAGTGGCACGACTGTC C CAG AGATTCCCT AAGGCAGAGTTT GCCGAAGT CT CT AAACT GGT GACT G ACCT GACCAA G GT GCAC ACCGAGT GCT GT CAT GGCG ACCT GCT GGAAT GCGCCGACGAT CGCGCT GAT CT G GC AAAGT AC AT CT GT GAGAACC AGGACAGCATT AGTT CAAAGCT GAAAGAGT GCT GT G AA AAACCCCT GCT GGAGAAGAGCCACT GCAT CGCAG AGGT GGAAAACGACGAAATGCCCG CC GAT CT GCCT AGT CT GGCT GC AG ACTTCGT GGAGT C AAAAG AT GT CT GT AAG AATT ACGC T GAAGCAAAGGATGTGTTCCTGGGCATGTTTCTGTACGAGTATGCTAGGCGCCACCCAGA C T ACT CCGTGGTCCTGCTGCT G AGGCT GGCCAAG ACCT AT GAG ACCAC ACT GG AAAAAT G C T GTGCCGCT GC AGATCCCC AT GAGTGCTAT GCCAAAGT GTT CGACG AGTTC AAGCCACT G GTCGAGGAACCCCAGAACCT GATTAAGC AGAATTGT GAGCT GTTT GAACAGCT GGGCG AG TACAAATT CCAGAACGCCCT GCT GGTGCGCTATACAAAGAAAGTCCCT C AGGT GAGCAC A CC AACT CT GGT GGAAGT CT CCAGG AAT CTGGGAAAGGT CGGCTCTAAAT GCT GT AAGC A C CCCGAGGCCAAACGCAT GCCTT GCGCT GAAG ATTACCT GT CCGTGGTCCT GAACCAGCT G T GTGT GCT GCAT GAGAAGACCCCAGT CT CT GACCGGGT GACAAAATGCT GT ACT GAAAG T CT GGT GAAT CG ACGGCCCT GCTTT AGCGCCCT GGAGGT GGAT GAAAC ATAT GT CCCT AA G GAGTT CC AGGCT GAAACCTT C AC ATTTCAC GC AG AC AT CT GT ACT CTGT CCG AG AAAG A A AGACAGATTAAGAAACAGACCGCCCTGGTCGAGCTGGTGAAGCATAAACCCAAGGCCA CA AAAGAACAGCT GAAGGCT GT GAT GGACGATTT CGCCGCTTTT GTCGAGAAAT GCT GTAA G GCT GACG AT AAGG AAACTT GCTTT GCAGAGGAAGGG AAG AAACT GGT GGC AGC AT CCC AG GCT GCACT GGG ACT GGCAGCT GCACT GCAGGT CCAGCT GGT GCAGT CT GGCGCCG AGGT G AAG AAACCT GGGG AAAGT CT GA AAAT CTCCT GT AAGGGC AGT GGGT ACT C ATT C ACC A GC TATT GGATT GCCT GGGT GAGGC AGAT GCCAGGAAAGGGCCT GGAGT ACAT GGG ACT GA TC T AT CCT GGCG AC AGCG AT AC AAAAT ACT C ACC AAGCTTT C AGGGCC AGGT C AC AATT AG C

GT GGAT AAGT CCGTCT CT ACT GCCT AT CT GC AGT GGAGCT CCCT G AAACCT AGT G ACT C A GCCGT GT ACTT CT GCGCT CGCC AC G ACGTCGGCT ATT GC AC AG ATCG AACTT GT GCC AA G T GGCC AG AGT GGCT GGG AGT GT GGGG AC AGGGAACC CT GGT GAC AGT CT CT AGT GGGG GA GGCGGGT CAAGCGG AGGAGGGTCCGGAGG AGGAGGAAGCC AGT CCGT GCT GACCCAG CCC CCTT CT GT CAGT GCCGCTCCT GGCC AGAAGGTGAC AAT CT C AT GCAGCGGGTCCTCT AG T AAC ATT GG AAAC AATT ACGT G AGCT GGT AT CAGC AGCT GCC AGGGACCGCT CC C AAGC TG CT G AT CT ACG AT C AT AC AAAT AG ACCT GC AGG AGT GCC AG AC AGGTTTT CCGGCTCT AA A AGT GGGACCT CAGCCAGCCT GGCT ATT AGCGGCTT CCGGT CCGAGG ACG AAGC AG ATT AC T ATT GTGCCTCCT GGGACT AT AC ACT GTCTGGCTGGGT GTTCGGCGGGGG AACT AAGCT G ACCGT CCT GGGGT G AGG AT CC

ID NO: 156 (CL_#1102_MM-111, AA)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGQVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSS YWMSWVRQAPGKGLEWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCARDRGVGYFDLWGRGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSP GQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLII SGLQADDEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVLGAASDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL VLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRET YGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIA RRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQ KFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYI CENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDV FLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQN LIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMP CAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFTF HADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFA EEGKKLVAAS Q AALGL AAALQ V QLV Q S G AE VKKPGE S LKIS CKGS GY S FT S Y WIA WVRQM PGKGLEYMGLIYPGDSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARHDV GYCTDRTCAKWPEWLGVWGQGTLVTVSSGGGGSSGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSAAPGQ KVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGF RSEDEADYYCASWDYTLSGWVFGGGTKLTVLG*GS

ID NO: 157 (V1088)

GAATT CGCG ACC AT GGCT GT G AT GGCT CCT AG AAC ACT GGT GCT GCTGCT GT CCGGGGC T CT GGCT CT GACT C AG ACTT GGGCTGGGC AGGT GCAGCT GC AGGAGT CT GGAGG AGG AC TG

GT GAAGC C AGG AGGGT CTCT GCG ACT GAGTT GCGCCGCTT CAGGCTT CACCTTT AGCT C C TACT GG AT G AGCT GGGT CCGCCAGGC ACC AGGGAAGGGACT GGAGT GGGT GGCCAACA TC AAT CG AG ACGGG AGCGCTTCCT ACT AT GT GGAT AGCGT C AAGGG AAGGTTT AC AATT AG T CGCGACGATGCCAAAAACT C ACT GTACCT GCAGAT GAAT AGCCTGCGAGCT GAGGATA CT GC AGT CT ACT ATTGCGCT AG AG AC AGGGGCGT GGGGT ATTTCGAT CT GT GGGG AAG AG GC ACT CT GGT GACCGT CT CTAGT GCAAGCACCGGAGG AGG AGG AT C AGGCGG AGG AGGCA GC GGAGGAGGCGGGTCTCAGAGTGCCCTGACCCAGCCAGCTTCAGTGAGCGGGTCCCCAG GA CAG AGC AT C ACAATTTCCT GTACTGGCACCT CAAGCG ACGT CGGAGGCT ACAACTTT GT G AGCT GGT ATCAGCAGCACCC AGGCAAAGCCCCCAAGCT GAT GAT CTACGACGTCT CCG AT CG ACCT AGCGGGGT GT CCG AT CGGTTCTCT GGAAGT AAAT C AGGCAAT ACC GCCTCT CT G AT C ATT AGT GGGCT GC AGGCCG ACG AT G AGGCT GACT ACT ATT GCTCCTCTT AT GG AAG T T CAAGC ACACATGT GAT CTT CGGGGG AGGCACAAAAGT GACT GTCCT GGGAGCAGCCT CC GAT GCAC ACAAAT CTGAGGT GGCCCAT CGGTTCAAGGACCT GGGCGAGGAAAACTTTA AA GCCCT GGT GCT GATT GCCTTCGCT CAGT ACCT GCAGCAGAGCCCCTTTGAGGACCACGT G AAGCT GGT CAACGAGGT G ACCGAGTT CGCCAAAACAT GCGT GGC AGACGAGTCCGCCG AA AATT GT GAT AAGT CT CT GC AT ACT CTGTTT GG AG AT AAACT GT GT ACCGT GGCC AC ACT G CGGGAG ACCTAT GGCGAAAT GGCT GACTGCT GT GCAAAGCAGGAGCCCGAAAGAAACG AG TGCTTCCT GCAGC AC AAAG ACG AT AACCC CAAT CTGCCTCGCCTGGT GCG ACCT G AAGT G GACGT C AT GT GT ACT GCCTT CC AC GAT AAT G AGG AAACCTTT CT GAAG AAAT ACCT GT A T GAG ATCGCT CGG AG AC AT C CCT ACTTTT AT GCCCCT GAACT GCTGTTCTTT GCT AAAAG A TACAAGGCT GCATT CACCGAGT GCT GT CAGGCCGCT GAT AAAGCAGCCT GCCT GCT GCC C AAGCT GGACGAGCT G AGAGAT GAAGGGAAGGCTT CCT CTGCAAAACAG AGGCT GAAGT GT GCT AGCCT GC AGAAATT CGGCGAGAGGGCCTTCAAGGC AT GGGC AGT GGCTCG ACT GA GC CAG AGATTCCCT AAGGCCGAGTTT GCT GAAGTCT CCAAACT GGT GACT G ACCT G ACCAA GT GCAC ACAGAGT GCT GT CAT GGCGACCT GCT GGAAT GCGCCGACGAT CGCGCAG AT CT G GCC AAGT AC AT CT GT G AG AAT C AGG ACTCT ATT AGTT CAAAGCT GAAAG AGT GCT GT G A A AAACCCCT GCT GGAGAAG AGCCACT GCAT CGCCGAGGT GGAAAACGACGAAAT GCCT G CT GAT CT GCC AAGT CTGGCT GC AG ACTTT GT CG AGT C A AAAG AT GT GT GT AAG AATT ACGC A GAAGCCAAGGAT GT GTT CCT GGGCAT GTTTCT GT ACG AGT AT GCAAGGCGCC ACCCT GA C T ACT CCGTGGTCCTGCTGCT G AGGCT GGCT AAG ACCT AT GAG ACCAC ACT GG AAAAAT G C T GT GCCGCTGC AGATCC ACAT GAGT GCT AT GCCAAAGT CTT CGACGAGTTCAAGCCACT G GT GGAGGAACCCCAGAACCT G ATTAAGCAGAATT GT GAGCT GTTT GAAC AGCT GGGCG AG TACAAATT CCAGAACGCCCT GCT GGT GCGCT ATACAAAGAAAGTCCCT C AGGT GAGCAC A CC AACT CT GGT GG AAGT CT CC AGG AAT CTGGGC AAGGT CGGGTCT AAAT GCT GT AAGC A C CCCGAGGCTAAACGC ATGCCTT GCGC AGAAGATTACCTGT CT GTGGT CCT GAACCAGCT G T GT GT GCT GCAT GAGAAGAC ACC AGT CAGT GACCGGGT GACAAAAT GCT GT ACT GAAA GT CT GGT GAATCGACGGCCTT GCTTTTCAGCCCT GG AGGT CGAT GAAACTTAT GT GCC AAA G GAGTT CCAGGCAGAAACCTTCAC ATTT CACGCCG ACAT CT GT ACACT GT CCGAGAAAGA A AGACAG ATTAAGAAACAG ACTGCCCT GGT CGAGCT GGT GAAGCAT AAACCCAAGGCTA CT AAAG AAC AGCT GAAGGCAGT CAT GGACGATTT CGCCGCTTTT GTGGAGAAATGCT GT AA G GCAGACGAT AAGGAAACCT GCTT CGCCGAGGAAGGCAAGAAACT GGT GGC AGCCT CT C AG GCT GCACT GGGGCTGT GAGG AT CC

Q ID NO: 158 (V1088, AA)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGQVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSS YWMSWVRQAPGKGLEWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCARDRGVGYFDLWGRGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSP GQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLII SGLQADDEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVLGAASDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL VLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRET YGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIA RRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQ KFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYI CENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDV FLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQN LIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMP CAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFTF HADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFA EEGKKLVAASQAALGL*GS

Q ID NO: 159 (V1089, NT)

GAATT CGCGACCAT GGCT GT G AT GGCT CC ACGAACCCT GGT CCT GCT GCT GT CCGGCGC A CT GGC ACT G ACT C AG ACTT GGGCT GGGGAT GCT C AT AAGT CT GAGGT GGC AC AC AGGTT C AAAG AT CT GGGCG AGG AAAACTTT AAGGCCCT GGTCCT GAT CGCTTT CGC AC AGT ACCT G CAGCAGAGCCCTTTTGAGGACCACGTGAAACTGGTCAACGAGGTGACCGAGTTCGCCA AG ACATGCGT GGCT GACG AGT CAGCAGAAAATT GT GATAAAAGCCT GCAT ACCCT GTTT GG G GAT AAGCT GT GCACCGT GGCC ACACT GAG AGAGAC AT ACGGAGAAAT GGCCGACT GCT GT GCTAAAC AGGAGCCT GAAAGGAACG AGTGCTTCCT GCAGC ATAAGG ACGAT AACCCAA AT CT GCCC AG ACT GGT GAGGCC AG AAGT GGACGT CAT GT GT ACT GCTTT CC ACGAT AAT G A G GAAACCTTT CT G AAG AAAT ACCT GT AT G AGAT CGCCCGG AG AC AT CCTT ACTTTT AT GC A CCAGAACT GCTGTT CTTTGCCAAACGCT ACAAGGCCGCTTT CACCGAGT GCT GT CAGGC A GCCG AT AAAGCT GCAT GC CTGCT GCCC AAGCT GG ACG AGCT GCG AGAT GAAGGGAAGG CA AGCTCCGCCAAAC AGCGGCT GAAGT GT GCT AGCCTGC AGAAATT CGGAGAGCGAGCCT TC AAGGCAT GGGCT GTGGCACGACT G AGT CAGCG ATT CCCTAAGGCT GAGTTTGCAGAAGT C T CAAAACT GGTGACT G ACCT G ACCAAGGT GCACACCG AGT GCT GT CAT GGCGACCT GCT G GAAT GCGCCG ACG AT AG AGCC GAT CTGGCT AAGT AC AT CT GT GAG AAT C AGG ACT CT AT T T CT AGT AAGCT G AAAG AGT GCT GT GAAAA AC CCCTGCT GGAG AAG AGCC ACT GCAT CG CC GAGGT GGAAAACGACGAAATGCCT GCT GAT CT GCCATCCCT GGCCGCTGACTTCGT GGA G T CT AAAG AT GT CT GT AAG AATT ACGCCG AAGCT AAGG AT GT GTT CCT GGGC AT GTTTCT G ACG AGT AT GCT AGGCGCCACCCAGACTACAGCGTGGT CCT GCTGCT GCGGCT GGCCAA A

ACCT AT G AG ACC AC ACT GG AAAAGT GCTGT GC AGCCGCT G AT CCCC AT G AGT GCT AT GC C AAAGT GTTCG ACGAGTT CAAGCCCCT GGTCGAGGAACCT C AGAACCT GAT CAAGCAGA AT T GT GAGCT GTTTGAACAGCT GGGCGAGT ACAAGTT CCAG AACGCCCT GCT GGT GAG AT A T ACCAAG AAAGT CCCACAGGT GAGTACT CCCACCCT GGT GGAGGT CT CACGCAAT CT GG GA AAAGT GGGC AGC AAAT GCT GT AAGC ACCCT GAGGCC AAGCG AAT GCC AT GCGCT G AAG AT T ACCT GT CT GT GGT CCT GAACC AGCT GTGTGTGCT GCAT G AG AAAACT CC AGT C AGT G A C AGGGTGACAAAGTGCTGTACTGAATCCCTGGTGAATCGACGGCCATGCTTTTCTGCCCT G GAGGT GGAT GAAACATAT GT CCCCAAAGAGTT CCAGGCT GAAAC ATT CACTTTT CACGC A GACAT CT GT ACT CT GT CCG AGAAGGAACGCCAGATTAAGAAAC AGACCGCCCTGGT CG AG CT GGT GAAGC AT AAACCC AAGGCC AC AAAAG AAC AGCT G AAGGCT GT GAT GG ACG ATT TC GC AGCCTTT GTCGAG A AATGCT GT AAGGC AG ACG AT AAGG AAACTT GCTTT GCCG AGG AA GGC AAG AAACT GGTGGCT GC AAGCC AGGC AGCT CT GGGACT GGC AGC AGCT CT GC AGG TC CAGCT GGT GC AGT CCGG AGCAG AGGT GAAGAAACCT GGAG AAAGT CT GAAAAT CT CCT GT AAGGGAAGCGGCT ACT CCTTCACCT CTTATTGGATT GCCT GGGT GCGGCAGAT GCCAGG G AAAGG ACT GG AGT AC AT GGGCCT GAT CT AT CCCGGGG AC AGCGAT AC AAAGT AC AGT C CT T CATTT C AGGGCCAGGT CACAATTT CCGT GGAT AAAAGCGT CT CCACT GCCT AT CT GCA G T GGT CAAGCCT GAAGCCCT CT GAC AGT GC AGT GT ACTT CT GCGCCAGGC ACGACGT CGG C T ATT GCAC AG AT CGC ACTT GT GCC AAGT GGCCT GAGT GGCT GGG AGT GT GGGG AC AGG GA ACCCT GGT C ACAGT CT CCT CT GGCGG AGG AGGCAGTT CAGG AGG AGGCAGCGGAGGAG GA GGGT CAC AGAGCGT GCT GAC AC AGCCACCTT CCGT CT CT GCAGCACCAGGAC AGAAAG TG ACT AT C AGTT GCT C AGG AAGCT CCT CT AAC ATT GGC AAC AATT ACGT GT CCT GGT AT C A G CAGCT GCCCGGAACCGCT CCT AAGCT GCT GAT CT ACGAT CACACAAATCGACC AGCAGG A GT GCC AG ACCGGTT CAGCGGGT CC AAGT CTGGAACT AGT GCAT CACT GGCC ATTAGCGG G

TT CAGGT CCG AGG ACGAAGCT GATT ACT ATTGCGC AT CTT GGGACT AT ACCCT GAGT GG A GGGT GTT CGGAGGCGGGACTAAGCT GACCGT CCT GGGCT G AGG AT CC

Q ID NO: 160 (V1089, AA)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYL QQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCC AKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISS KLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYE YARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLS WLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFTFHADICTL SEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFYEKCCKADDKETCFAEEGKKLV AASQAALGLAAALQVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEY MGLIYPGDSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARHDVGYCTDRT CAKWPEWLGVWGQGTLVTVSSGGGGSSGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSG SSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEAD YYCASWDYTLSGWVFGGGTKLTVLG*GS

Q ID NO: 161 (CL_#1105_antiHER3_1_HSA-1_337_DSS)

GAATT CGCGACCAT GGCCGT GAT GGCTCCT AGAACACTGGT GCTGCT GCT GT CCGGGGC T CT GGCT CT GACT CAG ACTT GGGCTGGGC AGGT GCAGCT GCAGG AG AGCGG AGGAGGAC TG GTGAAACCAGGAGGGTCTCTGCGACTGAGTTGCGCAGCTTCAGGCTTCACCTTTAGCTC C T ACT GG AT GTCCTGGGT CCG AC AGGC AC CT GGGAAGGG ACT GG AAT GGGT GGCC AAC A TC AAT CGGGACGGAAGCGCTTCCT ACT AT GT GGAT AGCGT C AAAGGCCGCTTT ACC ATT AG T CG AG ACG AT GCT AAGAACT C ACT GTACCT GCAGATGAAT AGCCT GCGCGCT G AGGAT A CA GC AGT CTACTATTGCGCAAGGGACCG AGGAGT GGG AT ATTT CGAT CT GT GGGGACG AG GC ACT CTGGT G ACCGT CTCT AGT GCCAGCACAGGCGGAGG AGGAT CAGG AGG AGG AGGC A GC GGAGGAGGCGGGT CT CAG AGTGCCCT GACT CAGCC AGCTT C AGT GAGCGGGTCCCCCG GA CAGAGCAT C ACCATTT CCT GT ACCGGCACAT CAAGCGACGT CGGAGGCT AC AACTTT GT G T CCT GGTAT C AGCAGC ACCCAGGAAAGGCCCCCAAACT GAT GAT CTACGACGT CT CT G A T CGGCCT AGCGGCGT GTCCG AT AGATT CT CT GGCAGTAAGT C AGGGAAT ACT GCCT CT CT G

AT C ATTAGT GGCCT GC AGGCCG ACG AT GAGGCT GACTACT ATT GCT CCT CTTATGGG AG T T CAAGC ACCCAT GTGAT CTTT GGGGGAGGCAC AAAAGT G ACT GT CCTGGGGGG AGGCT CC GAT GCAC ACAAGT CT GAGGTCGCCC AT AGGTT CAAAGACCT GGGCGAGGAAAACTTTA AG GCCCT GGT GCT GATT GCTTT CGCACAGT ACCT GCAGCAGT GCCCATTT GAAGAT CACGT G AAACT GGT CAACGAGGT GAC AGAGTTCGCCAAGACTTGCGT GGC AGACGAGT CCGCCG AA AATT GT GAT AAAT CT CT GC AT AC ACT GTTT GGGG AT AAGCT GT GT ACCGT GGCC AC ACT G AGAGAG ACTTATGG AG AAATGGCTGACTGCT GTGCAAAACAGGAGCCTGAAAGGAACG AG T GCTTCCTGCAGC ACAAGG ACG ATAACCCCAAT CT GCCT CG ACTGGT GCGGCCAGAAGT G GACGT C AT GT GT ACCGCTTT CCAC GAT AAT GAGG AAAC ATTT CT GAAG AAAT ACCT GT A T GAG ATCGCCCGGAG ACATCCCT ACTTTTAT GCT CCT GAACTGCT GTT CTTT GCAAAGCGC TACAAAGCAGCCTT CAC AGAGT GCT GT C AGGCT GCAGATAAGGCCGCTT GCCT GCT GCC A AAACT GGACGAGCT GAGGGAT G AAGGGAAAGCTT CCT CT GCAAAGCAGCGCCT GAAAT GT GCATCCCT GCAGAAGTT CGGCG AGCGGGCCTTTAAAGCCT GGGCTGT GGCAAG ACT GT C C CAG AGGTTCCCC AAGGCCGAGTTT GCT GAAGT CT CT AAGCT GGTGACT G ACCT G ACCAA A GT GCAC ACT GAGT GCT GT CAT GGCG ACCTGCT GGAAT GCGCCGACGATAG AGC AGAT CT G GCCAAGT ACAT CT GT GAG AAT C AGG ACAGCATT AGTT CAAAGCT GAAAGAGT GCT GT G AA AAGCCCCT GCT GGAGAAAAGCCACT GCATT GCT GAGGT GGAAAACGACGAAAT GCCT G CA GAT CT GCCAAGT CTGGCAGCCG ACTTCGTCGAG AGCAAGGAT GTGT GTAAAAATT AT GC C GAAGCT AAGGACGT GTT CCT GGGCAT GTTTCT GTACGAGT AT GCAAG AGCCT GAGGAT C C

Q ID NO: 162 (CL_#1105_antiHER3_1_HSA-1_337_DSS)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGQVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSS YWMSWVRQAPGKGEEWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSFYFQMNSPRAED TAVYYCARDRGVGYFDEWGRGTEVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSQSAFTQPASVSGSP GQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKFMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASFII SGFQADDEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVFGGGSDAHKSEVAHRFKDFGEENFKAF VEIAFAQYEQQCPFEDHVKEVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSEHTFFGDKFCTVATFRET

YGEMADCCAKQEPERNECFFQHKDDNPNEPRFVRPEVDVMCTAFHDNEETFEKKYFYEIA RRHPYFYAPEEFFFAKRYKAAFTECCQAADKAACEFPKEDEFRDEGKASSAKQRFKCASEQ KFGERAFKAWAVARESQRFPKAEFAEVSKFVTDFTKVHTECCHGDFEECADDRADFAKYI CENQDSISSKEKECCEKPLEEKSHCIAEVENDEMPAE>EPSEAADFVESKE>VCKNYAEAKE>V FEGMFFYEYARA* GS

Q ID NO: 163 (CL_#668_HSA-342-585DSS_4D5scFv-Subclonación)

GAATT CGCC ACT AT GGCCGT CATGGC ACCT AGAACACT GGT CCTGCT GCT G AGCGGGGC A CT GGC ACT G AC AC AG ACTTGGGCT GGGTC CGTCGTCCT GCTGCT GAG ACT GGCT AAG AC C T ACG AG ACC AC ACT GG AAAAAT GCTGTGCCGCT GC AG ACCCC CACG AGT GCT AT GCC A AG GTGTTCGATGAGTTCAAGCCTCTGGTCGAGGAACCACAGAACCTGATCAAGCAGAATTG T GAGCT GTTCGAACAGCT GGGCGAGT ACAAATTT CAGAACGCCCTGCT GGT GAGGT AT AC A AAGAAAGTGCCCCAGGT CT CTAC ACCT ACT CTGGT GGAGGT CAGT AGGAAT CT GGGC AA G GT CGGGT CAAAATGCT GT AAGCACCC AGAGGCCAAACGCAT GCCCT GCGCT GAAGACT AC CT GT CTGTGGTCCT GAACC AGCT GT GT GT GCT GC AT G AG AAG ACCCCT GT G AGCG ATCG A GTCACCAAATGCTGTACAGAAAGCCTGGTGAATCGGAGACCCTGCTTTTCCGCTCTGGA G GT GGACGAAACAT AT GT CCCT AAGGAGTT CAATGC AGAAACCTTCACATTT CACGCCGA T AT CT GT ACT CT GT CCG AG AAGG AACGCC AGATT AAG AAAC AG ACCGCCCT GGT GG AGC TG GT CAAGC AT AAACC AAAGGCT ACT AAGG AAC AGCT G AAAGC AGT G AT GG ACG ATTT CG CC GCTTTTGT CGAG AAAT GCT GT AAGGC AG ACG AT AAGG AAACCT GCTTT GCCG AGG AAG GC AAGAAACT GGT GGCAGCC AGCC AGGCT GC ACT GGGACT GGGAGGGTCCGGAGGCT CT G GA GGAAGT GGAGGGTCAGGAGGCG ACAT CCAGAT G ACAC AG AGCCCAAGCTCCCT GT C AG CA AGCGT GGGCG ACCG AGT C ACT ATT ACCT GTCGGGCCTC CC AGG AT GT G AAT ACT GC AGT C GCCTGGTACCAGCAGAAACC AGG AAAGGCT CCC AAACT GCT GAT CTACT CCGC AT CTTT C CT GT ATAGCGGCGT GCC AT CCAGGTTTAGT GGAT CACGCAGCGGCACAG ACTTCACACT G ACTATTTCTAGTCTGCAGCCCGAGGATTTTGCCACTTACTATTGCCAGCAGCACTATACT ACCCCCCCTACCTT CGG ACAGGGCACAAAGGT GGAGAT CAAGGG AGG AT CT GG AGG AG GA

AGT GGAGG AGGAT CAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCAGCGGAGAGGT GCAGCT GGTC GAA T CTGGAGG AGG ACT GGT GC AGCCT GGAGGGT CT CTGCGACT GAGTTGT GCCGCTTCAGG C TTT AACAT CAAGGACACCT ACATT CATT GGGT GCGGC AGGC ACCT GGGAAGGG ACT GG AG TGGGTCGCT AG AAT CT AT CC AACT AAT GGGT AC ACC AG AT AT GCCG AC AGCGT G AAGG GA AGGTTCACCATTAGCGCCGATACATCCAAAAACACTGCTTACCTGCAGATGAACAGCCT G CGCGCT G AGG AT AC AGC AGT GT ACT ATT GC AGT CG AT GGGGCGGCG AT GGGTTCT ACGC A AT GGACT ACT GGGG ACAGGGGACT CT GGT CACCGT C AGC AGCT GAGGAT CC

ID NO: 164 (CL_#668_HSA-342-585DSS_4D5scFv-Subclonación, AA)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAK VFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKV GSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVD ETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFV EKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGGSGGSGGSGGDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQ PEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWYARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS*GS

ID NO 165 (CL_#1105_antiHER3_1_HSA-1_337_DSS>

GAATT CGCGACCATGGCCGT GAT GGCTCCTAGAAC ACTGGT GCTGCTGCT GT CCGGGGC T CT GGCTCT GACT C AG ACTT GGGCTGGGCAGGT GCAGCT GCAGG AG AGCGGAGG AGGAC TG GT GAAAC C AGG AGGGT CTCT GCG ACT G AGTT GCGC AGCTT C AGGCTT CACCTTT AGCT C C T ACT GG AT GT CCTGGGT CCG AC AGGC AC CT GGGAAGGG ACT GG AAT GGGT GGCC AAC A TC AAT CGGGACGGAAGCGCTT CCT ACT AT GT GGAT AGCGT C AAAGGCCGCTTT ACC ATT AG

CG AG ACGAT GCT AAGAACT C ACT GT ACCT GC AG AT GAAT AGCCT GCGCGCT GAGGAT A CA GCAGTCTACTATTGCGCAAGGGACCGAGGAGTGGGATATTTCGATCTGTGGGGACGAG GC ACT CT GGT G ACCGT CTCT AGT GCC AGC AC AGGCGG AGG AGG AT CAGG AGG AGG AGGC A GC GGAGGAGGCGGGT CT C AG AGTGCCCTGACT CAGCC AGCTT C AGT G AGCGGGTCCCCCG GA

CAGAGCAT CACC ATTT CCT GT ACCGGCAC AT CAAGCGACGT CGGAGGCT AC AACTTT GT G T CCT GGT AT CAGCAGC ACCCAGGAAAGGCCCCCAAACT G AT GAT CT ACGACGT CT CT G A T CGGCCT AGCGGCGT GTCCG AT AGATT CT CT GGCAGTAAGT C AGGGAAT ACT GCCT CT CT G AT C ATT AGT GGCCT GC AGGCCG ACG AT G AGGCT G ACT ACT ATTGCTCCTCTT ATGGG AG T T CAAGC ACCC AT GT GAT CTTT GGGGGAGGCACAAAAGT G ACT GT CCT GGGGGGAGGCT CC GATGCACACAAGTCTGAGGTCGCCCATAGGTTCAAAGACCTGGGCGAGGAAAACTTTA AG GCCCT GGT GCT G ATT GCTTT CGC ACAGT ACCT GCAGCAGT GCCCATTT GAAG AT C ACGT G AAACT GGT CAACGAGGT GAC AG AGTT CGCCAAGACTT GCGT GGC AGACG AGTCCGCCG AA AATT GT GAT AAAT CT CT GC AT AC ACT GTTT GGGG AT AAGCT GT GT ACCGT GGCC AC ACT G AGAGAGACTT ATGGAGAAATGGCTGACTGCT GTGCAAAACAGGAGCCTGAAAGGAACG AG TGCTTCCTGCAGCACAAGGACGATAACCCCAATCTGCCTCGACTGGTGCGGCCAGAAGT G GACGT C AT GTGT ACCGCTTT CCACGATAAT GAGGAAACATTT CT GAAG AAAT ACCT GTA T GAGATCGCCCGG AGACATCCCT ACTTTTAT GCT CCTGAACT GCT GTT CTTT GCAAAGCGC T AC AAAGC AGCCTT CAC AG AGT GCT GT C AGGCT GC AG AT AAGGCCGCTT GCCTGCTGCC A AAACT GG ACG AGCT G AGGGAT GAAGGGAAAGCTT CCT CT GC AAAGC AGCGCCT GAAAT GT GC ATCCCT GCAGAAGTT CGGCG AGCGGGCCTTTAAAGCCT GGGCT GT GGCAAGACT GT C C CAG AGGTTCCCC AAGGCC G AGTTT GCT G AAGT CT CT AAGCT GGT GACT G ACCT G ACC AA A GT GCAC ACT G AGT GCT GT CAT GGCGACCTGCT GGAAT GCGCCGACG AT AGAGC AGAT CT G GCCAAGT ACAT CT GT GAGAAT C AGGAC AGCATT AGTT CAAAGCT GAAAG AGT GCT GT G AA AAGCCCCTGCTGGAGAAAAGCC ACTGC ATT GCTGAGGTGGAAAACGACGAAATGCCTG CA GAT CT GCCAAGT CT GGC AGCCG ACTTCGTCGAGAGCAAGGAT GTGT GTAAAAATT AT GC C GAAGCTAAGG ACGT GTTCCT GGGC AT GTTTCT GTACGAGT AT GCAAGAGCCT G AGG AT C C

Q ID NO: 166 (CL_#1105_antiHER3_1_HSA-1_337_DSS, AA)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGQVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSS YWMSWVRQAPGKGLEWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCARDRGVGYFDLWGRGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSP GQSITISCTGTSSDYGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLII SGLQADDEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVLGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL VLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRET YGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIA RRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQ KFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYI CENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCBCNYAEAKDV FLGMFLYEYARA* GS

Q ID NO: 167 (CL_#667_4D5scFv_HSA-342-585DSS-Subclonación)

GAATT CGCC ACT AT GGCCGT G AT GGCACCT AGAACACTGGT CCTGCTGCT G AGCGGGGC A CT GGCACT G ACACAGACTTGGGCT GGAG ACATT CAGAT GACAC AGAGCCC AAGCT CCC TG T CCGC AT CTGT GGGCGACCGAGT C ACAAT C ACTT GCCGGGCCT CCCAGGAT GT GAAC AC T GCT GT CGC AT GGT ACC AGC AG AAACC AGGGAAGGCT CCC AAACT GCT G AT CT AC AGT G CA T CATTCCT GT AT AGT GGCGT GCC AT C AAGGTTT AGCGGCT CCCG AT CT GG AACCG ACTT C ACCCT G ACAAT CT CT AGT CT GCAGCCCGAGGATTTT GCCACATACT ATT GCCAGCAGCA C TATACCACACCCCCTACTTTCGGGCAGGGAACCAAGGTGGAGATCAAGGGAGGGAGCG GA GGAGGGTCCGGAGGAGGGT CTGGAGGCGGGAGT GG AGGAGGGT CAGGAGAGGT GC AG CTG GT CGAAAGCGGAGGAGGACTGGT GCAGCCT GGAGGCAGCCT GCG ACT GT CCT GT GCCG CT T CT GGCTTTAACAT CAAGGAC ACCT AC ATTCATT GGGT GCGGCAGGCACCT GGCAAAGG A CT GGAGT GGGT GGCT AGAAT CT AT CCAACT AAT GGAT AC ACCAGATAT GCT GACAGCGT G AAGGGCAGGTTTACT AT C AGT GCT GAT ACAT CAAAGAACACT GCAT ACCTGCAGAT G AA T AGCCTGCGCGCCGAGGATACCGCTGTGTACTATTGTAGCCGATGGGGGGGAGACGGCTT C TACGCC AT GGATTATTGGGGACAGGGCACCCT GGT GACAGT CTCAAGCGGAGGGAGT G GA GGCT CAGGAGGAAGCGGAGGGT CCGG AGGCT CT GT GGT CCTGCT GCT GAGACT GGCT A AG ACCTACGAGACTACCCTGGAAAAATGCTGTGCAGCCGCTGACCCCCACGAGTGCTATGC A AAGGT GTTCGAT GAGTT CAAGCCT CT GGT CGAGGAACCAC AGAACCT GAT CAAGC AGA AT

T GT GAGCT GTT CGAAC AGCT GGGCG AGT ACAAGTTT C AG AACGCCCT GCT GGT GAGGT A T ACAAAGAAAGT GCCCCAGGT C AGC ACT CCTACCCT GGT GGAGGTCTCCAGGAAT CT GG GG AAGGTCGGAT CTAAGT GCT GT AAACACCC AGAGGCAAAACGCAT GCCCT GCGCCGAAG AC T ACCT GT CCGT GGT CCT G AAT C AGCT GT GT GT GCT GCAT G AG AAG ACCCCT GT GT CT GAT CGAGT C ACCAAATGCT GT AC AGAAAGTCT GGT GAACCGGAG ACCCT GCTTTTCT GCCCT G GAGGT GGACGAAACAT AT GT CCCT AAGGAGTT CAAT GCCGAAAC ATTCACTTTT CACGC T GAT AT CT GT AC ACT GT CCG AG AAGG AACGCC AG ATT AAG AAAC AG ACT GCTCT GGTGG AG CT GGT CAAGCATAAACCAAAGGCAACC AAGGAACAGCT GAAAGCCGT GAT GGACGATT TC GCAGCCTTTGT CGAGAAGT GCT GTAAAGCCGACGAT AAGGAAACTT GTTTCGCCG AGG A A GGCAAAAAACT GGT CGCAGCAT CACAGGCAGCACT GGGACT GT GAGGAT CC

ID NO: 168 (CL_#667_4D5scFv_HSA-342-585DSS-Subclonación)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTA VAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTP PTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNI KDT YIH WVRQ APGKGLE WV ARIYPTN GYTRY AD S VKGRFTIS ADT SKNT AYLQMN S LRAE DTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSWLLLRLAKTYET TLEKCCAAADPHECYAKVFDEFICPLYEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVP QVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKC CTESLYNRRPCFSALEYDETYYPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALYELYKHKPK ATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL*GS

ID NO: 169 (CL_#1105_antiHER3_1_HSA-1_337_DSS>

GAATT CGCG ACCAT GGCCGT GATGGCTCCT AGAACACTGGT GCTGCT GCT GT CCGGGGC T CTGGCT CT GACT C AG ACTT GGGCTGGGC AGGT GCAGCT GCAGG AG AGCGGAGG AGGAC TG GT GAAACC AGG AGGGT CT CT GCG ACT GAGTT GCGCAGCTTC AGGCTT CACCTTT AGCT C C T ACT GG AT GTCCTGGGT CCG AC AGGC AC CT GGGAAGGG ACT GG AAT GGGT GGCC AAC A TC AAT CGGGACGGAAGCGCTTCCT ACT AT GT GGAT AGCGT CAAAGGCCGCTTT ACCATT AG

CG AG ACGAT GCT AAGAACT C ACT GTACCT GCAGAT GAAT AGCCT GCGCGCT GAGGAT A CA GC AGT CT ACTATTGCGCAAGGGACCG AGGAGT GGGAT ATTT CGAT CT GTGGGG ACGAG GC

ACT CTGGT G ACCGT CTCT AGT GCC AGC AC AGGCGG AGG AGG AT C AGG AGG AGG AGGC A GC GGAGG AGGCGGGT CT CAGAGTGCCCT G ACTCAGCCAGCTT C AGT GAGCGGGTCCCCCG GA CAGAGCAT CACC ATTT CCT GT ACCGGCAC AT CAAGCGACGT CGGAGGCT AC AACTTT GT G T CCT GGT AT CAGCAGC ACCCAGGAAAGGCCCCCAAACT G AT GAT CT ACGACGT CT CT G A T CGGCCT AGCGGCGT GTCCG AT AGATT CT CT GGCAGTAAGT C AGGGAAT ACT GCCT CT CT G AT C ATT AGT GGCCT GC AGGCCG ACG AT G AGGCT G ACT ACT ATT GCTCCTCTT ATGGG AG T T CAAGC ACCC AT GT GAT CTTT GGGGGAGGCACAAAAGT G ACT GT CCT GGGGGGAGGCT CC GATGCACACAAGTCTGAGGTCGCCCATAGGTTCAAAGACCTGGGCGAGGAAAACTTTA AG GCCCT GGT GCT G ATT GCTTT CGC ACAGT ACCT GCAGCAGT GCCCATTT GAAG AT C ACGT G AAACT GGT CAACGAGGT GAC AG AGTT CGCCAAGACTT GCGT GGC AGACG AGTCCGCCG AA AATT GT GAT AAAT CT CT GC AT AC ACT GTTT GGGG AT AAGCT GT GT ACCGT GGCC AC ACT G AGAGAGACTT ATGGAGAAATGGCTGACTGCT GTGCAAAACAGGAGCCTGAAAGGAACG AG TGCTTCCTGCAGCACAAGGACGATAACCCCAATCTGCCTCGACTGGTGCGGCCAGAAGT G GACGT C AT GTGT ACCGCTTT CCACGATAAT GAGGAAACATTT CT GAAG AAAT ACCT GTA T GAGATCGCCCGG AGACATCCCT ACTTTTAT GCT CCTGAACT GCT GTT CTTT GCAAAGCGC T AC AAAGC AGCCTT CAC AG AGT GCT GT C AGGCT GC AG AT AAGGCCGCTT GCCTGCTGCC A AAACTGGACG AGCT G AGGGAT GAAGGGAAAGCTT CCT CT GC AAAGC AGCGCCT GAAAT GT GC ATCCCT GCAGAAGTT CGGCG AGCGGGCCTTTAAAGCCT GGGCTGT GGC AAGACT GT C C CAG AGGTTCCCC AAGGCC G AGTTT GCT G AAGT CT CT AAGCT GGT GACT G ACCT G ACC AA A GT GCAC ACT G AGT GCT GT CAT GGCGACCTGCT GGAAT GCGCCGACG AT AGAGC AGAT C TG GCCAAGT ACAT CT GT GAGAAT C AGGAC AGCATT AGTT CAAAGCT GAAAG AGT GCT GT G AA AAGCCCCTGCTGGAGAAAAGCC ACTGC ATT GCTGAGGTGGAAAACGACGAAATGCCTG CA GAT CT GCCAAGT CT GGC AGCCG ACTTCGTCGAGAGCAAGGAT GTGT GTAAAAATT AT GC C GAAGCTAAGG ACGT GTT CCT GGGC AT GTTTCT GTACGAGT AT GCAAGAGCCT G AGG AT C C

Q ID NO: 170 (CL_#1105_antiHER3_1_HSA-1_337_DSS, aa)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGQVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSS YWMSWVRQAPGKGLEWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCARDRGVGYFDLWGRGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSP GQSITISCTGTSSDYGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLII SGLQADDEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVLGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL VLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRET YGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIA RRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQ KFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYI CENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDV FLGMFLYEYARA* GS

Q ID NO: 171 (CL_#1106_HSA-342_585_DSS_antiHER2_2, nt)

GAATT CGCGACCAT GGCT GT G AT GGCT CCT CGAACCCT GGT GCT GCT GCT GT CCGGCGC T CT GGCT CTGACT CAGACTT GGGCTGGCT CCGT GGT GCT GCT GCT GAGGCT GGCCAAAAC C TACGAGACCAC ACT GGAAAAGTGCT GT GCCGCT GCAG ACCCT CACGAGT GCTAT GCT AA A GT CTTCGAT GAGTT CAAGCCCCT GGT GGAGGAACCT CAGAACCT GAT CAAACAGAATT G T GAGCT GTTCGAAC AGCT GGGCGAGT ACAAGTTTCAGAACGCCCT GCT GGT GCGCT ATAC C AAG AAAGT GCC AC AGGT C AGC ACT CCC. ACCCT GGT GG AGGT CT CC AG AAAT CT GGGG A AA GT GGGAT CT AAAT GCT GTAAGCACCCT GAGGCAAAGAGGAT GCC ATGCGCCGAAGACT AC CT GAGCGT GGTCCT GAACCAGCT GT GT GTGCT GCAT GAGAAAACCCC AGT GT CCG AT CG C GT CACCAAGT GCT GTACAGAAAGCCT GGT GAACCGGAGACCAT GCTT CT CCGCCCT GG A G GT CGACG AAAC AT ACGT GCCCAAGGAGTTT AAT GCT GAAACATTCACTTT CCACGCAG A T AT CT GT ACCCT G AGC G AGAAGGAACGACAG ATT AAG AAAC AGACAGCCCT GGT GG AGC TG GT CAAGC ATAAACCCAAGGCCACCAAAGAACAGCT GAAGGCT GT CAT GGACGATTTCG CC GCTTTT GT GGAGAAAT GCT GTAAGGC AGACGATAAGGAAACAT GCTT CGCCGAGGAAG GC AAG AAACT GGT GGC AGC AT C CC AGGCT GC ACT GGG ACT GGG AGGGAGT GG AC AGGT GC AG T GGT CCAGAGCGGAGCAG AGGT GAAGAAACCCGGCGAAT C ACTGAAAAT C AGCT GTA AG

GGGT CCGG ATACT CTTTT ACTAGTT ATT GGATTGCCT GGGT GCGGCAGAT GCCT GGCAA A GGGCT GG AGT AC AT GGGGCT G AT CT ATCCCGG AG ACT CT G AT ACAAAGT ACT C ACCT AG C TT CCAGGGCCAAGT GACT ATT AGCGTCGACAAATCCGT GT CTACCGCTT AT CT GCAGT G G AGCTCCCTGAAGCCTAGT GATT C AGCT GTCT ACTTTT GCGCACGAC ACG ACGT GGGCT A T T GCAC CG AT CGG AC AT GT GCC AAGT GGCC AG AGT GGCT GGG AGT GT GGGGAC AGGG AA CT CT GGT GACCGTCT CT AGT GGAGGCGGGGG AT CAAGCGGAGGAGGAT CT GGAGGAGGAG GC AGCCAGT CCGTCCT GACT CAGCC ACCTT CT GT GAGT GCAGCT CC AGG AC AGAAGGT GAC C AT CT C AT GC AGCGGCT CCT CT AGT AAC ATT GGG AAC AATT ACGT GAGCT GGT AT C AGC A G CT GCC AGG AAC AGCT CCC AAACT GCT G AT CT ACG AC C AT ACT AAT AGGCCT GC AGGCGT G CCAGAT CGCTT CTCCGGCT CTAAGAGT GGGACAT CAGC AAGCCTGGCCATTT CCGGCTT T AG AT CT G AGG ACG AAGCCG ATT ACT ATT GTGCT AGTTGGGACT AT ACT CT GT C AGGGT G G GT CTTCGGGGGAGGCACAAAGCT GACT GT GCT GGGAT GAGGAT CC

ID NO: 172 (CL_#1106_HSA-342_585_DSS_antiHER2_2, AA)

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAK VFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKV GSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVD ETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFV EKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGQVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSG YSFTSYW1AWVRQMPGKGLEYMGLIYPGDSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLK PSDSAVYFCARHDVGYCTDRTCAKWPEWLGVWGQGTLVTVSSGGGGSSGGGSGGGGSQS VLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDHTNRPAGVPDRFS GSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYCASWDYTLSGWVFGGGTKLTVLG*GS

ID NO: 173 (HER2_scFv)

QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPGDSDTKY SPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARHDVGYCTDRTCAKWPEWLGVWG QGTLVTVSSGGGGSSGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWY QQLPGTAPKLLIYDHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYCASWDYTLSG WVFGGGTKLTVLG

ID NO: 174 (HER3_scFv)

QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINRDGSASY YVDS VKGRFTISRDD AKNSLYLQMNSLRAEDT AVYY CARDRGV GYFDLWGRGTLVT V S S ASTGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPG KAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQADDEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGT KVTVLG

Claims

REIVINDICACIONES

Un heteromultímero que comprende:

una primera construcción de polipéptido que comprende un primer polipéptido transportador y al menos una primera molécula de carga, opcionalmente donde la primera molécula de carga es un polipéptido de carga, opcionalmente donde la primera construcción de polipéptido comprende dos primeros polipéptidos de carga; y una segunda construcción de polipéptido que comprende un segundo polipéptido transportador;

y

donde dichos primer y segundo polipéptidos transportadores se obtienen por segmentación de un polipéptido de albúmina que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 en un sitio de segmentación, y

donde la ubicación del sitio de segmentación es:

(a) entre los residuos 339 y 340 de la SEQ ID NO:1; o

(b) entre los residuos 300 y 301 de la SEQ ID NO:1; o

(c) entre los residuos 364 y 365 de la SEQ ID NO:1; o

(d) entre los residuos 441 y 442 de la SEQ ID NO:1; o

(e) entre los residuos 171 y 172 de la SEQ ID NO:1; o

(f) entre los residuos 281 y 282 de la SEQ ID NO:1; o

(g) después del residuo 83 y antes del residuo 85 de la SEQ ID NO:1 y el residuo 84 es eliminado; donde la numeración de los residuos comienza con el primer residuo después de la secuencia de señal, y donde dicho primer polipéptido transportador es diferente de dicho segundo polipéptido transportador, y dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar una estructura cuasi-nativa de la forma monomérica de dicho polipéptido de albúmina.

El heteromultímero de la reivindicación 1, donde:

al menos uno de los polipéptidos transportadores primero y segundo comprende además un enlazador, opcionalmente donde el enlazador es un enlazador GGGGS.

El heteromultímero de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, donde:

(a) dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO:39, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO:40;

(b) dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO:41, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO:42;

(c) dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO:43, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO:44;

(d) dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO:45, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO:46 del mismo;

(e) dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO:47, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO:48;

(f) dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO:49, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO:50;

(g) dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO:51, y donde dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO:52;

opcionalmente donde la primera y segunda secuencia de polipéptido transportador carece de una secuencia de señal.

El heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde:

(a) dicha segunda construcción de polipéptidos comprende además al menos una segunda molécula de carga, opcionalmente donde la segunda molécula de carga es un polipéptido de carga, opcionalmente donde la segunda construcción de polipéptido comprende además dos segundos polipéptidos de carga, opcionalmente donde al menos un primer polipéptido de carga y/o al menos un segundo polipéptido de carga es una construcción de polipéptido de unión a antígeno, opcionalmente una construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a CD3, CD19, CD20, HER2 o HER3; o

(b) dicha segunda construcción de polipéptido comprende además al menos un segundo polipéptido de carga, opcionalmente donde:

(i) dicho primer polipéptido de carga es una construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a CD3 y dicho segundo polipéptido de carga es una construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a CD19 o CD20, o

(ii) dicho primer polipéptido de carga es una construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a HER2 y dicho segundo polipéptido de carga es una construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a HER3, o

(c) dicho al menos un primer polipéptido de carga se fusiona a dicho primer polipéptido transportador con un enlazador, opcionalmente donde dicho al menos un segundo polipéptido de carga se fusiona a dicho segundo polipéptido transportador con un enlazador.

5. El heteromultímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho heteromultímero se une a FcRn.

6. El heteromultímero según la reivindicación 1, donde:

los extremos C y N introducidos en el sitio de segmentación se fusionan con la secuencia de péptidos GGGGS.

7. El heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde:

(a) la primera construcción de polipéptidos comprende al menos un primer polipéptido de carga que se une a un antígeno diana, y la segunda construcción de polipéptidos comprende al menos un segundo polipéptido de carga que es una fracción de toxina,

(b) la primera construcción de polipéptidos comprende al menos un primer polipéptido de carga se une a un antígeno diana, y donde dicho antígeno diana es al menos uno de la cadena a (CD25) de IL-2R, beta Amiloide, anti-EpCAM, anti-CD3, CD16, CD20, CD22, CD23, CD3, CD4, CD52, CD80, CTLA-4, EGFR, EpCAM, proteína F de RSV, G250, glucoproteína IIB/IIIa R, HER2, HER3, IGF1R, EGFR, HSP90, anticuerpo IgE, IL-12, IL-23, IL-1b, IL-5, IL-6, RANKL, TNF alfa, TNFR, TRAIL, VEGF-A, receptor de glucagón, receptor de GLP y receptor de LDL; o (c) al menos un polipéptido de carga es una enzima, hormona, polipéptido terapéutico, antígeno, quimiotoxina, radiotoxina, citocina o una variante o fragmento de los mismos.

8. El heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde la estructura monomérica cuasinativa tiene una estabilidad térmica que es comparable a la de la albúmina, opcionalmente donde la estabilidad térmica se mide determinando la temperatura de fusión (Tm) de la estructura monomérica cuasi-nativa.

9. El heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la actividad del polipéptido de carga es:

(a) alterada selectivamente en la fusión con el polipéptido transportador en relación con su formato no fusionado, o

(b) atenuada selectivamente en la fusión con el polipéptido transportador en relación con su formato no fusionado.

10. Una célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica el heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, opcionalmente donde:

(a) el ácido nucleico que codifica la primera construcción de polipéptidos y el ácido nucleico que codifica la segunda construcción de polipéptidos están presentes en un solo vector, o

(b) el ácido nucleico que codifica la primera construcción de polipéptidos y el ácido nucleico que codifica la segunda construcción de polipéptidos están presentes en vectores separados.

11. Una composición farmacéutica que comprende el heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un adyuvante.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11 para uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer.

13. El heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer mediante la inhibición del crecimiento de un tumor o la reducción de un tumor, donde el procedimiento comprende poner en contacto el tumor con una cantidad efectiva del heteromultímero.