ES2860973T3 - Diacuerpos monovalentes biespecíficos que pueden unirse a CD123 y CD3 y usos de estos - Google Patents

Abstract

Un diacuerpo que puede unirse de manera específica a un epítopo de CD123 y a un epítopo de CD3, en donde el diacuerpo comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, unidas covalentemente entre sí, en donde: A. la primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal: i. un Dominio 1, que comprende (1) un subdominio (1A), que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VLCD3) y que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:21; y (2) un subdominio (1B), que comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VHCD123) y que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26, en donde dichos subdominios 1A e 1B están separados entre sí por un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29; ii. un Dominio 2, en donde dicho Dominio 2 es un Dominio en espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:34 o un Dominio en espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:35, en donde dicho Dominio 2 está separado de dicho Dominio 1 por un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:30; y B. la segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal: i. un Dominio 1, que comprende (1) un subdominio (1A), que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VLCD123) y que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:25; y (2) un subdominio (1B), que comprende un dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VHCD3) y que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22, en donde dichos subdominios 1A e 1B están separados entre sí por un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29; ii. un Dominio 2, en donde dicho Dominio 2 es un Dominio en espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:35 o un Dominio en espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:34, en donde dicho Dominio 2 está separado de dicho Dominio 1 por un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:30; y en donde dicho Dominio 2 de dichas primera y segunda cadenas polipeptídicas no son ambos Dominios en espiral E o ambos Dominios en espiral K, y en donde: (a) dicho Dominio VL de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio VH de dicha segunda cadena polipeptídica forman un dominio de unión a antígeno que puede unirse específicamente a un epítopo de CD3; y (b) dicho Dominio VL de dicha segunda cadena polipeptídica y dicho Dominio VH de dicha primera cadena polipeptídica forman un dominio de unión a antígeno que puede unirse específicamente a un epítopo de CD123.

Description

DESCRIPCIÓN

Diacuerpos monovalentes biespecíficos que pueden unirse a CD123 y CD3 y usos de estos

Antecedentes:

Campo de la invención:

La presente invención se dirige a diacuerpos monovalentes biespecíficos CD123 x CD3 que pueden unirse simultáneamente a CD123 y CD3, y a los usos de tales moléculas en el tratamiento de enfermedades malignas hematológicas.

Descripción de la técnica relacionada:

I. CD123

CD123 (receptor alfa de interleucina 3, IL-3Ra) es una molécula de 40 kDa y es parte del complejo del receptor de interleucina 3 (Stomski, F.C. y otros, (1996) “Human Interleukin-3 (IL-3) Induces Disulfide-Linked IL-3 Receptor Alpha- And Beta-Chain Heterodimerization, Which Is Required For Receptor Activation But Not High-Affinity Binding,” Mol. Cell. Biol. 16(6):3035-3046). La interleucina 3 (IL-3) impulsa la diferenciación temprana de células madre multipotentes en células de los progenitores eritroides, mieloides y linfoides. CD123 se expresa en progenitores comprometidos CD34+ (Taussig, D.C. y otros, (2005) “Hematopoietic Stem Cells Express Multiple Myeloid Markers: Implications For The Origin And Targeted Therapy Of Acute Myeloid Leukemia,” Blood 106:4086-4092), pero no por células madre hematopoyéticas normales CD34+/CD38-. CD123 es expresado por basófilos, mastocitos, células dendríticas plasmocitoides, algo de expresión por monocitos, macrófagos y eosinófilos, y baja o nula expresión por neutrófilos y megacariocitos. Algunos tejidos no hematopoyéticos (placenta, células de Leydig del testículo, ciertos elementos de las células del cerebro y algunas células endoteliales) expresan CD123; sin embargo, la expresión es principalmente citoplasmática.

Se informa que CD123 es expresado por blastos leucémicos y células madre de leucemia (LSC) (Jordan, C.T. y otros, (2000) “The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells,” Leukemia 14:1777-1784; Jin, W. y otros, (2009) “Regulation Of Thl7 Cell Differentiation And EAE Induction By MAP3K NIK,” Blood 113:6603-6610) (Figura 1). En poblaciones de precursores humanos normales, CD123 es expresado por un subconjunto de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) pero no por células madre hematopoyéticas normales (HSC). CD123 también es expresado por células dendríticas plasmocitoides (pDC) y basófilos y, en menor medida, por monocitos y eosinófilos (Lopez, A.F. y otros, (1989) “Reciprocal Inhibition Of Binding Between Interleukin 3 And Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor To Human Eosinophils,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:7022-7026; Sun, Q. y otros, (1996) “Monoclonal Antibody 7G3 Recognizes The N-Terminal Domain Of The Human Interleukin-3 (TL-3) Receptor Alpha Chain And Functions As A Specific IL-3 Receptor Antagonist,” Blood 87:83-92; Muñoz, L. y otros, (2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86(12): 1261-1269; Masten, B.J. y otros, (2006) “Characterization Of Myeloid And Plasmacytoid Dendritic Cells In Human Lung,” J. Immunol. 177:7784-7793; Korpelainen, E.I. y otros, (1995) “ Interferon-Gamma Upregulates Interleukin-3 (IL-3) Receptor Expression In Human Endothelial Cells And Synergizes With IL-3 In Stimulating Major Histocompatibility Complex Class II Expression And Cytokine Production,” Blood 86:176-182).

Se ha informado que CD123 se sobreexpresa en células malignas en una amplia gama de enfermedades malignas hematológicas, incluida la leucemia mieloide aguda (AML) y el síndrome mielodisplásico (MDS) (Muñoz, L. y otros, (2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86(12): 1261-1269). La sobreexpresión de CD123 se asocia con un peor pronóstico en la AML (Tettamanti, M.S. y otros, (2013)“Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401).

Se cree que AML y MDS surgen y son perpetuados por una pequeña población de células madre leucémicas (LSC), que generalmente están inactivas (es decir, células que no se dividen rápidamente) y, por lo tanto, resisten la muerte celular (apoptosis) y los agentes quimioterapéuticos convencionales. Las LSC se caracterizan por altos niveles de expresión de CD123, que no está presente en la correspondiente población de células madre hematopoyéticas normales en la médula ósea humana normal (Jin, W. y otros, (2009) “Regulation OfThl7 Cell Differentiation And EAE Induction By MAP3K NIK,” Blood 113:6603-6610; Jordan, C.T. y otros, (2000) “77ze Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells,” Leukemia 14:1777-1784). CD123 se expresa en 45 %-95 % de AML, 85 % de leucemia de células pilosas (HCL) y 40 % de leucemia linfoblástica B aguda (B-ALL). La expresión de CD123 también se asocia con otras múltiples enfermedades malignas/enfermedades premalignas: células progenitoras de leucemia mieloide crónica (CML) (incluida crisis blástica de CML); células Reed Sternberg (RS) de Hodgkin; linfoma no Hodgkin transformado (NHL); algo de leucemia linfocítica crónica (CLL) (CDllc+); un subconjunto de leucemia linfoblástica T aguda (LLA-T) (16 %, la mayoría inmaduras, sobre todo adultas), enfermedades malignas de células dendríticas de plasmacitoides (pDC) (DC2) síndrome mielodisplásico CD34+/CD38- y enfermedades malignas de células de médula ósea (MDS).

La AML es una enfermedad clonal caracterizada por la proliferación y acumulación de células progenitoras mieloides transformadas en la médula ósea, lo que finalmente conduce a insuficiencia hematopoyética. La incidencia de AML aumenta con la edad, y los pacientes de edad avanzada típicamente tienen peores resultados de tratamiento que los pacientes más jóvenes (Robak, T. y otros, (2009) “Current And Emerging Therapies For Acute Myeloid Leukemia,” Clin. Ther. 2:2349-2370). Desafortunadamente, en la actualidad, la mayoría de los adultos con AML mueren a causa de su enfermedad.

El tratamiento de la AML se centra inicialmente en la inducción de la remisión (terapia de inducción). Una vez que se logra la remisión, el tratamiento cambia para centrarse en asegurar dicha remisión (terapia posterior a la remisión o de consolidación) y, en algunos casos, terapia de mantenimiento. El paradigma estándar de inducción de la remisión para la AML es la quimioterapia con una combinación de antraciclina/citarabina, seguida de quimioterapia de consolidación (generalmente con dosis más altas de los mismos fármacos que se usaron durante el período de inducción) o trasplante de células madre humanas, en dependencia de la capacidad del paciente de tolerar el tratamiento intensivo y la probabilidad de curación con quimioterapia sola (ver, por ejemplo, Roboz, G.J. (2012) “Current Treatment Of Acute Myeloid Leukemia,” Curr. Opin. Oncol. 24:711-719).

Los agentes usados con frecuencia en la terapia de inducción incluyen citarabina y antraciclinas. La citarabina, también conocida como AraC, destruye las células cancerosas (y otras células normales que se dividen rápidamente) al interferir con la síntesis de ADN. Los efectos secundarios asociados con el tratamiento con AraC incluyen una menor resistencia a las infecciones, como resultado de la disminución de la producción de glóbulos blancos; sangrado, como resultado de la disminución de la producción de plaquetas; y anemia, debido a una posible reducción de los glóbulos rojos. Otros efectos secundarios incluyen náuseas y vómitos. Las antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina, doxorrubicina e idarrubicina) tienen varios modos de acción que incluyen la inhibición de la síntesis de ADN y ARN, la alteración de las estructuras de orden superior del ADN y la producción de radicales de oxígeno libres que dañan las células. El efecto adverso más importante de las antraciclinas es la cardiotoxicidad, que limita considerablemente la dosis administrada de por vida y hasta cierto punto su utilidad.

Por lo tanto, desafortunadamente, a pesar del progreso sustancial en el tratamiento de la AML recién diagnosticada, del 20 % al 40 % de los pacientes no logran la remisión con la quimioterapia de inducción estándar, y se espera que entre el 50 % y el 70 % de los pacientes que ingresan a una primera remisión completa recaigan dentro de 3 años. La estrategia óptima en el momento de la recaída o para los pacientes con enfermedad resistente sigue siendo incierta. El trasplante de células madre se ha establecido como la forma más eficaz de terapia antileucémica en pacientes con AML en remisión primera o posterior (Roboz, G.J. (2012) “Current Treatment Of Acute Myeloid Leukemia,” Curr. Opin. Oncol. 24:711-719).

II. CD3

CD3 es un correceptor de células T compuesto por cuatro cadenas distintas (Wucherpfennig, K.W. y otros, (2010) “Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; páginas 1-14). En los mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3y, una cadena CD35 y dos cadenas CD3a. Estas cadenas se asocian con una molécula conocida como el receptor de células T (TCR) para generar una señal de activación en los linfocitos T. En ausencia de CD3, los TCR no se ensamblan correctamente y se degradan (Thomas, S. y otros, (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer,” Immunology 129(2): 170-177). El CD3 se encuentra unido a las membranas de todas las células T maduras y prácticamente en ningún otro tipo de célula (ver, Janeway, C.A. y otros, (2005) In: I^mmunobiology: T^he I^mmune S^ystem Iⁿ H^ealth A^nd D^isease,” 6ta ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214-216; Sun, Z. J. y otros, (2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3s:y Heterodimer,” Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. y otros, (2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex,” Immunity. Febrero de 2006; 24(2): 133-139).

III. Diacuerpos biespecíficos

La capacidad de un anticuerpo intacto no modificado (por ejemplo, una IgG) de unirse a un epítopo de un antígeno depende de la presencia de dominios variables en las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina (es decir, los dominios VL y Vh , respectivamente). El diseño de un diacuerpo se basa en el constructo de Fv de cadena única (scFv) (ver, por ejemplo, Holliger y otros, (1993) “'Diabodies Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; documento US 2004/0058400 (Hollinger y otros); documento US 2004/0220388 (Mertens y otros); Alt y otros, (1999) FEBS Lett. 454(l-2):90-94; Lu, D. y otros, (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672; WO 02/02781 (Mertens y otros); Olafsen, T. y otros, (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti- CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng. Des. Sei. 17(l):21-27; Wu, A. y otros, (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein ls Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2): 1025-1033; Asano y otros, (2004) “A Diabody For Cáncer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem.

76(8):992; Takemura, S. y otros, (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. y otros, (2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944).

La interacción de una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo y, en particular, la interacción de sus dominios VL y VH forma uno de los sitios de unión al epítopo del anticuerpo. Por el contrario, el constructo de scFv comprende un dominio VL y VH de un anticuerpo contenido en una única cadena polipeptídica en donde los dominios están separados por un enlazador flexible de longitud suficiente para permitir el autoensamblaje de los dos dominios en un sitio de unión a epítopo funcional. Cuando el autoensamblaje de los dominios VL y VH se vuelve imposible debido a un enlazador de longitud insuficiente (menos de aproximadamente 12 residuos de aminoácidos), dos de los constructos de scFv interactúan entre sí para formar una molécula bivalente en la que el VL de una cadena se asocia con el VH de la otra (revisado en Marvin y otros, (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658).

Los anticuerpos naturales pueden unirse solo a una especie de epítopo (es decir, monoespecíficos), aunque pueden unirse a múltiples copias de esa especie (es decir, que exhiben bivalencia o multivalencia). La técnica también ha señalado la capacidad de producir diacuerpos que difieren de tales anticuerpos naturales porque pueden unirse a dos o más especies de epítopos diferentes (es decir, exhibir biespecificidad o multiespecificidad además de bivalencia o multivalencia) (ver, por ejemplo, Holliger y otros, (1993) “'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al); US 2004/0220388 (Mertens et alf Alt y otros, (1999) FEBS Lett. 454(l-2):90-94; Lu, D. y otros, (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al); Mertens, N. y otros, “New Recombinant Bi- and Trispecific Antibody Derivatives,” In: N^ovel E^rontiers Iⁿ T^he P^roduction O^f C^ompounds L^or B^iomedical U^se, A. VanBroekhoven y otros, (Eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands (2001), páginas 195-208; Wu, A. y otros, (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2): 1025-1033; Asano y otros, (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. y otros, (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. y otros, (2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944).

La provisión de diacuerpos no monoespecíficos proporciona una ventaja significativa: la capacidad de coligar y colocalizar células que expresan diferentes epítopos. Por lo tanto, los diacuerpos biespecíficos tienen una amplia gama de aplicaciones, incluida la terapia y el inmunodiagnóstico. La biespecificidad permite una gran flexibilidad en el diseño y la ingeniería del diacuerpo en diversas aplicaciones, lo que proporciona una mayor avidez por los antígenos multiméricos, el entrecruzamiento de diferentes antígenos y el direccionamiento dirigido a tipos celulares específicos que dependen de la presencia de ambos antígenos diana. Debido a su mayor valencia, bajas tasas de disociación y rápida eliminación de la circulación (para diacuerpos de tamaño pequeño, de ~ 50 kDa o menos), las moléculas de diacuerpo conocidas en la técnica también han mostrado un uso particular en el campo de la formación de imágenes de tumores (Fitzgerald y otros, (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris, ” Protein Eng. 10:1221). De importancia particular es la coligación de células diferentes, por ejemplo, para el entrecruzamiento de células T citotóxicas con células tumorales (Staerz y otros (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells, ” Nature 314:628-631, y Holliger y otros, (1996) Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody, ” Protein Eng. 9:299-305).

Los dominios de unión a epítopo del diacuerpo pueden dirigirse a un determinante de superficie de cualquier célula efectora inmunitaria tal como CD3, CD16, c D32 o CD64, que se expresan en linfocitos T, células asesinas naturales (NK) u otras células mononucleares. En muchos estudios, también se descubrió que la unión de diacuerpos a determinantes de células efectoras, por ejemplo, receptores de F^cy (FcyR), activa la célula efectora (Holliger y otros, (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody, ” Protein Eng.

9:299-305; Holliger y otros, (1999) “Carcinoembryonic Antigen (CEA)- Speciflc T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins, ” Cancer Res.

59:2909-2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). Normalmente, la activación de células efectoras es desencadenada por la unión de un anticuerpo unido a un antígeno con una célula efectora a través de la interacción Fc-FcyR; por lo tanto, a este respecto, las moléculas de diacuerpo pueden exhibir una funcionalidad similar a Ig independientemente de si comprenden un Dominio Fc (por ejemplo, como se analiza en cualquier ensayo de función efectora conocido en la técnica o ejemplificado en la presente descripción (por ejemplo, ensayo de ADCC)). Al entrecruzar las células tumorales y efectoras, el diacuerpo no solo lleva la célula efectora a la proximidad con las células tumorales, sino que conduce a la destrucción efectiva del tumor (ver, por ejemplo, Cao y otros, (2003) “Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197).

Sin embargo, las ventajas anteriores tienen un costo notable. La formación de tales diacuerpos no monoespecíficos requiere el ensamblaje exitoso de dos o más polipéptidos distintos y diferentes (es decir, tal formación requiere que los diacuerpos se formen mediante la heterodimerización de diferentes especies de cadenas polipeptídicas). Este hecho contrasta con los diacuerpos monoespecíficos, que se forman mediante la homodimerización de cadenas polipeptídicas idénticas. Porque deben proporcionarse al menos dos polipéptidos diferentes (es decir, dos especies de polipéptidos) para formar un diacuerpo no monoespecífico, y porque la homodimerización de tales polipéptidos conduce a moléculas inactivas (Takemura, S. y otros, (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588), la producción de tales polipéptidos debe lograrse de manera que se evite la unión covalente entre polipéptidos de la misma especie (es decir, para evitar la homodimerización) (Takemura, S. y otros, (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588). Por lo tanto, la técnica ha enseñado la asociación no covalente de tales polipéptidos (ver, por ejemplo, Olafsen y otros, (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sei. 17:21-27; Asano y otros, (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. y otros, (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng.

13(8):583-588; Lu, D. y otros, (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).

Sin embargo, la técnica ha reconocido que los diacuerpos biespecíficos compuestos de polipéptidos asociados no covalentemente son inestables y se disocian fácilmente en monómeros no funcionales (ver, por ejemplo, Lu, D. y otros, (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).

Frente a este desafío, la técnica ha logrado desarrollar diacuerpos no monoespecíficos heterodiméricos estables unidos covalentemente (ver, por ejemplo, WO 2006/113665; ^w O/2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO/2012/162068; Johnson, S. y otros, (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion,” J. Molec. Biol.

399(3):436-449; Veri, M.C. y otros, (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor lib (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7): 1933­ 1943; Moore, P.A. y otros, (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551). Tales enfoques implican modificar genéticamente uno o más residuos de cisteína en cada una de las especies polipeptídicas empleadas. Por ejemplo, se ha demostrado que la adición de un residuo de cisteína al extremo C-terminal de tales constructos permite el enlace disulfuro entre las cadenas polipeptídicas, lo que estabiliza el heterodímero resultante sin interferir con las características de unión de la molécula bivalente.

A pesar de tal éxito, la producción de diacuerpos no monoespecíficos, heterodiméricos funcionales, estables puede optimizarse aún más mediante la consideración y colocación cuidadosas de residuos de cisteína en una o más de las cadenas polipeptídicas empleadas. Tales diacuerpos optimizados pueden producirse con mayor rendimiento y con mayor actividad que los diacuerpos no optimizados. Por lo tanto, la presente invención se dirige al problema de proporcionar polipéptidos que se diseñan y optimizan particularmente para formar diacuerpos heterodiméricos. La invención resuelve este problema mediante la provisión de diacuerpos CD123 x CD3 optimizados ilustrativos.

El documento WO 2012/162067 A2 (MacroGenics, Inc.) se dirige a moléculas de unión a CD3 capaces de unirse a CD3 humano y no humano, y describe variantes humanizadas de dos anticuerpos anti-CD3 murinos diferentes. Resumen de la invención:

La presente descripción se dirige a diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 que pueden unirse simultáneamente a CD123 y CD3, y a los usos de tales moléculas en el tratamiento de enfermedades, en particular enfermedades malignas hematológicas.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un diacuerpo que puede unirse específicamente a un epítopo de CD123 y a un epítopo de CD3 de acuerdo con la reivindicación 1 de la presente descripción.

Los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 de la descripción comprenden al menos dos cadenas polipeptídicas diferentes que se asocian entre sí de forma heterodimérica para formar un sitio de unión específico para un epítopo de CD123 y un sitio de unión específico para un epítopo de CD3. Un diacuerpo CD123 x CD3 de la descripción es, por lo tanto, monovalente porque es que puede unirse a una sola copia de un epítopo de CD123 y a una sola copia de un epítopo de CD3, pero biespecífico porque un solo diacuerpo puede unirse simultáneamente al epítopo de CD123 y al epítopo de CD3. Las cadenas polipeptídicas individuales de los diacuerpos se unen covalentemente entre sí, por ejemplo mediante enlaces disulfuro de residuos de cisteína ubicados dentro de cada cadena polipeptídica. En descripciones particulares, los diacuerpos de la presente descripción tienen además un dominio Fc de inmunoglobulina o un dominio de unión a albúmina para extender la vida media in vivo.

Se describe un diacuerpo monovalente biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia que puede unirse de forma específica a un epítopo de CD123 y a un epítopo de CD3, en donde el diacuerpo comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, unidos covalentemente entre sí, en donde:

A. la primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal:

i. un Dominio 1, que comprende:

(1) un subdominio (1A), que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VL^cd3) (SEQ ID NO:21); y

(2) un subdominio (1B), que comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VH^cdi23) (SEQ ID NO:26);

en donde los subdominios 1A y 1B están separados entre sí por un enlazador peptídico (SEQ ID NO:29); ii. un Dominio 2, en donde el Dominio 2 es un Dominio en espiral E (SEQ ID NO:34) o un Dominio en espiral K (SEQ ID NO:35), en donde el Dominio 2 está separado del Dominio 1 por un enlazador peptídico (SEQ ID NO:30); y

B. la segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal:

i. un Dominio 1, que comprende:

(1) un subdominio (1A), que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VLcdi²³) (SEQ ID NO:25); y

(2) un subdominio (1B), que comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VHcd³) (SEQ ID NO:22);

en donde los subdominios 1A y 1B están separados entre sí por un enlazador peptídico (SEQ ID NO:29); ii. un Dominio 2, en donde el Dominio 2 es un Dominio en espiral K (SEQ ID NO:35) o un Dominio en espiral E (SEQ ID NO:34), en donde el Dominio 2 está separado del Dominio 1 por un enlazador peptídico (SEQ ID NO:30); y en donde el Dominio 2 de la primera y la segunda cadenas polipeptídicas no son ambos Dominios en espiral E o ambos Dominios en espiral K;

y en donde:

(a) dicho Dominio VL de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio VH de dicha segunda cadena polipeptídica forman un dominio de unión a antígeno que puede unirse específicamente a un epítopo de CD3; y

(b) dicho Dominio VL de dicha segunda cadena polipeptídica y dicho Dominio VH de dicha primera cadena polipeptídica forman un dominio de unión a antígeno que puede unirse específicamente a un epítopo de CD123.

También se describe un diacuerpo monovalente biespecífico CD123 x CD3 sin optimización de secuencia que puede unirse de forma específica a un epítopo de CD123 y a un epítopo de CD3, en donde el diacuerpo comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, unidos covalentemente entre sí, en donde:

A. la primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal:

i. un Dominio 1, que comprende:

(1) un subdominio (1A), que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VLc^d3) (SEQ ID NO:23); y

(2) un subdominio (1B), que comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VH^cdi23) (SEQ ID NO:28);

en donde los subdominios 1A y 1B están separados entre sí por un enlazador peptídico (SEQ ID NO:29); ii. un Dominio 2, en donde el Dominio 2 es un Dominio en espiral E (SEQ ID NO:34) o un Dominio en espiral K (SEQ ID NO:35), en donde el Dominio 2 está separado del Dominio 1 por un enlazador peptídico (SEQ ID NO:30); y

B. la segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal:

i. un Dominio 1, que comprende:

(1) un subdominio (1A), que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VLcdi²³) (SEQ ID NO:27); y

(2) un subdominio (1B), que comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VH^cd3) (SEQ ID NO:24);

en donde los subdominios 1A y 1B están separados entre sí por un enlazador peptídico (SEQ ID NO:29); ii. un Dominio 2, en donde el Dominio 2 es un Dominio en espiral K (SEQ ID NO:35) o un Dominio en espiral E (SEQ ID NO:34), en donde el Dominio 2 está separado del Dominio 1 por un enlazador peptídico (SEQ ID NO:30); y en donde el Dominio 2 de la primera y la segunda cadenas polipeptídicas no son ambos Dominios en espiral E o ambos Dominios en espiral K

y en donde:

(a) dicho Dominio VL de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio VH de dicha segunda cadena polipeptídica forman un dominio de unión a antígeno que puede unirse específicamente a un epítopo de CD3; y

(b) dicho Dominio VL de dicha segunda cadena polipeptídica y dicho Dominio VH de dicha primera cadena polipeptídica forman un dominio de unión a antígeno que puede unirse específicamente a un epítopo de C^d 123.

La primera o segunda cadena polipeptídica, de los diacuerpos monovalentes biespecíficos descritos anteriormente, puede comprender además un dominio de unión a albúmina (SEQ ID NO:36) enlazado, por el extremo C-terminal al Dominio 2 o por el extremo N-terminal al Dominio 1, a través de un enlazador peptídico (SEQ ID NO:31).

La primera o segunda cadena polipeptídica, de los diacuerpos monovalentes biespecíficos descritos anteriormente, puede comprender además un Dominio 3 que comprende un Dominio CH2 y CH3 de un Dominio Fc de Inmunoglobulina IgG (SEQ ID NO:37), en donde el Dominio 3 está unido, Por el extremo N-terminal, al Dominio 1A a través de un enlazador peptídico (SEQ ID NO:33).

La primera o segunda cadena polipeptídica, de los diacuerpos monovalentes biespecíficos descritos anteriormente, puede comprender además un Dominio 3 que comprende un Dominio CH2 y CH3 de un Dominio Fc de Inmunoglobulina IgG (SEQ ID NO:37), en donde el Dominio 3 está unido, Por el extremo C-terminal, al Dominio 2 a través de un enlazador peptídico (SEQ ID NO:32).

Se describe además, el Dominio 2 de la primera cadena polipeptídica, de los diacuerpos monovalentes biespecíficos descritos anteriormente, un Dominio en espiral K (SEQ ID n O:35) y el Dominio 2 de la segunda cadena polipeptídica es un Dominio en espiral E (SEQ ID NO:34).

Se describe además, el Dominio 2 de la primera cadena polipeptídica, de los diacuerpos monovalentes biespecíficos descritos anteriormente, un Dominio en espiral E (SEQ ID ⁿ O:34) y el Dominio 2 de la segunda cadena polipeptídica es un Dominio en espiral K (SEQ ID NO:35).

Se describe además un diacuerpo monovalente biespecífico que puede unirse específicamente a un epítopo de CD123 y a un epítopo de CD3, en donde el diacuerpo comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, unidos covalentemente entre sí, en donde el diacuerpo específico comprende:

A. una primera cadena polipeptídica que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1; y

B. una segunda cadena polipeptídica que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3;

en donde dichas primera y segunda cadenas polipeptídicas están unidas covalentemente entre sí mediante un enlace disulfuro.

Los diacuerpos de la descripción exhiben actividades funcionales mejoradas inesperadamente como se describe más adelante.

Los diacuerpos de la descripción preferentemente pueden reaccionar de forma cruzada con proteínas CD123 y CD3 de humanos y primates, preferentemente con proteínas CD123 y CD3 de macaco cangrejero.

Los diacuerpos de la descripción preferentemente pueden agotar, en un ensayo basado en células in vitro, células dendríticas plasmocitoides (pDC) de un cultivo de PBMC primarias con una CI50 de aproximadamente 1 ng/ml o menos, aproximadamente 0,8 ng/ml o menos, aproximadamente 0,6 ng/ml o menos, aproximadamente 0,4 ng/ml o menos, aproximadamente 0,2 ng/ml o menos, aproximadamente 0,1 ng/ml o menos, aproximadamente 0,05 ng/ml o menos, aproximadamente 0,04 ng/ml o menos, aproximadamente 0,03 ng/ml o menos, aproximadamente 0,02 ng/ml o menos o aproximadamente 0,01 ng/ml o menos. Preferentemente, la CI50 es de aproximadamente 0,01 ng/ml o menos. En el ensayo descrito anteriormente, el cultivo de PBMC primarias puede ser de macaco cangrejero, en cuyo caso dicho agotamiento es de células dendríticas plasmocitoides (pDC) de macaco cangrejero. Opcionalmente, los diacuerpos de la descripción pueden agotar las células dendríticas plasmocitoides (pDC) de un cultivo primario de PBMC como se describe anteriormente en donde el ensayo se realiza mediante o de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 14, como se describe en la presente descripción, o mediante modificación tal ensayo como lo entenderían los expertos en la técnica, o por otros medios conocidos por los expertos en la técnica.

Los diacuerpos de la descripción exhiben preferentemente citotoxicidad en un ensayo de Kasumi-3 in vitro con una CE50 de aproximadamente 0,05 ng/ml o menos. Preferentemente, la CE50 es aproximadamente 0,04 ng/ml o menos, aproximadamente 0,03 ng/ml o menos, aproximadamente 0,02 ng/ml o menos, o aproximadamente 0,01 ng/ml o menos. Opcionalmente, los diacuerpos de la descripción pueden exhibir citotoxicidad como se describió anteriormente, donde el ensayo se lleva a cabo mediante o de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 3 como se describe en la presente descripción, o mediante la modificación de tal ensayo como lo entenderían los expertos en la técnica, o por otros medios conocidos por los expertos en la técnica.

Los diacuerpos de la descripción exhiben preferentemente citotoxicidad en un ensayo de Molm-13 in vitro con una CE50 de aproximadamente 5 ng/ml o menos. Preferentemente, la CE50 es aproximadamente 3 ng/ml o menos, aproximadamente 2 ng/ml o menos, aproximadamente 1 ng/ml o menos, aproximadamente 0,75 ng/ml o menos, o aproximadamente 0,2 ng/ml o menos. Opcionalmente, los diacuerpos de la descripción pueden exhibir citotoxicidad como se describió anteriormente, donde el ensayo se lleva a cabo mediante o de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 3 como se describe en la presente descripción, o mediante la modificación de tal ensayo como lo entenderían los expertos en la técnica, o por otros medios conocidos por los expertos en la técnica.

Los diacuerpos de la descripción preferentemente pueden inhibir el crecimiento de un xenoinjerto de tumor de MOLM-13 en un ratón. Preferentemente, los diacuerpos de la descripción pueden inhibir el crecimiento de un xenoinjerto de tumor de MOLM-13 en un ratón a una concentración de al menos aproximadamente 20 pg/kg, al menos aproximadamente 4 pg/kg, al menos aproximadamente 0,8 pg/kg, al menos aproximadamente 0,6 pg/kg o al menos aproximadamente 0,4 pg/kg. Los anticuerpos preferidos de la descripción inhibirán el crecimiento de un xenoinjerto de tumor de MOLM-13 en un ratón en al menos un 25 %, pero posiblemente en al menos aproximadamente un 40 % o más, en al menos aproximadamente un 50 % o más, en al menos aproximadamente un 60 % o más, en al menos aproximadamente un 70 % o más, en al menos aproximadamente un 80 % o más, en al menos aproximadamente un 90 % o más, o incluso inhiben completamente el crecimiento de tumor de MOLM-13 después de algún período de tiempo o provocan la regresión o desaparición del tumor. Esta inhibición tendrá lugar al menos para una cepa de ratón NSG. Opcionalmente, los diacuerpos de la descripción pueden inhibir el crecimiento de un xenoinjerto de tumor de MOLM-13 en un ratón de la manera descrita anteriormente mediante o de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 6 como se describe en la presente descripción, o mediante la modificación de tal ensayo como lo entenderán los expertos en la técnica, o por otros medios conocidos por los expertos en la técnica.

Los diacuerpos de la descripción preferentemente pueden inhibir el crecimiento de un xenoinjerto de tumor de RS4-11 en un ratón. Preferentemente, los diacuerpos de la descripción pueden inhibir el crecimiento de un xenoinjerto de tumor de RS4-11 en un ratón a una concentración de al menos aproximadamente 0,5 mg/kg, al menos aproximadamente 0,2 mg/kg, al menos aproximadamente 0,1 mg/kg, al menos aproximadamente 0,02 mg/kg o al menos aproximadamente 0,004 mg/kg. Los anticuerpos preferidos de la descripción inhibirán el crecimiento de un xenoinjerto de tumor de RS4-11 en un ratón en al menos aproximadamente un 25 %, pero posiblemente al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, o incluso inhiben completamente el crecimiento de tumoral de RS4-11 después de algún período de tiempo o provocan la regresión o desaparición del tumor. Esta inhibición tendrá lugar al menos para una cepa de ratón NSG. Opcionalmente, los diacuerpos de la descripción pueden inhibir el crecimiento de un xenoinjerto de tumor de RS4-11 en un ratón de la manera descrita anteriormente mediante o de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 6 como se describe en la presente descripción, o mediante la modificación de tal ensayo como lo entenderán los expertos en la técnica, o por otros medios conocidos por los expertos en la técnica.

Los diacuerpos de la descripción preferentemente pueden agotar las células blásticas leucémicas in vitro en un cultivo primario de células de médula ósea de AML. Preferentemente, los diacuerpos de la descripción pueden agotar las células blásticas leucémicas in vitro en un cultivo primario de células de médula ósea de AML a concentraciones de al menos aproximadamente 0,01 ng/ml, al menos aproximadamente 0,02 ng/ml, al menos aproximadamente 0,04 ng/ml, al menos aproximadamente 0,06 ng/ml, al menos aproximadamente 0,08 ng/ml o al menos aproximadamente 0,1 ng/ml. Preferentemente, los diacuerpos de la descripción pueden agotar las células blásticas leucémicas in vitro en un cultivo primario de células de la médula ósea de AML a menos del 20 % de la población total de células blásticas leucémicas primarias a concentraciones de diacuerpos de al menos aproximadamente 0,01 ng/ml, al menos aproximadamente 0,02 ng/ml, al menos aproximadamente 0,04 ng/ml, al menos aproximadamente 0,06 ng/ml, al menos aproximadamente 0,08 ng/ml o al menos aproximadamente 0,1 ng/ml, opcionalmente después de la incubación del cultivo primario con el diacuerpo durante aproximadamente 120 horas. Preferentemente, las células blásticas leucémicas se reducen in vitro en un cultivo primario de células de la médula ósea de AML a menos del 20 % de la población total de células blásticas leucémicas primarias a concentraciones de diacuerpos de aproximadamente 0,01 ng/ml o 0,1 ng/ml después de la incubación del cultivo primario con el diacuerpo durante aproximadamente 120 horas.

Los diacuerpos de la descripción preferentemente pueden inducir una expansión de una población de células T in vitro en un cultivo primario de células de médula ósea de AML. Preferentemente, tal expansión puede ser hasta aproximadamente el 70 % o más de la población máxima de células T que puede expandirse en el ensayo. Preferentemente, los diacuerpos de la descripción pueden inducir una expansión de una población de células T in vitro en un cultivo primario de células de médula ósea de AML hasta aproximadamente el 70 % o más de la población máxima de células T que puede expandirse en el ensayo a concentraciones diacuerpo de al menos aproximadamente 0,01 ng/ml, al menos aproximadamente 0,02 ng/ml, al menos aproximadamente 0,04 ng/ml, al menos aproximadamente 0,06 ng/ml, al menos aproximadamente 0,08 ng/ml o al menos aproximadamente 0,1 ng/ml, opcionalmente después de la incubación del cultivo primario con diacuerpo durante aproximadamente 120 horas. Preferentemente, una población de células T se expande in vitro en un cultivo primario de células de médula ósea de AML hasta aproximadamente el 70 % o más de la población máxima de células T que puede expandirse en el ensayo a concentraciones de diacuerpos de aproximadamente 0,01 ng/ml o aproximadamente 0,1 ng/ml después de la incubación del cultivo primario con el diacuerpo durante aproximadamente 120 horas.

Los diacuerpos de la descripción preferentemente pueden inducir una activación de una población de células T in vitro en un cultivo primario de células de médula ósea de AML. Tal activación puede producirse a concentraciones de diacuerpos de al menos aproximadamente 0,01 ng/ml, al menos aproximadamente 0,02 ng/ml, al menos aproximadamente 0,04 ng/ml, al menos aproximadamente 0,06 ng/ml, al menos aproximadamente 0,08 ng/ml o al menos aproximadamente 0,1 ng/ml, opcionalmente después de la incubación del cultivo primario con diacuerpo durante aproximadamente 72 horas. Tal activación puede medirse mediante la expresión de un marcador de activación de células T tal como CD25. Preferentemente, la activación de una población de células T in vitro en un cultivo primario de células de la médula ósea de AML medida por la expresión de CD25 puede producirse a concentraciones de diacuerpos de aproximadamente 0,01 ng/ml o aproximadamente 0,1 ng/ml después de la incubación del cultivo primario con el diacuerpo durante aproximadamente 72 horas.

Los diacuerpos de la descripción preferentemente pueden agotar las células blásticas leucémicas in vitro en un cultivo primario de células de la médula ósea de ^a M^l a menos del 20 % de la población total de células blásticas leucémicas primarias y al mismo tiempo inducir una expansión de la población de células T in vitro en el cultivo primario de células de médula ósea de AML hasta aproximadamente el 70 % o más de la población máxima de células T que puede expandirse en el ensayo a concentraciones de diacuerpos de al menos aproximadamente 0,01 ng/ml, al menos aproximadamente 0,02 ng/ml, al menos aproximadamente 0,04 ng/ml, al menos aproximadamente 0,06 ng/ml, al menos aproximadamente 0,08 ng/ml o al menos aproximadamente 0,1 ng/ml, opcionalmente después de la incubación del cultivo primario con el diacuerpo durante aproximadamente 120 horas. Preferentemente, las concentraciones de diacuerpo son aproximadamente 0,01 ng/ml o aproximadamente 0,1 ng/ml y el cultivo primario se incuba con el diacuerpo durante aproximadamente 120 horas.

Los diacuerpos de la descripción pueden agotar las células blásticas leucémicas in vitro en un cultivo primario de células de la médula ósea de AML y/o inducir una expansión de una población de células T in vitro en un cultivo primario de células de la médula ósea de AML y/o inducir una activación de una población de células T in vitro en un cultivo primario de células de la médula ósea de AML de la manera descrita anteriormente mediante o de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 8 como se describe en la presente descripción, o por modificación de tal ensayo como lo entenderían aquellos expertos en la técnica, o por otros medios conocidos por los expertos en la técnica.

Para evitar cualquier duda, los diacuerpos de la descripción pueden exhibir uno, dos, tres, más de tres o todos los atributos funcionales descritos en la presente descripción. Por lo tanto, los diacuerpos de la descripción pueden exhibir cualquier combinación de los atributos funcionales descritos en la presente descripción.

Los diacuerpos de la descripción pueden usarse como productos farmacéuticos. Preferentemente, los diacuerpos se usan en el tratamiento de una enfermedad o afección asociada o caracterizada por la expresión de CD123. Se describe el uso de diacuerpos de la descripción en la fabricación de una composición farmacéutica, preferentemente para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada o caracterizada por la expresión de CD123 como se define adicionalmente en la presente descripción.

La enfermedad o afección asociada o caracterizada por la expresión de CD123 puede ser cáncer. Por ejemplo, el cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en: leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), incluida la crisis blástica de CML y el oncogén de Abelson asociado con CML (translocación Bcr-ABL), síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia linfoblástica B aguda (B-ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), incluido el síndrome de Richter o la transformación de CLL de Richter, leucemia de células pilosas (HCL), neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (BPDCN), linfomas no Hodgkin (NHL), incluida la leucemia de células del manto (MCL) y linfoma linfocítico pequeño (SLL), linfoma de Hodgkin, mastocitosis sistémica y linfoma de Burkitt. La enfermedad o afección asociada o caracterizada por la expresión de CD123 puede ser una afección inflamatoria. Por ejemplo, la afección inflamatoria puede seleccionarse del grupo que consiste en: Lupus autoinmunitario (SLE), alergia, asma y artritis reumatoide.

Además, se describe una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los diacuerpos descritos anteriormente y un portador fisiológicamente aceptable.

También se describe el uso de la composición farmacéutica descrita anteriormente en el tratamiento de una enfermedad o afección asociada o caracterizada por la expresión de CD123.

La descripción se dirige particularmente a la descripción de tal uso, en donde la enfermedad o afección asociada con o caracterizada por la expresión de CD123 es cáncer (especialmente un cáncer seleccionado del grupo que consiste en: leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), que incluye crisis blástica de CML y oncogén de Abelson asociado con CML (translocación Bcr-ABL), síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia linfoblástica B aguda (B-ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), incluido el síndrome de Richter o la transformación de Richter de CLL, leucemia de células pilosas (HCL), neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (BPDCN), linfomas no Hodgkin (NHL), incluida la leucemia de células del manto (MCL) y linfoma de linfocitos pequeños (SLL), linfoma de Hodgkin, mastocitosis sistémica y linfoma de Burkitt).

La descripción también se dirige particularmente a la descripción de tal uso, en donde la enfermedad o afección asociada con o caracterizada por la expresión de CD123 es una afección inflamatoria (especialmente una afección inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en: Lupus autoinmunitario (SLE), alergia, asma y artritis reumatoide).

Los términos tal como "aproximadamente" deben entenderse dentro del 10 %, con mayor preferencia dentro del 5 %, del valor especificado, a menos que el contexto requiera lo contrario.

Breve descripción de los dibujos:

La Figura 1 muestra que se sabía que CD123 se expresaba en células madre leucémicas.

La Figura 2 ilustra las estructuras de la primera y segunda cadenas polipeptídicas de un diacuerpo monovalente biespecífico CD123 x CD3 de dos cadenas de la presente descripción.

Las Figuras 3A y 3B ilustran las estructuras de dos versiones de la primera, segunda y tercera cadenas polipeptídicas de un diacuerpo Fc monovalente biespecífico CD123 x CD3 de tres cadenas de la presente descripción (Versión 1, Figura 3A; Versión 2, Figura 3B).

La Figura 4 (Paneles A-E) muestra la capacidad de diferentes diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 de mediar en la destrucción redireccionada por células T de células diana que muestran una cantidad variable de CD123. La Figura proporciona curvas de dosis-respuesta que indican que el diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia ("DART-A") que tiene un dominio de unión a albúmina (DART-A con ABD "c/ABD") exhibió mayor citotoxicidad que un diacuerpo biespecífico de control (DART de control) o un diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 sin optimización de secuencia (“DART-B”) en múltiples tipos de células diana: RS4-11 (Panel A); TF-1 (Panel B); Mohn-13 (Panel C); Kasumi-3 (Panel D); y t Hp-1 (Panel E) en una relación de E:T (efector : objetivo) de 10:1.

La Figura 5 (Paneles A-D) muestra la capacidad del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A), diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia que tiene un dominio de unión a albúmina (DART-A con ABD "c/ABD”) y diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia que tiene un dominio Fc de Inmunoglobulina IgG (DART-A con Fc “c/Fc”) de mediar en la activación de células T durante la destrucción redireccionada de las células diana. La Figura presenta curvas de dosis-respuesta que muestran la citotoxicidad mediada por DART-A, DART-A c/ABD y DART-A c/Fc en células Kasumi-3 (Panel A) y THP-1 (Panel B) y células T CD8 purificadas en una relación de E:T (célula efectora : célula diana) de 10:1 (incubación de 18 horas). Los paneles C y D muestran curvas de respuesta a dosis de la activación de las células T con el uso del marcador CD25 en células T CD8 en presencia (Panel D) y ausencia (Panel C) de células diana. La Figura 6 (Paneles A-B) muestra los niveles de Granzima B y Perforina en células T CD4 y CD8 después del tratamiento con el diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) (Panel A) o un diacuerpo biespecífico de control (DART Control) (Panel B) en presencia de células diana Kasumi-3 y células T en reposo en una relación de E:T de 10:1.

La Figura 7 (Paneles A-B) muestra la actividad antitumoral in vivo del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) a niveles de dosificación de nanogramos por kilogramo. Las células MOLM-13 (expresión intermedia de CD123) se mezclaron conjuntamente con células T y se implantaron por vía subcutánea (T:E 1:1) en ratones NSG. El tratamiento intravenoso fue una vez al día durante 8 días (QDx8) a partir de la implantación. Se compararon varias concentraciones de DART-A con un diacuerpo biespecífico de control (DART de control). El panel A muestra las células Molm-13 solas o con células T, y el efecto de varias dosis de DART-A sobre el volumen tumoral incluso en tiempos superiores a 30 días. El panel B muestra el efecto de dosis crecientes de DART-A sobre el volumen tumoral observado en ratones NSG que recibieron células MOLM-13 y células T (T:E 1:1) durante un período de tiempo de 0-18 días.

La Figura 8 muestra la actividad antitumoral in vivo del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) en células RS4-11 (ALL con características monocíticas). Las células se mezclaron conjuntamente con células T y se implantaron por vía subcutánea (T:E 1:1) en ratones NSG. El tratamiento intravenoso fue una vez al día durante 4 días (QDx4) a partir de la implantación. Se compararon diversas concentraciones de DART-A con un diacuerpo biespecífico de control (DART de control).

La Figura 9 (Paneles A-B) muestra blastos CD123+ en mononucleocitos de médula ósea (BM MNC) y mononucleocitos de sangre periférica (PBMC) del paciente 1 con AML (Panel A) en comparación con la línea celular Kasumi-3 de AML (Panel B).

La Figura 10 (Paneles A-C) muestra la capacidad del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) de mediar en la reducción de blastos en la AML primaria a las 120 h (Panel A), impulsar la expansión de células T en la AML primaria a las 120 h (Panel B) e inducir la activación de células T en AML a las 48 h y 72 h (Panel C).

La Figura 11 (Paneles A-H) muestra la identificación de la población de blastos CD123+ en una muestra primaria de PBMC de ALL. Los paneles A y E muestran la dispersión frontal y lateral de la población de entrada de PBMC normales (Panel A) y PBMC de ALL (Panel E). Los paneles B y F muestran la identificación de la población de linfocitos como principalmente células B (Panel B) y células blásticas leucémicas (Panel F). Los paneles C y G muestran la identificación de la población de linfocitos que son CD123+. Los paneles D y H muestran la identificación de células CD 19+ y células CD123+.

La Figura 12 (Paneles A-B) muestra la identificación de las poblaciones CD4 y CD8 de células T en una muestra primaria de PBMC de ALL. El panel A muestra la dispersión frontal y lateral de las PBMC de ALL de entrada. El panel B muestra las poblaciones CD4 o CD8 de células T presentes en las muestras. Los números indican que las células T CD4 representan aproximadamente el 0,5 % de células totales y las células T CD8 representan aproximadamente el 0,4 % de células totales presentes en la muestra de PBMC de ALL.

La Figura 13 (Paneles A-H) muestra la capacidad del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) de mediar en el agotamiento de blastos de ALL con CTL autólogo. Los paneles A y E muestran la dispersión frontal y lateral de la población de entrada de PBMC normales (Panel A) y PBMC de ALL (Panel E). Las PBMC no se trataron (Paneles B y F), se trataron con un diacuerpo biespecífico de control (DART de control) (Paneles C y G) o se trataron con DART-A (Paneles D y H) y se incubaron durante 7 días seguido de tinción para CD34 y CD 19.

La Figura 14 (Paneles A-L) muestra la capacidad del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) de mediar en la expansión de células T (Paneles A, B, C, G, H e I) y la activación (Paneles D, E, F, J, K y L) en PBMC normales (Paneles A-F) y PBMC de A^lL (Paneles G-L). Las células no se trataron (Paneles A, D, G y J) o se trataron con un diacuerpo biespecífico de control (DART de control) (Paneles B, E, H y K) o DART-A (Paneles C, F, I y L) durante 7 días.

La Figura 15 (Paneles A-C) muestra la identificación de la población de blastos de AML y células T en una muestra primaria de AML. El panel A muestra la dispersión frontal y lateral de las PBMC de AML de entrada. El panel B muestra la identificación de la población de blastos de AML en la muestra de AML. El panel C muestra la identificación de la población de células T en la muestra de AML.

La Figura 16 (Paneles A-C) muestra la capacidad del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) de mediar en el agotamiento de blastos de AML con CTL autólogo y expansión de células T. Las PBMC de AML primarias del paciente 2 se incubaron con PBS, un diacuerpo biespecífico de control (DART Control) o DART-A durante 144 h. Se contaron las células blásticas (Panel A), las células T CD4 (Panel B) y las células T CD8 (Panel C).

La Figura 17 (Paneles A-D) muestra la capacidad del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) de mediar en la activación de células T en AML. Se determinó la expresión de CD25 (Panel A) y Ki-67 (Panel B) para las células T CD4 y CD8 del paciente 2 con AML después de la incubación con un diacuerpo biespecífico de control (DART Control) o DART-A con PBMC autólogas. Se determinó el nivel de perforina (Panel C) y granzima B (Panel D) para las células T CD4 y CD8 del paciente 2 con AML después de la incubación con DART Control o DART-A con PBMC autólogas.

La Figura 18 (Paneles A-D) muestra que el diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) puede reaccionar de forma cruzada con proteínas CD123 y CD3 tanto humanas como de primates. Los paneles muestran los gráficos del sensograma BIACORE™ de los resultados de los análisis realizados para evaluar la capacidad de DART-A de unirse a proteínas humanas (Paneles A y C) y de primates no humanos (Paneles B y D) CD3 (Paneles A y B) y CD123 (Paneles C y D). Se proporcionan los valores de KD.

La Figura 19 (Paneles A-B) muestra la capacidad del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) de mediar en el agotamiento de monocitos autólogos in vitro con PBMC humanas y de macaco cangrejero. Los paneles presentan los resultados de las curvas de respuesta a la dosis de citotoxicidad mediada por DART-A con PBMC humanas primarias (Panel A) o PBMC de macaco cangrejero (Panel B).

La Figura 20 (Paneles A-N) muestra la capacidad del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) de mediar en el agotamiento de pDC en macacos cangrejeros sin inducción sistémica de citocinas. Los paneles A-D muestran los resultados de control obtenidos a las 4 horas y 4 días con el vehículo y el portador. Los paneles E-H muestran los resultados de control obtenidos a las 4 h y 4 días con un diacuerpo biespecífico de control (DART Control). Los paneles I-N muestran los resultados obtenidos a las 4 horas y 4 días a 10 ng/kg/día y a los 4 días con 30 ng/kg/día de DART-A.

La Figura 21 (Paneles A-D) muestra la capacidad del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) de mediar en el agotamiento dependiente de la dosis de pDC en macacos cangrejeros. A los macacos cangrejeros se les administró DART-A a 0,1, 1, 10, 30, 100, 300 o 1000 ng/kg. Las PBMC se evaluaron en el momento indicado y se contaron las células B totales (Panel A), los monocitos (Panel B), las células NK (Panel C) y las pDC (Panel D).

La Figura 22 (Paneles A-D) muestra la capacidad del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) de modular intermitentemente las células T en macacos cangrejeros. A los macacos cangrejeros se les administró DART-A a 0,1, 1, 10, 30, 100, 300 o 1000 ng/kg. Se evaluaron las PBMC en el momento indicado y se contaron las células T totales (Panel A), las células T CD4 (Panel B), las células CD69 (Panel C) y las células T CD8 (Panel D).

La Figura 23 muestra el análisis SDS-PAGE de la proteína DART-A purificada en condiciones reductoras (izquierda) y no reductoras (derecha).

Las Figuras 24A-24B muestran la caracterización fisicoquímica de DART-A purificado. Figura 24A: perfil SEC de la proteína DART-A en una columna TSK G3000SWxL calibrada. Figura 24B: espectro de masas de la proteína DART-A.

Las Figuras 25A-25D muestran el análisis SPR de la unión de DART-A a CD123 y CD3 inmovilizados humanos o de macaco cangrejero. Las líneas discontinuas representan el ajuste global a un modelo de Langmuir 1:1 de las curvas de unión experimentales obtenidas a concentraciones de DART-A de 0, 6,25, 12,5, 25, 50 o 100nM (líneas continuas). Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Las Figuras 26A-26E muestran que DART-A podía unirse simultáneamente tanto a CD3 como a CD123. Las Figuras 26A-26B proporcionan los resultados de un ELISA bifuncional y demuestran el acoplamiento simultáneo de ambos antígenos diana de DART-A. Las placas de ELISA se recubrieron con CD123 humano (Figura 26A) o CD123 de macaco cangrejero (Figura 26B). La titulación de DART-A y las concentraciones de DART de control fueron seguidas por la detección con CD3 humano-biotina. Las Figuras 26C-26E demuestran la unión a la superficie celular de DART-A en células diana Mohn-13 CD123+ (Figura 26C), células T humanas (Figura 26D) y células T de macaco cangrejero (Figura 26E). La unión se detectó mediante análisis FACS con el uso de un anticuerpo monoclonal específico para la región en espiral E y en espiral K de la molécula DART-A o DART de control.

Las Figuras 27A-27H muestran la capacidad de DART-A de mediar en la destrucción redireccionada de células diana por células efectoras humanas o de macaco cangrejero contra líneas celulares leucémicas Kasumi-3 CD123+, demuestran la capacidad de las moléculas de unirse a subconjuntos de leucocitos circulantes normales, incluidos pDC y monocitos y demuestran la capacidad de las moléculas de agotar células CD14 CD123high (pDC y basófilos) sin afectar a los monocitos (células CD14+). La Figura 27A muestra los sitios de unión relativos anti-CD123-PE en las líneas celulares leucémicas U937 y Kasumi-3 según se determina mediante análisis QFACS. La Figura 27B muestra el porcentaje de citotoxicidad relativamente bajo mediado por DART-A o DART de control en una línea celular de AML (células U937) que, como se muestra en la Figura 27A, tienen relativamente pocos sitios de unión a CD123). La Figura 27C muestra el porcentaje de citotoxicidad mediada por DART-A o DART de control en presencia de células T humanas purificadas (como células efectoras) en una línea celular de AML (células Kasumi-3) que, como se muestra en la Figura 27A, tienen un número sustancial de sitios de unión de CD123. En las Figuras 27B-27C, la relación de E:T es 10:1. La Figura 27D muestra el porcentaje de citotoxicidad mediada por DART-A o DART de control en presencia de PBMC purificadas de macaco cangrejero (como células efectoras) en células Kasumi-3 (la relación de E:T es 15:1) y demuestra que DART-A puede unirse a las células T de macaco cangrejero. La Figura 27E muestra los sitios de unión anti-CD123-PE relativos en células Kasumi-3, monocitos humanos, células dendríticas plasmocitoides humanas ("pDC"), monocitos de macaco cangrejero y células dendríticas plasmocitoides de macaco cangrejero según se determina mediante análisis QFACS. La Figura 27F muestra la capacidad de DART-A de agotar las células CD14 CD123lD. La Figura 27G muestra la capacidad de DART-A de agotar las células CD 14 CD123Hi humanas. La Figura 27H muestra la capacidad de DART-A de agotar las células CDI4 CD123Hi de macaco cangrejero. La citotoxicidad se determinó mediante la liberación de LDH, con valores de CE50 determinados con el uso del software GraphPad PRISM®.

La Figura 28 muestra el uso de un modelo de dos compartimentos para estimar los parámetros farmacocinéticos de DART-A. Los datos muestran las concentraciones séricas al final de infusión (EOI) de DART-A en macacos cangrejeros después de recibir una infusión a dosis de 96 horas a 100 ng/kg/día, 300 ng/kg/día, 600 ng/kg/día y 1000 ng/kg/día. Cada punto representa un animal individual; las líneas horizontales representan el valor medio para el grupo de dosis.

Las Figuras 29A-29C muestran el efecto de las infusiones de DART-A sobre la producción de la citoquina IL-6. Los niveles de IL-6 en suero (media ± SEM) en monos infundidos con DART-A se muestran por grupo de tratamiento. Los macacos cangrejeros se trataron con control de vehículo el Día 1, seguido de 4 infusiones semanales ya sea de vehículo (Grupo 1) (Figura 29A) o DART-A administrado como infusiones semanales de 4 días a partir de los días 8, 15, 22 y 29 (Grupos 2-5) (Figura 29B) o como una infusión de 7 días/semana durante 4 semanas a partir del Día 8 (Grupo 6) (Figura 29C). Los intervalos de tratamiento están indicados por las barras grises rellenas.

Las Figuras 30A-30F muestran el efecto de las infusiones de DART-A sobre el agotamiento de las células CD14-/CD123+ (Figuras 30A-30C) y células CD303+ (Figuras 30D-30F). Se muestra la media ± SEM de los niveles circulantes de CD14-/CD123+ (Figuras 30A-30C) o CD303+ (Figuras 30D-30F) por día de estudio y por grupo. Los macacos cangrejeros se trataron con control de vehículo el Día 1, seguido de 4 infusiones semanales ya sea de vehículo (Grupo 1) (Figuras 30A y 30D) o DART-A administrado como infusiones semanales de 4 días a partir de los Días 8, 15, 22 y 29 (Grupos 2-5) (Figuras 30A y 30E) o como una infusión de 7 días/semana durante 4 semanas comenzando el Día 8 (Grupo 6) (Figuras 30C y 30F). Los intervalos de tratamiento están indicados por las barras grises rellenas.

Las Figuras 31A-31I muestran los cambios observados en las poblaciones de células T (Figuras 31A-31C), las poblaciones de células CD4+ (Figuras 31D-31F) y las poblaciones de células CD8+ (Figuras 31G-31I) que reciben DART-A administrado como infusiones de 4 días a partir de los Días 8, 15, 22 y 29. Leyenda: CD25+ (cuadrados grises); CD69+ (triángulos grises), PD-1+ (triángulos blancos); Tim-3+ (cuadrados blancos). Las células T se enumeraron a través de los marcadores CD4 y CD8, en lugar del CD3 canónico, para eliminar la posible interferencia del DART-A. Los macacos cangrejeros se trataron con control de vehículo el Día 1, seguido de 4 infusiones semanales ya sea de vehículo (Grupo 1) o DART-A administrado como infusiones semanales de 4 días a partir de los Días 8, 15, 22 y 29 (Grupo 5) o como una infusión de 7 días/semana durante 4 semanas a partir del Día 8 (Grupo 6). Los intervalos de tratamiento están indicados por las barras grises rellenas. Se muestra la media ± SEM del número absoluto de linfocitos T circulantes totales por día de estudio y grupo (Figuras 31A-31C). Se muestran los valores relativos (porcentaje medio ± SEM) de CD25+, CD69+, PD-1+ y Tim-3+ de células T CD4 (Figuras 31D-31E) o CD8 (Figuras 31F-31H) por día de estudio y por grupo.

Las Figuras 32A-32F muestran los cambios observados en las poblaciones de células T CD4+ (Figuras 32A-32C) y las poblaciones de células CD8+ (Figuras 32D-32F) durante y después de una infusión continua de 7 días de DART-A. Se muestra el porcentaje medio ± SEM de CD25+, CD69+, PD-1+ y Tim-3+ en células T CD4 (Figuras 32A-32C) o CD8 (Figuras 32D-32F) por día de estudio para los Grupos 2, 3 y 4. Los intervalos de tratamiento están indicados por las barras grises rellenas. Leyenda: CD25+ (cuadrados grises); CD69+ (triángulos grises), PD-1+ (triángulos blancos); Tim-3+ (cuadrados blancos).

Las Figuras 33A-33F muestran los cambios observados en las poblaciones de células T CD4+ (Figuras 33A-33C) y las poblaciones de células CD8+ (Figuras 33D-33F) durante y después de una infusión continua de 7 días de DART-A. Se muestra el porcentaje medio ± SEM de células T C^d4+ no tratadas (CD95-/CD28+), CMT (CD95+/CD28+) y EMT (CD95+/CD28-) en la población CD4+ (Figuras 33A-33C) o población CD8 (Figuras 33D-33F) por día de estudio para los Grupos 2, 3 y 4. Los macacos cangrejeros se trataron con control de vehículo el Día 1, seguido de 4 infusiones semanales de DART-A administrado como infusiones semanales de 4 días a partir de los Días 8, 15, 22 y 29 (Grupos 2-4). Los intervalos de tratamiento están indicados por las barras grises rellenas. Leyenda: No tratadas (triángulos blancos); CMT (triángulos negros), EMT (cuadrados grises).

La Figura 34 muestra la citotoxicidad mediada por DART-A contra células Kasumi-3 con PBMC de monos no tratados o de monos tratados con múltiples infusiones de DART-A.

Las Figuras 35A-35F muestran que la exposición a DART-A aumentó la frecuencia relativa de células CD4 de memoria central y células CD8+ de memoria efectora a expensas de la correspondiente población de células T no tratadas. El porcentaje medio ± SEM de células T CD4+ no tratadas (CD95-/CD28+), CMT (CD95+/CD28+) y EMT (CD95+/CD28-) en la población CD4+ (Figuras 35A-35C) o en la población CD8+ (Figuras 35D-35F) por día de estudio y por grupo. Los macacos cangrejeros se trataron con control de vehículo el Día 1, seguido de 4 infusiones semanales ya sea de vehículo (Grupo 1) o DART-A administrado como infusiones semanales de 4 días a partir de los Días 8, 15, 22 y 29 (Grupo 5) o como una infusión de 7 días/semana durante 4 semanas a partir del Día 8 (Grupo 6). Los intervalos de tratamiento están indicados por las barras grises rellenas. Leyenda: No tratadas (triángulos blancos); CMT (triángulos negros), EMT (cuadrados grises).

Las Figuras 36A-36F muestran el efecto de DART-A sobre los parámetros de los glóbulos rojos en monos que habían recibido infusiones de las moléculas. Se muestran los niveles de RBC circulantes (Figuras 36A-36C) o reticulocitos (Figuras 36D-36F) (media ± SEM) en muestras recolectadas en los puntos de tiempo indicados de monos tratados con DART-A.

Las Figuras 37A-37B muestran que la frecuencia (porcentaje medio ± SEM) de células CD123+ (Figura 37A) o HSC (células CD34+/CD38-/CD45-/CD90+) (Figura 37B) dentro de la población de células Lin- en muestras de médula ósea recolectadas en los puntos de tiempo indicados de monos tratados con DART-A. Los macacos cangrejeros se trataron con control de vehículo el Día 1, seguido de 4 infusiones semanales ya sea de vehículo (Grupo 1) o DART-A administrado como infusiones semanales de 4 días a partir de los Días 8, 15, 22 y 29 (Grupos 2-5) o como una infusión de 7 días/semana durante 4 semanas a partir del Día 8 (Grupo 6).

Descripción detallada de la descripción:

Se describen diacuerpos monovalentes biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia que pueden unirse simultáneamente a CD123 y CD3, y a los usos de tales moléculas en el tratamiento de enfermedades malignas hematológicas. Aunque los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 sin optimización son completamente funcionales, análogos a las mejoras obtenidas en la expresión génica a través de la optimización de codones (ver, por ejemplo, Grosjean, H. y otros, (1982) "Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon-Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes'' Gene 18(3): 199­ 209), es posible mejorar aún más la estabilidad y/o función de los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 al modificar o refinar sus secuencias.

Los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 preferidos de la presente descripción están compuestos de al menos dos cadenas polipeptídicas que se asocian entre sí para formar un sitio de unión específico para un epítopo de CD123 y un sitio de unión específico para un epítopo de CD3 (Figura 2). Las cadenas polipeptídicas individuales del diacuerpo se unen covalentemente entre sí, por ejemplo mediante enlaces disulfuro de residuos de cisteína ubicados dentro de cada cadena polipeptídica. Cada cadena polipeptídica contiene un dominio de unión a antígeno de un dominio variable de cadena ligera, un dominio de unión a antígeno de un dominio variable de cadena pesada y un dominio de heterodimerización. Un péptido enlazador intermedio (Enlazador 1) separa el dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena ligera del dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena pesada. El dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena ligera de la primera cadena polipeptídica interactúa con el dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena pesada de la segunda cadena polipeptídica para formar un primer sitio de unión a antígeno funcional que es específico para el primer antígeno (es decir, CD123 o CD3). Asimismo, el dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena ligera de la segunda cadena polipeptídica interactúa con el dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena pesada de la primera cadena polipeptídica para formar un segundo sitio de unión al antígeno funcional que es específico para el segundo antígeno (es decir, CD123 o CD3, dependiendo de la identidad del primer antígeno). Por lo tanto, la selección del dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena ligera y el dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena pesada de la primera y segunda cadenas polipeptídicas están coordinadas, de manera que las dos cadenas polipeptídicas comprenden en conjunto dominios de unión a antígeno de dominios variables de cadena ligera y pesada que pueden unirse a CD123 y CD3.

La formación de heterodímeros de la primera y segunda cadenas polipeptídicas puede ser impulsada por los dominios de heterodimerización. Tales dominios incluyen GVEPKSC (S^eQ ID NO:50) (o VEPKSC; SEQ ID NO:51) en una cadena polipeptídica y GFNRGEC (SEQ iD NO:52) (o FNRGEC; SEQ ID NO:53) en la otra cadena polipeptídica (US2007/0004909). Alternativamente, tales dominios pueden diseñarse para que tengan espirales de cargas opuestas. El dominio de heterodimerización de una de las cadenas polipeptídicas comprende una secuencia de al menos seis, al menos siete o al menos ocho aminoácidos cargados positivamente, y el dominio de heterodimerización de la otra de las cadenas polipeptídicas comprende una secuencia de al menos seis, al menos siete o al menos ocho aminoácidos cargados negativamente. Por ejemplo, el primer o el segundo dominio de heterodimerización comprenderá preferentemente una secuencia de ocho aminoácidos cargados positivamente y el otro de los dominios de heterodimerización comprenderá preferentemente una secuencia de ocho aminoácidos cargados negativamente. El aminoácido cargado positivamente puede ser lisina, arginina, histidina y/o el aminoácido cargado negativamente puede ser ácido glutámico o ácido aspártico. El aminoácido cargado positivamente es preferentemente lisina y/o el aminoácido cargado negativamente es preferentemente ácido glutámico.

Los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 de la presente descripción están diseñados de manera que tales primera y segunda cadenas polipeptídicas se unen covalentemente entre sí mediante residuos de cisteína a lo largo de su longitud. Tales residuos de cisteína pueden introducirse en el enlazador intermedio que separa los dominios VL y VH de los polipéptidos. Alternativamente, y con mayor preferencia, se introduce un segundo péptido (Enlazador 2) en cada cadena polipeptídica, por ejemplo, en el extremo amino-terminal de las cadenas polipeptídicas o una posición que coloca al Enlazador 2 entre el dominio de heterodimerización y el dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena ligera o dominio variable de cadena pesada.

En descripciones particulares, los diacuerpos monovalentes biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia de la presente descripción tienen además un dominio Fc de inmunoglobulina o un dominio de unión a albúmina para extender la vida media in vivo.

Los diacuerpos monovalentes biespecíficos CD123 x CD3 de la presente descripción que comprenden un dominio Fc de inmunoglobulina (es decir, diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos CD123 x CD3) están compuestos por una primera cadena polipeptídica, una segunda cadena polipeptídica y una tercera cadena polipeptídica. La primera y segunda cadenas polipeptídicas se asocian entre sí para formar un sitio de unión específico para un epítopo de CD123 y un sitio de unión específico para un epítopo de CD3. La primera cadena polipeptídica y la tercera cadena polipeptídica se asocian entre sí para formar un dominio Fc de inmunoglobulina (Figura 3A y Figura 3B). La primera y segunda cadenas polipeptídicas del diacuerpo Fc monovalente biespecífico se unen covalentemente entre sí, por ejemplo mediante enlaces disulfuro de residuos de cisteína ubicados dentro de cada cadena polipeptídica.

La primera y tercera cadenas polipeptídicas se unen covalentemente entre sí, por ejemplo mediante enlaces disulfuro de residuos de cisteína ubicados dentro de cada cadena polipeptídica. La primera y segunda cadenas polipeptídicas contienen cada una un dominio de unión a antígeno de un dominio variable de cadena pesada, un dominio de unión a antígeno de un dominio variable de cadena pesada y un dominio de heterodimerización. Un péptido enlazador intermedio (Enlazador 1) separa el dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena ligera del dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena pesada. El dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena ligera de la primera cadena polipeptídica interactúa con el dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena pesada de la segunda cadena polipeptídica para formar un primer sitio de unión a antígeno funcional que es específico para el primer antígeno (es decir, CD123 o CD3). Asimismo, el dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena ligera de la segunda cadena polipeptídica interactúa con el dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena pesada de la primera cadena polipeptídica para formar un segundo sitio de unión al antígeno funcional que es específico para el segundo antígeno (es decir, CD3 o CD123, dependiendo de la identidad del primer antígeno). Por lo tanto, la selección del dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena ligera y el dominio de unión a antígeno del dominio variable de cadena pesada de la primera y segunda cadenas polipeptídicas están coordinadas, de manera que las dos cadenas polipeptídicas comprenden en conjunto dominios de unión a antígeno de dominios variables de cadena ligera y pesada que pueden unirse a CD123 y CD3. La primera y tercera cadenas polipeptídicas contienen cada una parte o la totalidad del Dominio CH2 y/o parte o la totalidad del Dominio CH3 de un dominio Fc de inmunoglobulina completo y un péptido que contiene cisteína. Algunos o todos los Dominios CH2 y/o algunos o todos los Dominios CH3 se asocian para formar el dominio Fc de inmunoglobulina de los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos de la presente descripción. La primera y tercera cadenas polipeptídicas de los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos de la presente descripción se unen covalentemente entre sí, por ejemplo mediante enlaces disulfuro de residuos de cisteína ubicados dentro del péptido que contiene cisteína de las cadenas polipeptídicas.

I. El diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia, “DART-A”

Se describe un diacuerpo biespecífico con optimización de secuencia que puede unirse simultáneamente y específicamente a un epítopo de CD123 y a un epítopo de CD3 (un diacuerpo biespecífico “CD123 x CD3” o DART-A). Como se analiza a continuación, se descubrió que DART-A exhibe una actividad funcional mejorada en relación con otros diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 sin optimización de secuencia de composición similar y, por lo tanto, se denomina un diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con “optimización de secuencia”.

El diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica. La primera cadena polipeptídica del diacuerpo biespecífico comprenderá, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un extremo N-terminal, un dominio variable de cadena ligera (Dominio VL) de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VL^cd3), un péptido enlazador intermedio (Enlazador 1), un dominio variable de cadena pesada (Dominio VH) de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VHCD¹²³), y un extremo C-terminal. Una secuencia preferida para un tal dominio VL^cd3 es la SEQ ID NO:21:

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGG

TNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWY SNLWVFGGGT

KLTVLG

El dominio de unión a antígeno de VLcd³ comprende CDR1 SEQ ID NO:38: RSSTGAVTTSNYAN, CDR2 SEQ ID NO:39: GTNKRAP y CDR3 SEQ ID NO:40: ALWYSNLWV.

Una secuencia preferida para tal enlazador 1 es la SEQ ID NO:29: GGGSGGGG. Una secuencia preferida para un Dominio VHcd¹²³ tal es la SEQ ID NO:26:

EVQLVQSGAE LKKPGASVKVS CKASGYTFT DYYMKWVRQAPGQGLEWIGD11

PSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRA

SWFAYWGQGTLVTVSS

El dominio de unión a antígeno de VH^cDⁱ23 comprende CDR1 SEQ ID NO:47: DYYMK, CDR2 SEQ ID NO:48: DIIPSNGATFYNQKFKG y CDR3 SEQ ID NO:49: SHLLRAS.

La segunda cadena polipeptídica comprenderá, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un extremo N-terminal, un dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VLCD¹²³), un péptido enlazador intermedio (por ejemplo, Enlazador 1), un dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VHcd³), y un extremo C-terminal. Una secuencia preferida para un Dominio VLCD¹²³tal es la SEQ ID NO:25:

DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKL

LIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTF

GQGTKLEIK

El dominio de unión a antígeno de VLcd¹²³ comprende CDR1 SEQ ID NO:44: KSSQSLLNSGNQKNYLT, CDR2 SEQ ID NO:45: WASTRES y CDR3 SEQ ID NO:46: QNDYSYPYT.

Una secuencia preferida para un Dominio VH^cd3 tal es la SEQ ID NO:22:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIR

SKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQHNSLKTEDTAVYYCVRHGNF

GNSYV SWFAYWGQGTLVTVSS

El dominio de unión a antígeno de VHcd³ comprende CDR1 SEQ ID NO:41: TYAMN, CDR2 SEQ ID NO:42: RIRSKYNNYATYYADSVKD, y CDR3 SEQ ID NO:43: HGNFGNSYVSWFAY.

Los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia, descritos en la presente descripción, se modifican de manera que tales primer y segundo polipéptidos se unan covalentemente entre sí mediante residuos de cisteína a lo largo de su longitud. Tales residuos de cisteína pueden introducirse en el enlazador intermedio (por ejemplo, Enlazador 1) que separa los dominios VL y VH de los polipéptidos. Alternativamente, y con mayor preferencia, se introduce un segundo péptido (Enlazador 2) en cada cadena polipeptídica, por ejemplo, en una posición N-terminal al dominio VL o C-terminal al dominio VH de tal cadena polipeptídica. Una secuencia preferida para tal Enlazador 2 es la SEQ ID NO:30: GGCGGG.

La formación de heterodímeros puede impulsarse mediante la modificación adicional de tales cadenas polipeptídicas para que contengan espirales polipeptídicas de carga opuesta. Por lo tanto, en una descripción preferida, una de las cadenas polipeptídicas se modificará para que contenga un dominio "en espiral E" (SEQ ID NO:34: EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK) cuyos residuos formarán una carga negativa a pH 7, mientras que la otra de las dos cadenas polipeptídicas se modificará para que contenga un dominio "en espiral K" (SEQ ID NO:35: KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE) cuyos residuos formarán una carga positiva a pH 7. La presencia de tales dominios cargados promueve la asociación entre el primer y segundo polipéptidos y, por lo tanto, fomenta la heterodimerización.

Es indiferente qué espiral se proporciona a la primera o segunda cadenas polipeptídicas. Sin embargo, un diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia preferido, descrito en la presente descripción, ("DART-A") tiene una primera cadena polipeptídica que tiene la secuencia (SEQ ID NO:1):

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGG

TNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGT

KLTVLGGGGSGGGGEVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVR

QAPGQGLEWIGDIIP SNGATFYNQKFKGRVTITVDKS T STAYMELS SLRSE D

TAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGILVTVS SGGCGGGEVAALEKEVAALEKEV

AALEKEVAALEK

La cadena 1 de DART-A está compuesta por: SEQ ID NO:21 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:26 - SEQ ID NO:30 -SEQ ID NO:34. Un polinucleótido que codifica la cadena 1 de DART-A es la SEQ ID NO:2:

caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactg tgaccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgc caattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggt acaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgg gcggaaaggccgctctgactattaccggggcacaggcccaggacgaagccga ttactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcaca

aaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggcggaggcgaggtgcagc tggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtc ttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcagg caggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacg gggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtgga caaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagat acagccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttg cttattggggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcgg tggagaagtggccgcactggagaaagagqttgctgctttggagaaggaggtc gctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaa

La segunda cadena polipeptídica de DART-A tiene la secuencia (SEQ ID NO:3):

DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKL

LIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTF

GQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMN

WVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNS

LKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEK

VAALKEKVAALKEKVAALKE

La cadena 2 de DART-A está compuesta por: SEQ ID NO:25 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:22 - SEQ ID NO:30 -SEQ ID NO:35. Un polinucleótido que codifica la cadena 2 de DART-A es la SEQ ID NO:4:

gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagc gggtgactatgtcttqcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatca gaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactg ctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcg gcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccga ggacgtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttc ggccaggggaccaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcg aggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccct qaqactctcctgtgcaqcctctggattcaccttcagcacatacqctatgaat tgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatcaggt ccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagatt cacéatetcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagc ctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcg gcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgac tgtgtcttccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaa gttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccc tgaaagag

Como se analiza a continuación, se descubrió que el diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) tiene la capacidad de unirse simultáneamente a CD123 y CD3 según lo dispuesto por células humanas y de mono. Se descubrió que la provisión de DART-A provoca la activación de células T, media en la reducción de blastocitos, impulsa la expansión de células T, induce la activación de células T y provoca la destrucción redireccionada de células cancerosas diana.

II. Comparativo de diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 sin optimización de secuencia, “DART-B”

DART-B es un diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 sin optimización de secuencia que tiene una estructura general similar a la de DART-A. La primera cadena polipeptídica de DART-B comprenderá, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un extremo N-terminal, un dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VL^cd3), un péptido enlazador intermedio (Enlazador 1), un dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VH^cd-¹²³), un Enlazador 2 intermedio, un Dominio en espiral E y un extremo C-terminal. El dominio VLcd³ de la primera cadena polipeptídica de DART-B tiene la secuencia (SEQ ID NO:23):

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSK

VASGVPYRFSGSG5GT SYSLTISSMEAEDAATYYCQQWS SNPLTFGAGTKLE

LK

El dominio VHcd¹²³ de la primera cadena polipeptídica de DART-B tiene la secuencia (SEQ ID NO:28):

QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDII

PSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRA

SWFAYWGQGTLVTVSS

Por lo tanto, la cadena 1 de DART-B está compuesta por: SEQ ID NO:23 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:28 - SEQ ID NO:30 - SEQ ID NO:34. La secuencia de la primera cadena polipeptídica de DART-B es (SEQ ID NO:5):

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSK

VASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLE

LKGGGSGGGGQVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPG

QGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVY

YCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALE

KEVAALEK

Un polinucleótido que codifica la cadena 1 de DART-B es la SEQ ID NO:6:

gacattcagctgacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaga aggtcaccatgacctgcagagccagttcaagtgtaagttacatgaactggta ccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaa gtggcttctggagtcccttatcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcat actctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactg ccaacagtggaqtagtaacccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggag

ctgaaaggaggcggatccggcggcggaggccaggtgcagctggtgcagtccg gggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtcttgcaaagccag tggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcaggcaggctccagga cagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacggggccactttct acaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtggacaaatcaacaag cactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagatacagccgtgtac tattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttgcttattggggac agggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggc cgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaa aaggaggtcgcagccctggagaaa

La segunda cadena polipeptídica de DART-B comprenderá, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un extremo N-terminal, un dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VLcdi²³), un péptido enlazador intermedio (Enlazador 1) y un dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VH^cd3), un Enlazador intermedio 2, un Dominio en espiral K y un extremo C-terminal.

El Dominio VL^cdi23 de la segunda cadena polipeptídica de DART-B tiene la secuencia (SEQ ID NO:27):

DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKL

LIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTF

GQGTKLEIK

El Dominio VH^cd3 de la segunda cadena polipeptídica de DART-B tiene la secuencia (SEQ ID NO:24):

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYIN

PSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHY

CLDYWGQGTTLTVSS

Por lo tanto, la cadena 2 de DART-B está compuesta por: SEQ ID NO:27 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:24 - SEQ ID NO:30 - SEQ ID NO:35. La secuencia de la segunda cadena polipeptídica de DART-B es (SEQ ID NO:7):

DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKL LIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTF GQGTKLEIKGGGSGGGGDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMH WVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLT SEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKE KVAALKEKVAALKE

Un polinucleótido que codifica la cadena 2 de DART-B es la SEQ ID NO:8:

gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagc gggtgactatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatca

gaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactg ctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcg gcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccga ggacgtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttc ggccaggggaccaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcg atatcaaactgcagcagtcaggggctgaactggcaagacctggggcctcagt gaagatgtcctgcaagacttctggctacacctttactacgtacacgatgcac tgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatc ctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacatt gactacagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgaca tctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatattatgatgatcattact gccttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctccggaggatg tggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagag aaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

III. Variantes modificadas del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A)

A. Diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia que tiene un dominio de unión a albúmina (DART-A con ABD "c/ABD")

Además, se describe el diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) comprenderá uno o más dominios de unión a albúmina (“ABD”) (DART-A con ABD “c/ABD”) en uno o ambos de las cadenas polipeptídicas del diacuerpo.

Como se describe en el documento WO 2012/018687, para mejorar las propiedades farmacocinéticas in vivo de los diacuerpos, los diacuerpos pueden modificarse para que contengan una porción polipeptídica de una proteína de unión a suero en uno o más de los extremos del diacuerpo. Con la máxima preferencia, tal porción polipeptídica de una proteína de unión a suero se instalará en el extremo C-terminal del diacuerpo. Una porción polipeptídica particularmente preferida de una proteína de unión a suero para este propósito es el dominio de unión a albúmina (ABD) de la proteína estreptocócica G. Se prefiere particularmente el dominio de unión a albúmina 3 (ABD3) de la proteína G de la cepa G148 de Streptococcus.

El dominio de unión a albúmina 3 (ABD3) de la proteína G de la cepa G148 de Streptococcus consiste en 46 residuos de aminoácidos que forman un paquete estable de tres hélices y tiene una amplia especificidad de unión a albúmina (Johansson, M.U. y otros, (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). La albúmina es la proteína más abundante en el plasma y tiene una vida media de 19 días en seres humanos. La albúmina posee varios sitios de unión a moléculas pequeñas que le permiten unirse de manera no covalente a otras proteínas y, por lo tanto, extender su vida media en suero.

Por lo tanto, la primera cadena polipeptídica de un diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia tal que tiene un dominio de unión a albúmina contiene un tercer enlazador (Enlazador 3), que separa la espiral E (o espiral K) de tal cadena polipeptídica del dominio de unión a albúmina. Una secuencia preferida para tal Enlazador 3 es la SEQ ID NO:31: g Gg S. Un dominio de unión a albúmina (ABD) preferido tiene la secuencia (SEQ ID NO:36): LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP.

Por lo tanto, una primera cadena preferida de un diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia que tiene un dominio de unión a albúmina tiene la secuencia (SEQ ID NO:9):

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRS STGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGG

TNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFG3GT

KLTVLGGGGSGGGGEVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVR

QAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKS TSTAYMELS SLRSED

TAVYYCARSHLLPASWFAYWGQGTLVTVS SGGCGGGEVAALEKEVAALEKEV

AALEKEVAALEKGGGSLAEAKVLANRELDKYGVSDYYKKLIDNAKSAEGVKA

LIDEILAALP

Un diacuerpo CD123 x CD3 con optimización de secuencia que tiene un dominio de unión a albúmina está compuesta por: SEQ ID NO:21 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:26 - SEQ ID NO:30 - SEQ ID NO:34 - SEQ ID NO:31 -SEQ ID NO:36. Un polinucleótido que codifica un diacuerpo CD123 x CD3 con optimización de secuencia que tiene un derivado del dominio de unión a albúmina es la SEQ ID NO:10:

caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactg tgaccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgc caattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaagggccctgatcgggggt acaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgg gcggaaaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccga ttactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcaca aaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggcggaggcgaggtgcagc tggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtc ttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcagg caggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacg gggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtgga caaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagat acagccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttg

cttattggggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcgg tggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtc gctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggcgggtctctgg ccgaagcaaaagtgctggccaaccgcgaactggataaatatggcgtgagcga ttattataagaacctgattgacaacgcaaaatccgcggaaggcgtgaaagca ctgattgatgaaattctggccgccctgcct

La segunda cadena polipeptídica de tal diacuerpo CD123 x CD3 con optimización de secuencia que tiene un dominio de unión a albúmina tiene la secuencia descrita anteriormente (SEQ ID NO:3) y está codificada por un polinucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO:4.

B. Diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia que tienen un dominio Fc de IgG (DART-A con Fc “c/Fc”)

Además, se describe un diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia compuesto por tres cadenas polipeptídicas y que posee un dominio Fc de IgG (DART-A con Fc “c/Fc” Versión 1 y Versión 2) (Figuras 3A-3B).

Para formar tal dominio Fc de IgG, la primera y tercera cadena polipeptídica de los diacuerpos contienen, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un péptido que contiene cisteína (con la máxima preferencia, el Péptido 1 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID nO:55): DKTHTCPPCP), algunos o todos los Dominios CH2 y/o algunos o todos los Dominios CH3 de un Dominio Fc de inmunoglobulina completo y un extremo C-terminal. Algunos o todos los Dominios CH2 y/o algunos o todos los Dominios CH3 se asocian para formar el dominio Fc de inmunoglobulina de los diacuerpos que contienen el dominio Fc monovalente biespecífico descritos en la presente descripción. La primera y segunda cadenas polipeptídicas de los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos descritos en la presente descripción se unen covalentemente entre sí, por ejemplo mediante enlace disulfuro de residuos de cisteína ubicados dentro del péptido que contiene cisteína de las cadenas polipeptídicas.

Los dominios CH2 y/o CH3 del primer y tercer polipéptidos no necesitan ser idénticos, y ventajosamente se modifican para fomentar la formación de complejos entre los dos polipéptidos. Por ejemplo, puede introducirse una sustitución de aminoácidos (preferentemente una sustitución con un aminoácido que comprende un grupo lateral voluminoso que forma un “botón”, por ejemplo, triptófano) en el Dominio CH2 o CH3 de manera que la interferencia estérica evitará la interacción con un dominio mutado de manera similar y obligará al dominio mutado a emparejarse con un dominio en el que se ha diseñado una mutación complementaria o de acomodación, es decir, "el ojal" (por ejemplo, una sustitución con glicina). Tales conjuntos de mutaciones pueden diseñarse en cualquier par de polipéptidos que comprenden la molécula de diacuerpo Fc monovalente biespecífico y, además, diseñarse en cualquier parte de las cadenas polipeptídicas de dicho par. Los métodos de ingeniería de proteínas para favorecer la heterodimerización sobre la homodimerización se conocen bien en la técnica, en particular con respecto a la ingeniería de moléculas similares a las inmunoglobulinas, y se incluyen en la presente descripción (ver, por ejemplo, Ridgway y otros, (1996) “'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization, ” Protein Engr. 9:617-621, Atwell y otros, (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library, ” J. Mol. Biol. 270: 26-35, y Xie y otros, (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101). Preferentemente, el 'botón' se diseña en los Dominios CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica y el 'ojal' se diseña en los Dominios CH2-CH3 de la tercera cadena polipeptídica. Por lo tanto, el 'botón' ayudará a evitar que la primera cadena polipeptídica se homodimerice a través de sus Dominios CH2 y/o CH3. Como la tercera cadena polipeptídica contiene preferentemente la sustitución del 'ojal', se heterodimerizará con la primera cadena polipeptídica así como también se homodimerizará consigo misma. Un botón preferido se crea mediante la modificación de un dominio Fc de IgG nativo para que contenga la modificación T366W. Un ojal preferido se crea mediante la modificación de un dominio Fc de IgG nativo para que contenga la modificación T366S, L368A e Y407V. Para ayudar a purificar el homodímero de la tercera cadena polipeptídica del diacuerpo Fc monovalente biespecífico final que comprende la primera, segunda y tercera cadenas polipeptídicas, el sitio de unión a proteína A de los Dominios CH2 y CH3 de la tercera cadena polipeptídica está preferentemente mutado por sustituciones de aminoácidos en la posición 435 (H435R). Por lo tanto, el homodímero de la tercera cadena polipeptídica no se unirá a la proteína A, mientras que el diacuerpo Fc monovalente biespecífico conservará su capacidad de unirse a la proteína A a través del sitio de unión de la proteína A en la primera cadena polipeptídica.

Una secuencia preferida para los Dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de anticuerpo presente en la primera cadena polipeptídica es (SEQ ID NO:56):

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK

TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ

PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK

Una secuencia preferida para los Dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de anticuerpo presente en la tercera cadena polipeptídica es (SEQ ID NO:11):

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK

TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ

PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQ

KSLSLSPGK

C. Constructo de DART-A c/Fc Versión 1

Para ilustrar tales diacuerpos Fc, se proporciona un constructo de DART-A c/Fc versión 1. El primer polipéptido de del constructo de DART-A c/Fc versión 1 comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un extremo N-terminal, un dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VLCD¹²³), un péptido enlazador intermedio (Enlazador 1), un dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VHcd³), un Enlazador 2, un dominio en espiral E, un Enlazador 5, Péptido 1, un polipéptido que contiene los Dominios CH2 y CH3 de un dominio Fc y un extremo C-terminal. Un Enlazador 5 preferido tiene la secuencia (SEQ ID NO:32): GGG. Un polipéptido preferido que contiene los Dominios CH2 y CH3 de un dominio Fc tiene la secuencia (SEQ ID NO:37):

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK

TISKAKGQ PREPQVYT L PPSREEMTKNQVS LWCLVKG FYPS DIAVEWES NGQ

PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK

Por lo tanto, el primer polipéptido de tal constructo de DART-A c/Fc versión 1 está compuesto por: SEQ ID NO:25 -SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:22 - SEQ ID NO:30 - SEQ ID NO:34 - SEQ ID NO:32 - SEQ ID NO:55 - SEQ ID NO:37.

Una secuencia preferida del primer polipéptido de tal constructo de DART-A c/Fc versión 1 tiene la secuencia (SEQ ID NO:13):

DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKL

LIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTF

GQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMN

WVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNS

LKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKE

VAALEKEVAALEKEVAALEKGGGDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD

TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR

VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP

SREEMTKKQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF

LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK

Un polinucleótido preferido que codifica tal polipéptido es (SEQ ID NO:14):

gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagc gggtgactatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatca gaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactg ctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcg gcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccga ggacgtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttc ggccaggggaccaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcg aggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccct gagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcacatacgctatgaat tgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatcaggt ccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagatt caccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagc ctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcg gcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgac tgtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagag gttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccc tggagaaaggcggcggggacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacc tgaagccgcggqgggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggac accctcatgatctcccggacccctgagqtcacatgcgtcgtggtggacgtga gccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtgcacggcgtggaggt gcataatgccaagacaaagccgcgggaqqagcagtacaacagcacgtaccgt gtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagt acaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccat ctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaecetgccccca tcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtgctgcctggtcaaag gcttctatcccagcgacatcgccgtggaqtgggagagcaatgggcagccgga gaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttc ctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtct tctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagag cctctccctgtctccgggtaaa

La segunda cadena de un constructo de DART-A c/Fc versión 1 tal comprenderá, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un extremo N-terminal, un dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VLcd³), un péptido enlazador intermedio (Enlazador 1), un dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VHcd-¹²³), un Enlazador 2, un Dominio en espiral K y un extremo C-terminal. Por lo tanto, el segundo polipéptido de tal constructo de DART-A c/Fc versión 1 está compuesto por: SEQ ID NO:21 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:26 - SEQ ID NO:30 - SEQ ID NO:35. Un polipéptido tal tiene la secuencia (SEQ ID NO:15):

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGG

TNKRAPWT PARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWY SNLWVFGGGT

KLTVLGGGGSGGGGEVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVR

QAPGQGLEWIGDIIP SNGATFYNQKFKGRVTITVDKST STAYMELS SLRSE D

TAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKV

AALKEKVAALKE

Un polinucleótido preferido que codifica un polipéptido tal tiene la secuencia (SEQ ID NO:16):

caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactg tgaccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgc caattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggt acaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgg gcggaaaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccga ttactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcaca aaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggcggaggcgaggtgcagc tggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtc ttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcagg caggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacg gggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtgga caaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagat acaqccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttg cttattggggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcgg tggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtc gccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

La tercera cadena polipeptídica de un DART-A c/Fc versión 1 tal comprenderá los Dominios CH2 y CH3 de un dominio Fc de IgG. Un polipéptido preferido que está compuesto por el Péptido 1 (SEQ ID NO:55) y los Dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc (SEQ ID NO:11) y tiene la secuencia de SEQ ID NO:54:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHERPE

VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS

NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSD

IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

HEALHNRYTQKSLSLSPGK

Un polinucleótido preferido que codifica un polipéptido tal tiene la secuencia (SEQ ID NO:12):

gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggac cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccg

gacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgag gtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaa agccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcac cgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctcc aacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggc agccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgac caagaaccaggtcagcctgagttgcgcagtcaaaggcttctatcccagcgac atcgccgtggagtqggagagcaatgqgcagccggagaacaactacaagacca cqcctcccgtgctqgactccgacggctccttcttcctcgtcagcaagctcac cgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatg catgaggctctgcacaaccgctacacgcagaagagcctctccctgtctccgg gtaaa

D. Constructo de DART-A c/Fc versión 2

Como un segundo ejemplo de un diacuerpo DART-A c/Fc tal, la descripción proporciona un diacuerpo de tres cadenas, “diacuerpo DART-A c/Fc Versión 2” (Figura 3B).

El primer polipéptido de un constructo de DART-A c/Fc versión 2 tal comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un extremo N-terminal, un péptido enlazador (Péptido 1), un polipéptido que contiene los Dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc unido (a través de un Enlazador 4) al dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VLCD¹²³), un péptido enlazador intermedio (Enlazador 1), un dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VH^cd3), un Enlazador 2, un Dominio en espiral K y un extremo C-terminal.

Un polipéptido preferido que contiene los Dominios CH2 y CH3 de un dominio Fc tiene la secuencia (SEQ ID NO:37):

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK

TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ

PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK

El "Enlazador 4" comprenderá preferentemente la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:57): APSSS. Un "Enlazador 4" preferido tiene la secuencia (SEQ ID NO:33): APSSSPME. Por lo tanto, el primer polipéptido de un constructo de Da RT-A c/Fc versión 2 tal está compuesto por: SEQ ID NO:55 - SEQ ID NO:37 - SeQ ID NO:33 - SEQ ID NO:25 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:22 - SEQ ID NO:30 - SEQ ID NO:35. Un polipéptido que tiene una secuencia tal es (SEQ ID NO:17):

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS

NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSD

IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

HEALHNHYTQKSLSLS PGKAPS SS PMEDFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKS

SQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDF

TLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESG

GGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYAT

YYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWF

AYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

Un polinucleótido preferido que codifica un polipéptido tal tiene la secuencia (SEQ ID NO: 18):

gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggac cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccg gacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgag gtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaa agccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcac cgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctcc aacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggc agccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgac caagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgac atcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcac cgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatg catgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgg gtaaagccccttccagctcccctatggaagacttcgtgatgacacagtctcc tgatagtctggccgtgagtctgggggagcgggtgactatgtcttgcaagagc tcccagtcactgctgaacagcggaaatcagaaaaactatctgacctggtacc agcagaagccaggccagccccctaaactgctgatctattgggcttccaccag ggaatctggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcacagatttt accctgacaatttctagtctgcaggccgaggacgtggctgtgtactattgtc agaatgattacagctatccctacactttcggccaggggaccaagctggaaat taaaggaggcggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctggg ggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctg gattcaccttcagcacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaa ggggctggagtgggttggaaggatcaggtccaagtacaacaattatgcaacc tactatgccgactctgtgaaggatagattcaccatctcaagagatgattcaa agaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgt gtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaattcttacgtgtcttggttt gcttattggggacaggggacactggtgactgtgtcttccggaggatgtggcg gtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggt cgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

La segunda cadena polipeptídica de un constructo de DART-A c/Fc versión 2 tal comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, el dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VL^cd3), un péptido enlazador intermedio (Enlazador 1) y un dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VH^cdi23) ■ Esta porción de la molécula se une (a través del Enlazador 2) a un dominio en espiral E. Por lo tanto, el tercer polipéptido de un constructo de DART-A c/Fc versión 2 tal está compuesto por: SEQ ID NO:21 - SEQ ID NO:29 - Se Q ID NO:26 - SEQ ID NO:30 - SEQ ID NO:34. Un polipéptido que tiene una secuencia tal es (SEQ ID NO:1), y está codificado preferentemente por un polinucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO:2.

La tercera cadena polipeptídica comprenderá los Dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc de IgG. Un polipéptido preferido está compuesto por el Péptido 1 (SEQ ID NO:55) y los Dominios CH2 y CH3 de un Dominio Fc (SEQ ID NO: 11) y tiene la secuencia de S^eQ ID NO:54.

Para evaluar la actividad de los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 antes mencionados (DART-A, DART-A c/ABD, DART-A c/Fc, DART-B), se produjo un diacuerpo biespecífico de control (DART de control). El DART de control puede unirse simultáneamente a FITC y CD3. Sus dos cadenas polipeptídicas tienen las siguientes secuencias respectivas:

Cadena 1 de DART de control (SEQ ID NO: 19):

DVVMTQTPFSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVL

IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFG

GGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNW

VRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSL

KTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEV

AALEKEVAALEKEVAALEK

Cadena 2 de DART de control (SEQ ID NO: 20):

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRS STGAVTT3NYANWVQQKPGQAPRGLIGG

TNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGT

KLTVLGGGGSGGGGEVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVR

QSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRV

EDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAA

LKEKVAALKE IV. Composiciones farmacéuticas

Tales composiciones de la descripción incluyen composiciones farmacológicas a granel útiles en la fabricación de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones impuras o no estériles) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que son adecuadas para la administración a un sujeto o paciente) que pueden usarse en la preparación de formas de dosificación unitarias. Tales composiciones comprenden una cantidad profilácticamente o terapéuticamente eficaz de los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia de la presente descripción, o una combinación de tales agentes y un portador farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, las composiciones de la descripción comprenden una cantidad profilácticamente o terapéuticamente eficaz del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia de la descripción y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción, y un segundo anticuerpo terapéutico (por ejemplo, anticuerpo monoclonal específico de tumor) que es específico para un antígeno de cáncer particular y un portador farmacéuticamente aceptable.

En una descripción específica, la frase “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listado en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para el uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freund (completo e incompleto), excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua y etanol. La composición, si se desea, puede contener, además, cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos y formulaciones de liberación sostenida.

Generalmente, los ingredientes de las composiciones de la descripción se suministran ya sea por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o bolsita que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contenga agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de manera que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.

Las composiciones de la descripción pueden formularse como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como las derivadas de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, y aquellas formadas con cationes tales como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína.

También se describe un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia, descritos en la presente descripción, solos o con tal portador farmacéuticamente aceptable. Además, en el paquete o kit farmacéutico pueden incluirse, además, uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de una enfermedad. Se describe un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la descripción. Opcionalmente asociado con tal(es) recipiente(s) puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, dicho aviso refleja la aprobación de la agencia para la fabricación, el uso o la venta para administración en seres humanos.

También se describen kits que pueden usarse en los métodos anteriores. Un kit puede comprender diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción. El kit puede comprender además uno o más de otros agentes profilácticos y/o terapéuticos útiles para el tratamiento del cáncer, en uno o más recipientes; y/o el kit puede comprender además uno o más anticuerpos citotóxicos que se unen a uno o más antígenos del cáncer asociados con el cáncer. En determinadas descripciones, el otro agente profiláctico o terapéutico es un quimioterapéutico. En otras descripciones, el agente profiláctico o terapéutico es un agente terapéutico biológico u hormonal.

V. Métodos de administración

Las composiciones de la presente descripción pueden proporcionarse para el tratamiento, profilaxis y mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una proteína de fusión o una molécula conjugada de la descripción, o una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión o una molécula conjugada de la descripción. En un aspecto preferido, tales composiciones están sustancialmente purificadas (es decir, sustancialmente libres de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados). En una descripción específica, el sujeto es un animal, preferentemente un mamífero tal como un no primate (por ejemplo, bovino, equino, felino, canino, roedor) o un primate (por ejemplo, monos tales como, un mono cangrejero, ser humano). En una descripción preferida, el sujeto es un ser humano.

Se conocen varios sistemas de suministro y pueden usarse para administrar las composiciones de la descripción, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes que pueden expresar el anticuerpo o proteína de fusión, endocitosis mediada por receptores (ver, por ejemplo, Wu y otros, (1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro.

Los métodos de administración de una molécula de la descripción incluyen administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), epidural y mucosal (por ejemplo, vías intranasal y oral). También descritos, los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción se administran por vía intramuscular, intravenosa o subcutánea. Las composiciones pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, también puede emplearse la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente aerosolizante. Ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; and 4,880,078; y las pulicaciones PCT núms. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903.

También descritos, los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia, descritos en la presente descripción, se envasan en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o bolsita que indica la cantidad de la molécula. En una modalidad, los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente invención se suministran como un polvo liofilizado esterilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado y pueden reconstituirse, por ejemplo, con agua o solución salina a la concentración apropiada para la administración a un sujeto. Preferentemente, los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción se suministran como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente herméticamente cerrado en una dosificación unitaria de al menos 5 |jg, con mayor preferencia al menos 10 |jg, al menos 15 |jg, al menos 25 |jg, al menos 50 |jg, al menos 100 |jg o al menos 200 jig.

Los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia liofilizados descritos en la presente descripción deben almacenarse a entre 2 y 8 °C en su recipiente original y las moléculas deben administrarse dentro de las 12 horas, preferentemente dentro de las 6 horas, dentro de las 5 horas, dentro de las 3 horas o dentro de 1 hora después de ser reconstituidos. En una descripción alternativa, los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción se suministran en forma líquida en un recipiente herméticamente cerrado que indica la cantidad y concentración de la molécula, proteína de fusión o molécula conjugada. Preferentemente, la forma líquida de los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción se suministran en un recipiente herméticamente cerrado en el que las moléculas están presentes a una concentración de al menos 1 |jg/ml, con mayor preferencia al menos 2,5 |jg/ml, al menos 5 jg/ml, al menos 10 jg/ml, al menos 50 jg/ml o al menos 100 jg/ml.

La cantidad de la composición de la descripción que será eficaz en el tratamiento, prevención o mejora de uno o más síntomas asociados con un trastorno puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. La dosis precisa a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la afección, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de las curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba en modelos animales o in vitro.

Para los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción, la dosificación administrada a un paciente se determina preferentemente en función del peso corporal (kg) del sujeto receptor. La dosificación administrada es típicamente de al menos aproximadamente 0,3 ng/kg por día a aproximadamente 0,9 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 1 ng/kg por día a aproximadamente 3 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 3 ng/kg por día a aproximadamente 9 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 10 ng/kg por día a aproximadamente 30 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 30 ng/kg por día a aproximadamente 90 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 100 ng/kg por día a aproximadamente 300 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 200 ng/kg por día a aproximadamente 600 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 300 ng/kg por día a aproximadamente 900 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 400 ng/kg por día a aproximadamente 800 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 500 ng/kg por día a aproximadamente 1000 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 600 ng/kg por día a aproximadamente 1000 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 700 ng/kg por día a aproximadamente 1000 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 800 ng/kg por día a aproximadamente 1000 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 900 ng/kg por día a aproximadamente 1000 ng/kg por día, o al menos aproximadamente 1000 ng/kg por día.

En otra descripción, se administra al paciente un régimen de tratamiento que comprende una o más dosis de tal cantidad profilácticamente o terapéuticamente eficaz de los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción, en donde el régimen de tratamiento se administra durante 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días. En determinadas descripciones, el régimen de tratamiento comprende la administración intermitente de dosis de la cantidad profilácticamente o terapéuticamente eficaz de los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción (por ejemplo, administrar una dosis el día 1, el día 2, el día 3 y el día 4 de una semana determinada y no administrar dosis de la cantidad profilácticamente o terapéuticamente eficaz de los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción el día 5, el día 6 y el día 7 de la misma semana). Típicamente, existen 1,2, 3, 4, 5 o más cursos de tratamiento. Cada curso puede ser el mismo régimen o un régimen diferente.

En otra descripción, la dosis administrada aumenta durante el primer cuarto, la primera mitad o los primeros dos tercios o tres cuartos del(de los) régimen(es) (por ejemplo, durante el primer, segundo o tercer régimen de un tratamiento de 4 ciclos) hasta que se logra la cantidad diaria profilácticamente o terapéuticamente eficaz de los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción.

La Tabla 1 proporciona 5 ejemplos de diferentes regímenes de dosificación descritos anteriormente para un curso de tratamiento típico.

La dosificación y frecuencia de administración de los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción pueden reducirse o alterarse al mejorar la captación y la penetración tisular de los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia mediante modificaciones tales como, por ejemplo lipidación.

La dosificación de los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción administrados a un paciente puede calcularse para el uso como una terapia con un solo agente. Alternativamente, los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción se usan en combinación con otras composiciones terapéuticas y la dosificación administrada a un paciente es menor que cuando dichas moléculas se usan como una terapia con un solo agente.

Las composiciones farmacéuticas de la descripción puede administrarse localmente en el área que necesita tratamiento; esto puede lograrse, por ejemplo, y no a modo de limitación, por infusión local, por inyección, o por medio de un implante, donde dicho implante es de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluidas membranas, tales como membranas silastic o fibras. Preferentemente, cuando se administra una molécula de la descripción, se debe tener cuidado de usar materiales a los cuales no se absorban la molécula.

Las composiciones de la descripción pueden suministrarse en una vesícula, en particular un liposoma (ver Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treat y otros, en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, Nueva York, págs. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, en el mismo lugar, págs. 317-327; ver en general el mismo lugar).

Las composiciones descritas en la presente descripción pueden administrarse en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida. Puede usarse cualquier técnica conocida por un experto en la técnica para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 4,526,938; publicación PCT WO 91/05548; publicación PcT WO 96/20698; Ning y otros, (1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song y otros, (1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions, ” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek y otros, (1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, ” Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam y otros, (1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, ” Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760. En una descripción, puede usarse una bomba en un sistema de liberación controlada (ver Langer, arriba; Sefton, (1987) “Implantable Pumps,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald y otros, (1980) “Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis, ” Surgery 88:507-516; y Saudek y otros, (1989) “A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J. Med. 321:574-579). En otra descripción, pueden usarse materiales poliméricos para lograr la liberación controlada de las moléculas (ver, por ejemplo, M^edical A^{pplications of} C^ontrolled R^elease, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); C^ontrolled D^rug B^{ioavailability}, D^rug P^roduct D^{esign and} P^erformance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Levy y otros, (1985) “Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,” Science 228:190-192; During y otros, (1989) “Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,” Ann. Neurol.

25:351-356; Howard y otros, (1989) “Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits, ” J. Neurosurg. 7(1): 105-112); patente de Estados Unidos núm. 5,679,377; patente de Estados Unidos núm. 5,916,597; patente de Estados Unidos núm. 5,912,015; patente de Estados Unidos núm. 5,989,463; patente de Estados Unidos núm. 5,128,326; publicación PCT núm. WO 99/15154; y publicación PCT núm. WO 99/20253). Los ejemplos de polímeros usados en formulaciones de liberación sostenida incluyen poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(acetato de etileno-co-vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinil pirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicólidos) (PLGA) y poliortoésteres. Puede colocarse un sistema de liberación controlada en las proximidades de la diana terapéutica (por ejemplo, los pulmones), requiriendo de este modo solo una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, en M^edical A^{pplications of} C^ontrolled R^elease, arriba, vol. 2, págs.

115-138 (1984)). Las composiciones poliméricas útiles como implantes de liberación controlada pueden usarse de acuerdo con Dunn y otros, (Ver el documento U.S. 5,945,115). Este método particular se basa en el efecto terapéutico de la liberación controlada in situ del material bioactivo del sistema polimérico. La implantación generalmente puede realizarse en cualquier parte del cuerpo del paciente que necesite tratamiento terapéutico. Puede usarse un sistema de suministro sostenido no polimérico, mediante el cual se usa un implante no polimérico en el cuerpo del sujeto como sistema de suministro de fármacos. Tras la implantación en el cuerpo, el disolvente orgánico del implante se disipará, dispersará o lixiviará de la composición al fluido tisular circundante, y el material no polimérico se coagulará o precipitará gradualmente para formar una matriz microporosa sólida (ver el documento U.S. 5,888,533).

Los sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer (1990, “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533). Puede usarse cualquier técnica conocida por un experto en la técnica para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más agentes terapéuticos de la descripción. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 4,526,938; publicaciones internacionales núms. WO 91/05548 y Wo 96/20698; Ning y otros, (1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song y otros, (1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions, ” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek y otros, (1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, ” Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam y otros, (1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, ” Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.

Cuando la composición descrita en la presente descripción es un ácido nucleico que codifica un diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión de este diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia codificado, mediante su construcción como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y su administración de manera que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (ver la patente de Estados Unidos núm. 4,980,286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o mediante recubrimiento con lípidos o receptores de superficie celular o agentes transfectantes, o mediante su administración en unión a un péptido similar a una caja homeótica que se sabe que ingresa al núcleo (Ver, por ejemplo, Joliot y otros, (1991) “Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868). Alternativamente, un ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula huésped para la expresión mediante recombinación homóloga.

El tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de los diacuerpos biespecíficos CD123 x c D3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, un sujeto es tratado con diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción una vez por semana durante aproximadamente 1 a 10 semanas, preferentemente entre 2 a 8 semanas, con mayor preferencia entre aproximadamente 3 a 7 semanas, e incluso con mayor preferencia durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción pueden administrarse una vez al día, dos veces al día o tres veces al día. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse una vez a la semana, dos veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada seis semanas, una vez cada dos meses, dos veces al año o una vez al año. También se apreciará que la dosificación eficaz de las moléculas usadas para el tratamiento puede aumentar o disminuir durante el transcurso de un tratamiento en particular.

VI. Usos de las composiciones de la descripción

Los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia descritos en la presente descripción tienen la capacidad de tratar cualquier enfermedad o afección asociada o caracterizada por la expresión de CD123. Por lo tanto, sin limitación, tales moléculas pueden emplearse en el diagnóstico o tratamiento de la leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), incluida la crisis blástica de CML y el oncogén de Abelson asociado con CML (translocación Bcr-ABL), síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia linfoblástica B aguda (B-ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), incluido el síndrome de Richter o la transformación de Richter de CLL, leucemia de células pilosas (HCL), neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (BPDCN), linfomas no Hodgkin (NHL), que incluye leucemia de células del manto (MCL) y linfoma de linfocitos pequeños (SLL), linfoma de Hodgkin, mastocitosis sistémica y linfoma de Burkitt (ver el Ejemplo 2); Lupus autoinmunitario (SLE), alergia, asma y artritis reumatoide. Los diacuerpos biespecíficos descritos en la presente descripción pueden usarse además en la fabricación de medicamentos para el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente.

Habiendo descrito ahora en general la descripción, la misma se entenderá más fácilmente mediante la referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente descripción a menos que se especifique.

Ejemplo 1

Construcción de diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 y proteína de control

La Tabla 2 contiene una lista de diacuerpos biespecíficos que se expresaron y purificaron. El diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) y el diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 sin optimización de secuencia (DART-B) pueden unirse simultáneamente a CD123 y CD3. El diacuerpo biespecífico de control (DART de control) puede unirse simultáneamente a FITC y CD3. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros o heterotrímeros de las secuencias de aminoácidos mencionadas. Los métodos para formar diacuerpos biespecíficos se proporcionan en los documentos WO 2006/113665, WO 2008/157379, WO 2010/080538, WO 2012/018687, WO 2012/162068 y WO 2012/162067.

Ejemplo 2

Mareaje con anticuerpos de células diana para FACS cuantitativo (QFACS)

Se cosecharon un total de 106 células diana a partir del cultivo, se resuspendieron en suero AB humano al 10 % en tampón de FACS (PBS BSA al 1 % Azida sódica al 0,1 %) y se incubaron durante 5 min para bloquear los receptores de Fc. El marcaje con anticuerpos de microesferas con diferentes capacidades de unión a anticuerpos (Quantum™ Simply Cellular® (QSC), Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN) y las células diana se marcaron con anticuerpo anti-CD123 PE (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se añadió una gota de cada microesfera QSC a un tubo de polipropileno de 5 ml y se añadió anticuerpo anti-CD123 marcado con PE a una concentración de 1 pg/ml tanto a las células diana como a las microesferas. Los tubos se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a 4 °C. Las células y microesferas se lavaron al añadir 2 mL de tampón de FACS y al centrifugar a 2500 x G durante 5 minutos. Se añadió una gota de la población de microesferas de blanco después del lavado. Las microesferas se analizaron primero en el citómetro de flujo para establecer la configuración del instrumento específico de la prueba (voltajes y compensación de PMT). Con el uso de la misma configuración del instrumento, se registraron los valores de fluorescencia media geométrica de las microesferas y las células diana. Se generó una curva estándar de sitios de unión de anticuerpos en poblaciones de microesferas a partir de la fluorescencia media geométrica de las poblaciones de microesferas. Los sitios de unión del anticuerpo en las células diana se calcularon basándose en la fluorescencia media geométrica de las células diana con el uso de la curva estándar generada para microesferas en la hoja de cálculo QuickCal (Bangs Laboratories).

Para determinar líneas celulares diana adecuadas para evaluar diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3, se evaluaron los niveles de Expresión superficial de CD123 en líneas diana Kasumi-3 (AML), Molml3 (AML), THP-1 (AML), TF-1 (Eritroleucemia) y RS4- 11 (ALL) por FACS cuantitativo (QFACS). Se calcularon los números absolutos de sitios de unión del anticuerpo contra CD123 en la superficie celular mediante el uso de un kit de QFACS. Como se muestra en la Tabla 3, el número absoluto de sitios de unión del anticuerpo contra CD123 en las líneas celulares fue del orden de Kasumi-3 (alto) > Molml 3 (medio) > THP-1 (medio) > TF-1 (medio bajo) > RS4-11 (bajo). Las tres líneas celulares de mayor expresión fueron las líneas celulares AML: Kasumi-3, M0LM13 y THP-1. Las líneas celulares sin AML: TF-1 y RS4-11 tenían una expresión media-baja / baja de CD123, respectivamente.

Ejemplo 3

Ensayo de citotoxicidad de CTL (ensayo de liberación de LDH)

Las células tumorales diana adherentes se separaron con una solución de tripsina-EDTA al 0,25 % y se recolectaron mediante centrifugación a 1000 rpm durante 5 min. Las líneas celulares diana en suspensión se cosecharon del cultivo y se lavaron con medio de ensayo. La concentración y la viabilidad celular se midieron mediante exclusión con Azul Tripán con el uso de un contador Beckman Coulter Vi-Cell. Se diluyeron las células diana a 4 x105 células/ml en el medio de ensayo. Se añadieron 50 pl de la suspensión celular diluida a una placa tratada de cultivo celular de fondo en U de 96 pocillos (BD Falcon Cat#353077).

Se establecieron tres conjuntos de controles para medir la liberación máxima (MR) de la diana, la citotoxicidad celular independiente del anticuerpo (AICC) y la liberación espontánea (SR) de la célula diana de la siguiente manera:

1) MR: 200 |jl de medio de ensayo sin diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 y 50 j l de células diana; detergente añadido al final del experimento para determinar la liberación máxima de LDH.

2) AICC: 50 j l de medio de ensayo sin diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3, 50 j l de células diana y 100 j l de células T.

3) SR: 150 j l de medio sin diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 y 50 j l de células diana.

Los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 (DART-A, DART-A c/ABD y DART-B) y los controles se diluyeron inicialmente a una concentración de 4 jg/ml, y después se prepararon diluciones en serie hasta una concentración final de 0,00004 ng/ml (es decir, 40 fg/ml). Se añadieron 50 pL de diluciones a la placa que contenía 50 pl de células diana/pocillo.

Las células T purificadas se lavaron una vez con medio de ensayo y se resuspendieron en medio de ensayo a una densidad celular de 2 x 106 células/ml. Se añadieron 2 x 105 células T en 100 j l a cada pocillo, para una relación final de efector con respecto a células diana (E:T) de 10:1. Las placas se incubaron durante aproximadamente 18 horas a 37 °C en CO² al 5 %.

Después de la incubación, se añadieron 25 j l de solución de lisis oflO (Promega # G182A) o 1 mg/ml de digitonina a los pocillos de control de liberación máxima, se mezclaron pipeteando 3 veces y las placas se incubaron durante 10 min para lisar completamente las células diana. Las placas se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos y se transfirieron 50 pl de sobrenadante de cada pocillo de la placa de ensayo a una placa ELISA de fondo plano y se añadieron 50 pl de solución de sustrato LDH (Promega #G1780) a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 10­ 20 min a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad, después se añadieron 50 j l de solución de parada. La densidad óptica (D.O.) se midió a 490 nm en 1 hora en un lector de placas Victor2 Multilabel (Perkin Elmer #1420-014). El porcentaje de citotoxicidad se calculó como se describe a continuación y se generaron curvas de respuesta a dosis con el uso del software GraphPad PRISM5®.

La lisis celular específica se calculó a partir de los datos de D.O. con el uso de la siguiente fórmula:

Citotoxicidad (%) = 100 x (DO de muestra - DO de AICC) I (DO de MR - DO de SR) Destrucción redireccionada de líneas celulares diana con diferentes niveles de niveles superficiales de CD123: Los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 exhibieron una potente capacidad de destrucción redireccionada con concentraciones necesarias para alcanzar el 50 % de la actividad máxima (CE50) en un intervalo inferior a ng/ml, independientemente de la especificidad de unión al epítopo CD3 (DART-A frente a DART-B) en líneas celulares diana con alta expresión de CD123, Kasumi-3 (CE50=0,01 ng/ml) (Figura 4 Panel D), expresión de CD123 media, Molml3 (CE50=0,18 ng/ml) y THP-1 (CE50=0,24 ng/ml) (Figura 4, Panel C y E, respectivamente) y expresión de CD123 media baja o baja, TF-1 (CE50=0,46 ng/ml) y RS4-11 (CE50=0,5 ng/ml) (Figura 4, Panel B y A, respectivamente). De manera similar, también se observó destrucción redireccionada mediada por moléculas biespecíficas CD123 x CD3 con múltiples líneas celulares diana con células T de diferentes donantes y no se observó actividad de destrucción redireccionada en líneas celulares que no expresan CD123. Los resultados se resumen en la Tabla 4.

Si fuera necesario replicar este ejemplo, se apreciará que un experto en la técnica puede, dentro de límites razonables y aceptables, variar el protocolo descrito anteriormente de una manera apropiada para replicar los resultados descritos. Por lo tanto, no se pretende que el protocolo ejemplificado se cumpla de una manera estrictamente rígida.

Ejemplo 4

Activación de células T durante la destrucción redireccionada por diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A, DART-A c/ABD y DART-A c/Fc)

Los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia exhibieron una potente capacidad de destrucción redireccionada independientemente de la presencia o ausencia de tecnología de extensión de la vida media (DART-A frente a DART-A c/ABD frente a DART-A c/Fc) en las líneas celulares diana con alta expresión de CD123, Kasumi-3, y media, THP-1, expresión de CD123, (Figura 5, Paneles A y B, respectivamente) Para caracterizar la activación de células T durante el proceso de destrucción redireccionada mediada por diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia, las células T de los ensayos de destrucción redireccionada se tiñeron para el marcador de activación de células T CD25 y se analizaron por FACS. Como se muestra en la Figura 5, Panel D, CD25 se reguló positivamente en células T c D8 de una manera dependiente de la dosis, lo que indica que los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia inducen la activación de células T en el proceso de destrucción redireccionada. Por el contrario, en ausencia de células diana no hay activación de células T CD8 (Figura 5, Panel C), lo que indica que los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia no activan las células T en ausencia de células diana. De manera similar, las células T CD8 no se activan cuando se incuban con células diana y un diacuerpo biespecífico de control (DART de control) (Figura 5, Panel D) que indica el requisito de entrecruzar la célula T y la célula diana con los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia.

Ejemplo 5

Tinción intracelular para Granzima B y Perforina

Para determinar los niveles intracelulares de granzima B y perforina en células T, se configuró un ensayo de CTL como se describió anteriormente. Después de aproximadamente 18 h, las células de la placa de ensayo se tiñeron con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 mediante la incubación durante 30 minutos a 4 °C. Después de la tinción de la superficie, las células se incubaron en 100 pl de tampón de fijación y permeabilización (BD BioSciences) durante 20 min a 4 °C. Las células se lavaron con tampón de permeabilización/lavado (BD BioSciences) y se incubaron en 50 pl de granzima B y una mezcla de anticuerpos de perforina (preparada en tampón de permeabilización/lavado 1X) a 4 °C durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron con 250 pl de tampón de permeabilización/lavado y se resuspendieron en tampón de permeabilización/lavado para la adquisición de FACS.

Regulación positiva de granzima B y perforina por diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) en células T durante la destrucción redireccionada

Para investigar el posible mecanismo de citotoxicidad mediada por diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia por células T, se midieron los niveles intracelulares de granzima B y perforina en las células T después de la destrucción redireccionada. Se observó una regulación positiva dependiente de dosis de los niveles de granzima B y perforina en las células T CD8 y CD4 después de la incubación de las células T y las células Kasumi-3 con DART-A (Figura 6, Panel A). Curiosamente, la regulación positiva fue casi dos veces mayor en las células T CD8 en comparación con las células T CD4 (Figura 6, Panel A). Cuando el ensayo se realizó en presencia de inhibidores de granzima B y de perforina, no se observó destrucción celular. No hubo regulación positiva de granzima B o perforina en las células T CD8 o CD4 cuando las células T se incubaron con células diana Kasumi-3 y un diacuerpo biespecífico de control (DART de control) (Figura 5, Panel B). Estos datos indican que la destrucción de células diana mediada por DART-A puede estar mediada por mecanismos de granzima B y perforina.

Ejemplo 6

Actividad antitumoral in vivo del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) Aislamiento de las PBMC y células T de sangre total humana

Se aislaron PBMC de donantes humanos sanos a partir de sangre total mediante centrifugación en gradiente con Fico 11. En resumen, la sangre total se diluyó 1:1 con PBS estéril. Treinta y cinco ml de la sangre diluida se colocaron en capas sobre Ficoll-Paque™ Plus de 15 ml en tubos de 50 ml y los tubos se centrifugaron a 1400 rpm durante 20 min sin el freno. La capa de recubrimiento esponjosa entre las dos fases se recolectó en un tubo de 50 ml y se lavó con 45 ml de PBS mediante la centrifugación de los tubos a 600 x g (1620 rpm) durante 5 min. El sobrenadante se descartó y el sedimento celular se lavó una vez con PBS y se determinó el recuento de células viables mediante exclusión con colorante Azul Tripán. Las PBMC se resuspendieron a una concentración final de 2,5x106 células/ml en medio completo (RPMI 1640, FBS al 10 %, Glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, 100 p/100 p/ml de penicilina/estreptomicina (P/S).

Aislamiento de células T: Se aislaron células T intactas mediante selección negativa de PBMC de sangre completa humana con el uso del kit de aislamiento de células T humanas intactas Dynabeads (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del aislamiento, las células T se cultivaron durante la noche en medio RPMI con FBS al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 %.

Modelo tumoral

Las células T humanas y las células tumorales (Molml3 o RS4-11) se combinaron en una relación de 1:5 (1 x 106 y 5 x 106, respectivamente) y se suspendieron en 200 pl de solución salina estéril y se inyectaron por vía subcutánea (SC) el Día de estudio 0 (SD0). Se administraron por vía intravenosa (IV) el diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 (DART-A) con optimización de secuencia o el diacuerpo biespecífico de control (DART de control) mediante inyecciones en la vena de la cola en 100 pl como se describe en la Tabla 5 (MOLM13) y la Tabla 6 (RS4-11).

Recopilación de datos y análisis estadístico:

Pesos de los animales - Los pesos de los animales individuales se registraron dos veces por semana hasta la finalización del estudio, comenzando en el momento de la inyección de las células tumorales.

Estado agónico/Mortalidad - Los animales se observaron dos veces por semana para determinar su estado agónico general y diariamente para determinar la mortalidad. Las muertes de animales se evaluaron como relacionadas con fármacos o técnicas en función de factores que incluían la observación general y la pérdida de peso; las muertes de animales se registraron diariamente.

Volumen tumoral - Los volúmenes tumorales individuales se registraron dos veces por semana, comenzando dentro de una semana de la implantación del tumor y continuando hasta la finalización del estudio.

Longitud (mm) X -ancho2

Volumen tumoral

2

Los animales que experimentaron muertes técnicas o relacionadas con fármacos fueron excluidos de los cálculos de datos.

Inhibición del crecimiento tumoral - Se calcularon los valores de inhibición del crecimiento tumoral (TGI) para cada grupo que contenía animales tratados con el uso de la fórmula:

Volumen tumoral medio final (Tratado) - Volumen tumoral inidal medio (Tratado)

x loe Volumen tumoral medio final (Cantrol) - Volumen tumoral inicial medio (Control))

Los animales que experimentaron una respuesta parcial o completa, o los animales que experimentaron muertes técnicas o relacionadas con fármacos fueron excluidos de los cálculos de TGI. El criterio del Instituto Nacional del Cáncer para la actividad de los compuestos es TGI>58 % (Corbett y otros, (2004) Anticancer Drug Development Guide; Totowa, NJ: Humana 99-123).

Respuesta tumoral parcial/completa - Los ratones individuales que poseían tumores que medían menos de 1 mm3 en el Día 1 se clasificaron como con respuesta parcial (RP) y se determinó un valor de regresión tumoral porcentual (% TR) con el uso de la fórmula:

Volumen tumoral final (mm3)

1- x 100

Volume n tumoral inicial (mm®)

Los ratones individuales que carecían de tumores palpables se clasificaron como sometidos a una respuesta completa (R).

Estadísticas de volumen tumoral - Se llevaron a cabo análisis estadísticos entre los grupos tratados y de control mediante la comparación de los volúmenes tumorales. Para estos análisis, se empleó un análisis de varianza bidireccional seguido de una prueba posterior de Bonferroni. Todos los análisis se realizaron con el uso del software GraphPad PRISM® (versión 5.02). Los datos de peso y de tumores de animales individuales que experimentaron muertes técnicas o relacionadas con fármaco se excluyeron del análisis. Sin embargo, en estos cálculos se incluyeron datos de tumores de animales que informaron respuestas parciales o completas.

Resultados de MOLM13

La línea celular de AML MOLM13 se mezcló previamente con células T activadas y se implantó SC en ratones con inactivación de NOD/SCID gamma (NSG) (N = 8/grupo) en SDO como se detalla anteriormente. Los tumores MOLM13 en el grupo tratado con vehículo (células MOLM13 solas o más células T) demostraron un perfil de crecimiento relativamente agresivo in vivo (Figura 7, Paneles A y B). En SD8, el volumen promedio de los tumores en el grupo tratado con vehículo fue 129,8 ± 29,5 mm3 y en SD15 los tumores habían alcanzado un volumen promedio de 786,4 ± 156,7 mm3. Al final del experimento en SD18, los tumores habían alcanzado un volumen promedio de 1398,8 ± 236,9 mm3.

El tratamiento con DART-A se inició el mismo día en que se implantó la mezcla de células tumorales/células T [(SDO)] y se procedió posteriormente con inyecciones diarias durante 7 días adicionales para un total de 8 inyecciones diarias. Los animales se trataron con DART-A a 9 niveles de dosis (0,5, 0,2, 0,1, 0,02 y 0,004 mg/kg y 20, 4, 0,8 y 0,16 pg/kg). Los resultados se muestran en la Figura 7, Panel A (0,5, 0,2, 0,1, 0,02 y 0,004 mg/kg) y en la Figura 7, Panel B (20, 4, 0,8 y 0,16 pg/kg). En el día 11 del estudio, el crecimiento de los tumores MOLM13 se inhibió significativamente a los niveles de dosis de 0,16, 0,5, 0,2, 0,1, 0,02 y 0,004 mg/kg (p < 0,001). Además, el tratamiento de los ratones portadores de tumores MOLM13 a los niveles de dosis de 20 y 4 pg/kg dio como resultado 8/8 y 7/8 CR, respectivamente. Al final del experimento en SD18, el volumen promedio de los tumores tratados con DART-A a 0,8 - 20 pg/kg varió entre 713,6,0 ± 267,4 a 0 mm3, todos los cuales eran significativamente más pequeños que los tumores en el grupo de control tratado con vehículo. Los valores de TGI fueron 100, 94 y 49 % para los grupos de dosis de 20, 4 y 0,8 pg/kg, respectivamente. En comparación con el grupo de células tumorales MOLM13 tratadas con vehículo, los grupos que recibieron DART-A en el nivel de dosis de 20 y 4 pg/kg alcanzaron significación estadística por SD15 mientras que el grupo tratado con 0,8 pg/kg alcanzó significación en SD18.

Resultados de RS4-11

La línea celular de ALL RS4-11 se mezcló previamente con células T activadas y se implantó SC en ratones con inactivación de NOD/SCID gamma (N = 8/grupo) en SDO como se detalla anteriormente. Los tumores RS4-11 en el grupo tratado con vehículo (células RS4-11 solas o más células T) demostraron un perfil de crecimiento relativamente agresivo in vivo (Figura 8).

El tratamiento con DART-A se inició el mismo día en que se implantó la mezcla de células tumorales/células T [(SDO)] y se procedió posteriormente con inyecciones diarias durante 3 días adicionales para un total de 4 inyecciones diarias. Los animales se trataron con DART-A a 5 niveles de dosis (0,5, 0,2, 0,1, 0,02 y 0,004 mg/kg). Los resultados se muestran en la Figura 8.

El diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) inhibió eficazmente el crecimiento de los tumores M0LM13 AML y RS4-11ALL implantados SC en ratones NOD/CID en el contexto del modelo Winn cuando la dosificación se inició el día de implantación y continuó durante 3 o más días consecutivos. Según los criterios establecidos por el Instituto Nacional del Cáncer, DART-A al nivel de dosis de 0,1 mg/kg y superior (TGI >58) se considera activo en el modelo RS4-11 y una dosis de DART-A de 0,004 mg/kg y superior fue activo en el modelo M0LM13. Las dosis más bajas de DART-A asociadas con la inhibición del crecimiento tumoral en el modelo MOLM13 en comparación con el modelo RS4-11 son consistentes con los datos in vitro que demuestran que las células MOLM13 tienen un nivel más alto de expresión de CD123 que las células RS4-11, que se correlacionaron con mayor sensibilidad a la citotoxicidad mediada por DART-A in vitro en células M0LM13.

Si fuera necesario replicar este ejemplo, se apreciará que un experto en la técnica puede, dentro de límites razonables y aceptables, variar el protocolo descrito anteriormente de una manera apropiada para replicar los resultados descritos. Por lo tanto, no se pretende que el protocolo ejemplificado se cumpla de una manera estrictamente rígida.

Ejemplo 7

Expresión superficial de CD123 en células blásticas leucémicas y células madre en una muestra de tejido primario del paciente 1 con AML

Para definir el patrón de expresión de CD123 en las muestras primarias del paciente 1 con AML, se evaluaron muestras crioconservadas de médula ósea y PBMC del paciente con AML primaria para determinar la expresión superficial de CD123 en células blásticas leucémicas.

Muestra de médula ósea de AML - Informe clínico

Edad: 42

Género femenino

Subtipo de AML: M2

Porcentaje de células cancerosas en función de la morfología: 67,5 %

Inmunofenotipificación de la médula ósea:

CD15=19 %, CD33=98,5 %, CD38=28,8 %, CD45=81,8 %, CD64=39,7 %,

CD117=42,9 %, HLA-DR=17 %, CD2=1,8 %, CD5=0,53 %, CD7=0,2 %,

CD10=0,41 %, CD19=1,1 %, CD20=1,4 %, CD22=0,71 % CD34=0,82 %

Expresión de CD123 en células blásticas leucémicas en mononucleocitos de médula ósea (BM MNC)

Se evaluó la expresión de CD123 en un total de 0,5x106 mononucleocitos de médula ósea (BM MNC) y mononucleocitos de sangre periférica (PBMC)) del paciente 1 con AML. La línea celular Kasumi-3 se incluyó como un control. Las células blásticas leucémicas se identificaron con el uso del marcador mieloide CD33. Como se muestra en la Figura 9, Panel A, el 87 % de las células de la médula ósea de AML del paciente 1 expresaron CD123 y CD33. Los niveles de expresión de CD123 fueron ligeramente más bajos que los de la línea celular de AML Kasumi-3 de alta expresión de CD123 (Figura 9, Panel B).

Ejemplo 8

Ensayo de destrucción de CTL autólogos con el uso de muestras primarias de pacientes con AML

Se descongelaron muestras crioconservadas de AML primaria (mononucleocitos de médula ósea (BMNC) y mononucleocitos de sangre periférica (PBMC)) del paciente 1 con AML en RPMI 1640 con FBS al 10 % y se dejaron recuperar durante la noche a 37 °C en CO2 al 5 %. Las células se lavaron con medio de ensayo (RPMI 1640+FBS al 10 %) y se determinó el recuento de células viables mediante exclusión con Azul Tripán. Se añadieron 150 000 células / pocillo en 150 pl de medio de ensayo a una placa de fondo en U de 96 pocillos (BD Biosciences). El diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) se diluyó a 0,1 y 0,01 ng/ml y 50 pl de cada dilución se añadió a cada pocillo (volumen final = 200 pl). El diacuerpo biespecífico de control (DART de control) se diluyó a 0,1 ng/ml y se añadieron 50 ul de cada dilución a cada pocillo (volumen final = 200 pl). Se estableció una placa de ensayo separada para cada punto de tiempo (48, 72, 120 y 144 horas) y las placas se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %. En cada punto de tiempo, las células se tiñeron con los anticuerpos CD4, CD8, CD25, CD45, CD33 y CD123. Las células marcadas se analizaron en un citómetro de flujo FACS Calibur equipado con el software de adquisición CellQuest Pro, Versión 5.2.1 (BD Biosciences). El análisis de datos se realizó con el uso del software Flowjo v9.3.3 (Treestar, Inc). La expansión de células T se midió mediante la activación en las poblaciones CD4+ y CD8+ y la activación se determinó al medir la intensidad fluorescente media (MFI) de CD25 en las poblaciones CD4+ y CD8+. La población de células blásticas leucémicas se identificó mediante la activación de CD45+CD33+.

Agotamiento de células tumorales autólogas, expansión y activación de células T por diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) en muestras primarias del paciente 1 con AML

Para determinar la actividad mediada por el diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 (DART-A) con optimización de secuencia en el paciente 1 con AML, las muestras de los pacientes se incubaron con 0,1 ng/ml o 0,01 ng/ml de DART-A y los porcentajes de células blásticas leucémicas y células T se midieron en diferentes puntos de tiempo después del tratamiento. Las células blásticas leucémicas se identificaron mediante activación de CD45+/CD33+. La incubación de muestras de médula ósea de AML primaria con DART-A dio como resultado el agotamiento de la población de células leucémicas con el tiempo (Figura 10, Panel A), acompañado de una expansión concomitante de las células T residuales (Figura 10, Panel B) y la inducción de marcadores de activación de células T (Figura 10, Panel C). En las muestras tratadas con DART-A, las células T se expandieron de alrededor de 7 % a alrededor de 80 % en 120 horas. La activación de células T medida por la expresión de CD25 en células CD4 y CD8 alcanzó su punto máximo a las 72 h y disminuyó en el punto de tiempo de 120 h.

Si fuera necesario replicar este ejemplo, se apreciará que un experto en la técnica puede, dentro de límites razonables y aceptables, variar el protocolo descrito anteriormente de una manera apropiada para replicar los resultados descritos. Por lo tanto, no se pretende que el protocolo ejemplificado se cumpla de una manera estrictamente rígida.

Ejemplo 9

Expresión superficial de CD123 en células blásticas leucémicas y células madre en una muestra de tejido primario de paciente con ALL

Para definir el patrón de expresión de CD123 en muestras primarias de pacientes con ALL, se evaluó la muestra crioconservada de PBMC de pacientes con ALL primaria para determinar la expresión superficial de CD123 en células blásticas leucémicas.

Expresión de CD123 en células blásticas leucémicas en mononucleocitos de sangre periférica (PBMC)

Se evaluaron un total de 0,5x106 mononucleocitos de sangre periférica (PBMC)) de un donante sano y un paciente con ALL para determinar la expresión CD123. Como se muestra en la Figura 11, Paneles E-H, la gran mayoría de las células de médula ósea con ALL expresaban CD123. Por el contrario, como se esperaba en el donante normal, las células B son negativas para CD123 y las pDC y los monocitos son positivos para CD123 (Figura 11, Panel D). La población de células T se identificó en la muestra de pacientes con ALL al teñir las células para CD4 y CD8. Como se muestra en la Figura 12, Panel B, solo una pequeña fracción de las PBMC totales en la muestra de pacientes con ALL son células T (aproximadamente el 0,5 % son células T CD4 y aproximadamente el 0,4 % son células T CD8).

Ejemplo 10

Ensayo de destrucción de CTL autólogos con el uso de muestras primarias de paciente con ALL

Se descongelaron muestras crioconservadas de ALL primaria (mononucleocitos de sangre periférica (PBMC)) en RPM 11640 con FBS al 10 % y se dejaron recuperar durante la noche a 37 °C en CO2 al 5 %. Las células se lavaron con medio de ensayo (RPMI 1640+FBS al 10 %) y se determinó el recuento de células viables mediante exclusión con Azul Tripán. Se añadieron 150000 células / pocillo en 150 pl de medio de ensayo a una placa de fondo en U de 96 pocillos (BD Biosciences). Se diluyó el diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) a 10,1 ng/ml y se añadieron 50 pl de cada dilución a cada pocillo (volumen final = 200 pl). Se estableció una placa de ensayo separada para cada punto de tiempo (48, 72, 120 y 144 horas) y las placas se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %. En cada punto de tiempo, las células se tiñeron con los anticuerpos CD4, CD8, CD25, CD45, CD33 y CD123. Las células marcadas se analizaron en un citómetro de flujo FACS Calibur equipado con el software de adquisición CellQuest Pro, Versión 5.2.1 (BD Biosciences). El análisis de datos se realizó con el uso del software Flowjo v9.3.3 (Treestar, Inc). La expansión de las células T se midió mediante la activación en las poblaciones CD4+ y CD 8+ y la activación se determinó al medir la MFI de CD25 en las poblaciones CD4+ y CD8+ activadas. La población de células blásticas leucémicas se identificó mediante la activación de CD45+CD33+.

Agotamiento de células tumorales autólogas, expansión y activación de células T por diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) en muestras primarias de pacientes con ALL

Para determinar la actividad mediada por diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 (DART-A) con optimización de secuencia en las muestras de pacientes con ALL primaria, las muestras de los pacientes se incubaron con 1 ng/ml de DART-A y se midieron los porcentajes de células blásticas leucémicas y células T en diferentes puntos de tiempo después del tratamiento. Las células blásticas leucémicas se identificaron mediante activación de CD45/CD33+. La incubación de muestras de médula ósea de ALL primaria con DART-A dio como resultado el agotamiento de la población de células leucémicas a lo largo del tiempo en comparación con el control no tratado o el DART de control (Figura 13, Panel H frente a Paneles F y G). Cuando se contaron las células T (tinción de CD8 y CD4) y se analizó la activación (tinción de CD25), las células T se expandieron y se activaron en la muestra de DART-A (Figura 14, Paneles I y L, respectivamente) en comparación con las muestras no tratadas o DART de control (Figura 14, Paneles H, G, K y J, respectivamente).

Ejemplo 11

Expresión superficial de CD123 en células blásticas leucémicas y células madre en una muestra de tejido primario del paciente 2 con AML

Para definir el patrón de expresión de CD123 en muestras primarias del paciente 2 con AML, se evaluaron muestras crioconservadas de médula ósea y PBMC de pacientes con AML primaria para determinar la expresión superficial de CD123 en células blásticas leucémicas.

Expresión de CD123 en células blásticas leucémicas en mononucleocitos de médula ósea (BMNC)

Se evaluó un total de 0,5x106 mononucleocitos de médula ósea (BM MNC) y mononucleocitos de sangre periférica (PBMC) de un paciente 2 con AML para la identificación de células blásticas leucémicas. Las células blásticas leucémicas se identificaron con el uso de los marcadores mieloides CD33 y CD45. Como se muestra en la Figura 15, Panel B, el 94 % de las células de la médula ósea con AML son células blásticas leucémicas. La población de células T se identificó mediante la expresión de CD3. Como se muestra en la Figura 15, Panel C, aproximadamente el 15 % de las células de la muestra de médula ósea y PBMC con AML son células T.

Ejemplo 12

Ensayo de destrucción de CTL autólogos con muestras primarias de AML del paciente 2

Se descongelaron muestras crioconservadas de AML primaria (mononucleocitos de médula ósea (BM MNC) y mononucleocitos de sangre periférica (PBMC)) del paciente 2 con AML en RPMI 1640 con LBS al 10 % y se dejaron recuperar durante la noche a 37 °C en CO2 al 5 %. Las células se lavaron con medio de ensayo (RPMI 1640 LBS al 10 %) y se determinó el recuento de células viables mediante exclusión con Azul Tripán. Se añadieron 150000 células / pocillo en 150 |^jl de medio de ensayo a una placa de fondo en U de 96 pocillos (BD Biosciences). El diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) y el diacuerpo biespecífico de control (DART de control) se diluyeron a 0,1, y se añadieron 0,01 ng/ml y 50 j l de cada dilución a cada pocillo (volumen final = 200 jl). Se estableció una placa de ensayo separada para cada punto de tiempo (48, 72, 120 y 144 horas) y las placas se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %. En cada punto de tiempo, las células se tiñeron con los anticuerpos CD4, CD8, CD25, CD45, CD33 y CD123. Las células marcadas se analizaron en un citómetro de flujo LACS Calibur equipado con el software de adquisición CellQuest Pro, Versión 5.2.1 (BD Biosciences). El análisis de datos se realizó con el uso del software Llowjo v9.3.3 (Treestar, Inc). La expansión de células T se midió mediante la activación en las poblaciones CD4+ y CD8+ y la activación se determinó al medir la MLI de CD25 en las poblaciones CD4+ y CD8+. La población de células blásticas leucémicas se identificó mediante la activación de CD45+CD33+.

Agotamiento de células tumorales autólogas, expansión y activación de células T en muestras primarias del paciente 2 con AML

Para determinar la actividad mediada por el diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 (DART-A) con optimización de secuencia en muestras primarias del paciente 2 con AML, las muestras de pacientes se incubaron con 0,1 o 0,01 ng/ml de DART-A y los porcentajes de células blásticas leucémicas y células T se midieron en diferentes puntos de tiempo después del tratamiento. La incubación de muestras de médula ósea de AML primaria con DART-A dio como resultado el agotamiento de la población de células leucémicas con el tiempo (Figura 16, Panel A), acompañado de una expansión concomitante de las células T residuales (tanto CD4 como CD8) (Figura 16, Panel B y Figura 16, Panel C, respectivamente). Para determinar si las células T estaban activadas, las células se tiñeron para CD25 o Ki-67, ambos marcadores de activación de células T. Como se muestra en la Figura 17, Paneles A y B, la incubación de muestras de médula ósea de AML primaria con DART-A dio como resultado la activación de células T. Estos datos representan el punto de tiempo de 144 h.

Tinción intracelular para Granzima B y Perforina

Para determinar los niveles intracelulares de granzima B y perforina en las células T, se configuró el ensayo de CTL. Después de aproximadamente 18 h, las células de la placa de ensayo se tiñeron con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 al incubar durante 30 minutos a 4 °C. Después de la tinción de la superficie, las células se incubaron en 100 pl de tampón de fijación y permeabilización durante 20 min a 4 °C. Las células se lavaron con tampón de permeabilización/lavado y se incubaron en 50 pl de granzima B y una mezcla de anticuerpos de perforina preparada en tampón IX de perm/lavado a 4 °C durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron con 250 pl de tampón de perm/lavado y se resuspendieron en tampón de perm/lavado para la adquisición de FACS.

Regulación positiva de Granzima B y Perforina por diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) en células T durante la destrucción redireccionada.

Para investigar el posible mecanismo de citotoxicidad mediada por diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia por células T, se midieron los niveles intracelulares de granzima B y perforina en las células T después de la destrucción redireccionada. No hubo regulación positiva de granzima B y perforina cuando las células T se incubaron con diacuerpo biespecífico de control (DART de control). Se observó una regulación positiva de los niveles de granzima B y perforina en células T CD8 y CD4 con diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) (Figura 17, Paneles C y D). Curiosamente, la regulación positiva fue casi dos veces mayor en las células T CD8 en comparación con las células T CD4 (Figura 17, Panel C y Figura 17, Panel D). Estos datos indican que la destrucción de las células diana mediada por DART-A fue mediada por la ruta de granzima B y perforina.

Ejemplo 13

El diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia reacciona de forma cruzada con las proteínas CD123 y CD3 de primates no humanos.

Para cuantificar el grado de unión entre el diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) y el CD3 humano o de macaco cangrejero, se realizaron los análisis BI ACORE™. Los análisis BI ACORE™ miden la velocidad de disociación, kd. La afinidad de unión (KD) entre un anticuerpo y su diana es una función de las constantes cinéticas de asociación (velocidad de activación, ka) y disociación (velocidad de inactivación, kd) de acuerdo con la fórmula: KD = [kd]/[ka]. El análisis BIACORE™ usa la resonancia de plasmones superficiales para medir directamente estos parámetros cinéticos. Se inmovilizó directamente CD3 recombinante humano o de macaco cangrejero en un soporte. Se capturó CD123 humano o de macaco cangrejero purificado y se inmovilizó en un soporte. Se midió el curso temporal de la disociación y se realizó un ajuste bivalente de los datos. Las constantes de unión y la afinidad se obtuvieron con el uso de un ajuste de unión 1:1. En la Figura 18 se muestran los resultados de los análisis BIACORE™ que comparan la unión a proteínas CD123 y CD3 humanas frente a las de macaco cangrejero. Las afinidades de unión a las proteínas CD123 (Figura 18D) y CD3 (Figura 18B) de macaco cangrejero son comparables a las afinidades de unión para las proteínas CD123 (Figura 18C) y CD3 (Figura 18A) humanas.

Ejemplo 14

Agotamiento de monocitos autólogos in vitro con PBMC humanos y de macacos cangrejeros

Se añadieron PBMC de muestras de sangre total humana o de macaco cangrejero a placas de fondo en U a una densidad celular de 200000 células/pocillo en 150 pl de medio de ensayo. Se prepararon diluciones de diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A o DART-A c/ABD) en medio de ensayo. Se añadieron 50 pl de cada dilución de DART-A o DART-A c/ABD a la placa que contenía las PBMC en pocillos por duplicado. Las placas se incubaron durante ~ 18-24 h a 37 °C. Se usaron sobrenadantes para determinar la citotoxicidad como se describió anteriormente. Como se muestra en la Figura 19 (Paneles A y B), se observó el agotamiento de las células pDC en PBMC tanto humanas (Figura 19, Panel A) como de macaco cangrejero (Figura 19, Panel B). Estos resultados indican que la pDC circulante puede usarse como un marcador farmacodinámico para estudios de toxicología preclínica en macacos cangrejeros.

Si fuera necesario replicar este ejemplo, se apreciará que un experto en la técnica puede, dentro de límites razonables y aceptables, variar el protocolo descrito anteriormente de una manera apropiada para replicar los resultados descritos. Por lo tanto, no se pretende que el protocolo ejemplificado se cumpla de una manera estrictamente rígida.

Ejemplo 15

Agotamiento de células dendríticas plasmocitoides en macacos cangrejeros tratados con diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A)

Como parte de un estudio de toxicología de búsqueda de intervalo de dosis, a los macacos cangrejeros se les administró diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) como infusiones de 4 días en dosis de 0,1, 1, 10, 30, 100, 300 o 1000 ng/kg. El Da RT de control se administró a 100 ng/kg. Para identificar las pDC y poblaciones de monocitos en las PBMC de macaco cangrejero, las células se marcaron con anticuerpo contra CD14-FITC. Los monocitos se identificaron como la población CD14+ y las pDC se identificaron como la población CD14'CD123+. Como se muestra en los paneles K y L de la Figura 20, las pDC se agotaron tan pronto como 4 días después de la infusión con tan solo 10 ng/kg de DART-A. No se observó agotamiento de pDC en los monos tratados con diacuerpo biespecífico de control (DART de control) o en los monos tratados con vehículo portador en el punto de tiempo 4d (Figura 20, Paneles G, H, C y D, respectivamente). Los niveles de citocina de interferón-gamma, TNF-alfa, IL6, IL5, IL4 e IL2 se determinaron 4 horas después de la infusión. Hubo poca o ninguna elevación en los niveles de citocina en los animales tratados con DART-A en comparación con los animales tratados con DART de control o vehículo.

La Figura 21 y la Figura 22 proporcionan los resultados del análisis FACS para células B (CD20) (Figura 21, Panel A), monocitos (CD14+) (Figura 21, Panel B), células NK (CD159 CD16) (Figura 21, Panel C), pDC (CD123HI, CD14) (Figura 21, Panel D) y células T (total, C^d4+ y CD8+) (Figura 22, Panel A, Figura 22, Panel B y Figura 22, Panel D, respectivamente).

El tratamiento de monos con DART de control no tuvo efectos notables sobre los linfocitos T o B, células NK, monocitos y pDC. El tratamiento de monos con DART-A a dosis de 10 ng/kg/d o superiores dio como resultado la anulación de las pDC (Figura 21, Panel D). El agotamiento de pDC fue completo y duradero, volviendo a los niveles previos a la dosis varias semanas después de completar la dosificación. Los niveles circulantes de linfocitos T disminuyeron con la administración de DART-A, pero volvieron al nivel previo a la dosis al final de cada ciclo semanal, lo que sugiere cambios en el tráfico en lugar de un agotamiento real. Tanto los linfocitos T CD4 como los CD8 siguieron el mismo patrón. El marcador de activación de linfocitos T, CD69 (Figura 22, Panel C), fue solo marginalmente positivo entre las células circulantes y no siguió la dosificación de DART-A. Los linfocitos B, los monocitos y las células NK fluctuaron durante el transcurso de la dosificación de DART-A con una variabilidad sustancial observada entre los monos. Se observó una tendencia hacia el aumento de los niveles circulantes de linfocitos B y monocitos en ambos monos con las dosis más altas.

En resumen, los resultados anteriores demuestran la eficacia terapéutica del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A). El diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 con optimización de secuencia (DART-A) puede emplearse como un agente terapéutico para el tratamiento de múltiples enfermedades y afecciones, que incluyen: AML, ABL (ALL), CLL, MDS, pDCL, leucemia de células del manto, leucemia de células pilosas, transformación de Richter de CLL, crisis blástica de CML, BLL (el subconjunto es CD123+) (ver el Ejemplo 2); Lupus autoinmunitario (SLE), alergia (los basófilos son CD123+), asma.

Ejemplo 16

Propiedades comparativas del diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 optimizado para secuencia (DART-A) y el diacuerpo biespecífico contra CD123 xCD3 sin optimización de secuencia (DART-B). Ventaja inesperada y atributos de los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 con optimización de secuencia

Como se analizó anteriormente, DART-A y DART-B se diseñan de manera similar y el primer polipéptido de ambas constructos comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un extremo N-terminal, un dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VL^cd3), un péptido enlazador intermedio (Enlazador 1), un dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VH^cd123), un Enlazador 2, un Dominio en espiral E y un extremo C-terminal. Asimismo, el segundo polipéptido de ambas constructos comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un extremo N-terminal, un dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VL^cd-¹²³), un péptido enlazador intermedio (Enlazador 1), un dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VH^cd3), un Enlazador 2, un dominio en espiral K y un extremo C-terminal.

Como se indica en el Ejemplo 1, se encontró que ambos diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 eran capaces de unirse simultáneamente a CD3 y CD123. Además, como se describe en el Ejemplo 3 y en la Figura 4, Paneles C y D, los dos diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 exhibieron una potente capacidad de destrucción redireccionada con concentraciones requeridas para alcanzar el 50 % de la actividad máxima (CE50) en un intervalo por debajo de ng/ml, independientemente de la especificidad de unión al epítopo CD3 (DART-A frente a DART-B) en líneas celulares diana con alta expresión de CD123. Por lo tanto, ligeras variaciones en las secuencias específicas de los diacuerpos biespecíficos CD123 x CD3 no anulan completamente la actividad biológica.

Sin embargo, en todas las líneas celulares probadas, se encontró que DART-A era más activo y más potente en la destrucción redireccionada que DART-B (ver, por ejemplo, Figura 4, Paneles A, C y D) Por lo tanto DART-A exhibió una ventaja inesperada sobre DART-B similar.

Ejemplo 17

Farmacología en primates no humanos de DART-A para el tratamiento de enfermedades malignas hematológicas La cadena alfa del receptor de interleucina 3 (IL-3), CD123, se sobreexpresa en células malignas en una amplia gama de enfermedades malignas hematológicas (Munoz, L. y otros, (2001) "Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86:1261-1269; Testa, U. y otros, (2014) “CD123 Is A Membrane Biomarker And A Therapeutic Target In Hematologic Malignancies,” Biomark. Res. 2:4) y se asocia con un mal pronóstico (Vergez, F. y otros, (2011) “High Levels Of CD34+CD38low/-CD123+ Blasts Are Predictive Of An Adverse Outcome In Acute Myeloid Leukemia: A Groupe Ouest-Est Des Leucemies Aigues Et Maladies Du Sang (GOELAMS) Study,” Haematologica 96:1792-1798). Además, se ha informado que CD123 se expresa en células madre de leucemia (LSC) (Jordan, C.T. y otros, (2000) “The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells,” Leukemia 14:1777-1784; Jin, L. y otros, (2009) “Monoclonal Antibody-Mediated Targeting Of CD123, IL-3 Receptor Alpha Chain, Eliminates Human Acute Myeloid Leukemic Stem Cells,” Cell Stem Cell 5:31-42), que es una característica atractiva que permite dirigirse a la causa raíz de tales enfermedades. De acuerdo con esta conclusión, CD123 también participa en un bucle autocrino de IL-3 que mantiene la leucemogénesis, como lo demuestra la capacidad de un anticuerpo monoclonal bloqueador de CD123 para reducir el injerto de células madre leucémicas y mejorar la supervivencia en un modelo de ratón de leucemia mielógena aguda (AML) (Jin, L. y otros, (2009) “Monoclonal Antibody-Mediated Targeting Of CD123, IL-3 Receptor Alpha Chain, Eliminates Human Acute Myeloid Leukemic Stem Cells,” Cell Stem Cell 5:31-42). Sin embargo, en un estudio de fase 1 en pacientes con AML de alto riesgo, el anticuerpo monoclonal no exhibió actividad antileucémica (Roberts, A. W. y otros, (2010) “A Phase I Study Of Anti-CD123 Monoclonal Antibody (mAb) CSL360 Targeting Leukemia Stem Cells (LSC) In AML,” J. Clin. Oncol. 28(Supl.):el3012). Por lo tanto, se desean enfoques alternativos de direccionamiento de CD123, incluidas estrategias de agotamiento. Aunque CD123 se expresa en un subconjunto de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) normales, las células madre hematopoyéticas (HSC) expresan poco o nada de CD123 (Jordan, C.T. y otros, (2000) “The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells,” Leukemia 14:1777-1784; Jin, W. y otros, (2009) “Regulation OfThl7 Cell Differentiation And EAE Induction By MAP3K NIK,” Blood 113:6603-6610), que indica que las estrategias de agotamiento de células CD123 permiten la reconstitución a través de hematopoyesis normal.

Permitir que los linfocitos T del propio paciente se dirijan a las células leucémicas representa una estrategia inmunoterapéutica prometedora para el tratamiento de enfermedades malignas hematológicas. El potencial terapéutico de este enfoque se ha intentado con el uso de blinatumomab (un BiTE basado en anticuerpos biespecíficos que tiene la capacidad de unirse a CD3 y al antígeno CD 19 de células B) en pacientes con linfomas de células B y leucemia linfoblástica aguda precursora B (Klinger, M. y otros, (2012) “Immunopharmacologic Response Of Patients With B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia To Continuous Infusion Of T Cell-Engaging CD19/CD3-Bispecific BiTE Antibody Blinatumomab,” Blood 119:6226-6233; Topp, M.S. y otros, (2012) “Long-Term Follow-Up Of Hematologic Relapse-Free Survival In A Phase 2 Study Of Blinatumomab In Patients With MRD In B-Lineage ALL,” Blood 120:5185-5187; Topp, M.S. y otros, (2011) “Targeted Therapy With The T-Cell-Engaging Antibody Blinatumomab Of Chemotherapy-Refractory Minimal Residual Disease In B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia Patients Results In High Response Rate And Prolonged Leukemia-Free Survival,” J. Clin. Oncol. 29:2493-2498).

Las moléculas de diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 de la presente descripción, tal como DART-A, comprenden una modalidad alternativa basada en anticuerpos biespecíficos que ofrece una estabilidad mejorada y propiedades de fabricación más robustas (Johnson, S. y otros, (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399:436-449; Moore, P.A. y otros, (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117:4542-4551).

Para demostrar la superioridad y eficacia de las moléculas de diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 de la presente descripción, se confirmó la actividad biológica del DART-A descrito anteriormente en modelos in vitro y preclínicos de leucemia, y su farmacocinética, farmacodinámica y se evaluó la farmacología de seguridad en macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) en relación con el DART de control descrito anteriormente (biespecífico para CD3 y fluoresceína) o un "DART-2 de control" que era biespecífico para CD123 y fluoresceína).

Secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de "DART de control-2" (CD123VL — Enlazador — 4-4420VH — Enlazador — espiral E; los enlazadores están subrayados) (SEQ ID NO:58):

DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP

KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY

PYTFGQGTKL EIKGGGSGGG GEVKLDETGG GLVQPGRPMK LSCVASGFTF

SDYWMNWVRQ SPEKGLEWVA QIRNKPYNYE TYYSDSVKGR FTISRDDSKS

SVYLQMNNLR VEDMGIYYCT GSYYGMDYWG QGTSVTVSSG GCGGGEVAAL

EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEK

Secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica de "DART de control-2" (4420VL - Enlazador -CD123VH - Enlazador - espiral K) (SEQ ID NO:59):

DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK

VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP

WTFGGGTKLE I K GGGSGGGGEVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT

DYYMKWVRQA PGQGLEWIGD IIPSNGATFY NQKFKGRVTI TVDKSTSTAY

MELSSLRSED TAVYYCARSH LLRASWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGKVAA

LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE ELISA bifuncional

Se bloqueó una placa MaxiSorp ELISA (Nunc) recubierta durante la noche con el IL3R-alfa humano o de macaco cangrejero soluble (0,5 pg/ml) en tampón bicarbonato con BSA al 0,5 %; Tween-20 al 0,1 % en PBS (PBST/BSA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se aplicaron moléculas de DART-A, seguido de la adición secuencial de CD3£8-biotina humana y estreptavidina HRP (Jackson ImmunoResearch). La actividad de HRP se detectó mediante la conversión de tetrametilbencidina (BioFX) como sustrato durante 5 min; la reacción se terminó con 40 pl/pocillo de H2SO4 al 1 % y se leyó la absorbancia a 450 nm.

Análisis de resonancia de plasmones superficiales

La capacidad de DART-A para unirse a las proteínas CD3 o CD123 humanas y de macaco cangrejero se analizó con el uso de un biosensor BIAcore 3000 (GE, Healthcare) como se describe en Johnson, S. y otros, (2010) (('Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399:436-449) y Moore, P.A. y otros, (2011) ((Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117:4542-4551). Brevemente, los grupos carboxilo en el chip sensor CM5 se activaron con una inyección de N-etil-N-(3dietilaminopropil)carbodiimida 0,2 M y N-hidroxisuccinimida 0,05 M. Se inyectó CD3 o CD123 soluble (1 pg/ml) sobre la superficie de CM5 activada en acetato de sodio 10 mM, pH 5,0, a una tasa de flujo de 5 pl/min, seguido de etanolamina 1 M para la desactivación. Los experimentos de unión se realizaron en HEpES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo P20 al 0,005 %. La regeneración de las superficies receptoras inmovilizadas se realizó mediante inyección en pulsos de glicina 10 mM, pH 1,5. Los valores de KD se determinaron mediante un ajuste global de las curvas de unión al modelo de unión de Langmuir 1:1 (software BIAevaluation v4.1).

Ensayo de destrucción celular

Las líneas celulares usadas para los ensayos de destrucción de células se obtuvieron de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC) (Manassas, VA). Las PBMC se aislaron de sangre de donantes sanos con el uso del kit Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare); las células T se purificaron con un kit de selección negativa (Life Technologies). La densidad de CD123 en la superficie celular se determinó con el uso de perlas Quantum Simply Cellular (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN). Los ensayos de citotoxicidad se realizaron como se describe en Moore, P.A. y otros, (2011) (('Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117:4542-4551). Brevemente, las líneas celulares diana (105 células/ml) se trataron con diluciones en serie de proteínas DART-A o DART de control en la presencia de células T en las relaciones de células efectoras :células diana indicadas y se incubaron a 37 °C durante la noche. La destrucción celular se determinó como la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH, Promega) en el sobrenadante del cultivo. Para la destrucción basada en el flujo, las células diana se marcaron con CMTMR (Life Technologies) y la destrucción celular se monitorizó con el uso de un citómetro de flujo FACSCalibur. Los datos se analizaron con el uso del software PRISM® 5 (GraphPad) y se presentaron como porcentaje de citotoxicidad.

Farmacología en macaco cangrejero

Los experimentos con primates no humanos se llevaron a cabo en Charles River Laboratories (Reno, NV), de acuerdo con las directrices del Comité institucional de uso y cuidado de animales (IACUC) local. Macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) de origen chino (intervalo de edad de 2,5-9 años, intervalo de peso de 2,7-5 kg) criados para este propósito, se les proporcionó un vehículo o DART-A mediante infusión intravenosa a través de puertos femorales y yugulares con el uso de bombas de infusión programares alimentadas por baterías (CADD-Legacy®, SIMS Deltec, Inc., St. Paul, MN). Se recolectaron muestras de sangre periférica o de médula ósea en tubos que contenían anticoagulante en los puntos de tiempo indicados. Los análisis del fenotipo de la superficie celular se realizaron con un analizador LSR Fortessa (BD Biosciences) equipado con láseres de 488 nm, 640 nm y 405 nm y los siguientes anticuerpos: CD4-V450, CD8-V450, CD123-PE-Cy7, CD45-PerCP, CD4-APC-H7, CD8-FITC, CD25-PE-Cy7, CD69-PerCP, PD-l-PE, TIM3-APC, CD3-Pacific Blue, CD95-APC, CD28-BV421, CD16-FITC, CD3-Alexa488, CD38-PE, CD123-PE-Cy7, CD117-PerCP-Cy5.5, CD34-APC, CD90-BV421, CD45RA-APC -H7 y CD33-APC (BD Biosciences). El número absoluto de células se determinó con el uso de TruCOUNT (BD Biosciences). Los niveles séricos de citocinas IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, TNF-a e IFN-y se midieron con el kit de matriz citométrica de perlas de citocinas Th1/Th2 de primates no humanos (BD Bioscience). La concentración de DART-A en muestras de suero de mono se midió con el uso de un inmunoensayo tipo sándwich con detección de electroquimioluminiscencia (MesoScale Diagnostics, MSD, Rockville, MD). Brevemente, la placa de ensayo (MSD) se recubrió con IL-3 Ra humana recombinante (R&D System) y se bloqueó con BSA al 5 %. Se aplicaron estándares de calibración o muestras de prueba diluidas, seguido de la adición de un anticuerpo monoclonal biotinilado que exhibe unión específica para los dominios en espiral E (SEQ ID NO:34) y en espiral K (SEQ ID NO:35) descritos anteriormente de la molécula. Se añadió un conjugado de estreptavidina (MSD) marcado con SULFO-TAG™ y se analizó la formación de complejos en un generador de imágenes MSD SECTOR®. Las concentraciones de DART-A se determinaron a partir de curvas estándar generadas mediante el ajuste de los datos de intensidad de la luz en un modelo logístico de cinco parámetros.

La caracterización fisicoquímica del DART-A purificado demostró un heterodímero homogéneo con una masa molecular de 58,9 kDa (Figura 23; Figuras 24A-24B), que fue estable a 2-8 °C durante hasta 12 meses en PBS. El análisis de SPR demostró afinidades de unión casi idénticas de DART-A a los correspondientes antígenos solubles CD3 y CD123 humanos y de macaco cangrejero (Figuras 25A-25D y Tabla 7). Además, DART-A unió simultáneamente ambos antígenos en un formato ELISA que empleaba CD123 humano o de mono para la captura y CD3 humano para la detección (Figuras 26A-26B), y demostró una unión similar a los linfocitos T humanos y de mono (Figuras 26C-26E). Los datos en la Tabla 7 son promedios de 3 experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado.

DART-A media en la destrucción redireccionada por linfocitos T humanos o de macaco cangrejero

Destrucción redireccionada de células diana mediada por DART-A por células efectoras humanas o de mono contra líneas celulares leucémicas CD123+ Kasumi-3 (Figura 27A-27D), que fue acompañada por la inducción de marcadores de activación. No se observó actividad contra dianas negativas para CD123 (células U937) o con DART de control, lo que indica que la activación de células T depende estrictamente del acoplamiento de las células diana y que el acoplamiento monovalente de CD3 por DART-A fue insuficiente para desencadenar la activación de las células T. Dado que CD123 se expresa mediante subconjuntos de leucocitos circulantes normales, que incluyen pDC y monocitos (Figura 27E), el efecto de DART-A se investigó adicionalmente en las PBMC humanas y de monos normales.

Se observó un efecto gradual entre las PBMC humanas, con un rápido agotamiento dependiente de dosis de las células CD14'CD123high (pDC y basófilos) observado tan pronto como 3 horas después del inicio del tratamiento, mientras que los monocitos (células CD14+) no se vieron afectados en este punto de tiempo. (Figuras 27F-27G). El agotamiento de células CD14'CD123high aumentó con el tiempo en todas las concentraciones de moléculas de DART-A, mientras que los monocitos disminuyeron ligeramente a las 6 horas y se agotaron solo después de 18 horas y en concentraciones superiores a 1 ng/ml. La incubación de las PBMC de mono con DART-A dio como resultado un agotamiento dependiente de dosis comparable de células CD14 CD123high (Figura 27H), lo que respalda aún más la relevancia de esta especie para la farmacología de DART-A (las células de mono CD 14+ expresan poco o nada de CD123 y no se agotaron).

Farmacocinética de DART-A en macacos cangrejeros

El macaco cangrejero se seleccionó como un modelo farmacológico apropiado para el análisis de DART-A basado en la distribución equivalente de ambos antígenos diana en esta especie en comparación con los humanos según la inmunohistoquímica con los AcM precursores, de acuerdo con la información publicada (Munoz, L. y otros, (2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86:1261-1269; Korpelainen, E.I. y otros, (1996) “ IL-3 Receptor Expression, Regulation And Function In Cells Of The Vasculature,” Immunol. Cell Biol. 74:1-7).

El estudio realizado incluyó 6 grupos de tratamiento que consistían en 8 macacos cangrejeros por grupo (4 machos, 4 hembras) (Tabla 8). Todos los grupos recibieron control de vehículo para la primera infusión; después se administró vehículo o DART-A por vía intravenosa durante 4 ciclos semanales. Los animales del Grupo 1 recibieron control de vehículo durante las 4 infusiones posteriores, mientras que los Grupos 2-5 recibieron dosis semanales crecientes de DART-A durante 4 días a la semana para todas las infusiones posteriores. Los animales del Grupo 6 se trataron con dosis progresivas semanales ininterrumpidas de 7 días de DART-A para todas las infusiones. Los programas de 4 días con tratamiento/3 días sin tratamiento y 7 días con tratamiento se diseñaron para distinguir entre efectos duraderos y transitorios asociados con la administración de DART-A. Se sacrificaron dos machos y 2 hembras por grupo al final de la fase de tratamiento (Día 36), mientras que a los monos restantes se les hizo la necropsia después de una recuperación de 4 semanas (Día 65). Un subconjunto de monos desarrolló anticuerpos anti-fármaco (ADA) dirigidos contra el Fv humanizado tanto de CD3 y CD123 y los puntos de datos posteriores a la aparición de ADA se excluyeron del análisis farmacocinético. Todos los monos se expusieron a DART-A durante el período de estudio.

Se usó un modelo de dos compartimentos para estimar los parámetros farmacocinéticos (Tabla 9 y Figura 28). T ^a fue breve (4-5 min), lo que refleja una unión rápida a las dianas circulantes; T¹/²P también fue rápido, como se esperaba para una molécula de este tamaño, que está sujeta a eliminación renal. El análisis de las muestras de suero recolectadas al final de cada infusión de los monos del grupo 6 mostró un aumento dependiente de dosis en Cmáx de DART-A. En la Tabla 9, el vehículo era PBS, pH 6,0, que contenía 0,1 mg/ml de albúmina humana recombinante, 0,1 mg/ml de PS-80 y se usó alcohol bencílico al 0,24 % para todas las infusiones de vehículo durante los primeros 4 días de cada semana de infusión seguida de la misma formulación sin alcohol bencílico durante los 3 días restantes de cada infusión semanal. Se administró DART-A durante los tiempos indicados como una infusión IV continua de una solución de PBS, pH 6,0, que contenía 0,1 mg/ml de albúmina humana recombinante, 0,1 mg/ml de PS-80 y alcohol bencílico al 0,24 % a la concentración requerida.

Liberación de citocinas en macacos cangrejeros tratados con DART-A

Dadas las propiedades de activación de células T de DART-A, se anticipó un aumento de las citocinas circulantes que acompañan a la infusión y, por lo tanto, se usó una dosis de partida baja como una estrategia de "desensibilización", en función de la experiencia previa con compuestos similares (ver, por ejemplo, Topp, M.S. y otros, (2011) “Targeted Therapy With The T-Cell-Engaging Antibody Blinatumomab Of Chemotherapy-Refractory Minimal Residual Disease In B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia Patients Results In High Response Rate And Prolonged Leukemia-Free Survival,” J. Clin. Oncol. 29:2493-2498; Bargou, R. y otros, (2008) “Tumor Regression In Cancer Patients By Very Low Doses Of A T Cell-Engaging Antibody,” Science 321:974-977). De las citocinas probadas, IL-6 demostró los mayores cambios tras la infusión, aunque de naturaleza transitoria, de magnitud mínima y con grandes variaciones entre animales y entre grupos (Figuras 29A-29C). También se observaron pequeños aumentos transitorios en IL-6 después de las infusiones de vehículo (todas las infusiones del Grupo 1 y todas las del Día 1), lo que indica una sensibilidad de esta citocina al estrés por manipulación. No obstante, se observaron aumentos dependientes de DART-A (<80 pg/ml) en la IL-6 sérica en algunos monos después de la primera infusión de DART-A (100 ng/kg/día), que volvió a la línea de base a las 72 horas. Curiosamente, la magnitud de la liberación de IL-6 disminuyó con cada infusión sucesiva de DART-A, incluso cuando el nivel de dosis se incrementó hasta 1000 ng/kg/día. También se observaron aumentos mínimos y transitorios relacionados con DART-A en TNF-a sérico (<10 pg/ml); al igual que con IL-6, la mayor magnitud en la liberación de TNF-a se observó después de la primera infusión. No hubo cambios relacionados con DART-A en los niveles de IL-5, IL-4, IL-2 o IFN-y durante todo el estudio en comparación con los controles. En conclusión, la liberación de citocinas en respuesta al tratamiento de monos con DART-A fue mínima, transitoria y representó un efecto de primera dosis manejable mediante el aumento de la dosis intrasujeto.

Agotamiento mediado por DART-A de leucocitos CD14'/CD123+ circulantes in vivo

Los niveles absolutos circulantes de células CD14-/CD123+ se midieron a lo largo del estudio como criterio de valoración farmacodinámico. Si bien el número de células CD123+ en el Grupo de control 1 se mantuvo estable a lo largo del tiempo, el tratamiento con DART-A se asoció con un agotamiento extenso de las células CD14-/CD123+ circulantes (94-100 % de la línea de base previa al estudio) observable desde el primer punto de tiempo medido (72 horas) después del inicio de la primera infusión de DART-A (100 ng/kg/día) en todos los animales en todos los grupos de tratamiento activo (Figuras 30A-30C). El agotamiento fue duradero, ya que persistió durante las vacaciones de dosificación semanal de 3 días en el Grupo 2-5, volviendo a los niveles iniciales solo durante el período de recuperación prolongado. Para eliminar la posibilidad del enmascaramiento o modulación por DART-A de CD123 (un escenario poco probable, dados los bajos niveles de DART-A circulante), las pDC se enumeraron mediante el marcador ortogonal, CD303. De acuerdo con los datos de CD123, pDC CD303+ se agotó de manera similar en monos tratados con DART-A (Figuras 30D-30F).

Niveles de linfocitos T circulantes, activación y análisis de subconjuntos

En contraste con el agotamiento persistente de las células CD123+ circulantes, el DART-A administrado en el programa de 4 días con tratamiento/3 días sin tratamiento (Grupos 2-5) se asoció con fluctuaciones semanales en las células T circulantes, mientras que la administración como infusiones continuas de 7 días dio como resultado niveles de células T circulantes disminuidos de manera similar después de la primera administración que se recuperaron lentamente sin fluctuación incluso durante el período de dosificación (Figuras 31A-31C). La diferencia entre las dos estrategias de dosificación indica que el efecto de DART-A en los linfocitos T es consistente con el tráfico y/o la marginación, más que con el agotamiento. Tras el cese de la dosificación, las células T se recuperaron a niveles aproximadamente 2 veces más altos que el valor inicial durante el período de recuperación. La infusión de DART-A se asoció con un aumento de la frecuencia progresiva dependiente de la exposición de las células T que expresan el marcador de activación tardía, PD-1, en particular en las células CD4+, donde el Grupo 6 de dosis presenta los niveles globales más altos (Figuras 31D-31I y Figuras 32A-32F y Figuras 33A-33F). Tim-3, un marcador asociado con el agotamiento de las células T, no se detectó en las células T CD4+ y solo a baja frecuencia entre las células CD8+ (5,5-9,7 %) y que comprende 20,5-35,5 % de las células positivas dobles para CD8+/PD-1+. No hubo cambios consistentes en el marcador de activación de células T temprano, CD69, y solo variaciones moderadas en la expresión de CD25 entre las células circulantes.

Para descartar el agotamiento después de la exposición in vivo, se comparó el potencial citotóxico ex vivo de las células efectoras aisladas de macacos cangrejeros que recibieron múltiples infusiones de DART-A con el de las células de monos sin tratar. Como se muestra en la Figura 34, las PBMC aisladas de monos tratados con DART-A muestran una citotoxicidad comparable a la de las células aisladas de monos sin tratar, lo que indica que la exposición in vivo a DART-A no afecta negativamente la capacidad de las células T para destruir las células diana.

La exposición a DART-A aumentó la frecuencia relativa de las células CD4 de memoria central y las células CD8+ de memoria efectora a expensas de la correspondiente población de células T sin tratar (Figuras 35A-35F y Figuras 32A-32F y Figuras 33A-33F), lo que indica que la exposición a DART-A promovió la expansión y/o movilización de estas células.

Efectos sobre la hematopoyesis y los precursores de la médula ósea

DART-A fue bien tolerado en monos en todas las dosis probadas; sin embargo, se observaron reducciones reversibles en los parámetros de los glóbulos rojos a las dosis más altas (Figuras 36A-36C). El muestreo frecuente de sangre podría haber sido un factor contribuyente potencial, ya que los animales tratados con vehículo mostraron una disminución moderada en la masa de glóbulos rojos. Se observó respuesta de reticulocitos en todos los animales; en la exposición más alta (Grupo 6), sin embargo, la respuesta pareció ligeramente menos robusta para una disminución similar en la masa de glóbulos rojos (Figuras 36D-36F). El análisis morfológico de los frotis de médula ósea a lo largo del estudio no fue destacable. El análisis de citometría de flujo, sin embargo, reveló que la frecuencia de células CD123+ dentro de las poblaciones de médula ósea de linaje inmaduro negativo (Lin-) disminuyó en los animales tratados con DART-A al final del período de dosificación, volviendo a los niveles de línea base al final del tiempo de recuperación (Figura 37A-37B). HSC (definidas como células Lin-/CD34+/CD38-/CD45RA-/CD90+ (Pang, W.W. y otros, (2011) “Human Bone Marrow Hematopoietic Stem Cells Are Increased In Frequency And Myeloid-Biased With Age,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 108:20012-20017)) mostraron una gran variabilidad entre grupos; los monos tratados con DART-A del Grupo 4-6 muestran alguna reducción aparente en comparación con los niveles correspondientes antes de la dosis, sin embargo, no se observó ninguna disminución en todos los grupos tratados en comparación con los animales tratados con vehículo. Estos datos indican que las HSC son menos susceptibles al direccionamiento por DART-A y son consistentes con la reversibilidad observada de los efectos negativos del tratamiento con DART-A sobre la hematopoyesis.

Como se demostró anteriormente, con respecto a las infusiones durante 4 semanas en un programa semanal de 4 días con tratamiento/3 días sin tratamiento o un programa de 7 días con tratamiento a dosis iniciales de 100 ng/kg/día que se aumentaron gradualmente semanalmente a 300, 600 y 1000 ng/kg/día, la administración de DART-A a macacos cangrejeros fue bien tolerada. El agotamiento de las células CD123+ circulantes, incluidas las pDC, se observó después del inicio de la primera administración y persistió durante todo el estudio en todas las dosis y programas. También se observó una reducción reversible del precursor CD123+ de médula ósea. La liberación de citocinas, como un problema de seguridad significativo con las terapias dirigidas a CD3, pareció manejable y consistente con un efecto de primera dosis. Se observó anemia moderada y reversible con las dosis más altas, pero no se observaron otros eventos adversos (dentro o fuera de la diana).

El macaco cangrejero es un modelo animal apropiado para la evaluación farmacológica de DART-A, dada la alta homología entre los ortólogos y la capacidad de DART-A para unirse con afinidad similar a los antígenos y mediar en la destrucción de células T redireccionadas en ambas especies. Además, ambos antígenos se expresan de forma concordante en monos y seres humanos, incluida una expresión similar por precursores hematopoyéticos y en el citoplasma del endotelio de múltiples tejidos. Las excepciones menores son la expresión en células de Leydig testiculares en seres humanos pero no en monos y CD123 bajo o ausente en monocitos de mono en comparación con humanos.

Una preocupación principal asociada con las estrategias terapéuticas que implican la activación de células T incluye la liberación de citocinas y efectos citotóxicos fuera de la diana. Un estudio reciente con un constructo de inmunofusión de scFv biespecífica contra CD3xCD123 con reconocimiento de CD3 bivalente demostró actividad antileucémica in vitro, pero provocó la activación no específica de las células T y la secreción de IFN-^y (Kuo, S.R. y otros, (2012) “Engineering A CD123xCD3 Bispecific scFv Immunofusion For The Treatment Of Leukemia And Elimination Of Leukemia Stem Cells,” Protein Eng. Des. Sei. 25:561-569). La naturaleza monovalente de cada brazo de unión y la forma monomérica altamente homogénea de DART-A aseguran que la activación de células T dependa exclusivamente de acoplamiento de las células diana: no se observó activación de células T en ausencia de células diana o mediante el uso de una molécula de DART de control que incluía sólo el brazo de direccionamiento de CD3. Además, las dosis altas (hasta 100 ug/kg/día) de la molécula DART de control no desencadenaron la liberación de citocinas en macacos cangrejeros.

La dosis inicial de la molécula DART-A de 100 ng/kg/día fue bien tolerada, con una liberación mínima de citocinas. Sin embargo, se produjo una tormenta de citocinas con una dosis inicial alta (5 pg/kg/día); sin embargo, tal dosis podría alcanzarse de manera segura mediante incrementos graduales de dosis semanales, lo que indica que la liberación de citocinas mediada por DART-A parece ser principalmente un efecto de la primera dosis. El agotamiento de las células diana CD123+, eliminando así una fuente de ligación de CD3, puede explicar el efecto de la primera dosis: se observó un agotamiento casi completo de las células CD123+ a dosis tan bajas como 3-10 ng/kg/día, lo que indica que la liberación de citocinas in vivo sigue una dosis-respuesta modificada en comparación con la citotoxicidad. Los perfiles de dosis-respuesta para la citotoxicidad y la liberación de citocinas por las células T humanas también fueron consistentes con esta observación.

La desensibilización de las células T, en la que la regulación positiva de PD1 inducida por DART-A puede desempeñar un papel, parece contribuir también a limitar la liberación de citocinas después de la primera infusión de DART-A. Estudios recientes demuestran que el aumento de la expresión de PD-1 después de la detención de células T inducida por antígenos en los sitios de inflamación contribuye, a través de interacciones con PD-L1, a terminar la señal de detención, lo que libera y desensibiliza de este modo las células (Honda, T. y otros, (2014) “Tuning Of Antigen Sensitivity By T Cell Receptor-Dependent Negative Feedback Controls T Cell Effector Function In Inflamed Tissues,” Immunity 40:235-247; Wei, F. y otros, (2013) “Strength OfPD-1 Signaling Differentially Affects T-Cell Effector Functions,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 110:^e2480-E2489). La respuesta de PD-1 a la fuerza de señalización de TCR no es uniforme: mientras que la proliferación y la producción de citoquinas parecen más sensibles a la inhibición de PD-1, la citotoxicidad es la menos afectada (Wei, F. y otros, (2013) “Strength Of PD-1 Signaling Differentially Affects T-Cell Effector Functions,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 110:E2480-E2489). De manera consistente, el potencial citotóxico ex vivo de las células T de monos expuestos a múltiples infusiones de DART-A fue comparable al de las células T de monos sin tratar, a pesar del aumento de los niveles de PD-1 en los primeros. Además, la regulación positiva de PD-1 no estuvo acompañada por la expresión de TIM3, un sello distintivo del agotamiento de células T, como se muestra para las células T expuestas a una estimulación prolongada con anticuerpos contra CD3 o infecciones crónicas (Gebel, H.M. y otros, (1989) “T Cells From Patients Successfully Treated With OKT3 Do Not React With The T-Cell Receptor Antibody,” Hum. Immunol. 26:123-129; Wherry, E.J. (2011) “T Cell Exhaustion,” Nat. Immunol. 12:492-499).

El agotamiento de las células CD123+ circulantes en los monos tratados con DART-A fue rápido y persistió durante las vacaciones de dosificación semanales en el programa de 4 días con tratamiento/3 días sin tratamiento, consistente con la eliminación de células diana. Por el contrario, las fluctuaciones transitorias en las células T circulantes probablemente fueron el resultado del tráfico desde/hacia tejidos y órganos linfoides como una función de DART-A. La exposición a DART-A promueve la expansión y/o movilización de linfocitos T experimentados con antígenos, células que se alojan preferentemente en los tejidos y ejercen más fácilmente la función efectora citotóxica (Mirenda, V. y otros, (2007) “Physiologic And Aberrant Regulation Of Memory T-Cell Trafficking By The Costimulatory Molecule CD28,” Blood 109:2968-2977; Marelli-Berg, F.M. y otros, (2010) “Memory T-Cell Trafficking: New Directions For Busy Commuters,” Immunology 130:158-165).

El agotamiento de las células normales CD123+ puede acarrear responsabilidades potenciales. Las pDC y los basófilos expresan niveles altos de CD123, en comparación con niveles más bajos en monocitos y eosinófilos (Lopez, A.F. y otros, (1989) “Reciprocal Inhibition Of Binding Between Interleukin 3 And Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor To Human Eosinophils,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:7022-7026; Munoz, L. y otros, (2001) “ Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86:1261-1269; Masten, B.J. y otros, (2006) “Characterization Of Myeloid And Plasmacytoid Dendritic Cells In Human Lung,” J. Immunol. 177:7784-7793; Korpelainen, E.I. y otros, (1995) “Interferon-Gamma Upregulates Interleukin-3 (IL-3) Receptor Expression In Human Endothelial Cells And Synergizes With IL-3 In Stimulating Major Histocompatibility Complex Class II Expression And Cytokine Production,” Blood 86:176-182). Se ha demostrado que las pDC desempeñan un papel en el control de ciertos virus en modelos de infección de ratón o mono, aunque no parecen ser críticos para controlar la respuesta inmunitaria a la gripe (Colonna, M. y otros, (1997) “Specificity And Function Of Immunoglobulin Superfamily NK Cell Inhibitory And Stimulatory Receptors,” Immunol. Rev. 155:127-133; Smit, J.J. y otros, (2006) “Plasmacytoid Dendritic Cells Inhibit Pulmonary Immunopathology And Promote Clearance Of Respiratory Syncytial Virus,” J. Exp. Med. 203:1153-1159). En modelos tumorales, las pDC pueden promover el crecimiento tumoral y la metástasis, mientras que el agotamiento de pDC dio como resultado la inhibición tumoral (Sawant, A. y otros, (2012) “Depletion Of Plasmacytoid Dendritic Cells Inhibits Tumor Growth And Prevents Bone Metastasis Of Breast Cancer Cells,” J. Immunol. 189:4258-4265). En algunos monos tratados con DART-A se observó inflamación facial transitoria, moderada e independiente de dosis; sin embargo, no se observó aumento de los niveles de histamina en estos monos o cuando se lisaron basófilos humanos mediante la destrucción de células T mediada por DART-A. El agotamiento de los monocitos puede conllevar un mayor riesgo de infección; por lo tanto, debe monitorearse la consecuencia del agotamiento de pDC, basófilos o eosinófilos en seres humanos.

Los precursores hematopoyéticos comprometidos que expresan CD123, tal como el precursor mieloide común (CMP) (Jordan, C.T. y otros, (2000) “The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells,” Leukemia 14:1777-1784; Rieger, M.A. y otros, (2012) “Hematopoiesis,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4:a008250), pueden ser direccionados por DART-A, una posible explicación de la anemia moderada observada después de la administración de DART-A en la dosis más alta. La respuesta de los reticulocitos eritropoyéticos pareció funcionar en todos los niveles de dosis de DART-A; sin embargo, para las caídas proporcionales en los parámetros de los glóbulos rojos, los animales sometidos a la mayor exposición a DART-A (Grupo 6, infusión de 7 días con tratamiento) mostraron una reducción de la respuesta de reticulocitos, lo que sugiere una posible actividad citotóxica sobre los precursores (por ejemplo, CMP). El efecto fue reversible después de la interrupción del tratamiento con DART-A, de acuerdo con la repoblación de las HSC CD1231bajas/negativas salvadas.

Los enfoques alternativos para el agotamiento de las células CD123+ incluyen un anticuerpo monoclonal mejorado con Fc específico para CD123 de segunda generación (Jin, L. y otros, (2009) “Monoclonal Antibody-Mediated Targeting Of CD123, IL-3 Receptor Alpha Chain, Eliminates Human Acute Myeloid Leukemic Stem Cells,” Cell Stem Cell 5:31-42; Roberts, A. W. y otros, (2010) “A Phase I Study Of Anti-CD123 Monoclonal Antibody (mAb) CSL360 Targeting Leukemia Stem Cells (LSC) In AML,” J. Clin. Oncol. 28(Supl):el3012), toxina diftérica unida a IL-3 (Frankel, A. y otros, (2008) “Phase I Clinical Study Of Diphtheria Toxin-Interleukin 3 Fusion Protein In Patients With Acute Myeloid Leukemia And Myelodysplasia,” Leuk. Lymphoma 49:543-553), células asesinas inducidas por citocinas (CIK) que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) específicos para CD123 (Tettamanti, S. y otros, (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401) y células T CAR CD123 (Gill, S. y otros, (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Norma1Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,” Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. y otros, (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un diacuerpo que puede unirse de manera específica a un epítopo de CD123 y a un epítopo de CD3, en donde el diacuerpo comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, unidas covalentemente entre sí, en donde:

A. la primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal:

i. un Dominio 1, que comprende

(1) un subdominio (1A), que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VLcd³) y que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:21; y (2) un subdominio (1B), que comprende un Dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VH^cd-¹²³) y que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26, en donde dichos subdominios 1A e 1B están separados entre sí por un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29;

ii. un Dominio 2, en donde dicho Dominio 2 es un Dominio en espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:34 o un Dominio en espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:35, en donde dicho Dominio 2 está separado de dicho Dominio 1 por un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:30; y

B. la segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal:

i. un Dominio 1, que comprende

(1) un subdominio (1A), que comprende un Dominio VL de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD123 (VL^cd123) y que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:25; y

(2) un subdominio (IB), que comprende un dominio VH de un anticuerpo monoclonal que puede unirse a CD3 (VHcd³) y que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22, en donde dichos subdominios 1A e IB están separados entre sí por un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29;

ii. un Dominio 2, en donde dicho Dominio 2 es un Dominio en espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:35 o un Dominio en espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:34, en donde dicho Dominio 2 está separado de dicho Dominio 1 por un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:30; y en donde dicho Dominio 2 de dichas primera y segunda cadenas polipeptídicas no son ambos Dominios en espiral E o ambos Dominios en espiral K,

y en donde:

(a) dicho Dominio VL de dicha primera cadena polipeptídica y dicho Dominio VH de dicha segunda cadena polipeptídica forman un dominio de unión a antígeno que puede unirse específicamente a un epítopo de CD3; y

(b) dicho Dominio VL de dicha segunda cadena polipeptídica y dicho Dominio VH de dicha primera cadena polipeptídica forman un dominio de unión a antígeno que puede unirse específicamente a un epítopo de C^d 123.

2. El diacuerpo de la reivindicación 1, en donde dicha primera cadena polipeptídica comprende además un dominio de unión a albúmina que tiene la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO:36 unido a dicho Dominio 2 a través de un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:31.

3. El diacuerpo de la reivindicación 1, en donde dicha segunda cadena polipeptídica comprende además un Dominio 3 que comprende un Dominio CH2 y CH3 de un Dominio Fc de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:37, en donde dicho Dominio 3 está unido a dicho Dominio 1 a través de un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:33.

4. El diacuerpo de la reivindicación 1, en donde dicha primera cadena polipeptídica comprende además un Dominio 3 que comprende un Dominio CH2 y CH3 de un Dominio Fc de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:37, en donde dicho Dominio 3 está unido a dicho Dominio 1 a través de un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:33.

5. El diacuerpo de la reivindicación 1, en donde dicha segunda cadena polipeptídica comprende además un Dominio 3 que comprende un Dominio CH2 y CH3 de un Dominio Fc de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:37, en donde dicho Dominio 3 está unido a dicho Dominio 2 a través de un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:32.

6. El diacuerpo de la reivindicación 1, en donde dicha primera cadena polipeptídica comprende además un Dominio 3 que comprende un Dominio CH2 y CH3 de un Dominio Fc de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:37, en donde dicho Dominio 3 está unido a dicho Dominio 2 a través un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:32.

7. El diacuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en donde dicho diacuerpo comprende además una tercera cadena polipeptídica que comprende un Dominio CH2 y CH3 de un Dominio Fc de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.

8. El diacuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 3-7, que comprende además un péptido que contiene cisteína N-terminal a dicho Dominio CH2 y CH3 de dicho Dominio Fc de inmunoglobulina, donde dicho péptido que contiene cisteína tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:55.

9. El diacuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho Dominio 2 de dicha primera cadena polipeptídica es un Dominio en espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:35 y dicho Dominio 2 de dicha segunda cadena polipeptídica es un Dominio en espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:34.

10. El diacuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho Dominio 2 de dicha primera cadena polipeptídica es un Dominio en espiral E que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:34 y dicho Dominio 2 de dicha segunda cadena polipeptídica es un Dominio en espiral K que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:35.

11. El diacuerpo de cualquier reivindicación anterior, en donde el diacuerpo puede reaccionar de forma cruzada con las proteínas CD123 y CD3 tanto humanas como de primates.

12. El diacuerpo de la reivindicación 1, en donde:

A. la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1; y

B. la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3.

13. El diacuerpo de la reivindicación 1, en donde el diacuerpo comprende además una tercera cadena polipeptídica, en donde:

A. la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15;

B. la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:13; y

C. la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:54.

14. El diacuerpo de la reivindicación 1, en donde el diacuerpo comprende además una tercera cadena polipeptídica, en donde:

A. la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1;

B. la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17; y

C. la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:54.

15. El diacuerpo de cualquier reivindicación anterior para el uso como un medicamento.

16. El diacuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para el uso en el tratamiento de una enfermedad o afección asociada o caracterizada por la expresión de CD123, en donde dicha enfermedad o afección es cáncer o una afección inflamatoria.

17. El diacuerpo para el uso de la reivindicación 16, en donde dicha enfermedad o afección es cáncer y dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en: leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), incluida la crisis blástica de CML y el oncogén de Abelson asociado con CML (translocación de Bcr-ABL), síndrome de mielodisplasia (MDS), leucemia linfoblástica B aguda (B-ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), incluido el síndrome de Richter o la transformación de Richter de CLL, leucemia de células pilosas (HCL), neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (BPDCN), linfoma no Hodgkin (NHL), incluida la leucemia de células del manto (MCL) y linfoma linfocítico pequeño (SLL), linfoma de Hodgkin, mastocitosis sistémica y linfoma de Burkitt.

18. El diacuerpo para el uso de la reivindicación 16, en donde dicha enfermedad o afección es dicha afección inflamatoria y dicha afección inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en: Lupus autoinmunitario (SLE), alergia, asma y artritis reumatoide.

19. Una composición farmacéutica que comprende el diacuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y un portador fisiológicamente aceptable.

20. La composición farmacéutica de la reivindicación 19 para el uso en el tratamiento de una enfermedad o afección asociada o caracterizada por la expresión de CD123, en donde dicha enfermedad o afección es cáncer o una afección inflamatoria.

21. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 20, en donde dicha enfermedad o afección es cáncer y en donde dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en: leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), incluida la crisis blástica de CML y el oncogén de Abelson asociado con CML (translocación de Bcr-ABL), síndrome de mielodisplasia (MDS), leucemia linfoblástica B aguda (B-ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), incluido el síndrome de Richter o la transformación de Richter de CLL, leucemia de células pilosas (HCL), neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (BPDCN), linfoma no Hodgkin (NHL), incluida la leucemia de células del manto (MCL) y linfoma linfocítico pequeño (SLL), linfoma de Hodgkin, mastocitosis sistémica y linfoma de Burkitt.

22. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 20, en donde dicha enfermedad o afección es dicha afección inflamatoria y en donde dicha afección inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en: Lupus autoinmunitario (SLE), alergia, asma y artritis reumatoide.