ES2827226T3 - Diacuerpos monovalentes biespecíficos con capacidad de unión a gpA33 y CD3, y usos de los mismos - Google Patents

Diacuerpos monovalentes biespecíficos con capacidad de unión a gpA33 y CD3, y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un diacuerpo biespecífico, en el que dicho diacuerpo biespecífico tiene la capacidad de unirse a un epítopo de gpA33 y a un epítopo de CD3, en el que el diacuerpo biespecífico comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en el que dichas primera y segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí, y en el que: A. la primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo Cterminal: i. un Dominio 1, que comprende un subDominio (1A) que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a CD3 (VLCD3) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; y un subDominio (1B) que comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (VHgpA33) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; en el que dichos subDominios (1A) y (1B) están separados uno del otro por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1; ii. un Dominio 2, en el que dicho Dominio 2 es un Dominio de espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o un Dominio de espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, en el que dicho Dominio 2 está separado de dicho Dominio 1 por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; B. la segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo Cterminal: i. un Dominio 1, que comprende un subDominio (1A) que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (VLgpA33) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26; y un subDominio (1B) que comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a CD3 (VHCD3) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; en el que dichos subDominios (1A) y (1B) están separados uno del otro por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1; ii. un Dominio 2, en el que dicho Dominio 2 es un Dominio de espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o un Dominio de espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, en el que dicho Dominio 2 está separado de dicho Dominio 1 por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; y en el que dicho Dominio 2 de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio 2 de dicha segunda cadena polipeptídica no son ambos Dominios de espiral E ni son ambos Dominios de espiral K; y en el que: (a) dicho Dominio VL de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio VH de dicha segunda cadena polipeptídica forman un Dominio de Unión a Antígeno monovalente con capacidad de unión a un epítopo de CD3 específico; y (b) dicho Dominio VH de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio VL de dicha segunda cadena polipeptídica forman un Dominio de Unión a Antígeno monovalente con capacidad de unión a un epítopo de gpA33 específico.

Description

DESCRIPCIÓN
Diacuerpos monovalentes biespecíficos con capacidad de unión a gpA33 y CD3, y usos de los mismos Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a diacuerpos biespecíficos que comprenden dos cadenas polipeptídicas y poseen un sitio de unión específico a un epítopo de gpA33 y un sitio de unión específico a un epítopo de CD3 (es decir, un "diacuerpo biespecífico gpA33 x CD3"). La presente divulgación se refiere además a diacuerpos biespecíficos que comprenden un dominio Fc de inmunoglobulina ("diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos"), están compuestos de tres cadenas polipeptídicas y poseen al menos un sitio de unión específico a un epítopo de gpA33 y un sitio de unión específico a un epítopo de CD3 (es decir, un "diacuerpo Fc biespecífico gpA33 x CD3"). Los diacuerpos biespecíficos y diacuerpos Fc biespecíficos de la presente divulgación tienen la capacidad de unirse simultáneamente a gpA33 y CD3. La divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen tales diacuerpos biespecíficos o tales diacuerpos Fc biespecíficos. La divulgación se refiere además a procedimientos para el uso de tales diacuerpos para el tratamiento del cáncer.
Descripción de la técnica relacionada
I. gpA33
El cáncer colorrectal es una de las malignidades más comunes del mundo occidental y es una de las principales causas de muerte por cáncer (Silverberg, E. et al. (1989) "Cancer Statistics (Estadísticas sobre el cáncer), 1989" CA Cancer J Clin. 39(1):3-20). Una diana potencialmente útil en el cáncer de colon es la 43 kD glicoproteína transmembranal A33 (gpA33) (Heath, J.K. et al. (1997) "The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily (El antígeno humano A33 es una glicoproteína transmembranal y un novedoso miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas)" Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) "Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium (Caracterización de las modificaciones postraduccionales del antígeno humano A33, una novedosa glicoproteína superficial palmitoilada del epitelio gastrointestinal humano)" Biochem. Biophys. Res. Commun. 236 (3):682-686). La gpA33 fue descubierta por primera vez a través de la producción de anticuerpos monoclonales murinos contra la línea de carcinoma pancreático humano derivado de células ASPC1. Se encontró que un anticuerpo (MAb A33) reaccionaba con una proteína de la superficie celular de 43 kDa, que se designó en consecuencia como "gpA33" (Wong, N.A. et al. (2006) "EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia (EpCAM y gpA33 son marcadores de metaplasia de Barrett)" J. Clin. Pathol. 59(3):260-263).
La gpA33 es una proteína transmembranal de la familia de moléculas de adhesión de unión; Abud, H.E. et al. (2000) "The Murine A33 Antigen Is Expressed At Two Distinct Sites During Development, The ICM Of The Blastocyst And The Intestinal Epithelium (El antígeno murino A33 se expresa en dos sitios distintos durante el desarrollo, el ICM del blastocisto y el epitelio intestinal)" Meeh. Dev. 98 (1-2):111-114; Barendswaard, E.C. et al. (1998) "Rapid And Specific Targeting Of Monoclonal Antibody A33 To A Colon Cancer Xenograft In Nude Mice (Direccionamiento rápido y específico del anticuerpo monoclonal A33 a un xenoinjerto de cáncer de colon en ratones sin pelaje)" Int. J. Oncol. 12(l):45-53; Panjideh, H. et al. (2008) "Biodistribution And Efficacy Of [131I]A33scFv::CDy, A Recombinant Antibody-Enzyme Protein For Colon Cancer (Biodistribución y eficacia de [131I]A33scFv::CDy: una proteína enzimática de anticuerpo recombinante para el cáncer de colon)" Int. J. Oncol.
32 (4):925-930). Aunque todavía no se comprende la importancia funcional del antígeno A33, se ha demostrado que media la reparación de la mucosa del colon en un modelo animal de colitis y se expresa de forma homogénea en > 95% de todos los carcinomas colorrectales. La expresión del A33 es uniforme tanto en todos los estadios de la enfermedad como todos los grados de diferenciación histológica, y el antígeno no se secreta ni disemina de forma detectable en el torrente sanguíneo (Infante, J.R. et al. (2013) "Safety, Pharmacokinetics And Pharmacodynamics Of The Anti-A33 Fully-Human Monoclonal Antibody, KRN330, In Patients With Advanced Colorectal Cancer (Seguridad, farmacocinética y farmacodinamia del anticuerpo monoclonal anti-A33 completamente humano, KRN330, en pacientes con cáncer colorrectal avanzado)" Eur. J. Cancer. 49(6):1169-1175; Panjideh, H. et al. (2008) "Biodistribution And Efficacy Of [131I]A33scFv::CDy, A Recombinant Antibody-Enzyme Protein For Colon Cancer (Biodistribución y eficacia de [131I]A33scFv::CDy: una proteína enzimática de anticuerpo recombinante para el cáncer de colon)" Int. J. Oncol. 32(4):925-930). Por el contrario, se identificaron solo unos pocos ejemplos de expresión no gastrointestinal del antígeno A33 (Johnstone, C.N. et al. (2000) "Characterization Of Mouse A33 Antigen, A Definitive Marker For Basolateral Surfaces Of Intestinal Epithelial Cells (Caracterización del antígeno A33 de ratón: un marcador definitivo de las superficies basolaterales de las células epiteliales intestinales)" Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 279(3):G500-G510).
En vista de la expresión altamente restringida del antígeno A33, los investigadores estudiaron la posibilidad de tratamiento con anticuerpos de los cánceres asociados con el A33 (Infante, J.R. et al. (2013) "Safety, Pharmacokinetics And Pharmacodynamics Of The Anti-A33 Fully-Human Monoclonal Antibody, KRN330, In Patients With Advanced Colorectal Cancer (Seguridad, farmacocinética y farmacodinamia del anticuerpo monoclonal anti-A33 completamente humano, KRN330, en pacientes con cáncer colorrectal avanzado)" Eur. J. Cancer. 49(6):1169-1175; Ackerman, M.E. et al. (2008) "A33 Antigen Displays Persistent Surface Expression (El antígeno A33 muestra una expresión superficial persistente)" Cancer Immunol. Immunother. 57(7):1017-1027; Barendswaard, E.C. et al. (2001) "Relative Therapeutic Efficacy Of (125)1- And (131)I-Labeled Monoclonal Antibody A33 In A Human Colon Cancer Xenograft (Eficacia terapéutica relativa del anticuerpo monoclonal A33 marcado con (125)1- y (131)I en un xenoinjerto de cáncer de colon humano)" J. Nucl. Med. 42(8):1251-1256; Carrasquillo, J.A. et al. (2011) "(124)1-huA33 Antibody PET Of Colorectal Cancer (PET con anticuerpo (124)1-huA33 del cáncer colorrectal)" J. Nucl. Med. 52(8):1173-1180; Chong, G. et al. (2005) "Phase I Trial Of 131I-HuA33 In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma (Ensayo de fase I de 131I-HuA33 en pacientes con carcinoma colorrectal avanzado)" Clin. Cancer Res. 11(13):4818-4826; Deckert, P.M. et al. (2000) "Pharmacokinetics And Microdistribution Of Polyethylene Glycol-Modified Humanized A33 Antibody Targeting Colon Cancer Xenografts (Farmacocinética y microdistribución del anticuerpo A33 humanizado modificado con polietilenglicol dirigido a xenoinjertos de cáncer de colon)" Int. J. Cancer. 87(3):382-390; Johnston, A.P. et al. (2012) "Targeting- Cancer Cells: Controlling The Binding And Internalization Of Antibody- Functionalized Capsules (Direccionamiento hacia células cancerosas: control de la unión e internalización de cápsulas funcionalizadas con anticuerpos)" ACS Nano. 6(8):6667-6674; Koppe, M.J. et al. (2005) "Radioimmunotherapy And Colorectal Cancer (Radioinmunoterapia y cáncer colorrectal)" Br. J. Surg. Mar;92(3):264-276; Sakamoto, J. et al. (2006) "A Phase I Radioimmunolocalization Trial Of Humanized Monoclonal Antibody HuA33 In Patients With Gastric Carcinoma (Un ensayo de radioinmunolocalización de fase I del anticuerpo monoclonal humanizado HuA33 en pacientes con carcinoma gástrico)" Cancer Sci. 97(11):1248-1254; Scott, A.M. et al. (2005) "A Phase I Trial Of Humanized Monoclonal Antibody A33 In Patients With Colorectal Carcinoma: Biodistribution, Pharmacokinetics, And Quantitative Tumor Uptake (Un ensayo de fase I del anticuerpo monoclonal A33 humanizado en pacientes con carcinoma colorrectal: biodistribución, farmacocinética y captación tumoral cuantitativa)" Clin. Cancer Res. 11(13):4810-4817; Tschmelitsch, J. et al. (1997) "Enhanced Antitumor Activity Of Combination Radioimmunotherapy (131I-Labeled Monoclonal Antibody A33) With Chemotherapy (Fluorouracil) (Actividad antitumoral mejorada de la combinación de radioinmunoterapia (anticuerpo monoclonal A33 marcado con 131I) con quimioterapia (fluorouracilo))" Cancer Res. 57(11):2181-2186). Del mismo modo, se evaluaron también fragmentos de dichos anticuerpos en cuanto a su potencial papel terapéutico (Coelho, V. et al. (2007) "Design, Construction, And In Vitro Analysis Of A33scFv::CDy, A Recombinant Fusion Protein For Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy In Colon Cancer (Diseño, construcción y análisis in vitro de A33scFv::CDy: una proteína de fusión recombinante para la terapia con profármacos enzimáticos dirigidos por anticuerpos en el cáncer de colon)" Int. J. Oncol. 31(4):951-957).
II. CD3
El CD3 es un correceptor de células T compuesto de cuatro cadenas diferentes (Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling (Biología estructural del receptor de células T: conocimientos sobre el ensamblaje del receptor, el reconocimiento de ligandos y la iniciación de la señalización)" Cold Spring Harb. Perspect. Biol.
2(4):a005140; págs. 1-14; Chetty, R. et al. (1994) "CD3: Structure, Function And The Role Of Immunostaining In Clinical Practice (CD3: estructura, función y papel de la inmunotinción en la práctica clínica)" J. Pathol. 173:303-307).
En mamíferos, el complejo CD3 contiene una cadena CD3y, una cadena CD38 y dos cadenas CD3e. Estas cadenas se asocian con una molécula conocida como el receptor de células T (TCR), con el fin de generar una señal de activación en linfocitos T. En ausencia de CD3, los TCR no se ensamblan correctamente y se degradan (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer (Lecciones de inmunología molecular de la transferencia terapéutica de genes del receptor de células T)" Immunology 129(2):170-177). CD3 se encuentra unido a las membranas de todas las células T maduras y en prácticamente ningún otro tipo de células (véase, Janeway, C.A. et al. 2005 En: IMMUNOBIOLOGY: THE IMMUNE SYSTEM IN HEALTH AND DISEASE (INMUNOBIOLOGÍA: EL SISTEMA INMUNITARIO EN LA SALUD Y EN LA ENFERMEDAD)" 6a ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214-216; Sun, Z. J. et al. (2001) "Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3e:y Heterodimer (Mecanismos que contribuyen a la señalización y ensamblaje del receptor de células T revelados por la estructura de solución de un fragmento de ectodominio del heterodímero CD3e:y)" Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) "Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex (Deconstruyendo la forma y función del complejo TCR/CD3)" Immunity. 2006 Feb; 24(2):133-139).
III. Diacuerpos biespecíficos
La capacidad de un anticuerpo intacto, sin modificar (por ejemplo, una IgG) para unirse a un epítopo de un antígeno depende la presencia de dominios variables de cadenas livianas y pesadas de inmunoglobulina (es decir, los dominios VL y VH, respectivamente). El diseño de un diacuerpo se basa en el constructo Fv monocatenario (scFv) (véase, por ejemplo, Holliger et al. (1993) "Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments (Diacuerpos: pequeños fragmentos de anticuerpos bivalentes y biespecíficos)" Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.) 90:6444-6448; Publicación de Patente US No. 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity (Un anticuerpo biespecífico similar a IgG recombinante completamente humano para el receptor del factor de crecimiento epidérmico y el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina para una actividad antitumoral mejorada)" J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications (El diacuerpo anti-CEA ligado a disulfuro covalente permite la conjugación y el radiomarcaje en sitios específicos para aplicaciones de direccionamiento tumoral)" Protein Eng. Des Sei. 17(1 ):21-27; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange (La multimerización de una proteína de fusión Fv-Fv monocatenaria anti-CD20 quimérica está mediada a través del intercambio de dominio variable)" Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region (Diacuerpo para la inmunoterapia contra el cáncer y su mejora funcional mediante la fusión de la región Fc humana)" Resumen 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System (Construcción de un diacuerpo (pequeño anticuerpo biespecífico recombinante) mediante un sistema de replegamiento)" Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy (Anticuerpos biespecíficos que se acoplan a las células T para la terapia contra el cáncer)" Cancer Res. 69(12):4941-4944).
La interacción entre una cadena ligera y una cadena pesada del anticuerpo y, en particular, la interacción de sus dominios VL y VH, forma uno de los sitios de unión a epítopo del anticuerpo. Por el contrario, el constructo scFv comprende un dominio VL y VH de un anticuerpo contenido en una única cadena polipeptídica en la que los dominios están separados por un ligador flexible de una longitud suficiente para permitir el autoensamblaje de los dos dominios en un sitio de unión a epítopo funcional. Cuando el autoensamblaje de los dominios Vl y VH resulta imposible debido a un ligador de longitud insuficiente (menos de aproximadamente 12 residuos de aminoácidos), dos de los constructos scFv interactúan entre sí para formar una molécula bivalente, en la cual el VL de una cadena se asocia con el VH de la otra (revisado en Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies (Enfoques recombinantes de anticuerpos biespecíficos similares a IgG)" Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658).
Los anticuerpos naturales pueden unirse a una sola especie de epítopo (es decir, son monoespecíficos), a pesar de que se pueden unir a múltiples copias de dicha especie (es decir, exhiben bivalencia o multivalencia). La técnica ha observado la capacidad de producir diacuerpos que difieren de estos anticuerpos naturales porque pueden unirse a dos o más especies diferentes de epítopos (es decir, exhiben biespecificidad o multiespecificidad además de bivalencia o multivalencia) (véase, por ejemplo, Holliger et al. (1993) "Diabodies': Small Bivalent Avid Bispecific Antibody Fragments (Diacuerpos: pequeños fragmentos de anticuerpos bivalentes ávidos biespecíficos)" Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity (Un anticuerpo biespecífico similar a IgG recombinante completamente humano para el receptor del factor de crecimiento epidérmico y el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina para una actividad antitumoral mejorada)" J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Mertens, N. et al., "New Recombinant Bi and Trispecific Antibody Derivatives (Nuevos derivados de anticuerpos recombinantes bi- y triespecíficos)" En: NOVEL FRONTIERS IN THE PRODUCTION OF COMPOUNDS FOR BIOMEDICAL USE (FRONTERAS NOVEDOSAS EN LA PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS PARA USO BIOMÉDICO), A. VanBroekhoven et al. (Eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands (2001), págs. 195-208; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange (La multimerización de una proteína de fusión Fv-Fv de cadena única anti-CD20 quimérica está mediada a través del intercambio de dominio variable)" Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region (Diacuerpo para la inmunoterapia contra el cáncer y su mejora funcional mediante la fusión de la región Fc humana)" Resumen 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System (Construcción de un diacuerpo (pequeño anticuerpo biespecífico recombinante) mediante un sistema de replegamiento)" Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy (Anticuerpos biespecíficos que se acoplan a las células T para la terapia contra el cáncer)" Cancer Res. 69(12):4941-4944).
La provisión de diacuerpos no monoespecíficos proporciona una ventaja significativa: la capacidad de coligar y colocalizar células que expresan diferentes epítopos. De modo que los diacuerpos bivalentes tienen aplicaciones de amplio alcance, incluidos tratamientos e inmunodiagnóstico. La bivalencia permite una gran flexibilidad en el diseño y la ingeniería del diacuerpo para diversas aplicaciones, proporcionando una mayor avidez a antígenos multiméricos, entrecruzamiento de antígenos diferentes, y orientación directa a tipos celulares específicos que dependen de la presencia de ambos antígenos diana. Debido a su mayor valencia, bajas tasas de disociación y eliminación rápida de la circulación (en caso de diacuerpos de pequeño tamaño, de ~50 kDa o menos), las moléculas de los diacuerpos conocidos en la técnica también demostraron un uso particular en el campo de imágenes de tumores (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris (Direccionamiento tumoral mejorado por diacuerpos estabilizados con disulfuro expresados en Pichia pastoris)" Protein Eng. 10:1221). De particular importancia es la coligadura de células diferentes, por ejemplo, la unión cruzada entre células T citotóxicas y células tumorales (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells (Los anticuerpos híbridos pueden dirigirse hacia sitios para el ataque de células T)" Nature 314:628-631, y Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody (Destrucción específica de células de linfoma por células T citotóxicas mediada por un diacuerpo biespecífico)" Protein Eng. 9:299-305).
Los dominios de unión a epítopo de los diacuerpos también pueden ser dirigidos a un determinante de superficie de cualquier célula efectora inmunitaria, tal como CD3, CD16, CD32 o CD64, que se expresan en los linfocitos T, células asesinas naturales (NK) u otras células mononucleares. En muchos estudios, se halló que la unión de diacuerpos a determinantes de células efectoras, por ejemplo, receptores Fcy (FcyR), también activan la célula efectora (Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody (Destrucción específica de células de linfoma por células T citotóxicas mediada por un diacuerpo biespecífico)" Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) "Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins (Antígeno carcinoembrionario (CEA): activación específica de células T en el carcinoma de colon inducida por diacuerpos biespecíficos anti-CD3 x anti-CEA y proteínas de fusión biespecíficas B7 x anti-CEA)" Cancer Res. 59:2909-2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). Normalmente, la activación de células efectoras es desencadenada por la unión de un anticuerpo unido a un antígeno a una célula efectora, a través de la interacción Fc-FcyR; por lo tanto, en este sentido, las moléculas del diacuerpo de la divulgación pueden exhibir una funcionalidad similar a Ig independientemente de que comprendan un Dominio Fc (por ejemplo, como se ensayó en todos los ensayos de función efectora conocidos en la técnica o se ejemplifica en el presente [por ejemplo, análisis ADCC]). A través de la unión cruzada entre células tumorales y células efectoras, el diacuerpo no solo acerca las células efectoras a las células tumorales, sino que conduce a la lisis efectiva del tumor (véase, por ejemplo, Cao et al. (2003) "Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics (Conjugados de anticuerpos biespecíficos en la terapéutica)" Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197).
Sin embargo, las ventajas anteriores conllevan un alto costo. La formación de tales diacuerpos no monoespecíficos requiere el ensamblado de dos o más polipéptidos distintos (es decir, tal formación requiere que los diacuerpos pueden se formen a través de la heterodimerización de diferentes tipos de cadenas polipeptídicas). A diferencia de los diacuerpos monoespecíficos, que se forman a través de la homodimerización de cadenas polipeptídicas idénticas. Debido a que se deben proveer al menos dos polipéptidos diferentes (es decir, dos tipos de polipéptidos) con el fin de formar un diacuerpo no monoespecífico, y a que la homodimerización de tales polipéptidos produce moléculas inactivas (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System (Construcción de un diacuerpo (pequeño anticuerpo biespecífico recombinante) mediante un sistema de replegamiento)" Protein Eng. 13(8):583-588), la producción de tales polipéptidos debe llevarse a cano de forma tal de evitar la unión covalente entre polipéptidos del mismo tipo (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System (Construcción de un diacuerpo (pequeño anticuerpo biespecífico recombinante) mediante un sistema de replegamiento)" Protein Eng. 13(8):583-588). Por lo tanto, la técnica ha desarrollado la asociación no covalente de tales polipéptidos (véase, por ejemplo, Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications (El diacuerpo anti-CEA ligado a disulfuro covalente permite la conjugación y el radiomarcaje en sitios específicos para aplicaciones de direccionamiento tumoral)" Prot. Engr. Des. Sei. 17:21-27; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region (Diacuerpo para la inmunoterapia contra el cáncer y su mejora funcional mediante la fusión de la región Fc humana)" Resumen 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System (Construcción de un diacuerpo (pequeño anticuerpo biespecífico recombinante) mediante un sistema de replegamiento)" Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity (Un anticuerpo biespecífico similar a IgG recombinante completamente humano para el receptor del factor de crecimiento epidérmico y el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina para una actividad antitumoral mejorada)" J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672).
Sin embargo, la técnica reconoce que diacuerpos monovalentes biespecíficos compuestos de polipéptidos asociados no covalentemente son inestables y se disocian fácilmente en monómeros no funcionales (véase, por ejemplo, Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity (Un anticuerpo biespecífico similar a IgG recombinante completamente humano para el receptor del factor de crecimiento epidérmico y el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina para una actividad antitumoral mejorada)" J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672).
De cara a este desafío, la técnica ha logrado desarrollar diacuerpos monoespecíficos heterodiméricos enlazados covalentemente estables (véase, por ejemplo, WO 2006/113665; WO/2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO/2012/162068; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion (El reclutamiento de células efectoras con una nueva proteína de reorientación de doble afinidad basada en Fv conduce a una potente citólisis tumoral y al agotamiento de las células B in vivo)" J. Molec. Biol. 399(3):436-449; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor lib (CD32B) Inhibitory-Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold (Control terapéutico de la activación de las células B mediante el reclutamiento de la función inhibidora del receptor de Fcgamma lib (CD32B) con un nuevo andamio de anticuerpos biespecíficos)" Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma (Aplicación de moléculas de retardo de doble afinidad para lograr la destrucción óptima de células T redirigidas del linfoma de células B)" Blood 117(17):4542-4551; Publicaciones de Patente US No. 2012/0294796 y 2013/0149236). Tales enfoques implican el diseño de uno o más residuos de cisteína en cada uno de los tipos de polipéptidos empleados. Por ejemplo, se ha demostrado que la adición de un residuo de cisteína al extremo C-terminal de tales constructos permite el enlace de disulfuro entre las cadenas polipeptídicas, lo que estabiliza el heterodímero resultante sin interferir con las características de unión de la molécula bivalente.
Se describió que diacuerpos y otras inmunoglobulinas supuestamente tienen especificidad para gpA33 o CD3 o para ambos (véase, por ejemplo, Publicaciones de Patente US No. 2012/0014957; 2012/0034160; 2012/0087858; 2012/0189541; 2012/0195900; 2012/0201746; 2012/0237442; 2012/0263722; 2012/0258108; and 2012/0276608).
A pesar de este éxito, la producción de diacuerpos no monoespecíficos heterodiméricos funcionales estables se puede mejorar aún más por la definición y colocación cuidadosa de los dominios empleados en las cadenas polipeptídicas. Por lo tanto, la presente divulgación se relaciona con la provisión de polipéptidos específicos, diseñados especialmente para formar, a través de enlace covalente, diacuerpos heterodiméricos y diacuerpos heterodiméricos Fc que pueden unirse simultáneamente a gpA33 y CD3.
Sumario de la invención
La divulgación se refiere a "diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3". En realizaciones particulares, los diacuerpos de la presente divulgación tienen además un dominio de una región Fc de inmunoglobulina (es decir, un "Dominio Fc") ("diacuerpos Fc biespecíficos gpA33 x CD3") o un dominio de unión a albúmina ("ABD") ("diacuerpos biespecíficos con ABD"), para extender la vida media in vivo. Los diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3 y los diacuerpos Fc biespecíficos gpA33 x CD3 de la presente divulgación comprenden dos cadenas polipeptídicas diferentes que se asocian entre sí en forma heterodimérica para formar un sitio de unión específico a un epítopo de gpA33 y un sitio de unión específico a un epítopo de CD3. Por lo tanto, los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 y los diacuerpos Fc biespecíficos gpA33 x CD3 de la presente divulgación son monovalentes, en cuanto pueden unirse solo a una copia de epítopo de gpA33 y solo a una copia de epítopo de CD3, pero son biespecíficos, en cuanto un único diacuerpo puede unirse simultáneamente al epítopo de gpA33 y al epítopo de CD3.
Los diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3 de la presente divulgación se componen de dos cadenas polipeptídicas (una "primera" y una "segunda" cadena polipeptídica), enlazadas covalentemente entre sí, por ejemplo, por enlace de disulfuro de residuos de cisteína localizados dentro de cada cadena polipeptídica. Los diacuerpos Fc biespecíficos gpA33 x CD3 de la presente divulgación se componen de tres cadenas polipeptídicas (una "primera", una "segunda" y una "tercera" cadena polipeptídica), con la primera y segunda cadenas polipeptídicas enlazadas covalentemente entre sí, y la primera y tercera cadenas polipeptídicas enlazadas covalentemente entre sí. Los diacuerpos biespecíficos y diacuerpos Fc biespecíficos de la presente divulgación pueden unirse simultáneamente a gpA33 y CD3. La divulgación se refiere a tales diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3 y diacuerpos Fc biespecíficos gpA33 x CD3, y a composiciones farmacéuticas que contienen tales diacuerpos biespecíficos o tales diacuerpos Fc biespecíficos. La divulgación se refiere además a los procedimientos para el uso de tales diacuerpos para el tratamiento del cáncer.
En detalle, la invención proporciona un diacuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1 en la presente memoria.
La divulgación se refiere, además, a la realización del diacuerpo biespecífico descrito anteriormente, en el que la primera cadena polipeptídica o la segunda cadena polipeptídica comprende un Dominio de Unión a Albúmina (SEQ ID NO:34), ligado por el extremo C-terminal al Dominio 2 o por el extremo N-terminal al Dominio 1A a través de un Ligador 3 (s Eq ID NO:32).
En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un diacuerpo Fc biespecífico de conformidad con la reivindicación 3 descrita en la presente memoria.
También se describe un diacuerpo Fc monovalente biespecífico, en el que el diacuerpo Fc monovalente biespecífico tiene la capacidad de unirse a un epítopo de gpA33 específico y a un epítopo de CD3 específico, y posee u dominio Fc IgG, en el que el diacuerpo Fc monovalente biespecífico comprende una primera cadena polipeptídica, una segunda cadena polipeptídica y una tercera cadena polipeptídica, en el que la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí y la primera y la tercera cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí, y en el que:
A. la primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal:
i. un Dominio 1, que comprende un subDominio (1A) que, a su vez, comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26); y un subDominio (1B) que, a su vez, comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a CD3 (VHcd3) (SEQ ID NO:25); en el que los subDominios (1A) y (1B) están separados uno del otro por un ligador peptídico (SEQ ID NO:1);
ii. un Dominio 2, en el que el Dominio 2 es un Dominio de espiral E (SEQ ID NO:3) o un Dominio de espiral K (SEQ ID NO:4), en el que el Dominio 2 está separado del Dominio 1 por un ligador peptídico (SEQ ID NO:2); y
iii. un Dominio 3, que comprende un subDominio (3A) que, a su vez, comprende un péptido que contiene cisteína (Péptido 1) (SEQ ID NO:39); y un subDominio (3B) que, a su vez, comprende una porción polipeptídica de un Dominio Fc de IgG que tiene los dominios c H2 y CH3 de un Dominio Fc de IgG; en el que los Dominios 3 y 2 están separados uno del otro por un espaciador peptídico (Ligador 5) (GGG);
B. la segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal:
i. un Dominio 1, que comprende un subDominio (1A) que, a su vez, comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a CD3 (VLcd3) (SEQ ID NO:5), y un subDominio (1B) que, a su vez, comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (VHgpA33) (SEQ ID NO:27); en el que los subDominios (1A) y (1B) están separados uno del otro por un ligador peptídico (SEQ ID NO:1);
ii. un Dominio 2, en el que el Dominio 2 es un Dominio de espiral K (SEQ ID NO:4) o un Dominio de espiral E (SEQ ID NO:3), en el que el Dominio 2 está separado del Dominio 1 por un ligador peptídico (SEQ ID NO:2); y en el que el Dominio 2 de la primera cadena polipeptídica y el Dominio 2 de la segunda cadena polipeptídica no son ambos Dominios de espiral E ni son ambos Dominios de espiral K; y
C. la tercera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal, un Dominio 3 que comprende:
(1) un subDominio (3A) que, a su vez, comprende un péptido que contiene cisteína (Péptido 1) (SEQ ID NO:39); y
(2) un subDominio (3B) que, a su vez, comprende una porción polipeptídica de un Dominio Fc de IgG con los dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de IgG;
y en el que:
(a) las porciones polipeptídicas de los dominios Fc de IgG de la primera y tercera cadenas polipeptídicas forman el Dominio Fc de IgG;
(b) el Dominio VL de la primera cadena polipeptídica y el Dominio VH de la segunda cadena polipeptídica forman un Dominio de Unión a Antígeno con capacidad de unión a un epítopo de CD3 específico; y
(c) el Dominio VH de la primera cadena polipeptídica y el Dominio VL de la segunda cadena polipeptídica forman un Dominio de Unión a Antígeno con capacidad de unión a un epítopo de gpA33 específico.
En un tercer aspecto de la invención, se proporciona un diacuerpo Fc biespecífico de conformidad con la reivindicación 4 descrita en la presente memoria
También se describe un diacuerpo Fc monovalente biespecífico, en el que el diacuerpo Fc monovalente biespecífico tiene la capacidad de unirse a un epítopo de gpA33 específico y a un epítopo de CD3 específico, y posee u dominio Fc IgG, en el que el diacuerpo Fc monovalente biespecífico comprende una primera cadena polipeptídica, una segunda cadena polipeptídica y una tercera cadena polipeptídica, en el que la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí y la primera y la tercera cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí, y en el que:
A. la primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal:
i. un Dominio 3, que comprende un subDominio (3A) que, a su vez, comprende un péptido que contiene cisteína (Péptido 1) (SEQ ID NO:39); y un subDominio (3B) que, a su vez, comprende una porción polipeptídica de un Dominio Fc de IgG con los dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de IgG; ii. un Dominio 1, que comprende un subDominio (1A) que, a su vez, comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26); y un subDominio (1B) que, a su vez, comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a CD3 (VHcd3) (SEQ ID NO:25); en el que los subDominios (1A) y (1B) están separados uno del otro por un ligador peptídico (SEQ ID NO:1); en el que los Dominios 1 y 3 están separados uno del otro por un espaciador peptídico (Ligador 4) (SEQ ID NO:38);
iii. un Dominio 2, en el que el Dominio 2 es un Dominio de espiral E (SEQ ID NO:3) o un Dominio de espiral K (SEQ ID NO:4), en el que el Dominio 2 está separado del Dominio 1 por un ligador peptídico (SEQ ID NO:2); y
B. la segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal:
i. un Dominio 1, que comprende un subDominio (1A) que, a su vez, comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a CD3 (VLcd3) (SEQ ID NO:5); y un subDominio (1B) que, a su vez, comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (VHgpA33) (SEQ ID NO:27); en el que los subDominios (1A) y (1B) están separados uno del otro por un ligador peptídico (SEQ ID NO:1);
ii. un Dominio 2, en el que el Dominio 2 es un Dominio de espiral K (SEQ ID NO:4) o un Dominio de espiral E (SEQ ID NO:3), en el que el Dominio 2 está separado del Dominio 1 por un ligador peptídico (SEQ ID NO:2); y en el que el Dominio 2 de la primera cadena polipeptídica y el Dominio 2 de la segunda cadena polipeptídica no son ambos Dominios de espiral E ni son ambos Dominios de espiral K; y
C. la tercera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal, un Dominio 3 que comprende:
(1) un subDominio (3A) que, a su vez, comprende un péptido que contiene cisteína (Péptido 1) (SEQ ID NO:39); y
(2) un subDominio (3B) que, a su vez, comprende una porción polipeptídica de un Dominio Fc de IgG con los dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de IgG;
y en el que:
(a) las porciones polipeptídicas de los dominios Fc de IgG de la primera y tercera cadenas polipeptídicas forman el Dominio Fc de IgG;
(b) el Dominio VL de la primera cadena polipeptídica y el Dominio VH de la segunda cadena polipeptídica forman un Dominio de Unión a Antígeno con capacidad de unión a un epítopo de CD3 específico; y
(c) el Dominio VH de la primera cadena polipeptídica y el Dominio VL de la segunda cadena polipeptídica forman un Dominio de Unión a Antígeno con capacidad de unión a un epítopo de gpA33 específico.
La divulgación se refiere además a las realizaciones de cualquiera de los diacuerpos Fc biespecíficos descritos anteriormente, en el que el subDominio (3B) de la primera cadena polipeptídica comprende una secuencia diferente de la del subDominio (3B) de la tercera cadena polipeptídica.
La divulgación se refiere además a las realizaciones de cualquiera de los diacuerpos Fc biespecíficos descritos anteriormente, en el que el subDominio (3B) de la primera cadena polipeptídica tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40 y el subDominio (3B) de la tercera cadena polipeptídica tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41.
La divulgación se refiere además a las realizaciones de cualquiera de los diacuerpos Fc biespecíficos descritos anteriormente, en el que el subDominio (3B) de la primera cadena polipeptídica tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y el subDominio (3B) de la tercera cadena polipeptídica tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40.
La divulgación se refiere además a las realizaciones de cualquiera de los diacuerpos Fc biespecíficos descritos anteriormente, en el que el Dominio 3 de la primera cadena polipeptídica y/o el Dominio 3 de la tercera cadena polipeptídica comprenden una variante de secuencia CH2-CH3, que exhibe una unión alterada a un receptor Fcy. La divulgación se refiere además a las realizaciones de cualquiera de los diacuerpos biespecíficos descritos anteriormente o de cualquiera de los diacuerpos Fc biespecíficos descritos anteriormente, en el que el Dominio 2 de la primera cadena polipeptídica comprende una espiral E (SEQ ID NO:3), y el Dominio 2 de la segunda cadena polipeptídica comprende una espiral K (SEQ ID NO:4).
La divulgación se refiere además a las realizaciones de cualquiera de los diacuerpos biespecíficos descritos anteriormente o de cualquiera de los diacuerpos Fc biespecíficos descritos anteriormente, en el que el Dominio 2 de la primera cadena polipeptídica comprende una espiral K (SEQ ID NO:4), y el Dominio 2 de la segunda cadena polipeptídica comprende una espiral E (SEQ ID NO:3).
La divulgación se refiere además a un diacuerpo biespecífico, en el que el diacuerpo biespecífico tiene la capacidad de unirse a un epítopo de CD3 y a un epítopo de gpA33, en el que el diacuerpo biespecífico comprende:
(1) una primera cadena polipeptídica que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, y una segunda cadena polipeptídica con tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; o
(2) una primera cadena polipeptídica que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35, y una segunda cadena polipeptídica con tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30;
en el que la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí por un enlace de disulfuro.
La divulgación se refiere además a un diacuerpo Fc biespecífico, en el que el diacuerpo Fc biespecífico tiene la capacidad de unirse a un epítopo de CD3 y a un epítopo de gpA33, y posee un Dominio Fc de IgG, en el que el diacuerpo Fc biespecífico comprende:
(1) una primera cadena polipeptídica que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42, una segunda cadena polipeptídica con tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 y una tercera cadena polipeptídica con tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46; o
(2) una primera cadena polipeptídica que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48, una segunda cadena polipeptídica con tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28 y una tercera cadena polipeptídica con tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46;
en el que la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí por un primer enlace de disulfuro y la primera y la tercera cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí por un segundo enlace de disulfuro.
La divulgación se refiere además a una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los diacuerpos biespecíficos descritos anteriormente o cualquiera de los diacuerpos Fc biespecíficos descritos anteriormente; y a un vehículo fisiológicamente aceptable.
La divulgación se refiere además al uso de la composición farmacéutica descrita anteriormente en el tratamiento de un cáncer caracterizado por la expresión de gpA33 y, especialmente, tal uso donde el cáncer es un cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer gástrico o cáncer pancreático.
La divulgación se refiere además a una célula que expresa una cadena polipeptídica de cualquiera de los diacuerpos biespecíficos descritos anteriormente o cualquiera de los diacuerpos Fc biespecíficos descritos anteriormente, así como a un polinucleótido que codifica tal polipéptido expresado.
La divulgación se refiere además a una célula que expresa un anticuerpo o una porción o fragmento polipeptídico del mismo, en el que el anticuerpo se une a gpA33, y donde el anticuerpo o la porción o fragmento polipeptídico del mismo comprende:
(1) CDR1 (SEQ ID NO:14), CDR2 (SEQ ID NO:15) y CDR3 (SEQ ID NO:16) de una cadena ligera de un anticuerpo anti-gpA33 humana;
(2) CDR1 (SEQ ID NO:18), CDR2 (SEQ ID NO:19) y CDR3 (SEQ ID NO:20) de una cadena pesada de un anticuerpo anti-gpA33 humana; o
(3) ambos, (1)y(2).
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra las estructuras de la primera y segunda cadenas polipeptídicas de un diacuerpo biespecífico gpA33 x CD3 de dos cadenas, de la presente divulgación.
Las Figuras 2A y 2B ilustran las estructuras de dos versiones de la primera, segunda y tercera cadenas polipeptídicas de un diacuerpo Fc biespecífico gpA33 x CD3 de tres cadenas, de la presente divulgación (versión 1, Figura 2A; y versión 2, Figura 2B).
La Figura 3 demuestra que los diacuerpos de la presente divulgación pueden unirse simultáneamente a CD3 y a gpA33.
La Figura 4 ilustra la capacidad de los diacuerpos de la presente divulgación para tratar el cáncer. Se incubaron células de cáncer colorrectal o cáncer pancreático en presencia del diacuerpo biespecífico gpA33 x CD3 (DART-1) y PBMC humanas (E:T = 25:1) o bien células T humanas activadas (E:T = 10:1), y se midió la citotoxicidad (Figura 4A (células colorrectales CSCL de colon), Figura 4B (células colorrectales Colo205), y Figura 4C (células de cáncer pancreático ASPC-1).
Las Figuras 5A-5F muestran que se produjo la activación de las células T CD8 en presencia del diacuerpo monovalente biespecífico CD3 (DART-1) solo en presencia de células cancerígenas (Figuras 5A-5C: células T CD8 células colo205 (Figura 5a ), células T CD8 células ASPC-1 (Figura 5B), células T CD8 solas (Figura 5C); Figuras 5D-5F: células T CD4 células colo205 (Figura 5D), células T CD4 células ASPC-1 (Figura 5e ), células T CD8 solas (Figura 5F).
Las Figuras 6A-6D demuestran que los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 (DART-1 y DART-2) mediaron la citotoxicidad equivalente para células de adenocarcinoma colorrectal SW948 (Figura 6A) y células colo205 (Figura 6B) y células Colo205-Luc (Figura 6C), y que ningún diacuerpo medió la citotoxicidad de la línea celular de gpA33 negativa, HCT116 (Figura 6D).
Las Figuras 7A-7D demuestran la capacidad del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 (DART-2), el diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un dominio de unión a albúmina (DART-2 con ABD "c/ABD") y el diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un Dominio Fc de IgG (DART-2 con Fc "c/Fc") para promover la citotoxicidad de las células cancerosas en presencia de PBMC humanas o de mono cynomolgus.
La Figura 8 demuestra la capacidad in vivo del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 (DART-1) para disminuir el volumen del tumor en un modelo murino de cáncer de colon Colo205.
Las Figuras 9A-9D muestran datos de imágenes de tumores de ratones NOD scid gamma (NSG) implantados con células Colo205 dos días después de recibir el vehículo (Figura 9A) o el diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 (DART-1) (Figura 9B), y 12 días después de recibir el Vehículo (Figura 9C) o el DART-1 (Figura 9D).
La Figura 10 demuestra la capacidad in vivo del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 (DART-1) para disminuir el volumen del tumor en un modelo murino de cáncer pancreático ASPC-1.
La Figura 11 muestra la capacidad del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un dominio Fc de inmunoglobulina IgG (DART-2 c/Fc Versión 1) para mediar una drástica reducción en el volumen del tumor en un modelo in vivo de cáncer de colon.
La Figura 12 muestra la capacidad del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un dominio Fc de inmunoglobulina IgG (DART-2 c/Fc Versión 1) para mediar una reducción en el volumen del tumor en un modelo in vivo de cáncer de colon, incluso a dosis extremadamente bajas.
La Figura 13 muestra la farmacocinética del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 (DART-2) y del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un dominio Fc de inmunoglobulina IgG (DART-2 c/Fc Versión 1) en monos cynomolgus.
Las Figuras 14A-14B muestran el análisis SPR de la unión de DART-2 c/Fc Versión 1 a CD3 inmovilizado humano y de mono cynomolgus. Las líneas discontinuas negras representan el ajuste global a un modelo 1:1 de Langmuir de curvas de unión obtenidas a concentraciones de ART-2 c/Fc de 0, 6,25, 12,5, 25, 50 o 100 nM. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Las Figuras 15A-15B muestran el análisis SPR de la unión de DART-2 c/Fc Versión 1 a gpA33 capturado humano y de mono cynomolgus. Las líneas discontinuas negras representan el ajuste global a un modelo 1:1 de Langmuir de curvas de unión obtenidas a concentraciones de ART-2 c/Fc versión 1 de 0, 6,25, 12,5, 25, 50 o 100 nM. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación se refiere a diacuerpos biespecíficos que comprenden dos cadenas polipeptídicas y poseen un sitio de unión específico a un epítopo de gpA33 y un sitio de unión específico a un epítopo de CD3 (es decir, un "diacuerpo biespecífico gpA33 x CD3"). La presente divulgación se refiere además a diacuerpos biespecíficos que comprenden un Dominio Fc de inmunoglobulina ("diacuerpos Fc biespecíficos"), están compuestos de tres cadenas polipeptídicas y poseen al menos un sitio de unión específico a un epítopo de gpA33 y un sitio de unión específico a un epítopo de CD3 (es decir, un "diacuerpo Fc biespecífico gpA33 x CD3"). Los diacuerpos biespecíficos y diacuerpos Fc biespecíficos de la presente divulgación tienen la capacidad de unirse simultáneamente a gpA33 y CD3. La divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen tales diacuerpos biespecíficos o tales diacuerpos Fc biespecíficos. La divulgación se refiere además a los procedimientos para el uso de tales diacuerpos para el tratamiento del cáncer.
Los diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3 de la presente divulgación están compuestos por dos cadenas polipeptídicas que se asocian entre sí para formar un sitio de unión específico a un epítopo de gpA33 y un sitio de unión específico a un epítopo de CD3. Las cadenas polipeptídicas individuales del diacuerpo se enlazan covalentemente entre sí, por ejemplo, por enlace de disulfuro de residuos de cisteína localizados dentro de cada cadena polipeptídica. Cada cadena polipeptídica contiene un Dominio de Unión a Antígeno de un dominio variable de cadena ligera, un Dominio de Unión a Antígeno de un dominio variable de cadena pesada y un dominio de heterodimerización. Un ligador peptídico interviniente (ligador 1) hace la separación entre el Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena ligera y el Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena pesada. El Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena ligera de la primera cadena polipeptídica interactúa con el Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena pesada de la segunda cadena polipeptídica, para formar un primer sitio funcional de unión a antígeno para el primer antígeno (es decir, gpA33 o CD3). Asimismo, el Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena ligera de la segunda cadena polipeptídica interactúa con el Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena pesada de la primera cadena polipeptídica, para formar un segundo sitio funcional de unión a antígeno para el segundo antígeno (es decir, gpA33 o CD3, dependiendo de la identidad del primer antígeno). Por lo tanto, se coordina la selección del Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena ligera y el Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena pesada de la primera y segunda cadenas polipeptídicas, de modo tal que las dos cadenas polipeptídicas conjuntamente comprendan dominios de unión a antígeno de dominios variables de cadena ligera y pesada capaces de unirse a gpA33 y CD3.
Los diacuerpos Fc biespecíficos gpA33 x CD3 de la presente divulgación se componen de una primera cadena polipeptídica, una segunda cadena polipeptídica y una tercera cadena polipeptídica. La primera y la segunda cadenas polipeptídicas se asocian entre sí para formar un sitio de unión específico a un epítopo de gpA33 y un sitio de unión específico a un epítopo de c D3. La primera cadena polipeptídica y la tercera cadena polipeptídica se asocian entre sí para formar un Dominio Fc de inmunoglobulina. La primera y la segunda cadenas polipeptídicas del diacuerpo Fc biespecífico se enlazan covalentemente entre sí, por ejemplo, por enlace de disulfuro de residuos de cisteína localizados dentro de cada cadena polipeptídica. La primera y la tercera cadenas polipeptídicas se enlazan covalentemente entre sí, por ejemplo, por enlace de disulfuro de residuos de cisteína localizados dentro de cada cadena polipeptídica. La primera y la segunda cadenas polipeptídicas contienen un Dominio de Unión a Antígeno de un dominio variable de cadena ligera, un Dominio de Unión a Antígeno de un dominio variable de cadena pesada y un dominio de heterodimerización. Un ligador peptídico interviniente (ligador 1) hace la separación entre el Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena ligera y el Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena pesada. El Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena ligera de la primera cadena polipeptídica interactúa con el Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena pesada de la segunda cadena polipeptídica, para formar un primer sitio funcional de unión a antígeno para el primer antígeno (es decir, gpA33 o CD3). Asimismo, el Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena ligera de la segunda cadena polipeptídica interactúa con el Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena pesada de la primera cadena polipeptídica, para formar un segundo sitio funcional de unión a antígeno para el segundo antígeno (es decir, gpA33 o CD3, dependiendo de la identidad del primer antígeno). Por lo tanto, se coordina la selección del Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena ligera y el Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena pesada de la primera y segunda cadenas polipeptídicas, de modo tal que las dos cadenas polipeptídicas conjuntamente comprendan dominios de unión a antígeno de dominios variables de cadena ligera y pesada capaces de unirse a gpA33 y CD3. La primera y la tercera cadenas polipeptídicas contienen, cada una, un péptido que contiene cisteína (Péptido 1) SEQ ID NO:39: y parte o la totalidad del dominio CH2 y/o parte o la totalidad del dominio CH3 de un dominio completo FC de inmunoglobulina y un péptido que contiene cisteína. La parte o la totalidad del dominio CH2 y/o la parte o la totalidad del dominio CH3 se asocian para formar el Dominio Fc de inmunoglobulina de los diacuerpos Fc biespecíficos de la presente divulgación. La primera y la tercera cadenas polipeptídicas de los diacuerpos Fc biespecífico de la presente divulgación se enlazan covalentemente entre sí, por ejemplo, por enlace de disulfuro de residuos de cisteína localizados dentro del péptido que contiene cisteína de las cadenas polipeptídicas.
La formación de heterodímeros de la primera y la segunda cadenas polipeptídicas del diacuerpo biespecífico o diacuerpo Fc biespecífico puede ser impulsada por los dominios de heterodimerización. Tales dominios incluyen GVEPKSC (SEQ ID NO:54) (o VEPKSC; SEQ ID NO:55) en una cadena polipeptídica y GFNRGEC (SEQ ID NO:56) (o FNRGEC; SEQ iD NO:57) en la otra cadena polipeptídica (US2007/0004909). Alternativamente, tales dominios se pueden diseñar para contener espirales de cargas opuestas. El dominio de heterodimerización de una de las cadenas polipeptídicas comprende una secuencia de al menos seis, al menos siete o al menos ocho aminoácidos cargados positivamente, y el dominio de heterodimerización de la otra cadena polipeptídica comprende una secuencia de al menos seis, al menos siete o al menos ocho aminoácidos cargados negativamente. Por ejemplo, el primero o el segundo dominio de heterodimerización puede comprender una secuencia con ocho aminoácidos cargados positivamente y el otro de los dominios - de heterodimerización puede comprender una secuencia con ocho aminoácidos cargados negativamente. El aminoácido cargado positivamente puede ser Usina, arginina, histidina, etc. y/o el aminoácido cargado negativamente puede ser ácido glutámico, ácido aspártico, etc. El aminoácido cargado es, de preferencia, lisina y/o el aminoácido cargado negativamente es, de preferencia, ser ácido glutámico.
Los diacuerpos biespecíficos y diacuerpos Fc biespecíficos de la presente divulgación son diseñados de modo que tales primera y segunda cadenas polipeptídicas se enlazan covalentemente entre sí a través de residuos de cisteína a todo lo largo. Tales residuos de cisteína se pueden introducir en el ligador interviniente que separa los dominios VL y VH de los polipéptidos. Alternativamente, y más preferentemente, se introduce un segundo péptido (ligador 2) en cada cadena polipeptídica, por ejemplo, en el extremo amino-terminal de las cadenas polipeptídicas o en una posición que coloca el ligador 2 entre el dominio de heterodimerización y el Dominio de Unión a Antígeno del dominio variable de cadena ligera o del dominio variable de cadena pesada.
Como se indicó anteriormente, gpA33 es expresada por las células colorrectales. Los anticuerpos capaces de unirse inmunoespecíficamente a gpA33 son capaces de unirse a dichas células. CD3 se expresa en las células T. Por lo tanto, los anticuerpos capaces de unirse inmunoespecíticamente a ambos gpA33 y CD3 son capaces de apuntar las células T a células colorrectales y otras células cancerosas que expresan gpA33 (por ejemplo, células de carcinoma de colon, células de cáncer pancreático, etc.) y, por consiguiente, proporcionar una terapia mejorada para tales tipos de cáncer.
I. Diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3 preferidos de la presente divulgación
A. Diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3
Una realización de la presente divulgación se relaciona con diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3 que se componen de una primera cadena polipeptídica, una segunda cadena polipeptídica y una tercera cadena polipeptídica, cuyas secuencias permiten que las cadenas polipeptídicas se enlacen covalentemente entre sí para formar un complejo covalentemente asociado que es capaz de unirse simultáneamente a gpA33 y CD3. La primera cadena polipeptídica de los diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3 preferidos comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal, un extremo N-terminal, un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a CD3 o bien a gpA33 (es decir, ya sea VLcd3 o VLgpA33), un primer péptido espaciador interviniente (Ligador 1), un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (si la primera cadena polipeptídica contiene VLcd3) o CD3 (si la primera cadena polipeptídica contiene VLgpA33), un segundo péptido espaciador interviniente que contiene cisteína (Ligador 2), un dominio promotor de heterodímeros y un extremo C-terminal (Figura 1).
La segunda cadena polipeptídica de los diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3 preferidos comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal, un extremo N-terminal, un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 o bien a CD3 (es decir, ya sea VLgpA33 o VLcd3, dependiendo del Dominio VL seleccionado para la primera cadena polipeptídica del diacuerpo), un péptido ligador interviniente (Ligador 1), un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a c D3 (si la segunda cadena polipeptídica contiene VLgpA33) o gpA33 (si la segunda cadena polipeptídica contiene VLdc3), un péptido espaciador interviniente que contiene cisteína (Ligador 2), un dominio promotor de heterodímeros y un extremo C-terminal (Figura 1).
El Dominio VL de la primera cadena polipeptídica de los diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3 preferidos interactúa con el Dominio VH de la segunda cadena polipeptídica los diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3 preferidos, para formar un primer sitio funcional de unión a antígeno para el primer antígeno (es decir, CD3 o gpA33). Asimismo, el Dominio VL de la segunda cadena polipeptídica interactúa con el Dominio VH de la primera cadena polipeptídica, para formar un segundo sitio funcional de unión a antígeno para un segundo antígeno (es decir, gpA33 o CD3, dependiendo de la identidad del primer antígeno). Por lo tanto, se coordina la selección de los dominios VL y VH de la primera y la segunda cadenas polipeptídicas, de modo tal que las dos cadenas polipeptídicas de los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 preferidos, conjuntamente, comprendan dominios VL y VH capaces de unirse a gpA33 y CD3 (es decir, que comprenden VLcd3/VHcd3 y VLgpA33/VHgpA33).
Más preferentemente, se selecciona la longitud del péptido ligador interviniente (Ligador 1, que separa dichos dominios VL y VH) para evitar sustancial o completamente que los dominios VL y VH de la cadena polipeptídica se unan uno al otro. Por lo tanto, los dominios VL y VH de la primera cadena polipeptídica son sustancial o completamente incapaces de unirse entre sí. Asimismo, los dominios VL y VH de la segunda cadena polipeptídica son sustancial o completamente incapaces de unirse entre sí. Un péptido espaciador interviniente preferido (Ligador 1) tiene la secuencia (SEQ ID NO:1): GGGSGGGG.
El segundo péptido espaciador interviniente que contiene cisteína (Ligador 2) contendrá 1, 2, 3 o más cisteínas. Un péptido espaciador interviniente que contiene cisteína preferido (Ligador 2) tiene la secuencia (SEQ ID NO:2): GGCGGG.
Los dominios promotores de heterodímeros de la primera y la segunda cadenas polipeptídicas son diferentes entre sí y están diseñadas para asociarse entre sí de modo de promover la asociación de la primera y la segunda cadenas polipeptídicas. Por lo tanto, en una realización preferente, una de esas cadenas polipeptídicas se diseñará para contener un Dominio de espiral E promotor de heterodímeros (SEQ ID NO:3):
EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
cuyos residuos formarán una carga negativa a pH 7, mientras la otra de las dos cadenas polipeptídicas se diseñará para contener un Dominio de espiral K promotor de heterodímeros (SEQ ID NO:4):
KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
cuyos residuos formarán una carga positiva a pH 7. La presencia de tales dominios cargados promueve la asociación entre el primero y el segundo polipéptidos, y por lo tanto fomenta la heterodimerización. Es indiferente cual espiral se asigna a cada cadena, siempre que los espirales empleados en la primera y la segunda cadenas polipeptídicas sean diferentes, a fin de fomentar la heterodimerización entre tales cadenas.
1. El diacuerpo biespecífico gpA33 x CD3, "DART-1"
La primera y la segunda cadenas polipeptídicas de un diacuerpo biespecífico gpA33 x CD3 preferido, designado en lo sucesivo "DART-1", comprende dominios polipeptídicos que tienen las siguientes secuencias:
El Dominio VL de un anticuerpo que se une a CD3 (VLcd3) (SEQ ID NO:5):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK
RAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG
El Dominio de Unión a Antígeno de VLcd3 comprende CDR1 que tiene la secuencia: (SEQ ID NO:6) RSSTGAVTTSNYAN; CDR2 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:7): Gt NKRAP; y CDR3 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:8): ALWYSNLWV.
El Dominio VH de un anticuerpo que se une a CD3 (VHcd3) (SEQ ID NO:9):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKY
NNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVS
WFAYWGQGTLVTVSS
El Dominio de Unión a Antígeno de VHcd3 comprende: CDR1 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:10): TYAMN; CDR2 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:11): RIRSKYNNYATYYADSVKD; y CDR3 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:12): HGNFGNSYVSWFAY.
El Dominio VL de un anticuerpo murino que se une a gpA33 (VLgpA33) (SEQ ID NO:13):
QIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSARSSISFMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLAS
GVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGSGTKLELK
El Dominio de Unión a Antígeno de VLgpA33 comprende CDR1 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:14): SARSSISFMY; CDR2 que tiene la secuencia (SEQ iD NO:15): DTSNLAS; y CDR3 que tiene la secuencia (SeQ ID NO:16): QQWSSYPLT.
El Dominio VH de un anticuerpo murino que se une a gpA33 (VHgpA33) (SEQ ID NO:17):
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSGSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGD
GETNYNGKFKDKATLTADKSSTTAYMELSSLTSVDSAVYFCARIYGNNVYFDVWG
AGTTVTVSS
El Dominio de Unión a Antígeno de VHgpA33 comprende CDR1 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:18): GSWMN; CDR2 que tiene la secuencia (SEQ ID No :19): RIYPGDGETnYnGKFKD; y CDR3 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:20): IYGNNVYFDV.
El primer péptido espaciador interviniente preferido (Ligador 1) tiene la secuencia (SEQ ID NO:1): GGGSGGGG. El péptido espaciador interviniente que contiene cisteína preferido (Ligador 2) tiene la secuencia (SEQ ID NO:2): GGCGGG.
El dominio promotor de heterodímeros de la primera cadena polipeptídica es el Dominio de espiral E (SEQ ID NO:3). El dominio promotor de heterodímeros de la segunda cadena polipeptídica es el Dominio de espiral K (SEQ ID NO:4).
Por lo tanto, la primera cadena polipeptídica de DART-1 tiene la secuencia (SEQ ID NO:21):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK
RAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG
GGGSGGGGQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSGSWMNWVKQRPGQGLEW
IGRIYPGDGETNYNGKFKDKATLTADKSSTTAYMELSSLTSVDSAVYFCARIYGN
NVYFDVWGAGTTVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
Como se apreciará, los residuos 1-110 de SEQ ID NO: 21 son el Dominio VL de un anticuerpo que se une a CD3 (VLcd 3 ) (s Eq ID NO:5); los residuos 111-118 de SEQ ID NO:21 son el primer péptido espaciador interviniente (Ligador 1) (SEQ ID nO:1); los residuos 119-237 de SEQ ID NO:21 son el Dominio VH de un anticuerpo murino que se une a gpA33 (VHgpA33) (SEQ ID NO:17), los residuos 238-243 de SEQ ID NO:21 son un péptido espaciador que contiene cisteína (Ligador 2) (SeQ ID NO:2) y los residuos 244-271 de SEQ ID NO:21 son el Dominio de espiral E promotor de heterodímeros (SEQ ID NO:3).
Un polinucleótido preferido que codifica la primera cadena polipeptídica de DART-1 tiene la secuencia (SEQ ID NO:22):
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtga ccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattg ggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaa agggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccg ctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctct gtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctggga ggtggtggatccggcggaggtggacaggtccagctgcagcagtctggacctgagc tggtgaagcctggggcctcagtgaagatttcctgcaaagcttcaggctacacatt cagtggctcttggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtgg attggacggatctaccctggagatggagaaactaactacaatgggaagtttaagg acaaggccacactgactgcagacaaatcatccaccacagcctacatggagctcag cagcctgacctctgtggactctgcggtctatttctgtgcaagaatctatggtaat aacgtttacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtgtcttccggag gatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaa ggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaa
La segunda cadena polipeptídica de DART-1 tiene la secuencia (SEQ ID NO:23):
QIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSARSSISFMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLAS
GVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGSGTKLELKRGGG
SGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVAR
IRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFG
NSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
Como se apreciará, los residuos 1-107 de SEQ ID NO:23 son el Dominio VL de un anticuerpo que se une a gpA33 (VLgpA33) (SEQ ID NO:13); los residuos 108-115 de SEQ ID NO:23 son el primer péptido espaciador interviniente (Ligador 1) (SEQ ID NO:1); los residuos 116-240 de SEQ ID NO:23 son el Dominio VH de un anticuerpo que se une a CD3 (VHcd3) (SeQ ID NO:9), los residuos 241-246 de SEQ ID NO:23 son un péptido espaciador que contiene cisteína (Ligador 2) (SEQ iD NO:2) y los residuos 247-274 de SEQ ID NO:23 son el Dominio de espiral K promotor de heterodímeros (SEQ ID NO:4).
Un polinucleótido preferido que codifica la segunda cadena polipeptídica de DART-1 tiene la secuencia (SEQ ID NO:24):
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaggg tcaccatgacctgcagtgccaggtcaagtataagtttcatgtactggtaccagca gaagccaggatcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttct ggagtccctgttcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttattctctcacaa tcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtag ttacccactcacgttcggttctgggaccaagctggagctgaaacggggtggagga tccggcggaggcggagaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagc ctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcaacacata cgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttgcaagg atcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggata gattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacag cctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggc aattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgt cttccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgc tttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag
2. El diacuerpo biespecífico gpA33 x CD3, "DART-2"
La primera y la segunda cadenas polipeptídicas de un segundo diacuerpo biespecífico gpA33 x CD3 preferido, designado en lo sucesivo "DART-2", comprende dominios polipeptídicos que tienen las siguientes secuencias:
El Dominio VL de un anticuerpo que se une a CD3 (VLcd3) (SEQ ID NO:5):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK
RAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG
El Dominio de Unión a Antígeno de VLcd3 comprende CDR1 que tiene la secuencia: (SEQ ID NO:6) RSSTGAVTTSNYAN; CDR2 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:7): Gt NKRAP; y CDR3 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:8): ALWYSNLWV.
El Dominio VH de un anticuerpo que se une a CD3 (VHcd3) (SEQ ID NO:25):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKY
NNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVS
WFAYWGQGTLVTVSS
El Dominio de Unión a Antígeno de VHcd3 comprende CDR1 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:10): TYAMN; CDR2 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:11): RIRSKYNNyAt YYADSVKD; y CDR3 que tiene la secuencia: (SEQ ID NO:12) HGNFGNSYVSWFAY.
El anticuerpo murino que se une a gpA33 humana, discutido anteriormente, fue humanizado para proporcionar los dominios VL y VH del diacuerpo preferido DART-2. Estos dominios humanizados son los siguientes:
El Dominio VL de un anticuerpo humanizado que se une a gpA33 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26):
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSARSSISFMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLAS
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIK
El Dominio de Unión a Antígeno de VLgpA33 comprende CDR1 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:14): SARSSISFMY; CDR2 que tiene la secuencia (SEQ iD NO:15): DTSNLAS; y CDR3 que tiene la secuencia (SeQ ID NO:16): QQWSSYPLT.
El Dominio VH de un anticuerpo humanizado que se une a gpA33 (VHgpA33) (SEQ ID NO:27):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEWIGRIYPGD
GETNYNGKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIYGNNVYFDVWG
QGTTVTVSS
El Dominio de Unión a Antígeno de VHgpA33 comprende CDR1 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:18): GSWMN; CDR2 que tiene la secuencia (SEQ ID No :19): RIYPGDGETnYnGKFKD; y CDR3 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:20): IYGNNVYFDV.
El primer péptido espaciador interviniente preferido (Ligador 1) tiene la secuencia (SEQ ID NO:1): GGGSGGGG. El péptido espaciador interviniente que contiene cisteína preferido (Ligador 2) tiene la secuencia (SEQ ID NO:2): GGCGGG.
El Dominio promotor de heterodímeros de la primera cadena polipeptídica es el Dominio de espiral E (SEQ ID NO:3). El Dominio promotor de heterodímeros de la segunda cadena polipeptídica es el Dominio de espiral K (SEQ ID NO:4).
Por lo tanto, la primera cadena polipeptídica de DART-2 tiene la secuencia (SEQ ID NO:28):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK
RAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG
GGGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEW
IGRIYPGDGETNYNGKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIYGN
NVYFDVWGQGTTVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
Como se apreciará, los residuos 1-110 de SEQ ID NO:28 son el Dominio VL de un anticuerpo que se une a CD3 (VLcd3 ) (s Eq ID NO:5); los residuos 111-118 de SEQ ID NO:28 son el primer péptido espaciador interviniente (Ligador 1) (SEQ ID nO:1); los residuos 119-237 de SEQ ID NO:28 son el Dominio VH de un anticuerpo que se une a gpA33 (VHgpA33) (s Eq ID NO:27), los residuos 238-243 de SEQ ID NO:28 son un péptido espaciador que contiene cisteína (Ligador 2) (SEQ ID No :2) y los residuos 244-271 de SEQ ID NO:28 son el Dominio de espiral E promotor de heterodímeros (SEQ ID NO:3).
Un polinucleótido preferido que codifica la primera cadena polipeptídica de DART-2 tiene la secuencia (SEQ ID NO:29):
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtga ccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattg ggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaa agggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccg ctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctct gtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctggga ggtggtggatccggcggaggtggacaggtccagctggtccagagcggggccgaag tcaaaaaacccggagcaagcgtgaaggtctcctgcaaagcatcaggctatacatt tacaggcagctggatgaactgggtgaggcaggctccaggacagggactggagtgg atcgggcgcatctaccctggagacggcgaaactaactataatggaaagttcaaag accgagtgaccatcacagccgataagtctactagtaccgcctacatggagctgag ctccctgcggtctgaagataccgccgtctactattgcgctagaatttacggaaac aatgtctattttgacgtgtgggggcagggaacaactgtgactgtctcctccggag gatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaa ggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaa
La segunda cadena polipeptídica de DART-2 tiene la secuencia (SEQ ID NO:30):
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSARSSISFMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLAS
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKGGGS
GGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRI
RSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGN
SYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
Como se apreciará, los residuos 1-106 de SEQ ID NO:30 son el Dominio VL de un anticuerpo que se une a gpA33 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26); los residuos 107-114 de SEQ ID NO:30 son el primer péptido espaciador interviniente (Ligador 1) (SEQ ID NO:1); los residuos 115-239 de SEQ ID NO:30 son el Dominio VH de un anticuerpo que se une a Cd3 (VHcd3) (SEQ ID NO:25), los residuos 240-245 de SEQ ID NO:30 son un péptido espaciador que contiene cisteína (Ligador 2) (SEQ ID NO:2) y los residuos 246-273 de SEQ ID NO:30 son el Dominio de espiral K promotor de heterodímeros (SEQ ID NO:4).
Un polinucleótido preferido que codifica la segunda cadena polipeptídica de DART-2 tiene la secuencia (SEQ ID NO:31):
gacattcagctgactcagtccccctcttttctgtccgcatccgtcggagatcgag tgactattacttgctctgctaggtcctcaatcagcttcatgtactggtatcagca gaagcccggcaaagcacctaagctgctgatctacgacacaagcaacctggcctcc ggggtgccatctcggttctctggcagtgggtcaggaactgagtttaccctgacaa ttagctccctggaggctgaagatgccgctacctactattgccagcagtggagcag ctatcctctgaccttcggacaggggactaaactggaaatcaagggtggaggatcc ggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctg gagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcacatacgc tatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatc aggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagat tcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcct gaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaat tcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtctt ccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgcttt gaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag
3. El diacuerpo biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un Dominio de Unión a Albúmina (ABD) ("DART-2 c/ABD")
En otra realización de la divulgación, el diacuerpo biespecífico gpA33 x CD3 comprenderá un Dominio de Unión a Albúmina ("ABD") ("diacuerpo biespecífico gpA33 x CD3 con a Bd")
Como se describe en el documento de patente WO 2012/018687, con el fin de mejorar las propiedades farmacocinéticas in vivo de moléculas de diacuerpos, las moléculas pueden ser modificadas para contener una porción polipeptídica de una proteína de unión sérica en uno o más de los extremos de la molécula de diacuerpo. Preferentemente, dicha porción polipeptídica de una proteína de unión sérica se instalará en el extremo C-terminal de la molécula de diacuerpo. Una porción polipeptídica de una proteína de unión sérica particularmente preferida para este fin es el Dominio de Unión a Albúmina (ABD) de la proteína estreptocócica G. Se prefiere particularmente el Dominio de Unión a Albúmina 3 (ABD3) de la proteína G de la cepa G148 de Streptococcus. El Dominio de Unión a Albúmina 3 (ABD3) de la proteína G de la cepa G148 de Streptococcus consta de 46 residuos de aminoácidos que forman un haz estable de tres hélices y tiene una amplia especificidad de unión a albúmina (Johansson, M.U. et al. (2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules (Estructura, especificidad y modo de interacción de los módulos de unión a la albúmina bacteriana)" J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). La albúmina es la proteína más abundante en el plasma y tiene una vida media de 19 días en humanos. La albúmina posee varios pequeños sitios de unión moleculares que permiten que se una de forma no covalente a otras proteínas, de modo que se extiende su vida media en suero. Por lo tanto, la primera cadena polipeptídica o la segunda cadena polipeptídica de un diacuerpo biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un Dominio de Unión a Albúmina, contiene un tercer ligador (Ligador 3), que separa la espiral E (o espiral K) de dicha cadena polipeptídica del Dominio de Unión a Albúmina. Una secuencia preferida para ese Ligador 3 es GGGS (SEQ ID NO:32) o GGGNS (SEQ ID NO:33). Un Dominio de Unión a Albúmina (ABD) preferido tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:34):
LAQAKEAAIRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP
Con el fin de ilustrar este aspecto de la divulgación, se modificó la primera cadena polipeptídica del DART-2 descrito anteriormente para contener un Dominio de Unión a Albúmina, lo que dio lugar a un diacuerpo biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un ABD, designado en el presente "DART-2 c/ABD".
La primera cadena polipeptídica de tal DART-2 c/ABD tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:35):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK
RAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG
GGGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEW
IGRIYPGDGETNYNGKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIYGN
NVYFDVWGQGTTVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGS
LAQAKEAAIRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP
Como se reconocerá, los residuos 1-271 de SEQ ID NO:35 son idénticos a los residuos de DART-2 y, por lo tanto, proporcionan, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal, el Dominio VL de un anticuerpo que se une a CD3 (VLcd3) (SEQ ID NO:5); el primer péptido espaciador interviniente (Ligador 1) (SEQ ID NO:1); el Dominio VH de un anticuerpo que se une a gpA33 (VHgpA33) (SEQ ID NO:27), el péptido espaciador que contiene cisteína (Ligador 2) (SEQ ID NO:2) y el Dominio de espiral E promotor de heterodímeros (SEQ ID NO:3) y un extremo C-terminal. Los residuos 272-275 son el Ligador 3 (SEQ ID NO:32) y los residuos 276-321 son un Dominio de Unión a Albúmina (SEQ ID NO:34).
Un polinucleótido preferido que codifica la primera cadena polipeptídica de DART-2 c/ABD tiene la secuencia (SEQ ID NO:36):
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtga ccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattg ggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaa agggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccg ctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctct gtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctggga gggggtggatccggcggaggtggacaggtccagctggtccagagcggggccgaag tcaaaaaacccggagcaagcgtgaaggtctcctgcaaagcatcaggctatacatt tacaggcagctggatgaactgggtgaggcaggctccaggacagggactggagtgg atcgggcgcatctaccctggagacggcgaaactaactataatggaaagttcaaag accgagtgaccatcacagccgataagtctactagtaccgcctacatggagctgag ctccctgcggtctgaagataccgccgtctactattgcgctagaatttacggaaac aatgtctattttgacgtgtgggggcagggaacaactgtgactgtctcctccggag gatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaa ggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggcgggtct
ctggcccaggcaaaagaggcagccatccgcgaactggataaatatggcgtgagcg attattataagaacctgattgacaacgcaaaatccgcggaaggcgtgaaagcact gattgatgaaattctggccgccctgcct
La segunda cadena polipeptídica de DART-2 c/ABD es la misma que la segunda cadena polipeptídica de DART-2 mencionada anteriormente (SEQ ID NO:30).
B. Los diacuerpos biespecíficos gpA33 X CD3 que tienen un Dominio Fc de IgG ("DART-2 c/FC")
En una realización adicional, la divulgación proporciona diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3 que tienen un Dominio Fc de IgG. En consecuencia, se hace referencia en el presente a tales diacuerpos como "diacuerpos Fc biespecíficos gpA33 x CD3". El Dominio Fc de los diacuerpos Fc de la presente divulgación puede ser una región Fc completa (por ejemplo, una región Fc completa de IgG) o bien solo un fragmento de una región Fc completa. Aunque el Dominio Fc de los diacuerpos Fc biespecíficos de la presente divulgación puedan tener la capacidad para unirse a uno o más receptores Fc (por ejemplo, FcyR(s)), más preferentemente, tal Dominio Fc producirá una unión reducida a FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIHA (CD16a) o FcyRIIIB (CD16b) (en relación con la unión que exhibe una región Fc de tipo salvaje) o eliminará sustancialmente la capacidad de tal Dominio Fc para unirse a tal (es) receptor(es). El Dominio Fc de los diacuerpos Fc biespecíficos de la presente divulgación puede incluir parte o la totalidad del dominio CH2 y/o la parte o la totalidad del dominio CH3 de una región Fc completa, o puede comprender una secuencia de una variante de CH2 o de una variante de CH3 (lo que puede incluir, por ejemplo, una o más inserciones y/o una o más deleciones, con respecto a los dominios c H2 y CH3 de una región Fc completa). El Dominio Fc de los diacuerpos Fc biespecíficos de la presente divulgación puede comprender porciones Fc no polipeptídicas, o puede comprender porciones de regiones Fc no naturalmente completas, o puede comprender orientaciones de origen no natural de los dominios CH2 y CH3 (tal como, por ejemplo, dos dominios c H2 o dos dominios CH3 o, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal, un dominio CH3 vinculado a un dominio CH2, etc.).
En una primera realización, denominada "Versión 1", que se muestra en la Figura 2A, la primera cadena polipeptídica de un diacuerpo Fc biespecífico gpA33 x CD3 ejemplar comprenderá, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal, un extremo N-terminal, un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 o bien a CD3 (es decir, ya sea VLgpA33 0 VLcd3), un péptido espaciador interviniente (Ligador 1), un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (si la primera cadena polipeptídica contiene VLcd3) o CD3 (si la primera cadena polipeptídica contiene VLgpA33), un segundo péptido espaciador interviniente que contiene cisteína (Ligador 2), un Dominio promotor de heterodímeros, un péptido espaciador (Ligador 5), un péptido que contiene cisteína (Péptido 1), un Dominio Fc de IgG (de preferencia, parte o la totalidad de los dominios CH2 y CH3 de una región Fc de anticuerpo), y un extremo C-terminal.
En una segunda realización, denominada "Versión 2", que se muestra en la Figura 2B, la primera cadena polipeptídica de un diacuerpo Fc biespecífico gpA33 x CD3 ejemplar comprenderá, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal, un extremo N-terminal, un péptido que contiene cisteína (Péptido 1), un Dominio Fc de IgG (de preferencia, parte o la totalidad de los dominios CH2 y CH3 de una región Fc de anticuerpo), un péptido espaciador interviniente (Ligador 4), el Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 o bien a CD3 (es decir, ya sea VLgpA33 o VLcd3), un péptido espaciador interviniente (Ligador 1), un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (si la primera cadena polipeptídica contiene VLcd3) o CD3 (si la primera cadena polipeptídica contiene VLgpA33), un segundo péptido espaciador interviniente que contiene cisteína (Ligador 2), un Dominio promotor de heterodímeros, y un extremo C-terminal. De preferencia, en cualquiera de las realizaciones, el Dominio Fc de la primera cadena polipeptídica producirá una unión reducida a FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) o FcyRIHB (CD16b) (en relación con la unión que exhibe una región Fc de tipo salvaje) o eliminará sustancialmente la capacidad de tal Dominio Fc para unirse a tal(es) receptor(es). Formas variantes y mutantes de Fc capaces de mediar tales uniones modificadas son bien conocidas en la técnica e incluyen sustituciones de aminoácidos en las posiciones 234 y 235, una sustitución en la posición 265 o una sustitución en la posición 297 (véase, por ejemplo, la Patente US No. 5,624,821). En una realización preferente, el dominio CH2 y CH3 incluyen una sustitución en la posición 234 con alanina y 235 con alanina.
La segunda cadena polipeptídica de tales diacuerpos Fc biespecíficos gpA33 x CD3 (Versión 1 y Versión 2) ejemplares comprenderá, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal, un extremo N-terminal, un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 o bien a CD3 (es decir, ya sea VLgpA33 o VLcd3, dependiendo del Dominio VL seleccionado para la primera cadena polipeptídica del diacuerpo), un péptido ligador interviniente (Ligador 1), un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a CD3 (si la segunda cadena polipeptídica contiene VLgpA33) o gpA33 (si la segunda cadena polipeptídica contiene VLdc3), un péptido espaciador interviniente que contiene cisteína (Ligador 2), un Dominio promotor de heterodímeros (de preferencia un Dominio de espiral K) y un extremo C-terminal.
Los diacuerpos Fc monovalentes biespecífico gpA33 x CD3 (Versión 1 y Versión 2) ejemplares comprenderán además una tercera cadena polipeptídica que comprenderá, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal, un extremo N-terminal, un péptido que contiene cisteína (Péptido 1), un Dominio Fc de IgG (de preferencia, parte o la totalidad de los dominios CH2 y CH3 de una región Fc de anticuerpo) que tiene el mismo isotipo que el que tiene el Dominio Fc de la primera cadena polipeptídica, y un extremo C-terminal. De preferencia, el Dominio Fc de la tercera cadena polipeptídica producirá una unión reducida a FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) o FcYRillB (CD16b) (en relación con la unión que exhibe una región Fc de tipo salvaje) o eliminará sustancialmente la capacidad de tal Dominio Fc para unirse a tal(es) receptor(es), tal como se mencionó anteriormente, con respecto a la primera cadena polipeptídica de los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 ejemplares.
El péptido espaciador interviniente (Ligador 4), opcionalmente presente, comprenderá, de preferencia, la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:37): APSSS, y más preferentemente, tienen la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:38): APSSSPME.
El péptido que contiene cisteína (Péptido 1) de la primera y la tercera cadenas polipeptídicas puede estar compuesto de la misma secuencia de aminoácidos o de diferentes secuencias de aminoácidos, y contendrá 1, 2, 3 o más residuos de cisteína. Un Péptido 1 particularmente preferido tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:39): DKTHTCPPCP.
El péptido espaciador interviniente preferido (Ligador 1) tiene la secuencia SEQ ID NO:1, descrita anteriormente. El péptido espaciador interviniente que contiene cisteína preferido (Ligador 2) tiene, de preferencia, la secuencia SEQ ID NO:2, descrita anteriormente.
El dominio promotor de heterodímero de la primera y la segunda cadenas polipeptídicas de los diacuerpos Fc biespecíficos gpA33 x CD3 será, de preferencia, el Dominio de espiral E (SEQ ID NO:3) y el Dominio de espiral K (SEQ ID NO:4), descritos anteriormente, y se seleccionará de modo que una de dichas cadenas polipeptídicas posea un Dominio de espiral E, mientras el otro posea un Dominio de espiral K, como se mencionó anteriormente.
Un péptido espaciador preferido (Ligador 5) tiene la secuencia GGG.
Los dominios CH2 y/o CH3 del primer polipéptido y el tercer polipéptido no tienen que ser idénticos, y se modifican ventajosamente para fomentar la complejidad entre los dos polipéptidos. Por ejemplo, puede introducirse una sustitución de aminoácidos (de preferencia, una sustitución con un aminoácido que comprende un grupo lateral voluminoso que forma una 'protuberancia', por ejemplo, el triptófano) en el dominio CH2 o CH3, de tal manera que la interferencia esférica evitará la interacción con un dominio mutado en forma similar y obligará al dominio mutado a aparearse con un dominio en el que se ha diseñado una mutación complementaria o acomodaticia, es decir, 'la cavidad' (por ejemplo, una sustitución con glicina). Tales conjuntos de mutaciones pueden diseñarse en cualquier par de polipéptidos que comprendan la molécula del diacuerpo Fc biespecífico y, más aún, introducirse en cualquier parte de las cadenas polipeptídicas de dicho par. Los procedimientos de ingeniería de proteínas para favorecer la heterodimerización sobre la homodimerización son bien conocidos en la técnica, en particular con respecto a la ingeniería de moléculas similares a inmunoglobulina, y se abarcan en el presente (véase, por ejemplo, Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization (Diseño de 'protuberancias en agujeros' de dominios CH3 de anticuerpos para heterodimerización de cadenas pesadas)" Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library (Heterodímeros estables a partir de la remodelación de la interfaz de dominio de un homodímero usando una biblioteca de visualización de fagos)" J. Mol. Biol. 270:26-35, y Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis (Un nuevo formato de anticuerpo biespecífico: heterodimerización, expresión y lisis de células tumorales altamente eficientes)" J. Immunol. Methods 296:95-101). De preferencia, la 'protuberancia' se diseña en los dominios CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica y la 'cavidad' se diseña en los dominios CH2-CH3 de la tercera cadena polipeptídica. Por lo tanto, la 'protuberancia' ayudará a evitar que la primera cadena polipeptídica se homodimerice a través de sus dominios CH2 y/o CH3. Como la tercera cadena polipeptídica contiene, de preferencia, la sustitución 'protuberancia', se heterodimeriza con la primera cadena polipeptídica, así como se homodimeriza consigo misma. Se crea una protuberancia preferida, mediante la modificación de un Dominio Fc de una región Fc nativa de IgG para que contenga la modificación T366W. Se crea una cavidad preferida, mediante la modificación de un Dominio Fc de una región Fc nativa de IgG para que contenga las modificaciones T366S, L368A e Y407V. Para ayudar en la purificación de homodímero de la tercera cadena polipeptídica del diacuerpo Fc monovalente biespecífico final que comprende la primera, la segunda y la tercera cadenas polipeptídicas, el sitio de unión a la proteína A de los dominios CH2 y CH3 de la tercera cadena polipeptídica se muta, de preferencia, por un aminoácido de sustitución en la posición 435 (H435R). Para ayudar en la purificación de homodímero de la tercera cadena polipeptídica del diacuerpo Fc monovalente biespecífico final que comprende la primera, la segunda y la tercera cadenas polipeptídicas, el sitio de unión a la proteína A de los dominios CH2 y CH3 de la tercera cadena polipeptídica se muta, de preferencia, por un aminoácido de sustitución. Por lo tanto, el homodímero de la tercera cadena polipeptídica no se unirá a la proteína A, mientras que el diacuerpo Fc biespecífico retendrá su capacidad para unirse a la proteína A a través del sitio de unión a la proteína A de la primera cadena polipeptídica.
Una secuencia preferida para los dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de anticuerpo presente en la primera cadena polipeptídica es (SEQ ID NO:40):
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Una secuencia preferida para los dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de anticuerpo presente en la tercera cadena polipeptídica es (SEQ ID NO:41):
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
PVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK
1. DART-2 c/FC Versión 1
La primera, la segunda y la tercera cadenas polipeptídicas de un diacuerpo Fc monovalente biespecífico gpA33 x CD3 preferido, designado en lo sucesivo "DART-2 c/Fc Versión 1", comprende dominios polipeptídicos que tienen las siguientes secuencias:
La primera cadena polipeptídica de DART-2 c/Fc Versión 1 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:42):
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSARSSISFMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLAS
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKGGGS
GGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRI
RSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGN
SYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGG
GDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK
FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK
Como se apreciará, los residuos 1-106 de SEQ ID NO:42 son el Dominio VL de un anticuerpo que se une a gpA33 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26); los residuos 107-114 de SEQ ID NO:42 son el primer péptido espaciador interviniente (Ligador 1) (SEQ ID NO:1); los residuos 115-239 de SEQ ID NO:42 son el Dominio VH de un anticuerpo que se une a Cd3 (VHcd3) (SEQ ID NO:25), los residuos 240-245 de SEQ ID NO:42 son un péptido espaciador que contiene cisteína (Ligador 2) (SEQ iD NO:2); los residuos 246-273 de SEQ ID NO:42 son el Dominio de espiral E promotor de heterodímeros (SEQ ID NO:3); los residuos 274-276 son el péptido espaciador GGG (Ligador 5); los residuos 277-286 son el Péptido 1 (SEQ iD NO:39), los residuos 277-503 son la secuencia para los dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de anticuerpo (SEQ ID NO:40).
Un polinucleótido preferido que codifica la primera cadena polipeptídica de DART-2 c/Fc Versión 1 tiene la secuencia (SEQ ID NO:43):
gacattcagctgactcagtccccctcttttctgtccgcatccgtcggagatcgag tgactattacttgctctgctaggtcctcaatcagcttcatgtactggtatcagca gaagcccggcaaagcacctaagctgctgatctacgacacaagcaacctggcctcc ggggtgccatctcggttctctggcagtgggtcaggaactgagtttaccctgacaa ttagctccctggaggctgaagatgccgctacctactattgccagcagtggagcag ctatcctctgaccttcggacaggggactaaactggaaatcaagggtggaggatcc ggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctg gagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcacatacgc tatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatc aggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagat tcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcct gaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaat tcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtctt ccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgcttt ggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggc
ggggacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggac cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggac ccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaag ttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcggg aggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcacca ggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctccca gcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg tgtacaecetgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtg gtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaat gggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggct ccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaa cgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaag agcctctccctgtctccgggtaaa
La segunda cadena polipeptídica de DART-2 c/Fc Versión 1 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:44):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK
RAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG
GGGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEW
IGRIYPGDGETNYNGKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIYGN
NVYFDVWGQGTTVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
Como se apreciará, los residuos 1-110 de SEQ ID NO:44 son el Dominio VL de un anticuerpo que se une a CD3 (VLcd3) (s Eq ID NO:5); los residuos 111-118 de SEQ ID NO:44 son el primer péptido espaciador interviniente (Ligador 1) (SEQ ID nO:1); los residuos 119-237 de SEQ ID NO:44 son el Dominio VH de un anticuerpo que se une a gpA33 (VHgpA33) (s Eq ID NO:27), los residuos 238-243 de SEQ ID NO:44 son un péptido espaciador que contiene cisteína (Ligador 2) (SEQ ID NO:2) y los residuos 244-271 de SEQ ID NO:44 son el Dominio de espiral K promotor de heterodímeros (SEQ ID NO:4).
Un polinucleótido preferido que codifica la segunda cadena polipeptídica de DART-2 c/Fc Versión 1 tiene la secuencia (SEQ ID NO:45):
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtga ccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattg ggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaa agggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccg ctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctct gtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctggga gggggtggatccggcggaggtggacaggtccagctggtccagagcggggccgaag tcaaaaaacccggagcaagcgtgaaggtctcctgcaaagcatcaggctatacatt tacaggcagctggatgaactgggtgaggcaggctccaggacagggactggagtgg atcgggcgcatctaccctggagacggcgaaactaactataatggaaagttcaaag
accgagtgaccatcacagccgataagtctactagtaccgcctacatggagctgag ctccctgcggtctgaagataccgccgtctactattgcgctagaatttacggaaac aatgtctattttgacgtgtgggggcagggaacaactgtgactgtctcctccggag gatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaaga gaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag
La tercera cadena polipeptídica de DART-2 c/Fc Versión 1 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:46):
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKS
LSLSPGK
Como se apreciará, los residuos 1-10 de SEQ ID NO:46 son el Péptido 1 (SEQ ID NO:39) y los residuos 11-227 son los dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de anticuerpo (SEQ ID NO:41).
Un polinucleótido preferido que codifica la tercera cadena polipeptídica de DART-2 c/Fc Versión 1 tiene la secuencia (SEQ ID NO:47):
gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgt cagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccc tgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggagg agcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccagga ctggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgt acaecetgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgagttg cgcagtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggg cagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcct tcttcctcgtcagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgt cttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccgctacacgcagaagagc ctctccctgtctccgggtaaa
2. DART-2 c/Fc Versión 2
La primera, la segunda y la tercera cadenas polipeptídicas de un segundo diacuerpo Fc monovalente biespecífico gpA33 x CD3 preferido, designado en lo sucesivo "DART-2 c/Fc Versión 2", comprende dominios polipeptídicos que tienen las siguientes secuencias. Entre otras diferencias, DART-2 c/Fc Versión 1 difiere de DART-2 c/Fc Versión 2 en el posicionamiento de las secuencias de CH2 y CH3 de la primera cadena polipeptídica; estas secuencias se posicionan en la dirección de C-terminal de las secuencias de VL y VH de DART-2 c/Fc Versión 1, mientras que se posicionan en la dirección de N-terminal de las secuencias de VL y VH de DART-2 c/Fc Versión 2.
La primera cadena polipeptídica de DART-2 c/Fc Versión 2 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:48):
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGKAPSSSPMEDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSARSSISFMYWYQQKPG
KAPKLLIYDTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPL
TFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNW
VRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTE
DTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEK
VAALKEKVAALKE
Como se apreciará, los residuos 1-10 de SEQ ID NO:48 son el Péptido 1 (SEQ ID NO:39); los residuos 11-227 de SEQ ID NO:48 son la secuencia para los dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de anticuerpo (SEQ ID NO:40); los residuos 228-235 de SEQ ID NO:48 son el péptido espaciador interviniente (Ligador 4) (SEQ ID NO:38); los residuos 236-341 de SEQ ID NO:48 son el Dominio Vl de un anticuerpo que se une a gpA33 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26); los residuos 342-349 de SEQ ID NO:48 son el primer péptido espaciador interviniente (Ligador 1) (SEQ ID NO:1); los residuos 350-474 de SEQ ID NO:48 son el Dominio VH de un anticuerpo que se une a CD3 (VHcd3) (SEQ ID NO:25); los residuos 475-480 de SEQ ID NO:48 son el péptido espaciador (Ligador 2) (SEQ iD NO:2); los residuos 481-508 de SEQ ID NO:48 son el Dominio de espiral K promotor de heterodímeros (SeQ ID NO:4).
La segunda cadena polipeptídica de DART-2 c/Fc Versión 2 tiene la secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de DART-2 (es decir, SEQ ID NO:28), descrita anteriormente.
La tercera cadena polipeptídica de DART-2 c/Fc Versión 2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, descrita anteriormente.
Composiciones farmacéuticas
Las composiciones de la presente divulgación incluyen composiciones de fármacos a granel útiles en la fabricación de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones impuras o no estériles) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que son adecuadas para la administración a un sujeto o paciente), que pueden usarse en la preparación de formas farmacéuticas unitarias. Tales composiciones comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de los diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3 o diacuerpos Fc biespecíficos gpA33 x CD3 descritos en el presente, un agente terapéutico adicional y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De preferencia, las composiciones de la presente divulgación comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una o más moléculas de la presente divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La divulgación también abarca composiciones farmacéuticas que comprenden tales diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3 o diacuerpos Fc biespecíficos gpA33 x CD3 y un segundo anticuerpo terapéutico (por ejemplo, anticuerpo monoclonal específico para un antígeno tumoral) que es específico para un antígeno en particular asociado con un cáncer, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una realización específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por un ente regulador del gobierno nacional o estatal/provincial o listado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freund (completo e incompleto), excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de petróleo, animales, vegetales o sintéticos, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es el vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también pueden emplearse como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes amortiguadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación prolongada y similares.
Por lo general, los ingredientes de las composiciones de la presente divulgación se suministran por separado o mezclados juntos en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado, tal como una ampolla o bolsa, en la que se indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se ha de administrar por infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contiene agua estéril de calidad farmacéutica o solución salina. Cuando la composición se administra por inyección, se puede suministrar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina, para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
Las composiciones de la presente divulgación se pueden formular como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otras, las formadas con aniones, tales como los derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con cationes tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos de hierro, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaina, etc.
La divulgación también abarca un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más envases llenos de tales diacuerpos biespecíficos gpA33 x Cd3 o diacuerpos Fc biespecíficos gpA33 x CD3 descritos (solos o con agente (s) terapéutico(s) adicional (es)) y tal vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, también se pueden incluir en el paquete o kit farmacéutico uno o más agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de una enfermedad. La divulgación también abarca un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más envases llenos de uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación Opcionalmente asociada a dicho(s) envase(s) puede haber una notificación en la forma prescrita por la agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación emitida por la agencia en relación con la fabricación, el uso o la venta para la administración a humanos.
La presente divulgación proporciona kits que pueden usarse en los procedimientos anteriores. Un kit puede comprender una o más moléculas de la divulgación. Un kit puede comprender además uno o más agentes terapéuticos útiles para el tratamiento de un cáncer, en uno o más envases. Un kit puede comprender además uno o más anticuerpos que se unen a uno o más antígenos asociados a un cáncer. Se describe que el otro agente profiláctico o terapéutico es un agente quimioterapéutico. También se describe que el agente profiláctico o terapéutico es un agente terapéutico biológico u hormonal.
Usos de las composiciones de la divulgación
Los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 o diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 descritos en la presente memoria tienen la capacidad para tratar cualquier enfermedad o afección asociada con gpA33 o caracterizada por la expresión de gpA33. Por lo tanto, composiciones farmacéuticas que comprenden tales moléculas pueden emplearse sin limitación en el diagnóstico o tratamiento de cánceres de colon, colorrectales y pancreáticos.
Procedimientos de administración
Las composiciones descritas en la presente memoria se pueden proporcionar para el tratamiento, la profilaxis y la mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de la divulgación. Se describe que dichas composiciones están sustancialmente purificadas (es decir, sustancialmente libres de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados). También se describe que el sujeto es un animal, de preferencia un mamífero no primate (por ejemplo, bovino, equino, felino, canino, roedor, etc.) o primate (por ejemplo, mono tal como mono cynomolgus, humano, etc.). También se describe que el sujeto es un ser humano.
Se conocen varios sistemas de administración que pueden usarse para administrar las composiciones descritas en la presente memoria, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar la proteína del anticuerpo o de fusión, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System (Transformación genética in vitro mediada por receptores mediante un sistema portador de ADN soluble)" J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un retroviral u otro vector, etc.
Los procedimientos de administración de los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 o diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 descritos en la presente memoria incluyen, entre otros, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intravenosa y subcutánea), epidural y mucosa (por ejemplo, por vía intranasal u oral). En una realización específica, las moléculas descritas en la presente memoria se administran por vía intramuscular, intravenosa o subcutánea. Las composiciones pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, también puede emplearse la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente aerosolizador. Véase, por ejemplo, las Patentes U.S. No.
6,019,968; 5,985, 320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; y 4,880,078; y las Publicaciones PCT No. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903.
La divulgación también prevé que los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 o los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 de la presente divulgación se envasen en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o bolsa, en las que se indique la cantidad de tales moléculas. En una realización, los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 o los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 de la presente divulgación se suministran como polvo liofilizado esterilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado y pueden ser reconstituidos, por ejemplo, con agua o solución salina a la concentración adecuada para administración a un sujeto. De preferencia, los diacuerpos gpA33 x CD3 o los diacuerpos Fc gpA33 x CD3 de la presente divulgación se suministran como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente herméticamente cerrado a una dosis unitaria de al menos 5 |jg, más preferentemente, al menos 10 jg, al menos 15 jg, al menos 25 jg, al menos 50 jg, al menos 100 jg o al menos 200 jg.
Los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 o los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 liofilizados de la presente divulgación deben almacenarse a entre 2 y 8 °C en su recipiente original y las moléculas deben administrarse dentro de un plazo de 12 horas, de preferencia dentro de un plazo de 6 horas, dentro de un plazo de 5 horas, dentro de un plazo de 3 horas o dentro de un plazo de 1 hora, después de su reconstitución. También se describe que los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 o los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos gpA33 x c D3 de la presente divulgación se suministran en forma líquida en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o bolsa, en las que se indican la cantidad y concentración de la molécula, proteína de fusión o molécula conjugada. De preferencia, la forma líquida de tales diacuerpos monovalentes biespecíficos o diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos se suministra en un recipiente herméticamente sellado en el cual las moléculas se presentan a una concentración de al menos 1 jg/ml, más preferentemente, al menos 2,5 jg/ml, al menos 5 jg/ml, al menos 10 jg/ml, al menos 50 jg/ml o al menos 100 jg/ml.
Se puede determinar la cantidad de diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 o de diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 de la presente divulgación que será eficaz en el tratamiento, la prevención o mejora de uno o más síntomas asociados con un trastorno, a través de técnicas clínicas normales. La dosis exacta a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la afección, y debe ser determinada de acuerdo con la opinión del médico a cargo y de las circunstancias de cada paciente. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de las curvas de respuesta a dosis derivadas de los sistemas de ensayo de modelos in vitro o animales.
Para los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 o los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 descritos en la presente memoria, la dosificación administrada a un paciente es, típicamente, de al menos aproximadamente 0,01 jg/kg, al menos aproximadamente 0,05 jg/kg, al menos aproximadamente 0,1 jg/kg, al menos aproximadamente 0,2 pg/kg, al menos aproximadamente 0,5 jg/kg, al menos aproximadamente 1 jg/kg, al menos aproximadamente 2 pg/kg, al menos aproximadamente 3 pg/kg, al menos aproximadamente 5 jg/kg, al menos aproximadamente 10 jg/kg, al menos aproximadamente 20 jg/kg, al menos aproximadamente 30 jg/kg, al menos aproximadamente 50 jg/kg, al menos aproximadamente 0,1 mg/kg, al menos aproximadamente 0,15 mg/kg o más del peso corporal del sujeto.
La dosificación y la frecuencia de la administración de los diacuerpos monovalentes biespecíficos o los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos descritos en la presente memoria pueden reducirse o modificarse por medio de la mejora del consumo y la penetración en los tejidos de los diacuerpos Fc monovalentes diespecíficos como consecuencia de modificaciones tales como, por ejemplo, de lipidación.
Se describe que la dosificación de diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 o los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 descritos en la presente memoria administrados a un paciente se puede calcular para uso como único agente terapéutico. También se describe que los diacuerpos monovalentes biespecíficos o los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos descritos en la presente memoria se usan en combinación con otras composiciones terapéuticas y la dosificación administrada a un paciente es más baja que cuando dichos diacuerpos monovalentes biespecíficos o los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos se usan como único agente terapéutico.
Se describe que puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la divulgación localmente en el área que necesita tratamiento; esto puede lograrse, por ejemplo, entre otros medios, por infusión local, por inyección o por medio de un implante; implante éste que puede ser de material poroso, no poroso o gelatinoso, tal como membranas sialásticas o fibras. De preferencia, al administrar una molécula de la divulgación, se debe tener cuidado de usar materiales que no absorben la molécula.
También se describe que las composiciones pueden administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (Véase Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery (Nuevos métodos de administración de medicamentos)" Science 249:1527-1533); Treat et al., "Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer (Liposomas en la terapia de enfermedades infecciosas y cáncer)", Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, Nueva York, pp.
353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; véase generalmente ibid.).
También se describe que las composiciones pueden administrarse en un sistema de liberación controlada o prolongada. Se puede usar cualquier técnica conocida como de buena práctica para producir la liberación prolongada de formulaciones que comprenden una o más moléculas de la divulgación. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. No. 4,526,938; la Publicación PCT WO 91/05548; la Publicación PCT WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft ilsing A Sustained-Release Gel (Radioinmunoterapia intratumoral de un xenoinjerto de cáncer de colon humano utilizando un gel de liberación sostenida)" Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions (Direccionamiento pulmonar mediado por anticuerpos de emulsiones de circulación larga)" PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application (Portadores poliméricos biodegradables para un anticuerpo bFGF para aplicación cardiovascular)" Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery (Microencapsulación de anticuerpo monoclonal humanizado recombinante para administración local)" Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760. También se describe que se puede usar una bomba en un sistema de liberación controlada (Véase Langer, supra; Sefton, (1987) "Implantable Pumps (Bombas implantables)" CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis (Administración de heparina intravenosa continua a largo plazo mediante una bomba de infusión implantable en pacientes ambulatorios con trombosis venosa recurrente)" Surgery 88:507-516; y Saudek et al. (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery (Un ensayo preliminar del sistema de medicación implantable programable para la administración de insulina)" N. Engl. J. Med. 321:574-579). También se describe que se pueden usar materiales poliméricos para lograr la liberación controlada de anticuerpos (véase, por ejemplo, MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE (APLICACIONES MÉDICAS DE LIBERACIÓN CONTROLADA), Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE (BIODISPONIBILIDAD CONTROLADA DE MEDICAMENTOS, DISEÑO Y RENDIMIENTO DE MEDICAMENTOS), Smolen and Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate (Inhibición de la calcificación de las válvulas cardíacas bioprotésicas por difosfonato local de liberación controlada)" Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization (Liberación controlada de dopamina de un implante cerebral polimérico: caracterización in vivo)" Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) "Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits (Administración intracerebral de medicamentos en ratas con déficit de memoria inducidos por lesiones)" J. Neurosurg. 7(1):105-112); Patente U.S. No. 5, 679,377; Patente U.S. No. 5,916,597; Patente U.S. No.
5,912,015; Patente U.S. No. 5,989,463; Patente U.S. No. 5,128,326; la Publicación PCT No. WO 99/15154; y la Publicación PCT No. WO 99/20253). Ejemplos de polímeros usados en formulaciones de liberación prolongada incluyen, entre otros, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(acetato de etileno-co-vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicólidos) (PLGA) y poliortoésteres. En otra realización adicional, se puede colocar un sistema de liberación controlada cerca de un objetivo terapéutico (por ejemplo, los pulmones), de modo de requerir solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE (APLICACIONES MÉDICAS DE LIBERACIÓN CONTROLADA), supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). También se describe que composiciones poliméricas útiles como implantes de liberación controlada se usan de acuerdo con Dunn et al. (Véase la Patente U.S. 5,945,155). Este procedimiento en particular se basa en el efecto terapéutico de la liberación controlada in situ del material bioactivo del sistema polimérico. El implante puede hacerse, por lo general, en cualquier lugar del cuerpo del paciente, que necesite tratamiento terapéutico. También se describe que se usa un sistema de administración sostenida no polimérico, en el que se usa un implante no polimérico en el cuerpo del sujeto, a modo de sistema de aplicación del medicamento. Luego del implante en el cuerpo, el solvente orgánico del implante se disipa, dispersa o lixivia de la composición en el fluido de los tejidos circundantes, y el material no polimérico se coagula o precipita para formar una matriz sólida microporosa (véase la Patente U.S. 5,888,533).
Los sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión de Langer (1990, "New Methods Of Drug Delivery (Nuevos métodos de administración de medicamentos)" Science 249:1527-1533). Se puede usar cualquier técnica conocida como de buena práctica para producir la liberación prolongada de formulaciones que comprenden una o más agentes terapéuticos de la divulgación. Véase, por ejemplo, Patente U.S. No. 4,526,938; las Publicaciones Internacionales WO 91/05548 y WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel (Radioinmunoterapia intratumoral de un xenoinjerto de cáncer de colon humano utilizando un gel de liberación sostenida)" Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions (Direccionamiento pulmonar mediado por anticuerpos de emulsiones de circulación larga)" PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application (Portadores poliméricos biodegradables para un anticuerpo bFGF para aplicación cardiovascular)" Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery (Microencapsulación de anticuerpo monoclonal humanizado recombinante para administración local)" Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.
La composición de la divulgación puede ser un ácido nucleico que codifica un diacuerpo monovalente biespecífico o diacuerpo Fc monovalente biespecífico descrito en la presente memoria, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión del diacuerpo monovalente biespecífico o diacuerpo Fc monovalente biespecífico que codifica, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de modo que se torne intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (véase Patente U.S. No. 4,980,286), o mediante inyección directa o el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, un cañón de genes; Biolistic, Dupont), o recubrimiento con lipidos o receptores de superficie celular o agentes de transíección, o administrándolo ligado a un péptido tipo secuencia homeótica que se conoce que entra en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al. (1991) "Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis (El péptido Homeobox de Antennapedia regula la morfogénesis neuronal)" Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.) 88:1864-1868), etc. Alternativamente, un ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse a una célula de ADN del hospedador, para su expresión por recombinación homóloga.
El tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 o diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 descritos en la presente memoria puede incluir un único tratamiento o una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, un sujeto es tratado con moléculas de la divulgación una vez a la semana durante entre aproximadamente 1 a 10 semanas, de preferencia de 2 a 8 semanas, más preferentemente unas 3 a 7 semanas, y más preferentemente aún durante 4, 5 o 6 semanas. También se describe que las composiciones farmacéuticas de la divulgación se pueden administrar una vez al día, dos veces al día o tres veces al día. También se describe que las composiciones farmacéuticas se pueden administrar una vez a la semana, dos veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada seis semanas, una vez cada dos meses, dos veces al año o una vez al año. También se apreciará que la dosificación eficaz de las moléculas usadas para tratamiento puede aumentar o disminuir a lo largo del curso de un tratamiento en particular.
Habiendo descrito de manera general la invención, ahora esta podrá ser comprendida de mejor manera a través de los siguientes ejemplos, que se presentan a modo de ilustración y tienen la intención de ser limitantes de la presente divulgación, a menos que sea especado.
Ejemplo 1
Características de un anticuerpo monoclonal anti-gpA33 humana
Se quimerizó y humanizó un anticuerpo monoclonal murino específico con capacidad de unión a gpA33 humana. Las cadenas VL y VH del anticuerpo murino original tienen las secuencias SEQ ID NOs:13 y 17, respectivamente. Las cadenas VL y VH del anticuerpo humanizado tienen las secuencias SEQ ID NOs:26 y 27, respectivamente.
El Dominio de Unión a Antígeno de VLgpA33 comprende CDR1 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:14): SARSSISFMY; CDR2 que tiene la secuencia (SEQ iD NO:15): DTSNLAS; y CDR3 que tiene la secuencia (SeQ ID NO:16): QQWSSYPLT.
El Dominio de Unión a Antígeno de VHgpA33 comprende CDR1 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:18): GSWMN; CDR2 que tiene la secuencia (SEQ ID No :19): RIYPGDGETnYnGKFKD; y CDR3 que tiene la secuencia (SEQ ID NO:20): IYGNNVYFDV.
La Tabla 1 muestra el efecto de tales alteraciones en la cinética de unión.
Figure imgf000029_0002
Los datos indican que las modificaciones que dieron lugar a la humanización de los dominios VL y VH del anticuerpo no afectaron sustancialmente la cinética de unión a gpA33.
Ejemplo 2
Construcción de diacuerpos monovalentes biespecíficos y diacuerpos Fc gpA33 x CD3 y diacuerpos de control
La Tabla 2 contiene una lista de las secuencias de las cadenas polipeptídicas de los diacuerpos gpA33 x CD3 y diacuerpos Fc gpA33 x CD3 preferidos, que fueron expresadas y purificadas. Se encontró que los diacuerpos son capaces de unirse simultáneamente a gpA33 y CD3, como se juzgó por la detección de tal unión simultánea de los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3, dArT-1 y DART-2 ejemplares, y mediante los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 (DART-2 c/Fc) ejemplares. Además, se produjo un diacuerpo monovalente biespecífico de control ("DART de Control"), que fue monovalente biespecífico para CD3 y FITC, y se encontró que era capaz de unirse simultáneamente a CD3 y FITC.
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Los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 son heterodímeros compuestos por dos cadenas polipeptídicas (una cadena de cada secuencia indicada) y los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 son heterotrímeros compuestos por tres cadenas polipeptídicas (una cadena de cada secuencia de aminoácido indicada). Los procedimientos de formación de diacuerpos monovalentes biespecíficos se encuentran en las publicaciones WO 2006/113665, WO 2008/157379, WO 2010/080538, WO 2012/018687, WO 2012/162068 y WO 2012/162067.
Se halló que el diacuerpo monovalente biespecífico CD3 x FITC de control es capaz de unirse simultáneamente a CD3 y FITC. Se halló que los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 y los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos gpA3 x CD3 descritos anteriormente son capaces de unirse simultáneamente a gpA33 y CD3. Con el fin de demostrar dicha unión simultánea, se incubó el diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 DART-1 en presencia de un fragmento soluble de CD3 que se había inmovilizado en un soporte sólido. La detección de la unión se evaluó por la capacidad de los anticuerpos inmovilizados para unirse además a gpA33. Los resultados confirman la capacidad de los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 y los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos gpA3 x CD3 descritos anteriormente para unirse simultáneamente a gpA33 y (Figura 3).
Ejemplo 3
Los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 son citotóxicos para las células cancerosas La capacidad de los diacuerpos biespecíficos gpA33 x CD3 de la presente divulgación para tratar cáncer se ilustró a través de la incubación de células de cáncer colorrectal o cáncer pancreático en presencia del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 (DART-1) y PBMC humanas (E:T = 25:1) o bien células T humanas activadas (E:T = 10:1) El diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 DART-1 mostró una potente capacidad de lisis redirigida, a concentraciones necesarias para alcanzar el 50% de actividad máxima (EC50) en el rango de sub ng/ml a alrededor de 1 ng/ml. Por lo contrario, no se observó citotoxicidad al emplearse líneas celulares de cáncer negativas para gpA33 (por ejemplo, HCT116). Los resultados de la investigación se muestran en la Figura 4A (células tipo troncales de cáncer colorrectal (células CSCL de colon), la Figura 4B (células colorrectales Colo205) y la Figura 4C (células de cáncer pancreático ASPC-1). Los resultados se resumen en la Tabla 3.
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Ejemplo 4
Activación de células T en presencia de diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3
Con el fin de demostrar también la capacidad de los diacuerpos de la presente divulgación para tratar cáncer, se incubaron células T humanas en reposo con DART-1 monovalente biespecífico gpA33 x CD3 en presencia o ausencia de células cancerosas (colo205 o ASPC-1). Para caracterizar la activación de las células T durante el proceso de lisis redirigida mediado por el gpA33 x CD3 diacuerpo monovalente biespecífico (DART-1), las células T de los ensayos de lisis redirigida se tiñeron para el marcador CD25 de activación de células T y se analizaron mediante FACS. CD25 aumentó en las células T CD8 (Figuras 5A-5B) y CD4 (Figuras 5D-5E) de en forma dependiente de la dosis, lo que indica que los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 indujeron la activación de las células T en el proceso de lisis redirigida. Por el contrario, en ausencia de células blanco no activación de células T CD8 (Figura 5C) o CD4 (Figura 5F), lo que indica que los diacuerpos gpA33 x CD3 no activaron las células T en ausencia de células blanco. Asimismo, las células T CD8 o CD4 no se activaron cuando se incubaron con células blanco y un diacuerpo monovalente biespecífico de control (DART de Control) (Figuras 5A-5B, y Figuras 5D-5F, respectivamente), lo que indica el requisito de la unión cruzada de la célula T y la célula diana con diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3.
Ejemplo 5
Equivalencia del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 (DART-1) que tiene secuencias de dominios variables anti-gpA33 humana murinos y el diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 (DART-2) que tiene secuencias de dominios variables anti-gpA33 humana humanizados
Como se mencionó anteriormente, el diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 DART-1 contiene dominios VLgpA33 y VHgpA33 de un anticuerpo monoclonal murino, mientras el diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 DART-2 contiene dominios VLgpA33 y VHgpA33 humanizados del mismo anticuerpo murino. A fin de demostrar la capacidad de los dominios VLgpA33 y VHgpA33 humanizados para promover que las células T tuvieran como blanco las células cancerosas que expresan la gpA33, se incubaron células cancerosas que expresan la gpA33 en presencia de células T en reposo (Ensayo de LDH; E:T = 10:1) in presencia de DART-1, DART-1 o un diacuerpo monovalente biespecífico de control (DART de Control). Los resultados de este análisis (mostrados en las Figuras 6A-6D) demuestran que DART-1 y DART-2 mediaron la citotoxicidad equivalente para células de adenocarcinoma colorrectal SW948 (Figura 6A) y células colo205 (Figura 6B). Tanto DART-1 como DART-2 mediaron la citotoxicidad de una luciferasa que expresa una línea celular de Colo205 que fue trasnfectada establemente con un gen de luciferasa de luciérnaga (luc2) (Colo205-Luc), como se midió por luminiscencia disminuida (Figura 6C). Ni DART-1 ni DART-2 mediaron la citotoxicidad de la línea celular cancerosa negativa para gpA33, HCT116 (Figura 6D). Como se muestra en la Tabla 4, DART-1 y DART-2 exhibieron bioactividad equivalente similar contra múltiples líneas celulares tumorales.
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Ejemplo 6
Reactividad cruzada de los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3, diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 que tienen un Dominio de Unión a Albúmina y diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 que tienen un DOMINIO Fc de IgG con PBMc de mono cynomolgus
Como se mostró anteriormente, los dominios VLgpA33 y VHgpA33 humanizados del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 DART-2 median la citotoxicidad de células cancerosas que expresan gpA33 en presencia de células T humanas. Sorpresivamente, se encontró que los dominios VLcd3 y VHcd3 de los diacuerpos monovalentes biespecíficos gpA33 x CD3 de la presente divulgación también son capaces de unirse al CD3 de células T de mono cynomolgus y redirigirlas para destruir células que expresan gpA33.
Como se muestra en las Figuras 7A-7D, se encontró que el diacuerpo DART-2 monovalente biespecífico gpA33 x CD3, el diacuerpo DART-2 monovalente biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un Dominio de Unión a Albúmina (DART-2 c/ABD) y el diacuerpo DART-2 monovalente biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un Dominio Fc de IgG (DART-2 c/Fc) son todos capaces de promover la citotoxicidad de las células cancerosas en presencia de PBMC humanas o de mono cynomolgus. Las Figuras 7A-7B muestran la capacidad de los tres diacuerpos para mediar la citotoxicidad de las células Colo205-Luc que se incubaron con PBMC humano, medido por ensayo de LDH (Figura 7A) o luciferasa (Figura 7B). Las Figuras 7C-7D muestran la capacidad correspondiente de los tres diacuerpos para mediar la citotoxicidad de las células Colo205-Luc que se incubaron con PBMC de mono cynomolgus, medido por ensayo de LDH (Figura 7A) o luciferasa (Figura 7B).
Como se muestra en la Tabla 5, el diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 DART-2 y el diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un Dominio de Unión a Albúmina (DART-2 c/a Bd ) mostraron una actividad CLT comparable. Los diacuerpos monovalentes biespecíficos exhibieron actividad consistente con células efectoras PBMC tanto humanas como de mono cynomolgus (cyno).
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Ejemplo 7
Reactividad in vivo de diacuerpo gpA33 x CD3 en modelo de tumor de colon murino
Con el fin de demostrar la capacidad in vivo de los diacuerpos gpA33 x CD3 de la presente divulgación para proporcionar un tratamiento para el cáncer, se coimplantaron células Colo205 con células T activadas en ratones NSG (NOD scid gamma) inmunodeficientes (Agliano, A. et al. (2008) "Human Acute Leukemia Cells Injected In NOD/Ltsz-Scid/IL-2Rgamma Null Mice Generate A Faster And More Efficient Disease Compared To Other NOD/Scid-Related Strains (Las células de leucemia aguda humana inyectadas en ratones nulos NOD/Ltsz-Scid/IL-2Rgamma generan una enfermedad más rápida y eficaz en comparación con otras cepas relacionadas con NOD/Scid)" Int. J. Cáncer 123(9):2222-2227; Sánchez, P.V. et al. (2009) "A Robust Xenotransplantation Model For Acute Myeloid Leukemia (Un modelo robusto de xenotrasplante para la leucemia mieloide aguda)" Leukemia 23(11):2109-2117; Racki, W.J. et al. (2010) "NOD- Scid IL2rgamma (Null) Mouse Model Of Human Skin Transplantation And Allograft Rejection (Modelo de ratón NOD-Scid IL2rgamma (nulo) de trasplante de piel humana y rechazo de aloinjerto)" Transplantation 89(5):527-536; Choi, B. et al. (2011) "Human B Cell Development And Antibody Production In Humanized nOd/SCID/IL- 2Ry(Null) (NSG) Mice Conditioned By Busulfan (Desarrollo de células B humanas y producción de anticuerpos en ratones NOD/SCID/IL-2RY(nulos) humanizados (NSG) condicionados por busulfano)" J. Clin. Immunol. 31(2):253-264; Sartelet, H. et al. (2012) "Description Of A New Xenograft Model Of Metastatic Neuroblastoma Using NOD/SCID/I12rg Null (NSG) Mice (Descripción de un nuevo modelo de xenoinjerto de neuroblastoma metastásico con ratones NOD/SCID/I12rg nulos (NSG))" In Vivo 26(1):19-29; Spranger, S. et al. (2012) "NOD/scid IL- 2Rg(null) Mice: A Preclinical Model System To Evaluate Human Dendritic Cell-Based Vaccine Strategies in vivo (Ratones NOD/scid IL-2Rg(nulos): un sistema de modelo preclínico para evaluar estrategias de vacunas basadas en células dendríticas humanas in vivo)" J. Transí. Med. 10:30; von Bonin, M. et al. (2013) "In vivo Expansion Of Co-Transplanted T Cells Impacts On Tumor Re-Initiating Activity Of Human Acute Myeloid Leukemia In NSG Mice (La expansión in vivo de células T cotransplantadas repercute en la actividad de reinicio del tumor de leucemia mieloide aguda humana en ratones NSG)" PLoS One. 8(4):e60680).
El diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 DART-1 se administró a los ratones por vía IV una vez al día durante 4 días (QDx4) a partir del implante. Se encontró que el volumen del tumor Colo205 aumentó en los ratones que recibieron el vehículo de control (Figura 8). Sin embargo, en los animales que recibieron DART-1 se encontró que el volumen del tumor Colo205 habla disminuido o desaparecido (Figura 8).
Imágenes de ratones NSG implantados con células Colo205 mostraron que al segundo día de tratamiento, los ratones que recibieron el vehículo (Figura 9A) o el diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 DART-1 (Figura 9B) tenían tumores significativos. Sin embargo, el día 12 de tratamiento, en los ratones que recibieron el diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 DART-1 el volumen de los tumores habla disminuido drásticamente (Figura 9D). El día 12 de tratamiento, los ratones que recibieron el vehículo mostraron un aumento en el volumen de los tumores (Figura 9C).
Como mayor evidencia de la capacidad in vivo de los diacuerpos gpA33 x CD3 de la presente divulgación para proporcionar un tratamiento para el cáncer, el modelo tumoral descrito anteriormente se llevó a cabo usando a células tumorales pancreáticas ASPC-1 y células T activadas (E:T = 1:1). El diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 DART-1, un diacuerpo monovalente biespecífico de control (DART de Control), o un vehículo se administraron por vía IV una vez al día durante 9 días (QDx9) a partir del implante. Se encontró que el volumen del tumor ASPC-1 aumentó en los ratones que recibieron el vehículo de control (Figura 10). Sin embargo, en los animales que recibieron DART-1 se encontró que una reducción, dependiente de la dosis, del volumen del tumor (Figura 10).
Ejemplo 8
Determinación de la eficacia del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un Dominio Fc de IgG versión 1 (DART-2 c/Fc Versión 1)
Con el fin de determinar la eficacia del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un Dominio Fc de IgG Versión 1 (DART-2 c/Fc Versión 1), durante 7 días, los ratones recibieron la infusión (con bombas osmóticas) del DART-2 c/Fc Versión 1 descrito anteriormente, a diferentes niveles de dosificación. 48 horas después del implante de la bomba (es decir, en presencia de un nivel de circulación estable de DART-2 c/Fc Versión 1), se implantó una mezcla de células tumorales Colo205 y células T por vía subcutánea en los ratones, y se monitoreó la extensión del crecimiento del tumor. En la Tabla 6 se resume el diseño del estudio; cada grupo contenía 8 ratones hembra.
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 11, e indican que la administración del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un Dominio Fc de inmunoglobulina IgG (DART-2 c/Fc Versión 1) descrito anteriormente medió una drástica reducción en el volumen del tumor a todas las dosificaciones ensayadas.
A la luz de la dramática reducción en el volumen del tumor que se obtuvo en el estudio anterior, se llevó a cabo un estudio adicional, para evaluar la eficacia a dosis mucho más bajas. En la Tabla 7 se resume el diseño de este estudio posterior; cada grupo contenía 8 ratones hembra.
Figure imgf000033_0002
Los resultados de este estudio posterior se muestran en la Figura 12. En la Figura 12, cada símbolo representa un animal que recibió la dosis que se indica del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un Dominio Fc de IgG Versión 2 (DART-2 c/Fc Versión 1) descrito anteriormente o vehículo. Los datos muestran la eficacia a todas las dosis ensayadas.
Ejemplo 9
Perfil farmacocinético del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 (DART-2) y del diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un Dominio Fc de IgG (DART-2 c/Fc) en monos cynomolgus
La capacidad de los dominios VLcd3 y VHcd3 de los diacuerpos de la presente divulgación para unirse al CD3 de mono cynomolgus permite el uso de tales animales para medir la farmacocinética in vivo de los diacuerpos de la presente divulgación.
Para medir tal farmacocinética, se inyectó el diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 (DART-2) o el diacuerpo monovalente biespecífico gpA33 x CD3 que tiene un Dominio Fc de IgG (DART-2 c/Fc Versión 1), descritos anteriormente, en monos cynomolgus (10 pg/kg/día) y se monitoreó la concentración de tales moléculas remanecientes en la circulación. La Figura 13 muestra el resultado de este estudio, e indica que DART DART-2 y DART-2 c/Fc Versión 1 mostraron una cinética de eliminación de primer orden.
Ejemplo 10
Análisis SPR de la unión del diacuerpo Fc monovalente biespecífico gpA33 x CD3 (DART-1 c/Fc Versión 1) a CD3 y gpA33 humanas y de mono cynomolgus
Se analizó la unión del diacuerpo Fc monovalente biespecífico gpA33 x CD3 (DART-1 c/Fc Versión 1) a versiones solubles del receptor humano y de mono cynomolgus, por SPR y en un biosensor BIAcore 3000 (GE, Healthcare). Se inmovilizaron los receptores en el chip del sensor CM5, de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante. Se activaron brevemente los grupos carboxilo en la superficie del chip del sensor con la inyección de una solución que contenía 0,2 M de N-etil-N-(3dietilamino-propil) carbodiimida y 0,05 M de N hidroxi-succinimida. A continuación, se inyectó el receptor CD3 soluble (1 |jg/ml) sobre la superficie activada de CM5 en 10 mM de acetato de sodio, pH 5,0, a una velocidad de flujo de 5 jl/min, seguido de 1 M de etanolamina para su desactivación.
Las versiones solubles de CD3 humano y de cynomolgus empleadas en ese análisis se expresaron en células de mamíferos como un heterodímero CD3e/CD3S, estabilizado por secuencias enrolladas E y K promotoras de heterodímeros de carga opuesta, en su extremo C-terminal. El CD3e soluble de cynomolgus contenía los primeros 118 residuos de aminoácidos del CD3e de mono cynomolgus, con el alelo V35 (FN18+) seguido por el Dominio de espiral E (SEQ ID NO:3), anteriormente descrito, en el extremo carboxi. La secuencia de aminoácidos del alelo V35 (FN18+) de c D3e de cynomolgus es (SEQ ID NO:49):
MQSGTRWRVL GLCLLSIGVW GQDGNEEMGSITQTPYQVSI SGTTVILTCS
QHLGSEAQWQ HNGKNKEDSG DRLFLPEFSE MEQSGYYVCYPRGSNPEDAS
HHLYLKARVC ENCMEMDVMA
Figure imgf000034_0001
VATIVIVDIC ITLGLLLLVY YWSKNRKAKA
KPVTRGAGAG GRQRGQNKER PPPVPNPDYE PIRKGQQDLYSGLNQRRI
El CD38 soluble de cynomolgus contenía los primeros 101 residuos de aminoácidos del CD38 de mono cynomolgus, seguido por el Dominio de espiral K (SEQ ID NO:4), anteriormente descrito, en el extremo carboxi. La secuencia de aminoácidos del CD38 de cynomolgus es (SEQ ID NO:50):
MEHSTFLSGL VLATLLSQVS PFKIPVEELE DRVFVKCNTSVTWVEGTVGT
LLTNNTRLDL GKRILDPRGI YRCNGTDIYK DKESAVQVHYRMCQNCVELD PATLAGIIVT DVIATLLLAL GVFCFAGHETGRLSGAADTQ ALLRNDQVYQ PLRDRDDAQY SRLGGNWARN K
Las dos proteínas se coexpresaron en células CHO-S de mamífero y se purificaron usando un mAb anti-espiral E/K acoplado a SEPHAROSE®.
El CD3e humano soluble contenía los residuos 1-127 de aminoácidos de CD3e humano, con los alelos C119S y C122S, seguidos por el Dominio de espiral E (SEQ ID NO:3), anteriormente descrito, en el extremo carboxi. La secuencia de aminoácidos del CD3e humano es (SEQ ID NO:51):
MQSGTHWRVL GLCLLSVGVW GQDGNEEMGG ITQTPYKVSI SGTTVILTCP
QYPGSEILWQ HNDKNIGGDE DDKNIGSDED HLSLKEFSEL EQSGYYVCYP
RGSKPEDANF YLYLRARVCE NCMEMDVMSV ATIVIVDICI TGGLLLLVYY
WSKNRKAKAK PVTRGAGAGG RQRGQNKERP PPVPNPDYEP IRKGQRDLYS
GLNQRRI
El CD38 humano soluble contenía los residuos 1-101 del CD38 humano, seguidos por el Dominio de espiral K (SEQ ID NO:4), anteriormente descrito, en el extremo carboxi. Las dos proteínas se coexpresaron en células CHO-S de mamífero y se purificaron usando una columna de afinidad anti espiral E/K. La secuencia de aminoácidos del CD38 humano es (SEQ ID NO:52):
FKIPIEELE DRVFVNCNTS ITWVEGTVGT LLSDITRLDL GKRILDPRGI
YRCNGTDIYK DKESTVQVHY RMCQSCVELD PATVAGIIVT DVIATLLLAL
GVFCFAGHET GRLSGAADTQ ALLRNDQVYQ PLRDRDDAQY SHLGGNWARN
K
El gpA33 humana soluble contenía los residuos 1-235 del gpA33 humana con repeticiones de la (SEQ ID NO:53) HHHHHH ("6His") en el extremo terminal carboxi. El gpA33 soluble de cynomolgus contenía los residuos 1-314 del gpA33 de mono cynomolgus Met 1 a Gln 314 con repeticiones de 6His en el extremo terminal carboxi. Las dos proteínas se coexpresaron en células CHO-S de mamífero y se purificaron usando Ni SEPHAROSE®.
Los experimentos de unión se realizaron en tampón HBS-EP, que contiene 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA y 0,005% de tensioactivo P20. La unión de dArT-2 c/Fc Versión 1 se analizó (por duplicado) a concentraciones de 0, 6,25, 12,5, 25, 50 y 100 nM, inyectados durante 120 segundos a una velocidad de flujo de 30 ml/min.
La regeneración de las superficies de los receptores inmovilizados se hizo mediante inyección de pulsos de 10 mM de glicina, pH 1,5. Se trazaron curvas de referencia por inyección de cada dilución de DART-2 c/Fc sobre la superficie tratada sin ninguna proteína inmovilizada. Las curvas de unión a concentración cero se restaron como blanco. Se determinaron los valores de Kd mediante un ajuste global de las curvas de unión a las del modelo de

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un diacuerpo biespecífico, en el que dicho diacuerpo biespecífico tiene la capacidad de unirse a un epítopo de gpA33 y a un epítopo de CD3, en el que el diacuerpo biespecífico comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica,
en el que dichas primera y segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí, y en el que:
A. la primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal:
i. un Dominio 1, que comprende un subDominio (1A) que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a CD3 (VLcd3 ) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; y un subDominio (1B) que comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (VHgpA 33 ) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; en el que dichos subDominios (1A) y (1B) están separados uno del otro por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1;
ii. un Dominio 2, en el que dicho Dominio 2 es un Dominio de espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o un Dominio de espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, en el que dicho Dominio 2 está separado de dicho Dominio 1 por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:2;
B. la segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal:
i. un Dominio 1, que comprende un subDominio (1A) que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (VLgpA 33 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26; y un subDominio (1B) que comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a CD3 (VHcd 3 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; en el que dichos subDominios (1A) y (1B) están separados uno del otro por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1;
ii. un Dominio 2, en el que dicho Dominio 2 es un Dominio de espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o un Dominio de espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, en el que dicho Dominio 2 está separado de dicho Dominio 1 por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; y en el que dicho Dominio 2 de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio 2 de dicha segunda cadena polipeptídica no son ambos Dominios de espiral E ni son ambos Dominios de espiral K;
y en el que:
(a) dicho Dominio VL de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio VH de dicha segunda cadena polipeptídica forman un Dominio de Unión a Antígeno monovalente con capacidad de unión a un epítopo de CD3 específico; y
(b) dicho Dominio VH de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio VL de dicha segunda cadena polipeptídica forman un Dominio de Unión a Antígeno monovalente con capacidad de unión a un epítopo de gpA33 específico.
2. El diacuerpo biespecífico según la reivindicación 1, en el que dicha primera cadena polipeptídica o la segunda cadena polipeptídica comprende un Dominio de Unión a Albúmina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, dicho Dominio de Unión a Albúmina posicionado en sentido del extremo C-terminal con respecto a dicho Dominio 2, y separado de dicho Dominio 2 por un Ligador 3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32.
3. Un diacuerpo Fc biespecífico, en el que dicho diacuerpo Fc biespecífico tiene la capacidad de unirse a un epítopo de gpA33 específico y a un epítopo de CD3 específico, y posee u Dominio Fc IgG, en el que el diacuerpo Fc biespecífico comprende una primera cadena polipeptídica, una segunda cadena polipeptídica y una tercera cadena polipeptídica, en el que dichas primera y segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí y dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí, y en el que:
A. la primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal:
i. un Dominio 1, que comprende un subDominio (1A) que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (VLgpA 33 ) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26; y un subDominio (1B) que comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a CD3 (VHcd 3 ) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; en el que dichos subDominios (1A) y (1B) están separados uno del otro por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;
ii. un Dominio 2, en el que dicho Dominio 2 es un Dominio de espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o un Dominio de espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, en el que dicho Dominio 2 está separado de dicho Dominio 1 por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:2; y
iii. un Dominio 3, que comprende un subDominio (3A) que comprende un péptido que contiene cisteína (Péptido 1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39; y un subDominio (3B) que comprende una porción polipeptídica de un Dominio Fc de IgG con los dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de IgG; en el que dichos Dominios 3 y 2 están separados uno del otro por un espaciador peptídico que tiene la secuencia GGG (Ligador 5);
B. la segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal:
i. un Dominio 1, que comprende un subDominio (1A) que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a CD3 (VLcd3 ) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, y un subDominio (1B) que comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (VHgpA 33 ) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; en el que dichos subDominios (1A) y (1B) están separados uno del otro por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;
ii. un Dominio 2, en el que dicho Dominio 2 es un Dominio de espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o un Dominio de espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, en el que dicho Dominio 2 está separado de dicho Dominio 1 por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; y en el que dicho Dominio 2 de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio 2 de dicha segunda cadena polipeptídica no son ambos Dominios de espiral E ni son ambos Dominios de espiral K; y
C. la tercera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal, un Dominio 3 que comprende:
i. un subDominio (3A) que comprende un péptido que contiene cisteína (Péptido 1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39; y
ii. un subDominio (3B) que comprende una porción polipeptídica de un Dominio Fc de IgG con los dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de IgG;
y en el que:
(a) dichas porciones polipeptídicas de los dominios Fc de IgG de dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas forman dicho Dominio Fc de IgG;
(b) dicho Dominio VL de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio VH de dicha segunda cadena polipeptídica forman un Dominio de Unión a Antígeno monovalente con capacidad de unión a un epítopo de gpA33 específico; y
(c) dicho Dominio VH de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio VL de dicha segunda cadena polipeptídica forman un Dominio de Unión a Antígeno monovalente con capacidad de unión a un epítopo de CD3 específico.
4. Un diacuerpo Fc biespecífico, en el que dicho diacuerpo Fc biespecífico tiene la capacidad de unirse a un epítopo de gpA33 específico y a un epítopo de CD3 específico, y posee u Dominio Fc IgG, en el que el diacuerpo Fc biespecífico comprende una primera cadena polipeptídica, una segunda cadena polipeptídica y una tercera cadena polipeptídica, en el que dichas primera y segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí y dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí, y en el que:
A. la primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal:
i. un Dominio 3, que comprende un subDominio (3A) que comprende un péptido que contiene cisteína (Péptido 1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39; y un subDominio (3B) que comprende una porción polipeptídica de un Dominio Fc de IgG con los dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de IgG;
ii. un Dominio 1, que comprende un subDominio (1A) que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (VLgpA 33 ) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26; y un subDominio (1B) que comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a CD3 (VHcd 3 ) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; en el que dichos subDominios (1A) y (1B) están separados uno del otro por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1; en el que dichos dominios 1 y 3 están separados uno del otro por un espaciador peptídico (Ligador 4) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38;
iii. un Dominio 2, en el que dicho Dominio 2 es un Dominio de espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o un Dominio de espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, en el que dicho Dominio 2 está separado de dicho Dominio 1 por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:2; y
B. la segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal:
i. un Dominio 1, que comprende un subDominio (1A) que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a CD3 (VLcd3 ) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, y un subDominio (1B) que comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal con capacidad de unión a gpA33 (VHgpA 33 ) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; en el que dichos subDominios (1A) y (1B) están separados uno del otro por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;
ii. un Dominio 2, en el que dicho Dominio 2 es un Dominio de espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o un Dominio de espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, en el que dicho Dominio 2 está separado de dicho Dominio 1 por un ligador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; y en el que dicho Dominio 2 de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio 2 de dicha segunda cadena polipeptídica no son ambos Dominios de espiral E ni son ambos Dominios de espiral K; y
C. la tercera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal, un Dominio 3 que comprende:
(1) un subDominio (3A) que comprende un péptido que contiene cisteína (Péptido 1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39; y
(2) un subDominio (3B) que comprende una porción polipeptídica de un Dominio Fc de IgG con los dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de IgG;
y en el que:
(a) dichas porciones polipeptídicas de los dominios Fc de IgG de dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas forman dicho Dominio Fc de IgG;
(b) dicho Dominio VL de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio VH de dicha segunda cadena polipeptídica forman un Dominio de Unión a Antígeno monovalente con capacidad de unión a un epítopo de gpA33 específico; y
(c) dicho Dominio VH de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio VL de dicha segunda cadena polipeptídica forman un Dominio de Unión a Antígeno monovalente con capacidad de unión a un epítopo de CD3 específico.
5. El diacuerpo Fc biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en el que dicho subDominio (3B) de dicha primera cadena polipeptídica comprende una secuencia diferente de la de dicho subDominio (3B) de dicha tercera cadena polipeptídica.
6. El diacuerpo Fc biespecífico según la reivindicación 5, en el que dicho subDominio (3B) de dicha primera cadena polipeptídica tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40 y dicho subDominio (3B) de dicha tercera cadena polipeptídica tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41.
7. El diacuerpo Fc biespecífico según la reivindicación 5, en el que dicho subDominio (3B) de dicha primera cadena polipeptídica tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y dicho subDominio (3B) de dicha tercera cadena polipeptídica tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40.
8. El diacuerpo Fc biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en el que dicho Dominio 3 de dicha primera cadena polipeptídica y/o dicho Dominio 3 de dicha tercera cadena polipeptídica comprenden una variante de secuencia CH2-CH3 que exhibe una unión modificada a un receptor Fcy.
9. El diacuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o el diacuerpo Fc biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que dicho Dominio 2 de dicha primera cadena polipeptídica comprende una espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y dicho Dominio 2 de dicha segunda cadena polipeptídica comprende una espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.
10. El diacuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o el diacuerpo Fc biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que dicho Dominio 2 de dicha primera cadena polipeptídica comprende una espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y dicho Dominio 2 de dicha segunda cadena polipeptídica comprende una espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3.
11. Un diacuerpo biespecífico, en el que dicho diacuerpo biespecífico tiene la capacidad de unirse a un epítopo de cd3 y a un epítopo de gpa33 específicos, en el que dicho diacuerpo biespecífico comprende:
(1) una primera cadena polipeptídica que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, y una segunda cadena polipeptídica con tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; o
(2) una primera cadena polipeptídica que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35, y una segunda cadena polipeptídica con tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30;
en el que dicha primera y dicha segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí por un enlace de disulfuro.
12. Un diacuerpo Fc biespecífico, en el que dicho diacuerpo Fc biespecífico tiene la capacidad de unirse a un epítopo de CD3 y a un epítopo de gpA33, y posee un Dominio Fc de IgG, en el que dicho diacuerpo Fc biespecífico comprende:
(1) una primera cadena polipeptídica que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42, una segunda cadena polipeptídica con tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 y una tercera cadena polipeptídica con tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46; o
(2) una primera cadena polipeptídica que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48, una segunda cadena polipeptídica con tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28 y una tercera cadena polipeptídica con tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46;
en el que dicha primera y dicha segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí por un primer enlace de disulfuro y dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas están enlazadas covalentemente entre sí por un segundo enlace de disulfuro.
13. Una composición farmacéutica que comprende el diacuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 9-11 0 el diacuerpo Fc biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 3-10 o 12; y un vehículo fisiológicamente aceptable.
14. La composición farmacéutica según la reivindicación 13 para su uso en el tratamiento de un cáncer caracterizado por la expresión de gpA33.
15. La composición farmacéutica según la reivindicación 14, en la que dicho cáncer es cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer gástrico o cáncer de páncreas.
16. Una célula que expresa dicha primera cadena polipeptídica y dicha segunda cadena polipeptídica de cualquiera de los diacuerpos biespecíficos según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 9-11 o de cualquiera de los diacuerpos Fc biespecíficos según cualquiera de las reivindicaciones 3-10 o 12.
17. Un polinucleótido que codifica cualquiera de los diacuerpos biespecíficos según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 9-11 o cualquiera de los diacuerpos Fc biespecíficos según las reivindicaciones 3-10 o 12, en el que el polinucleótido comprende la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha primera cadena polipeptídica y/o dicha segunda cadena polipeptídica de cualquiera de los diacuerpos biespecíficos según una cualquiera según las reivindicaciones 1-2 o 9-11 o de cualquiera de los diacuerpos Fc biespecíficos según las reivindicaciones 3-10 o 12.
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