KR20160045135A - Gpa33 및 cd3에 결합할 수 있는 이중특이성 1가 디아바디 및 그것의 용도 - Google Patents

Gpa33 및 cd3에 결합할 수 있는 이중특이성 1가 디아바디 및 그것의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고 CD3의 에피토프에 특이적인 적어도 하나의 결합 부위 및 gpA33의 에피토프에 대한 하나의 결합 부위를 가지는 이중특이성 1가 디아바디 (즉 "gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디")에 관련된다. 본 발명은 또한 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하고 ("이중특이성 1가 Fc 디아바디") 3개의 폴리펩티드 사슬로 구성되며 gpA33의 에피토프에 특이적인 적어도 하나의 결합 부위 및 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 가지는 이중특이성 1가 디아바디 (즉 "gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디")에도 관련된다. 본 발명의 이중특이성 1가 디아바디 및 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 gpA33 및 CD3에 동시에 결합할 수 있다. 바령은 그런 이중특이성 1가 디아바디 또는 그런 이중특이성 1가 Fc 디아바디를 함유하는 약학 조성물에 관련된다. 발명은 추가로 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에 그런 디아바디들을 사용하는 방법에도 관련된다.

Description

GPA33 및 CD3에 결합할 수 있는 이중특이성 1가 디아바디 및 그것의 용도{BI-SPECIFIC MONOVALENT DIABODIES THAT ARE CAPABLE OF BINDING TO GPA33 AND CD3, AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 교차 -참조
본 출원은 미국 특허 출원 번호 61/869,528 (2013년 8월 23일 출원; 계류중) 및 61/907,691 (2013년 11월 22일 출원; 계류중), 및 유럽 특허 출원 번호 13198859 (2013년 12월 20일 출원)에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원들은 각각 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
서열 목록에 대한 참조 :
본 출원은 37 C.F.R. 1.821 (이하 참조)에 따르는 하나 또는 그 이상의 서열 목록을 포함하며, 그것들은 서류 및 컴퓨터-판독가능한 매체 둘 다에 개시되고, 그 서류 및 컴퓨터-판독가능한 개시물은 전체가 참조로 본원에 포함된다.
기술분야:
본 발명은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고 gpA33의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위 및 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 가지는 이중특이성 1가 디아바디 (즉 "gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디")에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하고 ("이중특이성 1가 Fc 디아바디") 3개의 폴리펩티드 사슬로 구성되며 gpA33의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위 및 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 가지는 이중특이성 1가 디아바디 (즉 "gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디")에 관한 것이다. 본 발명의 이중특이성 1가 디아바디 및 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 gpA33 및 CD3에 동시에 결합할 수 있다. 발명은 그런 이중특이성 1가 디아바디 또는 그런 이중특이성 1가 Fc 디아바디를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 발명은 추가로 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에 그런 디아바디들을 사용하는 방법에 관한 것이다.
I. gpA33
결장직장암은 서구에서 가장 보편적인 종양들 중 하나이며 암으로 인한 사망의 주된 원인이다 (Silverberg, E. et al. (1989) "Cancer Statistics, 1989," CA Cancer J Clin. 39(1):3-20). 결장암에 잠재적으로 유용한 한 가지 표적은 43kD 경막 당단백질 A33 (gpA33)이다 (Heath, J.K. et al. (1997) "The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) "Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium," Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686). gpA33은 처음에 인간 췌장암종 유도 셀라인 ASPC1에 대해 발생된 단클론성 쥐과 항체들을 통해 발견되었다. 한 항체 (MAb A33)가 43 kDa의 표면 세포 단백질과 반응하는 것으로 밝혀졌고, 그래서 "gpA33"으로 표시되었다 (Wong, N.A. et al. (2006) "EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia," J. Clin. Pathol. 59(3):260-263).
gpA33은 접합부 접착 분자 (junctional adhesion molecule) 패밀리의 경막 단백질이다; Abud, H.E. et al. (2000) "The Murine A33 Antigen Is Expressed At Two Distinct Sites During Development, The ICM Of The Blastocyst And The Intestinal Epithelium," Mech. Dev. 98(1-2):111-114; Barendswaard, E.C. et al. (1998) "Rapid And Specific Targeting Of Monoclonal Antibody A33 To A Colon Cancer Xenograft In Nude Mice," Int. J. Oncol. 12(1):45-53; Panjideh, H. et al. (2008) "Biodistribution And Efficacy Of [131I] A33scFv :: CDy , A Recombinant Antibody-Enzyme Protein For Colon Cancer," Int. J. Oncol. 32(4):925-930). 비록 A33 항원의 기능적 중요성은 아직 밝혀지지 않았지만, 그것은 대장염의 동물 모델에서 결장의 점막 수복을 중재하는 것으로 밝혀졌고 모든 결장직장 암종의 95% 이상에서 동질적으로 발현된다. A33 발현은 두 가지 질환 단계 및 조직학적 분화 정도를 가로질러 균일하고, 그 항원은 검출가능하게 분비되거나 혈류 안으로 흐르지 않는다 (Infante, J.R. et al. (2013) "Safety, Pharmacokinetics And Pharmacodynamics Of The Anti-A33 Fully-Human Monoclonal Antibody, KRN330 , In Patients With Advanced Colorectal Cancer," Eur. J. Cancer. 49(6):1169-1175; Panjideh, H. et al. (2008) "Biodistribution And Efficacy Of [131I]A33scFv::CDy, A Recombinant Antibody-Enzyme Protein For Colon Cancer,"Int. J. Oncol. 32(4):925-930). 역으로, 단지 몇 가지 경우에만 비-위장성 A33 항원 발현이 확인되었다 (Johnstone, C.N. et al. (2000) "Characterization Of Mouse A33 Antigen, A Definitive Marker For Basolateral Surfaces Of Intestinal Epithelial 세포," Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 279(3):G500-G510).
A33 항원의 고도로 제한된 발현의 관점에서, 연구자들은 A33-관련 암을 항체들로 치료하는 가능성을 모색하였다 (Infante, J.R. et al. (2013) "Safety, Pharmacokinetics And Pharmacodynamics Of The Anti-A33 Fully-Human Monoclonal Antibody, KRN330 , In Patients With Advanced Colorectal Cancer," Eur. J. Cancer. 49(6):1169-1175; Ackerman, M.E. et al. (2008) "A33 Antigen Displays Persistent Surface Expression," Cancer Immunol. Immunother. 57(7):1017-1027;Barendswaard, E.C. et al. (2001) "Relative Therapeutic Efficacy Of (125)I- And ( 131)I -Labeled Monoclonal Antibody A33 In A Human Colon Cancer Xenograft," J. Nucl. Med. 42(8):1251-1256; Carrasquillo, J.A. et al. (2011) "(124)I-huA33 Antibody PET Of Colorectal Cancer," J. Nucl. Med. 52(8):1173-1180; Chong, G. et al. (2005) "Phase I Trial Of 131I- HuA33 In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma," Clin. Cancer Res. 11(13):4818-4826; Deckert, P.M. et al. (2000) "Pharmacokinetics And Microdistribution Of Polyethylene Glycol-Modified Humanized A33 Antibody Targeting Colon Cancer Xenografts," Int. J. Cancer. 87(3):382-390; Johnston, A.P. et al. (2012) "Targeting Cancer 세포: Controlling The Binding And Internalization Of Antibody- Functionalized Capsules" ACS Nano. 6(8):6667-6674; Koppe, M.J. et al. (2005) "Radioimmunotherapy And Colorectal Cancer," Br. J. Surg. Mar;92(3):264-276; Sakamoto, J. et al. (2006) "A Phase I Radioimmunolocalization Trial Of Humanized Monoclonal Antibody HuA33 In Patients With Gastric Carcinoma," Cancer Sci. 97(11):1248-1254; Scott, A.M. et al. (2005) "A Phase I Trial Of Humanized Monoclonal Antibody A33 In Patients With Colorectal Carcinoma: Biodistribution, Pharmacokinetics , And Quantitative Tumor Uptake," Clin. Cancer Res. 11(13):4810-4817; Tschmelitsch, J. et al. (1997) "Enhanced Antitumor Activity Of Combination Radioimmunotherapy ( 131 I-Labeled Monoclonal Antibody A33) With Chemotherapy ( Fluorouracil ),"Cancer Res. 57(11):2181-2186). 마찬가지로 그런 항체들의 단편은 또한 그것들의 잠재적인 치료적 역할에 대해 평가되었다 (Coelho, V. et al. (2007) "Design, Construction, And In Vitro Analysis Of A33scFv :: CDy , A Recombinant Fusion Protein For Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy In Colon Cancer," Int. J. Oncol. 31(4):951-957).
II. CD3
CD3은 4개의 구별되는 사슬로 구성된 T 세포 공-수용체이다 (Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1-14; Chetty, R. et al. (1994) "CD3: Structure, Function And The Role Of Immunostaining In Clinical Practice," J. Pathol. 173:303-307).
포유류에서, 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬 및 2개의 CD3ε 사슬을 함유한다. 이들 사슬은 T 림프구에서 활성화 신호를 생성하기 위하여 T 세포 수용체 (TCR)로서 알려진 분자와 결합한다. CD3가 없을 때, TCR은 적절하게 조립하지 못하고 분해된다 (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer," Immunology 129(2):170-177). CD3은 모든 성숙한 T 세포의 막에 결합되고, 실제로 다른 세포 유형에는 결합되지 않는 것으로 나타난다 (Janeway, C.A. et al. (2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease," 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214- 216; Sun, Z. J. et al. (2001) "Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3?:? Heterodimer," Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) "Deconstructing The Form And Function Of The TCR /CD3 Complex," Immunity. 2006 Feb;24(2):133-139 참조).
III. 이중특이성 디아바디
항원의 에피토프에 결합하는 무상의 비변형 항체 (예컨대 IgG)의 능력은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 상의 가변 도메인 (즉 각각 VL 및 VH 도메인)의 존재에 따라 좌우된다. 디아바디의 디자인은 단일 사슬 Fv 구성물 (scFv)을 기초로 한다 (예컨대 Holliger et al. (1993) "'Diabodies ': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 특허 공보 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti- CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv - Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange," Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944 참조).
항체 경쇄 및 항체 중쇄의 상호작용, 및 특히 그것의 VL 및 VH 도메인의 상호작용은 항체의 에피토프 결합 부위들 중 하나를 형성한다. 대조적으로, scFv 구성물은 단일 폴리펩티드 사슬에 함유된 항체의 VL 및 VH 도메인들을 포함하고, 이때 그 도메인들은 충분한 길이의 가요성 링커에 의해 분리되어 두 도메인의 기능성 에피토프 결합 부위로의 자체-조립이 허용된다. VL 및 VH 도메인의 자체-조립이 불충분한 길이 (약 12 아미노산 잔기 미만)의 링커로 인해 불가능하게 되는 경우에, scFv 구성물들 중 2개가 다른 하나와 상호작용하여 한 사슬의 VL이 다른 사슬의 VH와 결합하는 2가 분자를 형성하게 된다 (Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG -Like Bispecific Antibodies," Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658에 개관됨).
천연 항체는 단지 하나의 에피토프 종에 결합할 수 있지만 (즉 단일-특이성), 그것은 그 종의 다수의 복사물에 결합할 수 있다 (즉 2-가 또는 다-가를 나타냄). 기술분야는 둘 또는 그 이상의 상이한 에피토프 종에 결합할 수 있는 데에서 그런 천연 항체들과 상이한 디아바디를 생성할 수 있는 (즉 2-가 또는 다-가 외에 이중특이성 또는 다중특이성을 나타내는) 능력에 주목하였다 (예컨대 Holliger et al. (1993) "'Diabodies ': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Mertens, N. et al., "New Recombinant Bi - and Trispecific Antibody Derivatives," In: Novel Frontiers In The Production Of Compounds For Biomedical Use, A. VanBroekhoven et al. (Eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands (2001), pages 195-208; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv - Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange," Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944 참조).
비-단일특이성 디아바디의 제공은 중요한 장점: 상이한 에피토프들을 발현하는 세포를 공동-결찰하고 동시-위치시키는 능력을 제공한다. 그러므로 이가 디아바디는 치료법 및 면역진단을 포함하여 광범위한 용도를 가진다. 2-가는 디양한 용도에서 디아바디의 디자인 및 엔지니어링 (engineering)에 대단한 유연성을 허용하며, 그것은 다량체 항원, 상이한 항원들의 교차결합, 및 두 가지 표적 항원의 존재에 의존하는 특이한 세포 유형들의 지정된 표적화에 대한 증강된 결합력을 제공한다. 증가된 결합가, 낮은 분해 속도 및 순환계로부터의 신속한 클리어런스 (clearance)로 인해 (~50 kDa 이하의 작은 분자의 디아바디의 경우), 기술분야에 공지된 디아바디 분자들은 또한 종양 영상 분야에서 특별한 용도를 나타냈다 (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris ," Protein Eng. 10:1221). 특히 중요한 것은 상이한 세포들의 공동-결찰, 예를 들면 세포독성 T-세포들의 종양 세포에의 교차결합이다 (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells," Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9:299-305).
디아바디 에피토프 결합 도메인들은 또한 T 림프구, 천연 킬러 (NK) 세포 또는 다른 단핵 세포 상에 발현되는, CD3, CD16, CD32 또는 CD64와 같은 어떠한 면역 이펙터 세포의 표면 결정기에 대해 지시될 수 있다. 많은 연구에서, 이펙터 세포 결정기들, 예컨대 Fcγ 수용체 (FcγR)에 결합하는 디아바디는 또한 이펙터 세포를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다 (Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody ," Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) " Carcinoembryonic Antigen ( CEA )-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti- CEA Bispecific Fusion Proteins," Cancer Res. 59:2909-2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). 정상적으로, 이펙터 세포 활성화는 Fc-FcγR 상호작용을 통한 항원 결합된 항체의 이펙터 세포에의 결합에 의해 야기되고; 그로써 이런 관점에서, 발명의 디아바디 분자들은 그것들이 Fc 도메인을 포함하는 것과는 무관하게 Ig-유사 기능성을 나타낼 수 있다 (예컨대 기술분야에 공지된 어떠한 이펙터 기능 분석에서 분석되거나 본원에서 예시된 것과 같이 (예컨대 ADCC 분석)). 종양과 이펙터 세포를 교차결합시킴으로써, 디아바디는 종양 세포와 근접한 곳으로 이펙터 세포를 가져올 뿐만 아니라 효과적인 종양 사멸을 유도한다 (예컨대 Cao et al. (2003) " Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics," Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197 참조).
그러나, 상기의 장점들은 가장 중요한 비용에 직면하게 된다. 그런 비-단일특이성 디아바디의 형성은 둘 또는 그 이상의 뚜렷하고 상이한 폴리펩티드의 연속적인 조립을 필요로 한다 (즉 그런 형성은 디아바디가 상이한 폴리펩티드 사슬 종들의 이종이량체화 (heterodimerization)를 통해 형성될 것을 필요로 한다). 이런 사실은 동일한 폴리펩티드 사슬들의 동종이량체화를 통해 형성되는 단일-특이성 디아바디와는 대조적이다. 비-단일특이성 디아바디를 형성하기 위하여 적어도 2개의 다른 폴리펩티드 (즉 두 개의 폴리펩티드 종)가 제공되어야 하기 때문에, 그리고 그런 폴리펩티드들의 동종이량체화가 비활성 분자를 유도하기 때문에 (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588), 그런 폴리펩티드의 제조는 동일한 종의 폴리펩티드들 사이의 공유 결합을 방지하기 위한 것과 같은 방식으로 이루어져야만 한다 (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588). 그러므로 기술분야는 그런 폴리펩티드들의 비-공유 결합을 교시한다 (예컨대 Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조).
그러나, 기술분야는 비-공유적으로 결합된 폴리펩티드들로 구성된 이중특이성 1가 디아바디가 불안정하고 쉽게 비-기능성 단량체들로 분해된다는 것을 인식하였다 (예컨대 Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조).
이런 도전에 직면하여, 기술분야는 안정되고, 공유적으로 결합된 이종이량체 비-단일특이성 디아바디의 개발에 성공하였다 (예컨대 WO 2006/113665; WO/2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO/2012/162068; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv -Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion," J. Molec. Biol. 399(3):436-449; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb ( CD32B ) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; 미국 특허 공보 번호 2012/0294796 및 2013/0149236 참조). 그런 접근법들은 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 각각의 사용된 폴리펩티드 종 (species)으로 엔지니어링하는 것을 포함한다. 예를 들어, 그런 구성물의 C-말단에 시스테인 잔기를 첨가하는 것은 폴리펩티드 사슬들 사이의 이황화 결합을 허용하여, 그 결과 생성된 이종이량체를, 2가 분자의 결합 특성을 간섭하지 않으면서 안정화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
디아바디 및 다른 면역글로불린들은 gpA33 및 CD3의 둘 다 또는 어느 하나에 대한 특이성을 갖는 취지로 기술되었다 (예컨대 미국 특허 공보 번호 2012/0014957; 2012/0034160; 2012/0087858; 2012/0189541; 2012/0195900; 2012/0201746; 2012/0237442; 2012/0263722; 2012/0258108; 및 2012/0276608 참조).
그런 성공에도 불구하고, 안정하고, 기능적인 이종이량체의, 비-단일특이성 디아바디의 제조는 폴리펩티드 사슬들에 사용된 도메인들의 세심한 고려 및 배치에 의해 추가로 개선될 수 있다. 그러므로 본 발명은 공유 결합을 통해, 이종이량체 디아바디 및 gpA33 및 CD3에 동시에 결합할 수 있는 이종이량체 Fc 디아바디를 형성하기 위해 특별히 고안된 특수한 폴리펩티드를 제공하는 것에 향해 있다.
발명의 요약
발명은 "gpA33 x CD3이중특이성 1가 디아바디"에 향해 있다. 특정 구체에에서, 본 발명의 디아바디는 생체 내에서 반감기를 연장하기 위하여 추가로 면역글로불린 Fc 영역의 도메인 (즉 "Fc 도메인")을 가지거나 ("gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디") 또는 알부민-결합 도메인 ("ABD")을 가진다 ("ABD를 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디"). 발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 및 발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 gpA33의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위 및 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 형성하기 위하여 이종이량체 방식으로 서로와 결합하는 2개의 상이한 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 그러므로 발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 및 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 gpA33의 에피토프의 단지 하나의 복사물 및 CD3의 에피토프의 단지 하나의 복사물에만 결합할 수 있다는 점에서 1가지만, 단일 디아바디가 gpA33의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 점에서 이중특이성이다.
발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디는, 예를 들어 각각의 폴리펩티드 사슬 내에 위치한 시스테인 잔기들의 이황화 결합에 의해 서로에 공유 결합되어 있는 2개의 폴리펩티드 사슬 ("제 1" 및 "제 2" 폴리펩티드 사슬)로 구성된다. 발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 3개의 폴리펩티드 사슬 ("제 1", "제 2" 및 "제 3" 폴리펩티드 사슬)로 구성되고, 이때 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유 결합되어 있고 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유 결합되어 있다. 본 발명의 이중특이성 1가 디아바디 및 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 gpA33 및 CD3에 동시에 결합할 수 있다. 발명은 그런 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 및 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디, 및 그런 이중특이성 1가 디아바디 또는 그런 이중특이성 1가 Fc 디아바디를 함유하는 약학 조성물에 관련된다. 발명은 추가로 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에 그런 디아바디들을 사용하는 방법에도 관련된다.
상세하게 설명하자면, 발명은 이중특이성 1가 Fc 디아바디를 제공하는데, 그 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 gpA33의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고, 이중특이성 1가 디아바디는 제 1 폴리펩티드 사슬 및 제 2 폴리펩티드 사슬을 가지며, 그 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유 결합되어 있고, 이때
A. 제 1 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
i. CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLCD3) (SEQ ID NO:5)을 포함하는 하위도메인 (1A); 및 gpA33에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHgpA33) (SEQ ID NO:27)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하며; 그 하위도메인들 (1A 및 1B)은 펩티드 링커 (SEQ ID NO:1)에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1;
ii. K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4) 또는 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3)인 도메인 2로서, 그 도메인 2는 펩티드 링커 (SEQ ID NO:2)에 의해 도메인 1과 분리되어 있는 도메인 2를 포함하고;
B. 제 2 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
i. gpA33에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26)을 포함하는 하위도메인 (1A); 및 CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHCD3) (SEQ ID NO:25)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하며, 그 하위도메인들 (1A 및 1B)은 펩티드 링커 (SEQ ID NO:1)에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1;
ii. E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3) 또는 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4)인 도메인 2로서, 그 도메인 2는 펩티드 링커 (SEQ ID NO:2)에 의해 도메인 1과 분리되어 있고; 제 1 폴리펩티드 사슬의 도메인 2 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 도메인 2는 둘 다 E-코일 도메인이 아니거나 둘 다 K-코일 도메인이 아닌 도메인 2를 포함하며;
(a) 제 1 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인은 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 형성하고;
(b) 제 1 폴리펩티드 사슬의 상기 VH 도메인 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 상기 VL 도메인은 gpA33의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 형성한다.
발명은 추가로 상기-기술된 이중특이성 1가 디아바디의 구체예에 관련되는데, 이때 제 1 폴리펩티드 사슬 또는 제 2 폴리펩티드 사슬은 링커 3 (SEQ ID NO:32)을 통해 도메인 2에 C-말단적으로 또는 도메인 1A에 N-말단적으로 연결된 알부민-결합 도메인 (SEQ ID NO:34)을 포함한다.
발명은 추가로 이중특이성 1가 Fc 디아바디에 관련되는데, 이때 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 gpA33의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고, IgG Fc 도메인을 가지며, 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 제 1 폴리펩티드 사슬, 제 2 폴리펩티드 사슬 및 제 3 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 이때 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유 결합되어 있으며 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유 결합되어 있고,
A. 제 1 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
i. gpA33에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26)을 포함하는 하위도메인 (1A) 및 CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHCD3) (SEQ ID NO:25)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하며; 그 하위도메인들 (1A 및 1B)은 펩티드 링커 (SEQ ID NO:1)에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1;
ii. E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3) 또는 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4)인 도메인 2로서, 그 도메인 2는 펩티드 링커 (SEQ ID NO:2)에 의해 도메인 1과 분리되어 있는 도메인 2; 및
iii. 시스테인-함유 펩티드 (펩티드 1) (SEQ ID NO:39)를 포함하는 하위도메인 (3A) 및 IgG 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인을 가지는 IgG Fc 도메인의 폴리펩티드 부분을 포함하는 하위 도메인 (3B)을 포함하는 도메인 3으로서, 도메인 3과 도메인 2는 스페이서 펩티드 (링커 5)(SEQ ID NO:33)에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 3을 포함하고;
B. 제 2 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
i. CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLCD3) (SEQ ID NO:5)을 포함하는 하위도메인 (1A) 및 gpA33에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHgpA33) (SEQ ID NO:27)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하며; 그 하위도메인들 (1A 및 1B)은 펩티드 링커 (SEQ ID NO:1)에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1;
ii. K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4) 또는 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3)인 도메인 2로서, 그 도메인 2는 펩티드 링커 (SEQ ID NO:2)에 의해 도메인 1과 분리되어 있고; 제 1 폴리펩티드 사슬의 도메인 2 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 도메인 2는 둘 다 E-코일 도메인이 아니거나 둘 다 K-코일 도메인이 아닌 도메인 2를 포함하며;
C. 제 3 폴리펩티드 사슬은 N-말단 방향에서 C-말단 방향으로:
(1) 시스테인-함유 펩티드 (펩티드 1) (SEQ ID NO:39)를 포함하는 하위도메인 (3A); 및
(2) IgG 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인을 가지는 IgG Fc 도메인의 폴리펩티드 부분을 포함하는 하위도메인 (3B)을 포함하는 도메인 3을 포함하고;
(a) 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 IgG Fc 도메인들의 폴리펩티드 부분은 IgG Fc 도메인을 형성하며;
(b) 제 1 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인은 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 형성하고;
(c) 제 1 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인은 gpA33의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 형성한다.
발명은 추가로 이중특이성 1가 Fc 디아바디에 관련되는데, 이때 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 gpA33의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고, IgG Fc 도메인을 가지며, 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 제 1 폴리펩티드 사슬, 제 2 폴리펩티드 사슬 및 제 3 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 이때 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유 결합되어 있으며 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유 결합되어 있고,
A. 제 1 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
i. 시스테인-함유 펩티드 (펩티드 1) (SEQ ID NO:39)를 포함하는 하위도메인 (3A) 및 IgG 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인을 가지는 IgG Fc 도메인의 폴리펩티드 부분을 포함하는 하위 도메인 (3B)을 포함하는 도메인 3;
ii. gpA33에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26)을 포함하는 하위도메인 (1A) 및 CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHCD3) (SEQ ID NO:25)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하며, 그 하위도메인들 (1A 및 1B)은 펩티드 링커 (SEQ ID NO:1)에 의해 서로 분리되어 있고; 도메인 1 및 3은 스페이서 펩티드 (링커 4) (SEQ ID NO:38)에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1;
iii. E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3) 또는 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4)인 도메인 2로서, 그 도메인 2는 펩티드 링커 (SEQ ID NO:2)에 의해 도메인 1과 분리되어 있는 도메인 2를 포함하고;
B. 제 2 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
i. CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLCD3) (SEQ ID NO:5)을 포함하는 하위도메인 (1A) 및 gpA33에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHgpA33) (SEQ ID NO:27)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하며; 그 하위도메인들 (1A 및 1B)은 펩티드 링커 (SEQ ID NO:1)에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1;
ii. K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4) 또는 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3)인 도메인 2로서, 그 도메인 2는 펩티드 링커 (SEQ ID NO:2)에 의해 도메인 1과 분리되어 있고; 제 1 폴리펩티드 사슬의 도메인 2 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 도메인 2는 둘 다 E-코일 도메인이 아니거나 둘 다 K-코일 도메인이 아닌 도메인 2를 포함하며;
C. 제 3 폴리펩티드 사슬은 N-말단 방향에서 C-말단 방향으로:
(1) 시스테인-함유 펩티드 (펩티드 1) (SEQ ID NO:39)를 포함하는 하위도메인 (3A); 및
(2) IgG 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인을 가지는 IgG Fc 도메인의 폴리펩티드 부분을 포함하는 하위도메인 (3B)을 포함하는 도메인 3을 포함하고;
(a) 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 IgG Fc 도메인들의 폴리펩티드 부분은 IgG Fc 도메인을 형성하며;
(b) 제 1 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인은 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 형성하고;
(c) 제 1 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인은 gpA33의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 형성한다.
발명은 추가로 상기-기술된 이중특이성 1가 디아바디들 중 어느 것의 구체예들에 관련되고, 이때 제 1 폴리펩티드 사슬의 하위도메인 (3B)은 제 3 폴리펩티드 사슬의 하위도메인 (3B)과 상이한 서열을 포함한다.
발명은 추가로 그런 상기-기술된 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 구체예들에 관련되는데, 여기서 제 1 폴리펩티드 사슬의 하위도메인 (3B)은 SEQ ID NO:40의 아미노산을 가지며, 제 3 폴리펩티드 사슬의 하위도메인 (3B)은 SEQ ID N0:41의 아미노산 서열을 가진다.
발명은 추가로 그런 상기-기술된 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 구체예들에 관련되는데, 여기서 제 1 폴리펩티드 사슬의 하위도메인 (3B)은 SEQ ID NO:41의 아미노산을 가지며, 제 3 폴리펩티드 사슬의 하위도메인 (3B)은 SEQ ID N0:40의 아미노산 서열을 가진다.
발명은 추가로 그런 상기-기술된 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 구체예들에 관련되는데, 여기서 제 1 폴리펩티드 사슬의 도메인 3 및/또는 제 3 폴리펩티드 사슬의 도메인 3은 Fcγ 수용체에 대해 변경된 결합을 나타내는 변이 CH2-CH3 서열을 포함한다.
발명은 추가로 상기-기술된 이중특이성 1가 디아바디들의 어느 것 또는 상기-기술된 이중특이성 1가 Fc 디아바디들의 어느 것의 구체예들에 관련되는데, 여기서 제 1 폴리펩티드 사슬의 도메인 2는 E-코일 (SEQ ID NO:3)을 포함하고, 제 2 폴리펩티드 사슬의 도메인 2 는 K-코일 (SEQ ID NO:4)을 포함한다.
발명은 추가로 상기-기술된 이중특이성 1가 디아바디들의 어느 것 또는 상기-기술된 이중특이성 1가 Fc 디아바디들의 어느 것의 구체예들에 관련되는데, 여기서 제 1 폴리펩티드 사슬의 도메인 2는 K-코일 (SEQ ID NO:4)을 포함하고, 제 2 폴리펩티드 사슬의 도메인 2 는 E-코일 (SEQ ID NO:3)을 포함한다.
발명은 추가로 이중특이성 1가 디아바디에 관련되는데, 이때 이중특이성 1가 디아바디는 CD3의 에피토프 및 gpA33의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고, 그 이중특이성 1가 디아바디는:
(1) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 가지는 제 1 폴리펩티드 사슬 및 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 가지는 제 2 폴리펩티드 사슬; 또는
(2) SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 가지는 제 1 폴리펩티드 사슬 및 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 가지는 제 2 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
이때 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 이황화 결합에 의해 서로에 공유 결합되어 있다.
발명은 추가로 이중특이성 1가 Fc 디아바디에 관련되는데, 이때 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 CD3의 에피토프 및 gpA33의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고, 그 이중특이성 1가 Fc 디아바디는:
(1) SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 가지는 제 1 폴리펩티드 사슬, SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 가지는 제 2 폴리펩티드 사슬 및 SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 가지는 제 3 폴리펩티드 사슬; 또는
(2) SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 가지는 제 1 폴리펩티드 사슬, SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 가지는 제 2 폴리펩티드 사슬 및 SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 가지는 제 3 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
이때 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 제 1 이황화 결합에 의해 서로에 공유 결합되어 있으며 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 제 2 이황화 결합에 의해 서로에 공유 결합되어 있다.
발명은 추가로 상기-기술된 이중특이성 1가 디아바디의 어느 것 또는 상기-기술된 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 어느 것; 및 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관련된다.
발명은 추가로 gpA33의 발현을 특징으로 하는 암의 치료에 사용되는 상기-기술된 약학 조성물의 용도, 특히 암이 결장직장암, 결장암, 위암 또는 췌장암인 경우의 용도에 관련된다.
발명은 추가로 상기-기술된 이중특이성 1가 디아바디의 어느 것 또는 상기-기술된 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 어느 것의 폴리펩티드 사슬을 발현하는 세포, 뿐만 아니라 그렇게 발현된 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드에 관련된다.
발명은 추가로 항체 또는 그것의 폴리펩티드 부분 또는 단편을 발현하는 세포에 관련되며, 이때 그 항체는 gpA33에 결합하고, 항체 또는 그것의 폴리펩티드 부분 또는 단편은:
(1) 항-인간 gpA33 항체의 경쇄의 CDR1 (SEQ ID NO:14), CDR2 (SEQ ID NO:15) 및 CDR3 (SEQ ID NO:16);
(2) 항-인간 gpA33 항체의 중쇄의 CDR1 (SEQ ID NO:18), CDR2 (SEQ ID NO:19) 및 CDR3 (SEQ ID NO:20); 또는
(3) (1) 및 (2) 둘 다를 포함한다.
도 1은 본 발명의 2개의 사슬 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디의 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 구조를 도시한다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 3개의 사슬 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 제 1, 제 2 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 2가지 버전의 구조를 도시한다 (버전 1, 도 2a; 버전 2, 도 2b).
도 3은 CD3 및 gpA33에 동시에 결합할 수 있는 본 발명의 디아바디를 도시한다.
도 4는 암을 치료하는 본 발명의 디아바디의 능력을 예시한다. 결장직장암 또는 췌장암 세포들은 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 ("DART-1") 및 인간 PBMC (E:T = 25:1) 또는 활성화된 T 세포 (E:T = 10:1) 중 어느 하나의 존재하에 인큐베이션되었고, 세포독성이 측정되었다 (도 4a (결장 CSCL 결장직장 세포), 도 4b (Colo205 결장직장 세포) 및 도 4c (ASPC-1 췌장암 세포)).
도 5a 내지 5f는 암세포의 존재하에서만 CD3 이중특이성 1가 디아바디 ("DART-1")의 존재하에서 발생한 CD8 T 세포의 활성화를 도시한다 (도 5a 내지 5c: CD8 T 세포 + colo205 세포 (도 5a), CD8 T 세포 + ASPC-1 세포 (도 5b), CD8 T 세포 단독 (도 5c); 도 5d 내지 5f: CD4 T 세포 + colo205 세포 (도 5d), CD4 T 세포 + ASPC-1 세포 (도 5e), CD8 T 세포 단독 (도 5f)).
도 6a 내지 6d는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-1 및 DART-2)가 SW948 결장직장 선암종 세포 (도 6a) 및 colo205 세포 (도 6b) 및 Colo205-Luc 세포 (도 6c)에 대해 동등한 세포독성을 중재하였고, 어떠한 디아바디도 gpA33-네거티브 암 셀라인인 HCT116 (도 6d)의 세포독성을 중재하지 못하였음을 도시한다.
도 7a 내지 7d는 인간 또는 시노몰구스 원숭이 PBMC의 존재하에 암세포의 세포독성을 촉진하는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2), 알부민-결합 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (ABD를 가지는 DART-2 "w/ABD") 및 면역글로불린 IgG Fc 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (Fc를 가지는 DART-2 "w/Fc")의 능력을 도시한다.
도 8은 쥐과 Colo205 결장암 모델에서 종양 부피를 감소시키는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-1)의 생체 내 능력을 도시한다.
도 9a 내지 9d는 비히클 (도 9a) 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-1) (도 9b)를 받은 후 2일 후, 또는 비히클 (도 9c) 또는 DART-1 (도 9d)을 받은 후 12일 후에 Colo205 세포로 이식된 NOD scid 감마 (NSG) 마우스의 종양 영상 데이터를 도시한다.
도 10은 쥐과 ASPC-1 췌장암 모델에서 종양 부피를 감소시키는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-1)의 생체 내 능력을 도시한다.
도 11은 생체 내 결장암 모델에서 종양 부피의 극적인 감소를 중재하는, 면역글로불린 IgG Fc 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/Fc 버전 1)의 능력을 도시한다.
도 12는 극히 적은 용량에서 생체 내 결장암 모델에서 종양 부피의 감소를 중재하는, 면역글로불린 IgG Fc 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/Fc 버전 1)의 능력을 도시한다.
도 13은 시노몰구스 원숭이에서 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2), 및 면역글로불린 IgG Fc 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/Fc 버전 1)의 약물동역학을 도시한다.
도 14a 및 14b는 고정된 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD3에 대한 DART-2 w/Fc 버전 1의 결합의 SPR 분석을 도시한다. 검은색 대시선은 0, 6.25, 12.5, 25, 50 또는 100 nM의 DART-2 w/Fc의 농도에서 얻어진 결합 곡선의 1:1 랭뮤어 모델에 전반적으로 적용한 것을 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 15a 및 15b는 포획된 인간 및 시노몰구스 원숭이 gpA33에 대한 DART-2 w/Fc 버전 1의 결합의 SPR 분석을 도시한다. 검은색 대시선은 0, 6.25, 12.5, 25, 50 또는 100 nM의 DART-2 w/Fc 버전 1의 농도에서 얻어진 결합 곡선의 1:1 랭뮤어 모델에 전반적으로 적용한 것을 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
본 발명은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고 gpA33의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위 및 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 가지는 이중특이성 1가 디아바디 (즉 "gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디")에 관련된다. 본 발명은 또한 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하고 3개의 폴리펩티드 사슬로 구성되며 ("이중특이성 1가 Fc 디아바디") gpA33의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위 및 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 가지는 이중특이성 1가 디아바디 (즉 "gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디")에 관련된다. 본 발명의 이중특이성 1가 디아바디 및 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 gpA33 및 CD3에 동시에 결합할 수 있다. 발명은 그런 이중특이성 1가 디아바디 또는 이중특이성 1가 Fc 디아바디를 함유하는 약학 조성물에 관련된다. 발명은 추가로 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에 사용되는 그런 디아바디들의 사용 방법에 관련된다.
본 발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디는 서로와 결합하여 gpA33의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위 및 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 디아바디의 개별적인 폴리펩티드 사슬은, 예를 들면 각각의 폴리펩티드 사슬 내에 위치한 시스테인 잔기들의 이황화 결합에 의해 서로에 공유 결합되어 있다. 각각의 폴리펩티드 사슬은 경쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인, 중쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인 및 이종이량체화 도메인을 함유한다. 개재 링커 펩티드 (링커 1)는 경쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인을 중쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인과 분리시킨다. 제 1 폴리펩티드 사슬의 경쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인은 제 1 항원 (즉 gpA33 또는 CD3 중 어느 하나)에 특이적인 제 1 기능성 항원 결합 부위를 형성하기 위하여 제 2 폴리펩티드 사슬의 중쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인과 상호작용한다. 마찬가지로, 제 2 폴리펩티드 사슬의 경쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인은 제 2 항원 (즉 제 1 항원의 정체성에 따라 gpA33 또는 CD3 중 어느 하나)에 특이적인 제 2 기능성 항원 결합 부위를 형성하기 위하여 제 1 폴리펩티드 사슬의 중쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인과 상호작용한다. 그러므로, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 경쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인과 중쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인의 선택은, 두 개의 폴리펩티드 사슬이 gpA33 및 CD3에 결합할 수 있는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들의 항원 결합 도메인들을 포괄적으로 포함하도록 조정된다.
본 발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 제 1 폴리펩티드 사슬, 제 2 폴리펩티드 사슬 및 제 3 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 서로 결합하여 gpA33의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위 및 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 형성한다. 제 1 폴리펩티드 사슬 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 서로 결합하여 면역글로불린 Fc 도메인을 형성한다. 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은, 예를 들면 각각의 폴리펩티드 사슬 내에 위치한 시스테인 잔기들의 이황화 결합에 의해 서로에 공유 결합된다. 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은, 예를 들면 각각의 폴리펩티드 사슬 내에 위치한 시스테인 잔기들의 이황화 결합에 의해 서로에 공유 결합된다. 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 각각 경쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인, 중쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인 및 이종이량체화 도메인을 함유한다. 개재 링커 펩티드 (링커 1)는 경쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인을 중쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인과 분리시킨다. 제 1 폴리펩티드 사슬의 경쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인은 제 1 항원 (즉 gpA33 또는 CD3 중 어느 하나)에 특이적인 제 1 기능성 항원 결합 부위를 형성하기 위하여 제 2 폴리펩티드 사슬의 중쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인과 상호작용한다. 마찬가지로, 제 2 폴리펩티드 사슬의 경쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인은 제 2 항원 (즉 제 1 항원의 정체성에 따라 gpA33 또는 CD3 중 어느 하나)에 특이적인 제 2 기능성 항원 결합 부위를 형성하기 위하여 제 1 폴리펩티드 사슬의 중쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인과 상호작용한다. 그러므로, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 경쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인과 중쇄 가변 도메인의 항원 결합 도메인의 선택은, 두 개의 폴리펩티드 사슬이 gpA33 및 CD3에 결합할 수 있는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들의 항원 결합 도메인들을 포괄적으로 포함하도록 조정된다. 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 각각 시스테인-함유 펩티드 (펩티드 1) 를 함유하고: 완전한 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 도메인의 일부 또는 전부 및/또는 CH3 도메인의 일부 또는 전부 및 시스테인-함유 펩티드를 함유한다. CH2 도메인의 일부 또는 전부 및/또는 CH3 도메인의 일부 또는 전부는 결합하여 본 발명의 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 면역글로불린 Fc 도메인이 형성된다. 본 발명의 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 예를 들면 폴리펩티드 사슬의 시스테인-함유 펩티드 내에 위치한 시스테인 잔기들의 이황화 결합에 의해 서로에 공유 결합된다.
이중특이성 1가 디아바디 또는 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 이종이량체의 형성은 이종이량체화 도메인에 의해 구동될 수 있다. 그런 도메인은 한 폴리펩티드 사슬 상의 GVEPKSC (SEQ ID NO:54) (또는 VEPKSC; SEQ ID NO:55) 및 다른 폴리펩티드 사슬 상의 GFNRGEC (SEQ ID NO:56) (또는 FNRGEC; SEQ ID NO:57)를 포함한다 (US2007/0004909). 다르게는, 그런 도메인들은 반대 전하의 코일을 함유하도록 엔지니어링될 수 있다. 폴리펩티드 사슬들 중 하나의 이종이량체화 도메인은 적어도 6, 적어도 7 또는 적어도 8개의 포지티브 전하의 아미노산의 서열을 포함하고, 다른 폴리펩티드 사슬의 이종이량체화 도메인은 적어도 6, 적어도 7 또는 적어도 8개의 네거티브 전하의 아미노산의 서열을 포함한다. 예를 들면, 제 1 또는 제 2 이종이량체화 도메인은 바람직하게 8개의 포지티브 전하의 아미노산을 포함하는 서열을 포함할 수 있고, 다른 이종이량체화 도메인은 바람직하게 8개의 네거티브 전하의 아미노산을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 포지티브 전하의 아미노산은 라이신, 아르기닌, 히스티딘 등일 수 있고 및/또는 네거티브 전하의 아미노산은 글루탐산, 아스파르트산 등일 수 있다. 포지티브 전하의 아미노산은 바람직하게 라이신이고 및/또는 네거티브 전하의 아미노산은 바람직하게 글루탐산이다.
본 발명의 이중특이성 1가 디아바디 및 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 그런 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬이 그것들의 길이를 따라 시스테인 잔기를 통해 서로에 공유 결합되도록 엔지니어링된다. 그런 시스테인 잔기들은 폴리펩티드의 VL 및 VH 도메인을 분리시키는 개재 링커에 도입될 수 있다. 다르게는, 그리고 보다 바람직하게, 제 2 펩티드 (링커 2)가 각각의 폴리펩티드 사슬에, 예를 들면 폴리펩티드 사슬의 아미노-말단에서 또는 경쇄 가변 도메인 또는 중쇄 가변 도메인의 이종이량체화 도메인과 항원 결합 도메인 사이에 링커 2를 위치시키는 위치에서 도입된다.
상기에서 나타낸 것과 같이, gpA33은 결장직장 세포에 의해 발현된다. gpA33에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체들은 그런 세포들에 결합할 수 있다. CD3은 T 세포 상에서 발현된다. 그러므로, gpA33 및 CD3 둘 다에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체들은 결장직장 및 gpA33을 발현하는 다른 암세포 (예컨대 결장 암종 세포, 췌장 암세포 등)에 대해 T 세포를 표적화할 수 있고, 그로써 그런 암들에 대한 향상된 치료법을 제공할 수 있다.
I. 본 발명의 바람직한 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디
A. gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디
본 발명의 한 구체예는 제 1 폴리펩티드 사슬 및 제 2 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 그것들의 서열들이 폴리펩티드 사슬들이 서로에 공유 결합되어 gpA33 및 CD3 둘 다에 동시에 결합할 수 있는 공유적으로-결합된 복합체를 형성하는 것을 허용하는, gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디에 관련된다.
바람직한 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, CD3 또는 gpA33 중 어느 하나에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (즉 VLCD3 또는 VLgpA33 중 어느 하나), 제 1 개재 스페이서 펩티드 (링커 1), gpA33 (제 1 폴리펩티드 사슬이 VLCD3을 함유하는 경우) 또는 CD3 (제 1 폴리펩티드 사슬이 VLgpA33을 함유하는 경우)에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인, 시스테인-함유 제 2 개재 스페이서 펩티드 (링커 2), 이종이량체-촉진 도메인 및 C-말단을 포함한다 (도 1).
바람직한 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디의 제 2 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, gpA33 또는 CD3 중 어느 하나에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (즉 디아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬에 대해 선택된 VL 도메인에 따라 VLgpA33 또는 VLCD3 중 어느 하나), 개재 링커 펩티드 (링커 1), CD3 (제 2 폴리펩티드 사슬이 VLgpA33을 함유하는 경우) 또는 gpA33 (제 2 폴리펩티드 사슬이 VLCD3을 함유하는 경우)에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인, 시스테인-함유 스페이서 도메인, 이종이량체-촉진 도메인 및 C-말단을 포함한다 (도 1).
바람직한 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인은 제 1 항원 (즉 gpA33 또는 CD3 중 어느 하나)에 특이적인 제 1 기능성 항원 결합 부위를 형성하기 위하여 바람직한 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디의 제 2 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인과 상호작용한다. 마찬가지로, 제 2 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인은 제 2 항원 (즉 제 1 항원의 정체성에 따라 gpA33 또는 CD3 중 어느 하나)에 특이적인 제 2 기능성 항원 결합 부위를 형성하기 위하여 제 1 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인과 상호작용한다. 그러므로, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 VL 및 VH 도메인의 선택은, 바람직한 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디의 두 개의 폴리펩티드 사슬이 gpA33 및 CD3에 결합할 수 있는 VL 및 VH 도메인들을 포괄적으로 포함하도록 (VLCD3/VHCD3 및 VLgpA33/VHgpA33을 포함하도록) 조정된다.
가장 바람직하게, 개재 링커 펩티드 (VL 및 VH 도메인을 분리시키는 링커 1)의 길이는 폴리펩티드 사슬의 VL 및 VH 도메인들이 서로에 결합하는 것을 실질적으로 또는 완전하게 방지하기 위해 선택된다. 그러므로 제 1 폴리펩티드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 서로에 실질적으로 또는 완전하게 결합할 수 없다. 마찬가지로, 제 2 폴리펩티드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 서로에 실질적으로 또는 완전하게 결합할 수 없다. 바람직한 개재 스페이서 펩티드 (링커 1)는 서열 (SEQ ID NO:1): GGGSGGGG를 가진다.
시스테인-함유 제 2 개재 스페이서 펩티드 (링커 2)는 1, 2, 3 또는 그 이상의 시스테인을 함유할 것이다. 바람직한 시스테인-함유 스페이서 펩티드 (링커 2)는 서열 SEQ ID NO:2: GGCGGG를 가진다.
제 1 및 제 2 폴리펩티드의 이종이량체-촉진 도메인은 서로 상이하며 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 결합을 촉진하기 위하여 서로에 결합되도록 디자인된다. 그러므로 바람직한 구체예에서, 이들 폴리펩티드 사슬들 중 하나는 다음의 이종이량체-촉진 "E-코일" 도메인 (SEQ ID NO:3):
E VAAL E K E VAAL E K E VAAL E K E VAAL E K
를 함유하도록 엔지니어링될 것이고, 그것의 잔기들은 pH 7에서 음전하를 형성하는 한편, 두 개의 폴리펩티드 사슬 중 다른 하나는 다음의 이종이량체-촉진 "K-코일" 도메인 (SEQ ID NO:4):
K VAAL K E K VAAL K E K VAAL K E K VAAL K E
를 함유하도록 엔지니어링될 것이고, 그것의 잔기들은 pH 7에서 양전하를 형성할 것이다. 그런 대전된 도메인들의 존재는 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사이의 결합을 촉진하고, 그로써 이종이량체화를 조성한다. 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬에 사용된 코일이 그런 사슬들 사이에서 이종이량체화를 조성하기 위해 상이한 한, 어느 코일이 어느 사슬에 제공되는지는 중요하지 않다.
1. gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 , "DART-1"
본원에서 "DART-1"로 표시된, 바람직한 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디의 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 다음의 서열을 가지는 폴리펩티드 도메인을 포함한다:
CD3에 결합하는 항체의 VL 도메인 (VL CD3 ) (SEQ ID NO:5):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGG
KAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG.
VLCD3의 항원 결합 도메인은 서열: (SEQ ID NO:6) RSSTGAVTTSNYAN을 가지는 CDR1; 서열 (SEQ ID NO:7): GTNKRAP를 가지는 CDR2; 및 서열 (SEQ ID NO:8): ALWYSNLWV를 가지는 CDR3을 포함한다.
CD3에 결합하는 항체의 VH 도메인 (VH CD3 ) (SEQ ID NO:9):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFT
ISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS.
VHCD3의 항원 결합 도메인은 서열 (SEQ ID NO:10): TYAMN을 가지는 CDR1; 서열 (SEQ ID NO:11) RIRSKYNNYATYYADSVKD를 가지는 CDR2; 및 서열 (SEQ ID NO:12): HGNFGNSYVSWFAY를 가지는 CDR3을 포함한다.
gpA33에 결합하는 쥐과 항체의 VL 도메인 (VL gpA33 ) (SEQ ID NO:13):
QIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSARSSISFMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYS
LTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGSGTKLELK.
VLgpA33의 항원 결합 도메인은 서열 (SEQ ID NO:14): SARSSISFMY를 가지는 CDR1; 서열 (SEQ ID NO:15): DTSNLAS를 가지는 CDR2; 및 서열 (SEQ ID NO:16): QQWSSYPLT를 가지는 CDR3을 포함한다.
gpA33에 결합하는 쥐과 항체의 VH 도메인 (VH gpA33 ) (SEQ ID NO:17):
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSGSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGETNYNGKFKDKATLT
ADKSSTTAYMELSSLTSVDSAVYFCARIYGNNVYFDVWGAGTTVTVSS.
VHgpA33의 항원 결합 도메인은 서열 (SEQ ID NO:18): GSWMN을 가지는 CDR1; 서열 (SEQ ID NO:19): RIYPGDGETNYNGKFKD를 가지는 CDR2; 및 서열 (SEQ ID NO:20): IYGNNVYFDV를 가지는 CDR3을 포함한다.
제 1 개재 스페이서 펩티드 (링커 1)는 서열 (SEQ ID NO:1): GGGSGGGG를 가진다. 시스테인-함유 스페이서 펩티드 (링커 2)는 서열 SEQ ID NO:2: GGCGGG를 가진다.
그러므로, DART-1의 제 1 폴리펩티드 사슬은 서열 (SEQ ID NO:21)을 가진다:
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGG
KAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKA
SGYTFSGSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGETNYNGKFKDKATLTADKSSTTAYMELSSLTSVDSAVYF
CARIYGNNVYFDVWGAGTTVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK.
인지되는 것과 같이, SEQ ID NO:21의 잔기 1 내지 110은 CD3에 결합하는 항체의 VL 도메인 (VL CD3 ) (SEQ ID NO:5)이고; SEQ ID NO:21의 잔기 111 내지 118은 제 1 개재 스페이서 펩티드 (링커 1) (SEQ ID NO:1)이며; SEQ ID NO:21의 잔기 119 내지 237은 gpA33에 결합하는 쥐과 항체의 VH 도메인 (VH gpA33 ) (SEQ ID NO:17)이고, SEQ ID NO:21의 잔기 238 내지 243은 시스테인-함유 스페이서 펩티드 (링커 2) (SEQ ID NO:2)이며 SEQ ID NO:21의 잔기 244 내지 271은 이종이량체-촉진 "E-코일" 도메인 (SEQ ID NO:3)이다.
DART-1의 제 1 폴리펩티드 사슬을 코드화하는 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 (SEQ ID NO:22)을 가진다:
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctgacatgcagatc
cagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggg
gcctgatcgggggtacaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcgga
aaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatag
caatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctgggaggtggtggatccggcggaggtggac
aggtccagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcctcagtgaagatttcctgcaaagct
tcaggctacacattcagtggctcttggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggat
tggacggatctaccctggagatggagaaactaactacaatgggaagtttaaggacaaggccacactgactg
cagacaaatcatccaccacagcctacatggagctcagcagcctgacctctgtggactctgcggtctatttc
tgtgcaagaatctatggtaataacgtttacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtgtcttc
cggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctg
cacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaa.
DART-1의 제 2 폴리펩티드 사슬은 서열 (SEQ ID NO:23)을 가진다:
QIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSARSSISFMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYS
LTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGSGTKLELKRGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF
TFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYC
VRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE.
인지되는 것과 같이, SEQ ID NO:23의 잔기 1 내지 107은 gpA33에 결합하는 쥐과 항체의 VL 도메인 (VL gpA33 ) (SEQ ID NO:13)이고; SEQ ID NO:23의 잔기 108 내지 115는 제 1 개재 스페이서 펩티드 (링커 1) (SEQ ID NO:1)이며; SEQ ID NO:23의 잔기 116 내지 240은 CD3에 결합하는 항체의 VH 도메인 (VH CD3 ) (SEQ ID NO:9)이고; SEQ ID NO:23의 잔기 241 내지 246은 시스테인-함유 스페이서 펩티드 (링커 2) (SEQ ID NO:2)이며 SEQ ID NO:23의 잔기 247 내지 274는 이종이량체-촉진 "K-코일" 도메인 (SEQ ID NO:4)이다.
DART-1의 제 2 폴리펩티드 사슬을 코드화하는 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 (SEQ ID NO:24)을 가진다:
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagagggtcaccatgacctgcag
tgccaggtcaagtataagtttcatgtactggtaccagcagaagccaggatcctcccccagactcctgattt
atgacacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttattct
ctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagttacccact
cacgttcggttctgggaccaagctggagctgaaacggggtggaggatccggcggaggcggagaggtgcagc
tggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattc
accttcaacacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttgcaaggat
caggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagattcaccatctcaagag
atgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgt
gtgagacacggtaacttcggcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgac
tgtgtcttccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagaga
aggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag.
2. gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 , "DART-2"
본원에서 "DART-2"로 표시된, 제 2의 바람직한 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디의 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 다음의 서열을 가지는 폴리펩티드 도메인을 포함한다:
CD3에 결합하는 항체의 VL 도메인 (VL CD3 ) (SEQ ID NO:5):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGG
KAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG.
VLCD3의 항원 결합 도메인은 서열: (SEQ ID NO:6) RSSTGAVTTSNYAN을 가지는 CDR1; 서열 (SEQ ID NO:7): GTNKRAP를 가지는 CDR2; 및 서열 (SEQ ID NO:8): ALWYSNLWV를 가지는 CDR3을 포함한다.
CD3에 결합하는 항체의 VH 도메인 (VH CD3 ) (SEQ ID NO:25):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFT
ISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS.
VHCD3의 항원 결합 도메인은 서열 (SEQ ID NO:10): TYAMN을 가지는 CDR1; 서열 (SEQ ID NO:11) RIRSKYNNYATYYADSVKD를 가지는 CDR2; 및 서열 (SEQ ID NO:12): HGNFGNSYVSWFAY를 가지는 CDR3을 포함한다.
인간 gpA33에 결합하는 상기-논의된 쥐과 항체는 바람직한 디아바디 DART-2의 VL 및 VH 도메인을 제공하기 위해 인간화되었다. 이들 인간화된 도메인들은 다음과 같다:
gpA33에 결합하는 인간화된 항체의 VL 도메인 (VL gpA33 ) (SEQ ID NO:26):
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSARSSISFMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFT
LTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIK.
VLgpA33의 항원 결합 도메인은 서열 (SEQ ID NO:14): SARSSISFMY를 가지는 CDR1; 서열 (SEQ ID NO:15): DTSNLAS를 가지는 CDR2; 및 서열 (SEQ ID NO:16): QQWSSYPLT를 가지는 CDR3을 포함한다.
gpA33에 결합하는 인간화된 항체의 VH 도메인 (VH gpA33 ) (SEQ ID NO:27):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEWIGRIYPGDGETNYNGKFKDRVTIT
ADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIYGNNVYFDVWGQGTTVTVSS.
VHgpA33의 항원 결합 도메인은 서열 (SEQ ID NO:18): GSWMN을 가지는 CDR1; 서열 (SEQ ID NO:19): RIYPGDGETNYNGKFKD를 가지는 CDR2; 및 서열 (SEQ ID NO:20): IYGNNVYFDV를 가지는 CDR3을 포함한다.
제 1 개재 스페이서 펩티드 (링커 1)는 서열 (SEQ ID NO:1): GGGSGGGG를 가진다. 시스테인-함유 스페이서 펩티드 (링커 2)는 서열 SEQ ID NO:2: GGCGGG를 가진다.
제 1 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인은 "E-코일" 도메인 (SEQ ID NO:3)이다. 제 2 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인은 "K-코일" 도메인 (SEQ ID NO:4)이다.
그러므로, DART-2의 제 1 폴리펩티드 사슬은 서열 (SEQ ID NO:28)을 가진다:
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGG
KAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA
SGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEWIGRIYPGDGETNYNGKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYY
CARIYGNNVYFDVWGQGTTVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK.
인지되는 것과 같이, SEQ ID NO:28의 잔기 1 내지 110은 CD3에 결합하는 항체의 VL 도메인 (VL CD3 ) (SEQ ID NO:5)이고; SEQ ID NO:28의 잔기 111 내지 118은 제 1 개재 스페이서 펩티드 (링커 1) (SEQ ID NO:1)이며; SEQ ID NO:28의 잔기 119 내지 237은 gpA33에 결합하는 항체의 VH 도메인 (VH gpA33 ) (SEQ ID NO:27)이고, SEQ ID NO:28의 잔기 238 내지 243은 시스테인-함유 스페이서 펩티드 (링커 2) (SEQ ID NO:2)이며 SEQ ID NO:21의 잔기 244 내지 271은 이종이량체-촉진 "E-코일" 도메인 (SEQ ID NO:3)이다.
DART-2의 제 1 폴리펩티드 사슬을 코드화하는 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 (SEQ ID NO:29)을 가진다:
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctgacatgcagatc
cagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggg
gcctgatcgggggtacaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcgga
aaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatag
caatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctgggaggtggtggatccggcggaggtggac
aggtccagctggtccagagcggggccgaagtcaaaaaacccggagcaagcgtgaaggtctcctgcaaagca
tcaggctatacatttacaggcagctggatgaactgggtgaggcaggctccaggacagggactggagtggat
cgggcgcatctaccctggagacggcgaaactaactataatggaaagttcaaagaccgagtgaccatcacag
ccgataagtctactagtaccgcctacatggagctgagctccctgcggtctgaagataccgccgtctactat
tgcgctagaatttacggaaacaatgtctattttgacgtgtgggggcagggaacaactgtgactgtctcctc
cggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctg
cacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaa.
DART-2의 제 2 폴리펩티드 사슬은 서열 (SEQ ID NO:30)을 가진다:
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSARSSISFMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFT
LTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT
FSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCV
RHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE.
인지되는 것과 같이, SEQ ID NO:30의 잔기 1 내지 106은 gpA33에 결합하는 쥐과 항체의 VL 도메인 (VL gpA33 ) (SEQ ID NO:26)이고; SEQ ID NO:30의 잔기 107 내지 114는 제 1 개재 스페이서 펩티드 (링커 1) (SEQ ID NO:1)이며; SEQ ID NO:30의 잔기 115 내지 239는 CD3에 결합하는 항체의 VH 도메인 (VH CD3 ) (SEQ ID NO:25)이고; SEQ ID NO:30의 잔기 240 내지 245는 시스테인-함유 스페이서 펩티드 (링커 2) (SEQ ID NO:2)이며 SEQ ID NO:30의 잔기 246 내지 273은 이종이량체-촉진 "K-코일" 도메인 (SEQ ID NO:4)이다.
DART-2의 제 2 폴리펩티드 사슬을 코드화하는 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 (SEQ ID NO:31)을 가진다:
gacattcagctgactcagtccccctcttttctgtccgcatccgtcggagatcgagtgactattacttgctc
tgctaggtcctcaatcagcttcatgtactggtatcagcagaagcccggcaaagcacctaagctgctgatct
acgacacaagcaacctggcctccggggtgccatctcggttctctggcagtgggtcaggaactgagtttacc
ctgacaattagctccctggaggctgaagatgccgctacctactattgccagcagtggagcagctatcctct
gaccttcggacaggggactaaactggaaatcaagggtggaggatccggcggcggaggcgaggtgcagctgg
tggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacc
ttcagcacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatcag
gtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagattcaccatctcaagagatg
attcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtg
agacacggtaacttcggcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgt
gtcttccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaagg
tcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag.
3. 알부민-결합 도메인 ( ABD )을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 ("DART-2 w/ABD")
발명의 다른 구체예에서, gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디는 알부민-결합 도메인 ("ABD")을 가질 것이다 (ABD를 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디).
WO 2012/018687에 개시된 것과 같이, 디아바디 분자의 생체 내 약물동역학적 특성을 향상시키기 위하여, 분자들은 디아바디 분자의 하나 또는 그 이상의 말단에서 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분을 함유하도록 변형될 수 있다. 가장 바람직하게, 혈청-결합 단백질의 그런 폴리펩티드 부분은 디아바디 분자의 C-말단에 도입될 것이다. 이 목적에 대해 혈청-결합 단백질의 특히 바람직한 폴리펩티드 부분은 스트렙토코쿠스 단백질 G로부터의 알부민-결합 도메인 (ABD)이다. 스트렙토코쿠스 스트레인 G148의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)이 특히 바람직하다.
스트렙토코쿠스 스트레인 G148의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)은 안정한 3-나선 번들을 형성하는 46 아미노산 잔기로 구성되고 광범위한 알부민-결합 특이성을 가진다 (Johansson, M.U. et al. (2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules," J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). 알부민은 혈장 중의 가장 풍부한 단백질이고 인간에서 19일의 반감기를 가지고 있다. 알부민은 다른 단백질들에 비-공유 결합되는 것을 허용하는 여러 개의 작은 분자 결합 부위를 가지고 있고, 그로써 반감기를 연장시킨다.
그러므로, 알부민-결합 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬 또는 제 2 폴리펩티드 사슬은 그런 폴리펩티드 사슬의 E-코일 (또는 K-코일)을 알부민-결합 도메인과 분리시키는 제 3 링커 (링커 3)를 함유한다. 그런 링커 3에 대해 바람직한 서열은 GGGS (SEQ ID NO:32) 또는 GGGNS (SEQ ID NO:33)이다. 바람직한 알부민-결합 도메인 (ABD)은 서열 (SEQ ID NO:34): LAQAKEAAIRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP를 가진다.
발명의 이런 측면을 예시하기 위하여, 상기-기술된 DART-2의 제 1 폴리펩티드 사슬은 알부민-결합 도메인을 함유하도록 변형되었고, 그 결과 본원에서 "DART-2 w/ABD"로 표시된, ABD를 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디가 생성된다.
그런 DART-2 w/ABD의 제 1 폴리펩티드 사슬은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:35)을 가진다:
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGG
KAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA
SGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEWIGRIYPGDGETNYNGKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYY
CARIYGNNVYFDVWGQGTTVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGSLAQAKEAAI
RELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP.
인지되는 것과 같이, SEQ ID NO:35의 잔기 1 내지 271은 DART-2의 잔기 1 내지 271과 동일하고, 그러므로, N-말단에서 C-말단 방향으로, CD3에 결합하는 항체의 VL 도메인 (VL CD3 ) (SEQ ID NO:5); 제 1 개재 스페이서 펩티드 (링커 1) (SEQ ID NO:1); gpA33에 결합하는 항체의 VH 도메인 (VH gpA33 ) (SEQ ID NO:27), 시스테인-함유 스페이서 펩티드 (링커 2) (SEQ ID NO:2), 이종이량체-촉진 "E-코일" 도메인 (SEQ ID NO:3) 및 C-말단을 제공한다. 잔기 272 내지 275는 링커 3 (SEQ ID NO:32)이고, 잔기 276 내지 321은 알부민-결합 도메인 (SEQ ID NO:34)이다.
DART-2 w/ABD의 제 1 폴리펩티드 사슬을 코드화하는 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 (SEQ ID NO:36)을 가진다:
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctgacatgcagatc
cagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggg
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cgcgaactggataaatatggcgtgagcgattattataagaacctgattgacaacgcaaaatccgcggaagg
cgtgaaagcactgattgatgaaattctggccgccctgcct.
DART-2 w/ABD의 제 2 폴리펩티드 사슬은 DART-2 (SEQ ID NO:30)의 상기-논의된 제 2 폴리펩티드 사슬과 같다.
B. IgG Fc 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 ("DART-2 w/Fc")
추가의 구체예에서, 발명은 IgG Fc 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디를 제공한다. 그런 디아바디는 따라서 본원에서 "gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디"로 언급된다. 본 발명의 Fc 디아바디의 Fc 도메인은 완전한 Fc 영역 (예컨대 완전한 IgG Fc 영역) 또는 완전한 Fc 영역의 단지 단편 중 어느 한 가지일 수 있다. 비록 본 발명의 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 Fc 도메인이 하나 또는 그 이상의 Fc 수용체들 (FcγR)에 결합하는 능력을 가지고 있을 수 있더라도, 보다 바람직하게 그런 Fc 도메인은 FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 또는 FcγRIIIB (CD16b)에 대해 감소된 결합을 유발하거나 (야생형 Fc 영역에 의해 나타난 결합에 비하여) 또는 실질적으로 그런 수용체(들)에 결합하는 그런 Fc 도메인의 능력을 제거할 것이다. 본 발명의 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 Fc 도메인은 완전한 Fc 영역의 CH2 도메인의 일부 또는 전부 및/또는 CH3 도메인의 일부 또는 전부를 포함하거나, 또는 변이 CH2 및/또는 변이 CH3 서열 (예를 들면, 완전한 Fc 영역의 CH2 또는 CH3 도메인에 대하여 하나 또는 그 이상의 삽입 및/또는 하나 또는 그 이상의 결실을 포함할 수 있다)을 포함할 수 있다. 본 발명의 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 Fc 도메인은 비-Fc 폴리펩티드 부분들을 포함하거나, 비-자연적 완전한 Fc 영역의 부분들을 포함하거나 또는 CH2 및/또는 CH3 도메인의 비-자연적으로 발생하는 배향 (예컨대, 예를 들면 2개의 CH2 도메인 또는 2개의 CH3 도메인, 또는 N-말단에서 C-말단 방향으로 CH2 도메인에 연결된 CH3 도메인 등)을 포함할 수 있다.
"버전 1"로서 표시되고 도 2a에 도시된 제 1 구체예에서, 예시적인 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, gpA33 또는 CD3 중 어느 하나에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (즉 VLgpA33 또는 VLCD3 중 어느 하나), 개재 스페이서 펩티드 (링커 1), gpA33 (제 1 폴리펩티드 사슬이 VLCD3을 함유하는 경우) 또는 CD3 (제 1 폴리펩티드 사슬이 VLgpA33을 함유하는 경우)에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인, 시스테인-함유 제 2 개재 스페이서 펩티드 (링커 2), 이종이량체-촉진 도메인, 스페이서 펩티드 (링커 5), 시스테인-함유 펩티드 (펩티드 1), IgG Fc 도메인 (바람직하게 항체 Fc 영역의 CH2 및 CH3 도메인의 전부 또는 일부) 및 C-말단을 포함한다.
"버전 2"로서 표시되고 도 2b에 도시된 제 2 구체예에서, 예시적인 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, 시스테인-함유 펩티드 (펩티드 1), IgG Fc 도메인 (바람직하게 항체 Fc 영역의 CH2 및 CH3 도메인의 전부 또는 일부), 개재 스페이서 펩티드 (링커 4); gpA33 또는 CD3 중 어느 하나에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (즉 VLgpA33 또는 VLCD3 중 어느 하나), 개재 스페이서 펩티드 (링커 1), gpA33 (제 1 폴리펩티드 사슬이 VLCD3을 함유하는 경우) 또는 CD3 (제 1 폴리펩티드 사슬이 VLgpA33을 함유하는 경우)에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인, 시스테인-함유 제 2 개재 스페이서 펩티드 (링커 2), 이종이량체-촉진 도메인 및 C-말단을 포함한다.
바람직하게, 어느 하나의 구체예에서, 제 1 폴리펩티드 사슬의 Fc 도메인은 FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 또는 FcγRIIIB (CD16b)에 대한 감소된 결합 (야생형 Fc 영역에 의해 나타나는 결합에 비교하여)을 유발하거나 또는 실질적으로 그런 수용체(들)에 결합하는 그런 Fc 도메인의 능력을 제거할 것이다. 그런 변경된 결합을 중재할 수 있는 Fc 변이체 및 돌연변이 형태는 기술분야에 잘 알려져 있고, 위치 234 및 235에서의 아미노산 치환, 위치 265에서의 치환 또는 위치 297에서의 치환을 포함한다 (예를 들면 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제 5,624,821호 참조). 바람직한 구체예에서 CH2 및 CH3 도메인은 위치 234에서 알라닌으로의 치환 및 235에서 알라닌으로의 치환을 포함한다.
그런 예시적인 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디 (버전 1 및 버전 2)의 제 2 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, gpA33 또는 CD3 중 어느 하나에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (즉 디아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬에 대해 선택된 VL 도메인에 따라 VLgpA33 또는 VLCD3 중 어느 하나), 개재 링커 펩티드 (링커 1), CD3 (제 2 폴리펩티드 사슬이 VLgpA33을 함유하는 경우) 또는 gpA33 (제 2 폴리펩티드 사슬이 VLCD3을 함유하는 경우)에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인, 시스테인-함유 스페이서 펩티드 (링커 2), 이종이량체-촉진 도메인 (바람직하게 K-코일 도메인) 및 C-말단을 포함할 것이다.
예시적인 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디 (버전 1 및 버전 2)는 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, 시스테인-함유 펩티드 (펩티드 1), 제 1 폴리펩티드 사슬의 Fc 도메인의 것과 동일한 아이소타입을 가지는 IgG Fc 도메인 (바람직하게 항체 Fc 영역의 CH2 및 CH3 도메인의 전부 또는 일부) 및 C-말단을 포함하는 제 3 폴리펩티드 사슬을 추가로 포함할 것이다. 바람직하게, 제 3 폴리펩티드 사슬의 Fc 도메인은 상기에서 논의된 것과 같이, 예시적인 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬과 관련하여, FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 또는 FcγRIIIB (CD16b)에 대한 감소된 결합 (야생형 Fc 영역에 의해 나타나는 결합에 비교하여)을 유발하거나 또는 실질적으로 그런 수용체(들)에 결합하는 그런 Fc 도메인의 능력을 제거할 것이다.
임의로 존재하는 개재 스페이서 펩티드 (링커 4)는 바람직하게 아미노산 서열 (SEQ ID NO:37): APSSS를 포함하고, 보다 바람직하게 아미노산 서열 (SEQ ID NO:38): APSSSPME를 가진다.
제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 시스테인-함유 펩티드 (펩티드 1)는 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 1, 2, 3 또는 그 이상의 시스테인 잔기들을 함유할 것이다. 특히 바람직한 펩티드 1은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:39): DKTHTCPPCP를 가진다.
개재 스페이서 펩티드 (링커 1)는 바람직하게, 상기에서 기술된 SEQ ID NO:1의 서열을 가진다. 시스테인-함유 제 2 개재 스페이서 펩티드 (링커 2)는 바람직하게 상기에서 기술된 SEQ ID NO2의 서열을 가진다.
gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인은 바람직하게 상기-기술된 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3) 및 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4)일 것이고, 그런 폴리펩티드 사슬들 중 하나는 상기에서 논의된 것과 같이, E-코일 도메인을 가지는 반면, 다른 것은 K-코일 도메인을 가지도록 선택될 것이다.
바람직한 스페이서 펩티드 (링커 5)는 서열 (SEQ ID NO:33) GGG를 가진다.
제 1 및 제 3 폴리펩티드의 CH2 및/또는 CH3 도메인은 동일할 필요는 없고, 유리하게 두 개의 폴리펩티드 사이의 복합체 형성을 조성하기 위해 변형된다. 예를 들어, 아미노산 치환 (바람직하게 '손잡이 (knob)'를 형성하는 벌키한 측면 기를 포함하는 아미노산, 예컨대 트립토판으로의 치환)은 CH2 또는 CH3 사슬에 도입될 수 있어서, 입체적 간섭이 유사하게 돌연변이된 도메인과의 상호작용을 방지하고 돌연변이된 도메인이 상보하는, 또는 순응하는 돌연변이, 즉 '구멍' (예컨대 글리신으로의 치환)이 엔지니어링 되어있는 도메인과 불가피하게 쌍을 이루게 될 것이다. 그런 돌연변이 세트는 이중특이성 1가 Fc 디아바디 분자를 포함하는 폴리펩티드의 어떠한 쌍으로, 및 나아가 상기 쌍의 폴리펩티드 사슬들의 어떠한 일부로 엔지니어링될 수 있다. 동종이량체화보다 이종이량체화를 장려하기 위한 단백질 엔지니어링 방법은 기술분야에, 특히 면역글로불린-유사 분자의 엔지니어링에 대해서 잘 알려져 있고, 본원에도 포함된다 (예컨대 Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization ," Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library," J. Mol. Biol. 270:26-35, and Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization , Expression And Tumor Cell Lysis ," J. Immunol. Methods 296:95-101 참조; 상기 문헌들은 각각 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다). 바람직하게 '손잡이'는 제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인에 엔지니어링되고 '구멍'은 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인에 엔지니어링된다. 그러므로 '손잡이'는 제 1 폴리펩티드 사슬이 그것의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 통해 동종이량체화하는 것을 방지하는 데 도움이 될 것이다. 제 3 폴리펩티드 사슬은 대신 바람직하게 '구멍'을 함유하기 때문에, 그것은 제 1 폴리펩티드 사슬과 이종이량체화될 뿐 아니라 자체 동종이량체화될 것이다. 바람직한 손잡이는 천연 IgG Fc 영역이 변형 T366W를 함유하도록 변형시킴으로써 생성된다. 바람직한 구멍은 천연 IgG Fc 영역이 변형 T366S, L368A 및 Y407V를 함유하도록 변형시킴으로써 생성된다. 제 3 폴리펩티드 사슬 동종이량체를 제 1, 제 2 및 제 3 폴리펩티드 사슬을 포함하는 최종 이중특이성 1가 Fc 디아바디로부터 정제하는 것을 보조하기 위하여, 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2 및 CH3 도메인의 단백질 A 결합 부위는 바람직하게 위치 435에서 아미노산 치환에 의해 돌연변이된다 (H435R). 제 3 폴리펩티드 사슬 동종이량체를 제 1, 제 2 및 제 3 폴리펩티드 사슬을 포함하는 최종 이중특이성 1가 Fc 디아바디로부터 정제하는 것을 보조하기 위하여, 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2 및 CH3 도메인의 단백질 A 결합 부위는 바람직하게 아미노산 치환에 의해 돌연변이된다. 그러므로 제 3 폴리펩티드 사슬 동종이량체는 단백질 A에 결합하지 않을 것이고, 반면 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 제 1 폴리펩티드 사슬 상의 단백질 A 결합 부위를 통해 단백질 A에 결합하는 능력을 보유할 것이다.
제 1 폴리펩티드 사슬에 존재하는 항체 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인에 대해 바람직한 서열은 (SEQ ID NO:40)이다:
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGF
YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK.
제 3 폴리펩티드 사슬에 존재하는 항체 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인에 대해 바람직한 서열은 (SEQ ID NO:41)이다:
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGF
YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSL
SPGK.
1. DART-2 w/ Fc 버전 1
본원에서 "DART-2 w/Fc 버전 1"로 표시된, 바람직한 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 제 1, 제 2 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 다음의 서열들을 가지는 폴리펩티드 도메인들을 포함한다:
그런 DART-2 w/Fc 버전 1의 제 1 폴리펩티드 사슬은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:42)을 가진다:
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSARSSISFMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFT
LTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT
FSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCV
RHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGDKTHTCPP
CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK.
인지되는 것과 같이, SEQ ID NO:42의 잔기 1 내지 106은 gpA33에 결합하는 항체의 VL 도메인 (VL gpA33 ) (SEQ ID NO:26)이고; SEQ ID NO:42의 잔기 107 내지 114는 제 1 개재 스페이서 펩티드 (링커 1) (SEQ ID NO:1)이며; SEQ ID NO:42의 잔기 115 내지 239는 CD3에 결합하는 항체의 VH 도메인 (VH CD3 ) (SEQ ID NO:25)이고; SEQ ID NO:42의 잔기 240 내지 245는 시스테인-함유 스페이서 펩티드 (링커 2) (SEQ ID NO:2)이며; SEQ ID NO:42의 잔기 246 내지 273은 이종이량체-촉진 "E-코일" 도메인 (SEQ ID NO:3)이고; 잔기 274 내지 276은 스페이서 펩티드 (링커 5) (SEQ ID NO:33)이며; 잔기 277 내지 286은 펩티드 1 (SEQ ID NO:39)이고, 잔기 277 내지 503은 항체 Fc 도메인 (SEQ ID NO:40)의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 서열이다.
DART-2 w/Fc 버전 1의 제 1 폴리펩티드 사슬을 코드화하는 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 (SEQ ID NO:43)을 가진다:
gacattcagctgactcagtccccctcttttctgtccgcatccgtcggagatcgagtgactattacttgctc
tgctaggtcctcaatcagcttcatgtactggtatcagcagaagcccggcaaagcacctaagctgctgatct
acgacacaagcaacctggcctccggggtgccatctcggttctctggcagtgggtcaggaactgagtttacc
ctgacaattagctccctggaggctgaagatgccgctacctactattgccagcagtggagcagctatcctct
gaccttcggacaggggactaaactggaaatcaagggtggaggatccggcggcggaggcgaggtgcagctgg
tggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacc
ttcagcacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatcag
gtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagattcaccatctcaagagatg
attcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtg
agacacggtaacttcggcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgt
gtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggagg
tcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggcggggacaaaactcacacatgcccacc
tgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcat
gatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttca
actggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacg
taccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggt
ctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccac
aggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaa
ggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccac
gcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggc
agcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctc
tccctgtctccgggtaaa.
DART-2 w/Fc 버전 1의 제 2 폴리펩티드 사슬은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:44)을 가진다:
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGG
KAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA
SGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEWIGRIYPGDGETNYNGKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYY
CARIYGNNVYFDVWGQGTTVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE.
인지되는 것과 같이, SEQ ID NO:44의 잔기 1 내지 110은 CD3에 결합하는 항체의 VL 도메인 (VL CD3 ) (SEQ ID NO:5)이고; SEQ ID NO:44의 잔기 111 내지 118은 제 1 개재 스페이서 펩티드 (링커 1) (SEQ ID NO:1)이며; SEQ ID NO:44의 잔기 119 내지 237은 gpA33에 결합하는 항체의 VH 도메인 (VH gpA33 ) (SEQ ID NO:27)이고, SEQ ID NO:44의 잔기 238 내지 243은 시스테인-함유 스페이서 펩티드 (링커 2) (SEQ ID NO:2)이며; SEQ ID NO:44의 잔기 244 내지 271은 이종이량체-촉진 "K-코일" 도메인 (SEQ ID NO:4)이다.
DART-2 w/Fc 버전 1의 제 2 폴리펩티드 사슬을 코드화하는 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 (SEQ ID NO:45)을 가진다:
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctgacatgcagatc
cagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggg
gcctgatcgggggtacaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcgga
aaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatag
caatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggaggtggac
aggtccagctggtccagagcggggccgaagtcaaaaaacccggagcaagcgtgaaggtctcctgcaaagca
tcaggctatacatttacaggcagctggatgaactgggtgaggcaggctccaggacagggactggagtggat
cgggcgcatctaccctggagacggcgaaactaactataatggaaagttcaaagaccgagtgaccatcacag
ccgataagtctactagtaccgcctacatggagctgagctccctgcggtctgaagataccgccgtctactat
tgcgctagaatttacggaaacaatgtctattttgacgtgtgggggcagggaacaactgtgactgtctcctc
cggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccg
cacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag.
그런 DART-2 w/Fc 버전 1의 제 3 폴리펩티드 사슬은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:46)을 가진다:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ
VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NRYTQKSLSLSPGK.
인지되는 것과 같이, SEQ ID NO:46의 잔기 1 내지 10은 펩티드 1 (SEQ ID NO:39)이고 잔기 11 내지 227은 항체 Fc 도메인 (SEQ ID NO:41)의 CH2 및 CH3 도메인이다.
DART-2 w/Fc 버전 1의 제 3 폴리펩티드 사슬을 코드화하는 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 (SEQ ID NO:47)을 가진다:
gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccc
cccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagcc
acgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccg
cgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaa
tggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaag
ccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccag
gtcagcctgagttgcgcagtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggca
gccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgtcagcaagc
tcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcac
aaccgctacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa.
2. DART-2 w/ Fc 버전 2
본원에서 "DART-2 w/Fc 버전 2"로서 표시된, 제 2의 바람직한 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 제 1, 제 2 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 다음의 서열들을 가지는 폴리펩티드 도메인들을 포함한다. 다른 차이들 중에서, DART-2 w/Fc 버전 1은 제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2 및 CH3 서열들의 위치에서 DART-2 w/Fc 버전 22와 상이하다; 이들 서열은 DART-2 w/Fc 버전 1의 VL 및 VH 서열에 대해 C-말단 쪽에 위치한 반면, DART-2 w/Fc 버전 2의 VL 및 VH 서열에 대해 N-말단 쪽에 위치한다.
그런 DART-2 w/Fc 버전 2의 제 1 폴리펩티드 사슬은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:48)을 가진다:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ
VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NHYTQKSLSLSPGKAPSSSPMEDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSARSSISFMYWYQQKPGKAPKLLIYD
TSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVE
SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS
KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVA
ALKEKVAALKE.
인지되는 것과 같이, SEQ ID NO:48의 잔기 1 내지 10은 펩티드 1 (SEQ ID NO:39)이고; SEQ ID NO:48의 잔기 11 내지 227은 항체 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 서열 (SEQ ID NO:40)이며; SEQ ID NO:48의 잔기 228 내지 235는 개재 스페이서 펩티드 (링커 4) (SEQ ID NO:38)이고; SEQ ID NO:48의 잔기 236 내지 341은 gpA33에 결합하는 항체의 VL 도메인 (VL gpA33 ) (SEQ ID NO:26)이고; SEQ ID NO:48의 잔기 342 내지 349는 제 1 개재 스페이서 펩티드 (링커 1) (SEQ ID NO:1)이며; SEQ ID NO:48의 잔기 350 내지 474는 CD3에 결합하는 항체의 VH 도메인 (VH CD3 ) (SEQ ID NO:25)이고; SEQ ID NO:48의 잔기 475 내지 480은 시스테인-함유 스페이서 펩티드 (링커 2) (SEQ ID NO:2)이며; SEQ ID NO:48의 잔기 481 내지 508은 이종이량체-촉진 "K-코일" 도메인 (SEQ ID NO:4)이다.
그런 DART-2 w/Fc 버전 2의 제 2 폴리펩티드 사슬은 DART-2의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열 (즉 SEQ ID NO:28)(상기 기술됨)을 가진다.
그런 DART-2 w/Fc 버전 2의 제 3 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:46 (상기 기술됨)을 가진다.
약학 조성물
발명의 조성물은 약학 조성물의 제조에 유용한 벌크 약물 조성물 (예컨대 불순물이 섞인 또는 비-멸균 조성물) 및 유닛 단위용량 형태의 제조에 사용될 수 있는 약학 조성물 (즉 대상 또는 환자에의 투여에 적당한 조성물)을 포함한다. 그런 조성물들은 예방적으로 또는 치료적으로 유효한 양의 본원에 개시된 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디 및 추가의 치료제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 바람직하게, 발명의 조성물은 예방적으로 또는 치료적으로 유효한 양의 발명의 하나 또는 그 이상의 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
발명은 또한 그런 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디 및 암과 관련된 특정 항원에 특이적인 제 2 치료 항체 (암-항원 특이적 단클론성 항체), 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
특정 구체예에서, 용어 "약학적으로 허용되는"은 동물, 보다 특별하게는 인간에 사용하기 위해, 미국 연방 또는 주 정부의 규제청에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 공인된 약전에 열거된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 그것과 함께 치료제가 투여되는 희석제, 보조제 (예컨대 프로인트 보조제 (완전 및 불완전)), 부형제 또는 비히클을 나타낸다. 그런 약학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및, 석유, 동물, 채소 또는 합성 기원의 것들을 포함하는 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등일 수 있다. 약학 조성물이 정맥 내로 투여될 때 물이 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로서, 특히 주사용 용액에 대해 사용될 수 있다. 적당한 약학적 부형제는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 쵸크, 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화 나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 필요에 따라 또한 미량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 환, 캡슐, 분말, 지속성 방출 제형 등의 형태를 가질 수 있다.
일반적으로, 발명의 조성물의 성분들은 별도로 또는 유닛 단위용량 형태로 함께 혼합되어, 예를 들면 활성 제제의 양을 표시하는 앰플 또는 봉지와 같은 기밀 밀봉된 용기 중의 건조된 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우에는, 멸균된 약학 등급수 또는 식염수를 함유하는 주입병을 사용하여 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우에는, 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균 수 또는 식염수 앰플이 제공될 수 있다.
발명의 조성물은 중성 또는 염 형태로서 제형될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것들과 같이 음이온으로 형성된 것들, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 철, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것들과 같은 양이온으로 형성된 것들을 포함한다.
발명은 또한 그런 개시된 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디 (단독으로 또는 추가의 치료제(들)과 함께) 및 그런 약학적으로 허용되는 담체와 함께 채워진 하나 또는 그 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 추가로, 질환의 치료에 유용한 하나 또는 그 이상의 예방제 또는 치료제가 또한 약학적 팩 또는 키트에 포함될 수 있다. 발명은 또한 발명의 약학 조성물의 하나 또는 그 이상의 성분들로 채워진 하나 또는 그 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 포함한다. 임의로 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 제어하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 안내문이 그런 용기(들)에 관련될 수 있고, 그 안내문은 기관에 의한 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 승인을 반영한다.
본 발명은 상기 방법들에 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 키트는 발명의 하나 또는 그 이상의 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 추가로 암의 치료에 유용한 하나 또는 그 이상의 다른 예방제 또는 치료제를 하나 또는 그 이상의 용기에 더 포함한다. 또 다른 구체예에서, 키트는 추가로 암과 관련된 하나 또는 그 이상의 항원에 결합하는 하나 또는 그 이상의 항체를 더 포함한다. 특정 구체예에서, 다른 예방제 또는 치료제는 화학요법제이다. 또 다른 구체예에서, 예방제 또는 치료제는 생물학적 또는 호르몬 치료제이다.
발명의 조성물의 용도
본 발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 gpA33의 발현과 관련된 또는 gpA33의 발현을 특징으로 하는 어떠한 질환 또는 상태든지 치료하는 능력을 가진다. 그러므로, 제한 없이, 그런 분자들을 포함하는 약학 조성물은 결장암, 결장직장암 및 췌장암의 진단 또는 치료에 사용될 수 있다.
투여 방법
본 발명의 조성물은 발명의 약학 조성물의 유효량을 대상에게 투여함으로써, 질환, 장애 또는 감염과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 치료, 예방 및 개선하기 위해 제공될 수 있다. 바람직한 측면으로, 그런 조성물은 실질적으로 정제된다 (즉, 실질적으로 조성물의 효과를 제한하거나 바람직하지 못한 부작용을 생성하는 물질들이 없다). 특정 구체예에서, 대상은 동물, 바람직하게 비-영장류 (예컨대 소, 말, 고양이, 개, 설치류 등) 또는 영장류 (예컨대 시노몰구스 (cynomolgous) 원숭이, 인간 등)와 같은 포유류이다. 바람직한 구체예에서, 대상은 인간이다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있고 발명의 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있는데, 예컨대 리포솜에의 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 항체 또는 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-중재된 식세포작용 (예컨대 Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 구성 등이 있다.
발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 투여 방법은, 그것들에 한정되지는 않지만, 비경구 투여 (예컨대 피부 내, 근육 내, 복막 내, 정맥 내 및 피하), 경막 외 및 점막 (예컨대 비강 내 및 구강 경로) 투여를 포함한다. 특정 구체예에서, 발명의 분자는 근육 내로, 정맥 내로 또는 피하로 투여된다. 조성물은 어떠한 편리한 경로에 의해, 예를 들면 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 피부점막 라이닝 (예컨대 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적 활성 제제들과 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 또한, 폐 투여가 예컨대 흡입기 또는 분무기의 사용에 의해, 및 에어로졸화제를 사용한 제형에 의해 또한 사용될 수 있다. 예컨대 미국 특허 제 6,019,968호; 제 5,985,320호; 제 5,985,309호; 제 5,934,272호; 제 5,874,064호; 제 5,855,913호; 제 5,290,540호; 및 제 4,880,078호; 및 PCT 공보 WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; 및 WO 99/66903 참조 (이것들은 각각 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다).
발명은 또한 발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디가 그런 분자들의 양을 표시하는 앰플 또는 봉지와 같은 기밀 밀봉된 용기에 팩킹되는 것을 제공한다. 한 구체예에서, 발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 기밀 밀봉된 용기 중의 건조 멸균된 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급되고 예컨대 대상에게 투여되기 위해 적절한 농도로 물 또는 식염수로 재구성될 수 있다. 바람직하게, 발명의 gpA33 x CD3 디아바디 또는 gpA33 x CD3 Fc 디아바디는 기밀 밀봉된 용기 중에 적어도 5 ㎍, 보다 바람직하게 적어도 10 ㎍, 적어도 15 ㎍, 적어도 25 ㎍, 적어도 50 ㎍, 적어도 100 ㎍ 또는 적어도 200 ㎍의 유닛 단위용량의 건조 멸균 동결건조 분말로서 공급된다.
발명의 동결건조된 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 그것의 원래 용기에 2 내지 8℃에서 저장되어야 하고 분자들은 재구성된 후 12시간 이내, 바람직하게 6시간 이내, 5시간 이내, 3시간 이내 또는 1시간 이내에 투여되어야 한다. 대체 구체예에서, 발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 분자, 융합 단백질 또는 포합된 분자의 양과 농도를 표시하는 기밀 밀봉된 용기 중의 액체 형태로 공급된다. 바람직하게 발명의 그런 이중특이성 1가 디아바디 또는 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 액체 형태는 분자들이 적어도 1 ㎍/ml, 보다 바람직하게 적어도 2.5 ㎍/ml, 적어도 5 ㎍/ml, 적어도 10 ㎍/ml, 적어도 50 ㎍/ml 또는 적어도 100 ㎍/ml의 농도로 존재하는 기밀 밀봉 용기로 공급된다.
장애와 관련된 하나 또는 그 이상의 증상의 치료, 방지 또는 개선에 효과적일 발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 양은 표준 임상 기법들에 의해 측정될 수 있다. 제형에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 상태의 심각성에 따라 좌우될 것이고, 의사의 판단 및 각 환자의 환경에 따라서 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
발명에 포함된 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디에 대해, 환자에게 투여되는 단위용량은 전형적으로 대상의 체중에 대해, 적어도 약 0.01 ㎍/kg, 적어도 약 0.05 ㎍/kg, 적어도 약 0.1 ㎍/kg, 적어도 약 0.2 ㎍/kg, 적어도 약 0.5 ㎍/kg, 적어도 약 1 ㎍/kg, 적어도 약 2 ㎍/kg, 적어도 약 3 ㎍/kg, 적어도 약 5 ㎍/kg, 적어도 약 10 ㎍/kg, 적어도 약 20 ㎍/kg, 적어도 약 30 ㎍/kg, 적어도 약 50 ㎍/kg, 적어도 약 0.1 mg/kg, 적어도 약 0.15 mg/kg 또는 그 이상이다.
발명의 이중특이성 1가 디아바디 또는 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 투여의 단위용량 및 빈도는 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 흡수 및 조직 침투를, 예를 들면 지질화와 같은 변형에 의해 증강시킴으로써 감소되거나 변경될 수 있다.
한 구체예에서, 환자에게 투여된 발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 단위용량은 단일 제제 요법으로서 사용하기 위해 계산될 수 있다. 다른 구체예에서 발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 다른 치료 조성물과 함께 사용되고 환자에게 투여된 단위용량은 그런 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디가 단일 제제 요법으로서 사용될 때보다 더 적다.
특정 구체예에서, 발명의 약학 조성물은 치료를 필요로 하는 지역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다; 이것은 예를 들면, 제한 없이, 국소 주입에 의해, 주사에 의해 또는 이식편에 의해 이루어질 수 있고, 상기 이식편은 막, 예컨대 시알라스틱(sialastic) 막을 포함하여 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질, 또는 섬유로 된 것이다. 바람직하게, 발명의 분자를 투여할 때, 분자를 흡수하지 않는 물질을 사용하기 위해 주의가 기울여져야 한다.
다른 구체예에서, 발명의 조성물은 소포로, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다 (Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, 상기 참조, pp. 317-327; 일반적으로 상기 참조).
또 다른 구체예에서, 발명의 조성물은 조절-방출 또는 지속성-방출 시스템으로 전달될 수 있다. 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 어떠한 기법이든지 발명의 하나 또는 그 이상의 분자를 포함하는 지속성-방출 제형을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대 미국 특허 제 4,526,938호; PCT 공보 WO 91/05548; PCT 공보 WO 96/20698; Ning et al. (1996) " Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; and Lam et al. (1997) " Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 참조, 이것들은 각각 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다. 한 구체예에서, 펌프가 조절-방출 시스템에 사용될 수 있다 (Langer, 상기 동일; Sefton, (1987) " Implantable Pumps," CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis," Surgery 88:507-516; and Saudek et al. (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery," N. Engl. J. Med. 321:574-579 참조). 다른 구체예에서, 중합체 물질이 항체의 조절 방출을 이루기 위해 사용될 수 있다 (예컨대 MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); CONTROLLED DRUG BIOAVAOLABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate ," Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization," Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) "Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits," J. Neurosurg. 7(1):105-112); 미국 특허 제 5,679,377호; 미국 특허 제 5,916,597호; 미국 특허 제 5,912,015호; 미국 특허 제 5,989,463호; 미국 특허 제 5,128,326호; PCT 공보 번호 WO 99/15154; 및 PCT 공보 번호 WO 99/20253 참조). 지속성-방출 제형에 사용된 중합체의 실례는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드 (PLG), 다가 무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드 (PLA), 폴리(락타이드-코-글리코라이드) (PLGA) 및 폴리오르토에스테르를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 조절 방출 시스템은 치료 표적 (예컨대 폐) 가까이에 배치될 수 있어서 전신적 용량의 단지 일부분만이 필요하게 된다 (예컨대 Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). 또 다른 구체예에서, 조절-방출 이식편으로서 유용한 중합체 조성물은 Dunn 등에 따라 사용된다 (U.S. 5,945,155 참조). 이 특별한 방법은 중합체 시스템으로부터의 생체활성 물질의 제자리 조절-방출에서의 치료 효과를 토대로 한다. 이식은 일반적으로 치료적 처치를 필요로 하는 환자의 신체에 있는 어느 곳에서든지 일어난다. 또 다른 구체예에서, 비-중합체 지속성 전달 시스템이 사용되는데, 그로써 대상의 신체에서 비-중합체 이식편은 약물 전달 시스템으로서 사용된다. 신체에 이식될 때, 이식편의 유기 용매는 조성물로부터 주변 조직액으로 소멸되거나, 분산되거나 또는 침출될 것이고, 비-중합체 물질은 점차로 응고되거나 침전되어 고체, 미소공성 매트릭스가 형성될 것이다 (U.S. 5,888,533 참조).
조절-방출 시스템은 문헌에서 개관적으로 논의된다 (Langer (1990, "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533). 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 어떠한 기법이든지 발명의 하나 또는 그 이상의 치료제를 포함하는 지속성-방출 제형을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대 미국 특허 제 4,526,938호; 국제 공보 번호 WO 91/05548 및 WO 96/20698; Ning et al. (1996) " Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; and Lam et al. (1997) " Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 참조, 이것들은 각각 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
특정 구체예에서 발명의 조성물이 발명의 이중특이성 1가 디아바디 또는 이중특이성 1가 Fc 디아바디를 코드화하는 핵산인 경우에, 그 핵산은 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 핵산을 구성하고 투여되어 세포 내에 있게 됨으로써, 예컨대 레트로바이러스 벡터의 사용에 의해 (미국 특허 제 4,980,286호 참조), 또는 직접 주사에 의해, 또는 미세입자 폭발에 의해 (예컨대 유전자 총; Biolistic, Dupont), 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질전환제를 코팅함으로써, 또는 핵으로 들어가는 것으로 알려져 있는 호메오박스 (homeobox)-유사 펩티드에 연결시켜 투여됨으로써 (예컨대 Joliot et al. (1991) " Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis ," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868) 참조), 등등의 방법에 의해 생체 내로 투여되어 그것이 코딩하는 이중특이성 1가 디아바디 또는 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 발현이 촉진될 수 있다. 다르게는, 핵산은 동종 재조합에 의한 발현을 위해 세포 내에 도입되고 숙주 세포 DNA 내에 통합될 수 있다.
발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디의 치료적 또는 예방적으로 유효한 양으로 대상을 치료하는 것은 단일 치료를 포함하거나, 또는 바람직하게 일련의 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 실례에서, 대상은 약 1 내지 10주, 바람직하게 2 내지 8주, 보다 바람직하게 약 3 내지 7주, 더욱 더 바람직하게 약 4, 5 또는 6주 동안 주 1회 발명의 분자로 치료된다. 다른 구체예에서, 발명의 약학 조성물은 하루에 1회, 하루에 2회 또는 하루에 3회 투여된다. 또 다른 구체예에서, 약학 조성물은 주 1회, 주 2회, 매 2주마다 1회, 1개월에 1회, 매 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 1년에 2회 또는 년 1회 투여된다. 또한 치료를 위해 사용된 분자의 효과적인 단위용량은 특정 치료 과정 동안 증가되거나 감소될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
이제 일반적으로 기술된 발명을 토대로, 예시에 의해 제공되고, 명시되지 않는 한 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않은 다음의 실시예들을 참조함으로써 발명은 보다 쉽게 이해될 것이다.
실시예 1
항-인간 gpA33 단클론성 항체의 특성확인
인간 gpA33에 특이적으로 결합할 수 있는 쥐과 단클론성 항체를 키메라 항체로 만들고 인간화하였다. 원래의 쥐과 항체의 VL 및 VH 사슬은 각각 서열 SEQ ID NO:13 및 17의 서열을 가진다. 인간화된 항체의 VL 및 VH 사슬은 각각 서열 SEQ ID NO:26 및 27의 서열을 가진다.
VLgpA33의 항원 결합 도메인은 서열 (SEQ ID NO:14): SARSSISFMY를 가지는 CDR1; 서열 (SEQ ID NO:15): DTSNLAS를 가지는 CDR2; 및 서열 (SEQ ID NO:16): QQWSSYPLT를 가지는 CDR3을 포함한다.
VHgpA33의 항원 결합 도메인은 서열 (SEQ ID NO:18): GSWMN을 가지는 CDR1; 서열 (SEQ ID NO:19): RIYPGDGETNYNGKFKD를 가지는 CDR2; 및 서열 (SEQ ID NO:20): IYGNNVYFDV를 가지는 CDR3을 포함한다.
아래의 표 1은 결합의 동역학에 대한 그런 변경의 효과를 나타낸다.
항체 KD ka kd
쥐과 mAb 1 2.3 nM 3.3 x 105 7.5 x 10-4
키메라 mAb 1 2.4 nM 5.8 x 105 1.4 x 10-3
인간화된 mAb 1 3.4 nM 5.6 x 105 1.9 x 10-3
실시예 2
gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 및 Fc 디아바디 및 대조 단백질의 구성
하기 표 2는 발현되고 정제된 gpA33 x CD3 디아바디 또는 gpA33 x CD3 Fc 디아바디의 목록이다. 디아바디는 예시적인 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디, DART-1 및 DART-2에 의한, 및 예시적인 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디 (DART-2 w/Fc)에 의한 그런 동시 결합의 검출에 의해 판단되는바, gpA33 및 CD3에 동시에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 대조 이중특이성 1가 디아바디 ("대조 DART")는 CD3 및 FITC에 대해 이중특이성 1가인 것으로 나타났고, CD3 및 FITC에 동시에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
디아바디 구성 폴리펩티드
(N-말단에서 C-말단 방향으로)
gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-1) SEQ ID NO:21
SEQ ID NO:23
gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2) SEQ ID NO:28
SEQ ID NO:30
알부민-결합 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/ABD)
생체 내 반감기의 연장을 위해 알부민-결합 도메인 (ABD)을 포함한다		 SEQ ID NO:35
SEQ ID NO:30
IgG Fc 도메인 버전 1을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/Fc 버전 1)
생체 내 반감기의 연장을 위해 Fc를 포함한다		 SEQ ID NO:42
SEQ ID NO:44
SEQ ID NO:46
IgG Fc 도메인 버전 2를 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/Fc 버전 2)
생체 내 반감기의 연장을 위해 Fc를 포함한다		 SEQ ID NO:48
SEQ ID NO:28
SEQ ID NO:46
gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디는 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 이종이량체이고 (한 사슬은 각각의 열거된 서열의 것임) gpA33 x CD3 이중특이성 Fc 디아바디는 3개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 이종삼량체이다 (한 사슬은 각각의 열거된 아미노산 서열의 것임). 이중특이성 1가 디아바디를 형성하는 방법은 WO 2006/113665, WO 2008/157379, WO 2010/080538, WO 2012/018687, WO 2012/162068 및 WO 2012/162067에 제공되어 있다.
대조 CD3 x FITC 이중특이성 1가 디아바디는 CD3 및 FITC에 동시에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기-기술된 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 및 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 gpA33 및 CD3에 동시에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그런 동시 결합을 증명하기 위하여, gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 DART-1을 고체 지지체에 고정된 가용성 CD3 단편의 존재하에 인큐베이션하였다. 결합의 검출은 추가로 gpA33에 결합하는 고정된 항체의 능력에 의해 평가하였다. 그 결과들은 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 및 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 Fc 디아바디가 gpA33 및 CD3에 대한 동시 결합을 중재하는 능력을 확인해준다 (도 3).
실시예 3
pA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디는 암세포에 대해 세포독성이다
본 발명의 pA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디의 암 치료 능력을, 결장직장 또는 췌장암 세포를 pA33 x CD3 이중특이성 1가 DART-1 및 인간 PBMC (E:T = 25:1) 또는 활성화된 인간 T 세포 (E:T = 10:1)중 어느 하나의 존재하에 인큐베이션함으로써 예시하였다. gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 DART-1은 하위-ng/mL 내지 약 1 ng/mL의 50% 최대 활성 (EC50)을 이루기 위해 필요한 농도로 강력한 재지시된 사멸 능력을 나타냈다. 대조적으로, 세포독성인 gpA33-네거티브 암 셀라인 (예컨대 HCT116)을 사용했을 때에는 관찰되지 않았다. 그 연구조사의 결과들은 도 4a (결장직장 암 줄기-유사 세포 (결장 CSCL 세포)), 도 4b (Colo205 결장직장 세포) 및 도 4c (ASPC-1 췌장암 세포)에 나타냈다. 결과들을 아래의 표 3에 요약한다.
표적 셀라인 gpA33 x CD3 이중특이 성 1가 디아바디의 EC50 (ng/mL) 이펙터:표적
( E:T ) 		관찰된 최대 % 사멸
결장 CSLC 0.9015 25:1 38
Colo205 0.5853 10:1 35
ASPC-1 1.142 10:1 25
실시예 4
gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디의 존재하에서의 T 세포 활성화
본 발명의 디아바디의 암 치료 능력을 증명하기 위하여, 휴지기 인간 T 세포를 암세포 (colo205 또는 ASPC-1)의 존재 또는 부재하에 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 DART-1과 함께 인큐베이션하였다. gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-1)-중재된 재지시된 사멸 과정 중에 T 세포 활성화를 특성확인하기 위하여, 재지시된 사멸 분석으로부터의 T 세포들을 T 세포 활성화 마커 CD25에 대해 염색하고 FACS에 의해 분석하였다. CD25는 CD8 (도 5a 및 5b) 및 CD4 (도 5d 및 5e) T 세포에서 용량-의존성 방식으로 상향조절되었고, 그것은 재지시된 사멸 과정에서 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디가 T 세포 활성화를 유도하였음을 시사한다. 역으로, 표적 세포의 부재시에 CD8 (도 5c) 또는 CD4 (도 5f) T 세포는 활성화되지 않았는데, 그것은 표적 세포의 부재시에 gpA33 x CD3 디아바디가 T 세포를 활성화시키지 않음을 시사한다. 마찬가지로, CD8 또는 CD4 T 세포는 표적 세포 및 대조 이중특이성 1가 디아바디 (대조 DART)와 함께 인큐베이션하였을 때 활성화되지 않앗고 (각각 도 5a, 5b 및 도 5d, 5e), 그것은 T 세포 및 표적 세포와 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디와의 교차결합의 필요성을 시사한다.
실시예 5
쥐과 항-인간 gpA33 가변 도메인 서열을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-1) 및 인간화된 항-인간 gpA33 가변 도메인 서열을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2)의 등가성
상기에서 논의된 것과 같이, gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 DART-1은 쥐과 단클론성 항체의 VLgpA33 및 VHgpA33 도메인을 함유하는 반면, gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 DART-2는 동일한 쥐과 항체의 인간화된 VLgpA33 및 인간화된 VHgpA33 도메인을 함유한다. gpA33-발현 암세포로 T 세포를 표적화하는 것을 촉진하는 인간화된 VLgpA33 및 VHgpA33 도메인의 능력을 증명하기 위하여, gpA33을 발현하는 암세포를 DART-1, DART-1 또는 대조 이중특이성 1가 디아바디 (대조 DART) 중 어느 하나의 존재하에 휴지기 T 세포의 존재하에 (LDH 분석; E:T = 10:1) 인큐베이션하였다. 이 분석의 결과들 (도 6a 내지 6d)은 DART-1 및 DART-2가 SW948 결장직장 선암종 세포 (도 6a) 및 colo205 세포 (도 6b)에 대해 동등한 세포독성을 중재했음을 증명한다. DART-1 및 DART-2는 둘 다, 감소된 발광에 의해 측정되는 바 (도 6c), 반딧불이 루시페라제 유전자 (luc2)로 안정하게 형질전환된, 루시페라제 발현 Colo205 셀라인 (Colo205-Luc)의 세포독성을 중재하였다. DART-1 또는 DART-2 중 어느 것도 gpA33-네거티브 암 셀라인, HCT116의 세포독성을 중재하지 못하였다 (도 6d). 아래의 표 4에서 알 수 있는 것과 같이, DART-1 및 DART-2는 다중 종양 셀라인에 대해 유사한 동등한 생체 활성을 나타냈다.
이펙터 /표적 LDH 분석 루시페라제 분석
공여 T 세포 종양 셀라인 gpA33xCD3
DART-2 		gpA33xCD3
DART 1 		gpA33xCD3
DART-2 		gpA33xCD3
DART 1
D54677 SW948 0.79 1.34
D54677 Colo205 1.17 2.52
D51031 Colo205-Luc 2.29 3.53 2.53 4.55
D41440 Colo205 2.29 3.37
D41440 Colo205-Luc 2.80 4.26 2.57 3.26
실시예 6
gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 , 알부민-결합 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 및 IgG Fc 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이 성 1가 디아바디와 시노몰구스 원숭이의 PBMC와의 교차반응성
상기에서 보여진 것과 같이, gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 DART-2의 인간화된 VLgpA33 및 인간화된 VHgpA33 도메인은 인간 T 세포의 존재하에 gpA33-발현 암세포의 세포독성을 중재한다. 본 발명의 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디의 VLCD3 및 VHCD3 도메인은 예상외로 또한 시노몰구스 원숭이 T 세포의 CD3에 결합하고 그 세포가 gpA33-발현 세포를 사멸시키도록 재지시할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
도 7a 내지 7d에서 알 수 있는 것과 같이, gpA33 x CD3 이중특이성 1가 DART-2 디아바디, 알부민-결합 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/ABD) 및 IgG Fc 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/Fc)는 모두 인간 또는 시노몰구스 원숭이 PBMC의 존재하에 암세포의 세포독성을 촉진할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 도 7a 및 7b는 LDH 분석 (도 7a) 또는 루시페라제 (도 7b)에 의해 측정되는 바, 인간 PBMC와 함께 인큐베이션된 Colo205-Luc 세포의 세포독성을 중재하는 세 가지 디아바디의 능력을 보여준다. 도 7c 및 7d는 LDH 분석 (도 7c) 또는 루시페라제 (도 7d)에 의해 측정되는 바, 시노몰구스 원숭이 PBMC와 함께 인큐베이션된 Colo205-Luc 세포의 세포독성을 중재하는 세 가지 디아바디의 상응하는 능력을 보여준다.
표 5에서 알 수 있는 것과 같이, gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 DART-2 및 알부민-결합 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/ABD)는 비교할만한 CTL 활성을 나타냈다. 이중특이성 1가 디아바디는 인간 및 시노몰구스 원숭이 (cyno) PBMC 이펙터 세포 둘 다와 일치하는 활성을 나타냈다.
EC50 - CTL 활성(ng/mL)
Colo205 표적 세포
LDH 분석 루시페라제 분석
DART 인간
PBMC 		Cyno
PBMC 		인간
PBMC 		Cyno
PBMC
gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2) 4.09 3.81 2.73 1.55
알부민-결합 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/ABD) 5.52 4.63 3.07 1.63
실시예 7
쥐과 결장 종양 모델에서 gpA33 x CD3 디아바디의 생체 내 반응성
암에 대한 치료를 제공할 수 있는 본 발명의 gpA33 x CD3 디아바디의 생체 내 능력을 증명하기 위하여, colo205 세포를 활성화된 T 세포와 함께 면역결핍 NSG (NOD scid 감마) 마우스들에 공동-이식하였다 (Agliano, A. et al. (2008) "Human Acute Leukemia Cells Injected In NOD/ Ltsz - Scid /IL- 2Rgamma Null Mice Generate A Faster And More Efficient Disease Compared To Other NOD/ Scid -Related Strains," Int. J. Cancer 123(9):2222-2227; Sanchez, P.V. et al. (2009) "A Robust Xenotransplantation Model For Acute Myeloid Leukemia," Leukemia 23(11):2109-2117; Racki, W.J. et al. (2010) "NOD- Scid IL2rgamma (Null) Mouse Model Of Human Skin Transplantation And Allograft Rejection," Transplantation 89(5):527-536; Choi, B. et al. (2011) "Human B Cell Development And Antibody Production In Humanized NOD/ SCID /IL- 2R?( Null) ( NSG ) Mice Conditioned By Busulfan," J. Clin. Immunol. 31(2):253-264; Sartelet, H. et al. (2012) "Description Of A New Xenograft Model Of Metastatic Neuroblastoma Using NOD/ SCID / Il2rg Null ( NSG ) Mice," In Vivo 26(1):19-29; Spranger, S. et al. (2012) "NOD/ scid IL- 2Rg (null) Mice: A Preclinical Model System To Evaluate Human Dendritic Cell-Based Vaccine Strategies in vivo," J. Transl. Med. 10:30; von Bonin, M. et al. (2013) "in vivo Expansion Of Co-Transplanted T Cells Impacts On Tumor Re-Initiating Activity Of Human Acute Myeloid Leukemia In NSG Mice," PLoS One. 8(4):e60680).
gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 DART-1을 마우스에 이식한 때로부터 시작하여 4일 동안 매일 1회 (QDx4) IV로 투여하였다. Colo205 종양 부피는 비히클 대조표준을 받은 마우스에서 증가하는 것으로 나타났다 (도 8).
Colo205 세포를 이식받은 NSG 마우스의 영상은 비히클 (도 9a) 또는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 DART-1 (도 9b)를 받은 마우스들이 처리 2일째에 상당한 종양을 가진 것을 보여주었다. 그러나, gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 DART-1를 받은 마우스들은 처리 12일째에 극적으로 종양 부피가 줄어들었다 (도 9d). 처리 12일째에, 비히클을 받은 마우스들은 종양 부피가 증가하였다 (도 9c).
암 치료를 제공할 수 있는 본 발명의 gpA33 x CD3 디아바디의 생체 내 능력에 대한 추가의 증거로서, 상기-기술된 종양 모델을 ASPC-1 췌장 종양 세포 및 활성화된 인간 T 세포 (E:T = 1:1)를 사용하여 수행하였다. gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 DART-1, 대조 이중특이성 1가 디아바디 (대조 DART) 또는 비히클을 이식한 때로부터 시작하여 9일 동안 매일 1회 (QDx9) IV 투여하였다. ASPC-1 종양 부피는 비히클 대조표준을 받은 마우스에서 증가하는 것으로 나타났다 (도 10). 그러나, DART-1을 받은 동물들은 용량-의존 방식으로 더 작은 종양 부피를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 10).
실시예 8
IgG Fc 도메인 버전 1을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/Fc 버전 1)의 효능 측정
IgG Fc 도메인 버전 1을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/Fc 버전 1)의 효능을 측정하기 위하여, 마우스들에게 (삼투 펌프를 사용하여) 다양한 단위용량 수준에서 상기-기술된 DART-2 w/Fc 버전 1을 7일 동안 주입하였다. 펌프 이식 후 48시간에 (즉 정상 상태 순환 수준의 DART-2 w/Fc 버전 1의 존재하에), Colo205 종양 세포와 T 세포의 혼합물을 마우스의 피하로 이식하고, 종양 성장의 정도를 모니터링하였다. 표 6은 연구 디자인을 요약한 것이다; 각 그룹은 8마리씩의 암컷 마우스를 포함하였다.
그룹 처리 용량
(mg/kg) 		경로/
스케줄 		이식 세포(들)
1 비히클 0 IV/QDx5 COLO205 (5E6)
2 IgG Fc 도메인을 가지는 gpA33xCD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/Fc 버전 1) 3.1 IP/CIF COLO205 (5E6)
hT-세포 (5E6)
3 DART-2 w/Fc 버전 1 1.5 IP/CIF COLO205 (5E6)
hT-세포 (5E6)
4 DART-2 w/Fc 버전 1 0.75 IP/CIF COLO205 (5E6)
hT-세포 (5E6)
5 DART-2 w/Fc 버전 1 0.375 IP/CIF COLO205 (5E6)
hT-세포 (5E6)
6 DART-2 w/Fc 버전 1 0.5 IV/QDx5 COLO205 (5E6)
hT-세포 (5E6)
이 연구 결과는 도 11d에 도시하는데, 그것은 상기-기술된 IgG Fc 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/Fc 버전 1)의 투여가 시험한 모든 단위용량에서 종양 부피의 극적인 감소를 중재하였음을 시사한다.
상기 연구에서 얻어진 종양 부피의 극적인 감소의 관점에서, 추가의 연구를 훨씬 더 적은 용량에서의 효능을 평가하기 위해 수행하였다. 표 7은 이 추가 연구의 디자인을 요약한 것이다; 각 그룹은 8마리씩의 암컷 마우스를 포함하였다.
그룹 처리 용량
(mg/kg) 		경로/
스케줄 		이식 세포(들)
1 비히클 0 IV/QDx5 COLO205 (5E6)
2 IgG Fc 도메인을 가지는 gpA33xCD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/Fc 버전 1) 0.2 IP/CIF COLO205 (5E6)
hT-세포 (5E6)
3 DART-2 w/Fc 버전 1 0.04 IP/CIF COLO205 (5E6)
hT-세포 (5E6)
4 DART-2 w/Fc 버전 1 0.008 IP/CIF COLO205 (5E6)
hT-세포 (5E6)
5 DART-2 w/Fc 버전 1 0.0016 IP/CIF COLO205 (5E6)
hT-세포 (5E6)
6 DART-2 w/Fc 버전 1 0.5 IV/QDx5 COLO205 (5E6)
hT-세포 (5E6)
이 추가 연구의 결과는 도 12에 나타낸다. 도 12에서, 각각의 기호는 표시된 단위용량의 IgG Fc 도메인을 가지는 gpA33xCD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/Fc 버전 1) 또는 비히클을 받은 동물을 나타낸다. 데이터는 시험함 모든 단위용량에서의 효능을 나타낸다.
실시예 9
시노몰구스 원숭이에서 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2) 및 IgG Fc 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/ Fc )의 약물동역학적 프로필
본 발명의 디아바디들의 VLCD3 및 VHCD3 도메인의 시노몰구스 원숭이의 CD3에 결합하는 능력은 그런 동물을 본 발명의 디아바디들의 생체 내 약물동역학을 측정하기 위해 사용하는 것을 허용한다.
그런 약물동역학을 측정하기 위하여, 상기-기술된 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2) 또는 IgG Fc 도메인을 가지는 gpA33 x CD3 이중특이성 1가 디아바디 (DART-2 w/Fc)를 시노몰구스 원숭이에 주사하고 (10 ㎍/kg/일) 순환계에서 유지되는 그런 분자의 농도를 모니터링하였다. 도 13은 이 연구 결과를 나타낸 것이고, DART-2 및 DART-2 w/Fc 버전 1이 1-차 제거 동역학을 나타낸 것을 시사한다.
실시예 10
인간 및 시노몰구스 원숭이 CD3 및 gpA33에 결합하는 gpA33 x CD3 이중특이 성 1가 Fc 디아바디 (DART-1 w/Fc 버전 1)의 SPR 분석
인간 및 시노몰구스 원숭이 CD3 수용체의 가용성 버전에 결합하는 gpA33 x CD3 이중특이성 Fc 디아바디 (DART-2 w/Fc 버전 1)를 BIAcore 3000 바이오센서 (GE, Healthcare) 상에서 SPR에 의해 분석하였다. 수용체들을 제조업체에 의해 권장된 과정을 따라 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다. 간단히 설명하며, 센서 칩 표면 상의 카르복실기를 0.2 M N-에틸-N-(3다이에틸아미노-프로필) 카보다이이미드 및 0.05 M N-하이드록시-석신이미드를 함유하는 용액을 주입함으로써 활성화하였다. 그런 다음 가용성 CD3 수용체 (1 ㎍/ml)를 활성화된 CM5 표면에 10 mM 나트륨-아세테이트, pH 5.0 중에서 5 μL/분의 유속으로 주입한 후, 탈활성화를 위해 1 M 에탄올아민을 주입하였다.
그런 분석에서 사용한 시노몰구스 및 인간 CD3의 가용성 버전을 CD3ε/CD3δ 이종이량체로서 포유류 세포에서 발현시켰고, 반대로 대전된 이종이량체-촉진 E-코일 및 K-코일 서열에 의해 그것들의 C-말단에서 안정화시켰다. 가용성 시노몰구스 CD3ε은 시노몰구스 원숭이 CD3ε의 처음 118 아미노산 잔기들을 함유하였는데, V35 대립유전자 (FN18+)에 이어서 카르복시 말단에 상기-기술된 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3)이 이어진다. V35 대립유전자 (FN18+) 시노몰구스 CD3ε의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:49)이다:
MQSGTRWRVL GLCLLSIGVW GQDGNEEMGS ITQTPYQVSI SGTTVILTCS QHLGSEAQWQ
HNGKNKEDSG DRLFLPEFSE MEQSGYYVCY PRGSNPEDAS HHLYLKARVC ENCMEMDVMA
VATIVIVDIC ITLGLLLLVY YWSKNRKAKA KPVTRGAGAG GRQRGQNKER PPPVPNPDYE
PIRKGQQDLY SGLNQRRI.
가용성 시노몰구스 CD3δ는 시노몰구스 원숭이 CD3δ의 처음 101 아미노산 잔기들을 함유하였고, 카르복시 말단에 상기-기술된 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4)이 이어진다. 시노몰구스 CD3δ의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:50)이다:
MEHSTFLSGL VLATLLSQVS PFKIPVEELE DRVFVKCNTS VTWVEGTVGT LLTNNTRLDL
GKRILDPRGI YRCNGTDIYK DKESAVQVHY RMCQNCVELD PATLAGIIVT DVIATLLLAL
GVFCFAGHET GRLSGAADTQ ALLRNDQVYQ PLRDRDDAQY SRLGGNWARN K.
2개의 단백질을 포유류 CHO-S 세포에서 공동-발현시켰고 SEPHAROSE®에 결합된 항-E/K-코일 mAb를 사용하여 정제하였다.
가용성 인간 CD3ε은 C119S 및 C122S를 가지는 인간 CD3ε의 잔기 1 내지 127을 함유하였고, 카르복시 말단에 상기-기술된 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3)이 이어진다. 인간 CD3ε의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:51)이다:
MQSGTHWRVL GLCLLSVGVW GQDGNEEMGG ITQTPYKVSI SGTTVILTCP QYPGSEILWQ
HNDKNIGGDE DDKNIGSDED HLSLKEFSEL EQSGYYVCYP RGSKPEDANF YLYLRARV C E
N C MEMDVMSV ATIVIVDICI TGGLLLLVYY WSKNRKAKAK PVTRGAGAGG RQRGQNKERP
PPVPNPDYEP IRKGQRDLYS GLNQRRI.
가용성 인간 CD3δ는 인간 CD3δ의 잔기 1 내지 101을 함유하였고, 카르복시 말단에 상기-기술된 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4)이 이어진다. 2개의 단백질을 포유류 CHO-S 세포에서 공동-발현시켰고 SEPHAROSE®에 결합된 항-E/K-코일 mAb를 사용하여 정제하였다. 인간 CD3δ의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:52)이다:
FKIPIEELE DRVFVNCNTS ITWVEGTVGT LLSDITRLDL GKRILDPRGI YRCNGTDIYK
DKESTVQVHY RMCQSCVELD PATVAGIIVT DVIATLLLAL GVFCFAGHET GRLSGAADTQ
ALLRNDQVYQ PLRDRDDAQY SHLGGNWARN K.
가용성 인간 gpA33은 인간 gpA33의 잔기 1 내지 235를 함유하였고, 카르복시 말단부에 (SEQ ID NO:53) HHHHHH ("6His") 반복부를 가진다. 가용성 시노몰구스 gpA33은 시노몰구스 원숭이 gpA33 Met 1 내지 Gln 314의 잔기 1 내지 314를 함유하였고, 카르복시 말단부에 6개의 His 반복부를 가진다. 단백질들을 포유류 CHO-S 세포에서 발현시켰고 Ni SEPHAROSE®를 사용하여 정제하였다.
결합 실험을 10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.005% P20 계면활성제를 함유한 HBS-EP 완충액 중에서 수행하였다. DART-2 w/Fc 버전 1의 결합을 30 μL/분의 유속으로 120초 동안 주입된 0, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 nM의 농도에서 (이중으로) 분석하였다.
고정된 수용체 표면의 재생을 10 mM 글리신, pH 1.5의 펄스 주입에 의해 수행하였다. 참조 곡선을 고정된 단백질을 포함하지 않은 처리된 표면 위로 DART-2 w/Fc의 각각의 희석액을 주입함으로써 얻었다. 0 농도에서의 결합 곡선을 블랭크로서 뺐다. KD 값을 랭뮤어 1:1 결합 모델 (BIAevaluation 소프트웨어 v4.1)에 대한 결합 곡선의 전반적인 적용에 의해 KD 값을 측정하였다.
인간 및 시노몰구스 원숭이 CD3 및 gpA33에 결합하는 gpA33 x CD3 이중특이성 Fc 디아바디 (DART-2 w/Fc 버전 1)의 SPR 분석은 2가지 상이한 종으로부터의 분자들에 대한 실질적인 유사성을 증명하였다 (도 14a 및 14b; 도 15a 및 15b). 표 8은 DART-2 w/Fc 상호작용에 대한 1:1 랭뮤어 모델 친화성 및 역학 상수에 대한 전반적인 적용에 의해 계한된 평형 분해 상수 (KD)를 제공한다. 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD3에 대한 DART-2 w/Fc 버전 1의 KD 값은 두 개의 항원 사이의 최대 결합 반응의 약간의 차이에도 불구하고, 각각 23 및 26 nM에서 거의 동일하다. 표면 상에 직접 고정된 상이한 아미노산 서열을 가지는 항원들의 무작위 배향은 표면 상의 이용가능한 결합 부위들의 상이한 밀도를 초래할 수 있다. 인간 및 원숭이 gpA33과의 DART-2 w/Fc 버전 1의 상호작용에 대한 KD 값은 각각 2.2 nM 및 12 nM이다 (표 8). 친화성의 차이는 DART-2 w/Fc 버전 1과 시노몰구스 원숭이 gpA33과의 상호작용에 대한 결합 속도 상수의 상대적으로 작은 감소 및 분해 속도 상수의 증가의 결과이다 (표 8). 데이터는 이중으로 시행한 3개의 독립적인 실험의 평균이다 (SD = 표준 편차; h, 인간; cyno, 시노몰구스 원숭이).
상이한 종으로부터의 항원들에 대한
DART-2 w/ Fc 버전 1의 결합에 대한 평형 분해 상수 (KD)
항원 k a (±SD)
(M -1 s -1 ) 		k d (±SD)
(s -1 ) 		K D (±SD)
(nM)
hCD3ε/δ 1.5(±0.1) x 105 3.5(±0.06)x10-3 23 ±2.0
cynoCD3ε/δ 1.3(±0.02)x105 3.4(±0.02) x10-3 26 ±0.6
hgpA33-His 4.2(±0.3) x105 9.0(±0.5)x10-4 2.2±0.2
cynogpA33-His 2.3(±0.2)x105 2.8(±0.1) x10-3 12±1.0
본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허는 본원에 각각의 개별적인 공보 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 그것의 전체 내용이 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 같은 정도로 참조로 본원에 포함된다. 발명은 발명의 특정 구체예들과 관련하여 기술된 한편, 추가로 변형될 수 있고, 본 출원은 일반적으로 발명의 원리에 따르는 발명의 어떠한 변화, 용도 또는 응용을 포함하며 본 개시내용으로부터의 그런 일탈을, 발명이 속하는 기술분야 내의 공지되거나 관례적인 실시범위 내에 있는 것으로서 및 지금까지 설명된 필수적인 특징에도 적용될 수 있는 것으로서 포함하는 것이 인지될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> MacroGenics, Inc. Moore, Paul Li, Jonathan Chen, Francine Johnson, Leslie Shah, Kalpana Bonvini, Ezio <120> Bi-Specific Monovalent Diabodies That Are Capable Of Binding to gpA33 And CD3, And Uses Thereof <130> 1301.0112PCT <150> US 61/869,528 <151> 2013-08-23 <150> US 61/907,691 <151> 2013-11-22 <150> EP 13198859 <151> 2013-12-20 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 1 Polypeptide <400> 1 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 2 Polypeptide <400> 2 Gly Gly Cys Gly Gly Gly 1 5 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E-Coil Domain <400> 3 Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 20 25 <210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Coil Domain <400> 4 Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 20 25 <210> 5 <211> 110 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(110) <223> Light Chain Variable Domain of Murine Anti-CD3 Antibody <400> 5 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> CDR1 of Light Chain Variable Domain of Murine Anti-CD3 Antibody <400> 6 Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE 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Ser Gly Pro Glu 115 120 125 Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly 130 135 140 Tyr Thr Phe Ser Gly Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly 145 150 155 160 Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr 165 170 175 Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys 180 185 190 Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp 195 200 205 Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe 210 215 220 Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys 225 230 235 240 Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu 245 250 255 Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 260 265 270 <210> 22 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Molecule Encoding First Polypeptide Chain of DART-1 <400> 22 caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg 60 acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag 120 aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc 180 cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca 240 caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc 300 gggggtggca caaaactgac tgtgctggga ggtggtggat ccggcggagg tggacaggtc 360 cagctgcagc agtctggacc tgagctggtg aagcctgggg cctcagtgaa gatttcctgc 420 aaagcttcag gctacacatt cagtggctct tggatgaact gggtgaagca gaggcctgga 480 cagggtcttg agtggattgg acggatctac cctggagatg gagaaactaa ctacaatggg 540 aagtttaagg acaaggccac actgactgca gacaaatcat ccaccacagc ctacatggag 600 ctcagcagcc tgacctctgt ggactctgcg gtctatttct gtgcaagaat ctatggtaat 660 aacgtttact tcgatgtctg gggcgcaggg accacggtca ccgtgtcttc cggaggatgt 720 ggcggtggag aagtggccgc actggagaaa gaggttgctg ctttggagaa ggaggtcgct 780 gcacttgaaa aggaggtcgc agccctggag aaa 813 <210> 23 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of DART-1 <400> 23 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu 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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 Gly Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala 245 250 255 Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu 260 265 270 Lys Glu <210> 24 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Molecule Encoding Second Polypeptide Chain of DART-1 <400> 24 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gagggtcacc 60 atgacctgca gtgccaggtc aagtataagt ttcatgtact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagttacc cactcacgtt cggttctggg 300 accaagctgg agctgaaacg gggtggagga tccggcggag gcggagaggt gcagctggtg 360 gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct 420 ggattcacct tcaacacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg 480 gagtgggttg caaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct 540 gtgaaggata gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg 600 aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc 660 aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc 720 ggaggatgtg gcggtggaaa agtggccgca ctgaaggaga aagttgctgc tttgaaagag 780 aaggtcgccg cacttaagga aaaggtcgca gccctgaaag ag 822 <210> 25 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(125) <223> Heavy Chain Variable Domain of Anti-CD3 Antibody <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr 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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 115 120 125 Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 130 135 140 Tyr Thr Phe Thr Gly Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 145 150 155 160 Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr 165 170 175 Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys 180 185 190 Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 195 200 205 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe 210 215 220 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys 225 230 235 240 Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu 245 250 255 Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 260 265 270 <210> 29 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Molecule Encoding First Polypeptide Chain of DART-2 <400> 29 caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg 60 acatgcagat ccagcacagg 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gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc 360 cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc 420 aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga 480 cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga 540 aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag 600 ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac 660 aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt 720 ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc 780 gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag 813 <210> 46 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Third Polypeptide Chain of DART-2 w/Fc Version 1 Construct <400> 46 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His 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accgtcagtc 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 420 aaccaggtca gcctgagttg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcgt cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgctacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ctccgggtaa a 681 <210> 48 <211> 508 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of DART-2 w/Fc Version 2 Construct <400> 48 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu Asp Ile Gln Leu Thr 225 230 235 240 Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile 245 250 255 Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met Tyr Trp Tyr Gln Gln 260 265 270 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu 275 280 285 Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu 290 295 300 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 305 310 315 320 Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr 325 330 335 Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln 340 345 350 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 355 360 365 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn 370 375 380 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile 385 390 395 400 Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 405 410 415 Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 420 425 430 Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 435 440 445 Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp 450 455 460 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly 465 470 475 480 Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val 485 490 495 Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 500 505 <210> 49 <211> 198 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(198) <223> V35 allele (FN18+) of CD3 epsilon <400> 49 Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys 50 55 60 Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu 65 70 75 80 Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro 85 90 95 Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn 100 105 110 Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp 115 120 125 Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys 130 135 140 Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly 145 150 155 160 Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn 165 170 175 Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly 180 185 190 Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 <210> 50 <211> 171 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(171) <223> CD3 delta <400> 50 Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Val Glu Glu Leu Glu Asp Arg 20 25 30 Val Phe Val Lys Cys Asn Thr Ser Val Thr Trp Val Glu Gly Thr Val 35 40 45 Gly Thr Leu Leu Thr Asn Asn Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile 50 55 60 Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Lys Glu Ser Ala Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys 85 90 95 Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Leu Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val 100 105 110 Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His 115 120 125 Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg 130 135 140 Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr 145 150 155 160 Ser Arg Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys 165 170 <210> 51 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(207) <223> CD3 epsilon <400> 51 Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 50 55 60 Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp 65 70 75 80 His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr 85 90 95 Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu 100 105 110 Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met 115 120 125 Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu 130 135 140 Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys 145 150 155 160 Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 165 170 175 Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 180 185 190 Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 200 205 <210> 52 <211> 150 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(150) <223> CD3 delta <400> 52 Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys 1 5 10 15 Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser 20 25 30 Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly 35 40 45 Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr 50 55 60 Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys Val Glu Leu Asp Pro 65 70 75 80 Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val Ile Ala Thr Leu Leu 85 90 95 Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His Glu Thr Gly Arg Leu 100 105 110 Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr 115 120 125 Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly 130 135 140 Asn Trp Ala Arg Asn Lys 145 150 <210> 53 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6His Peptide <400> 53 His His His His His His 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterodimerization Domain <400> 54 Gly Val Glu Pro Lys Ser Cys 1 5 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterodimerization Domain <400> 55 Val Glu Pro Lys Ser Cys 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterodimerization Domain <400> 56 Gly Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 <210> 57 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterodimerization Domain <400> 57 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5

Claims (18)

  1. gpA33의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이성 1가 디아바디로서, 상기 이중특이성 1가 디아바디는 제 1 폴리펩티드 사슬 및 제 2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유 결합되어 있고, 이때
    A. 제 1 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
    i. CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLCD3) (SEQ ID NO:5)을 포함하는 하위도메인 (1A); 및 gpA33에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHgpA33) (SEQ ID NO:27)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하며; 상기 하위도메인들 (1A 및 1B)은 펩티드 링커 (SEQ ID NO:1)에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1;
    ii. K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4) 또는 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3)인 도메인 2로서, 상기 도메인 2는 펩티드 링커 (SEQ ID NO:2)에 의해 상기 도메인 1과 분리되어 있는 도메인 2를 포함하고;
    B. 제 2 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
    i. gpA33에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26)을 포함하는 하위도메인 (1A); 및 CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHCD3) (SEQ ID NO:25)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하며, 상기 하위도메인들 (1A 및 1B)은 펩티드 링커 (SEQ ID NO:1)에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1;
    ii. E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3) 또는 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4)인 도메인 2로서, 상기 도메인 2는 펩티드 링커 (SEQ ID NO:2)에 의해 도메인 1과 분리되어 있고; 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 도메인 2 및 상기 제 2 폴리펩티드 사슬의 도메인 2는 둘 다 E-코일 도메인이 아니거나 둘 다 K-코일 도메인이 아닌 도메인 2를 포함하며;
    (a) 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인 및 상기 제 2 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인은 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 형성하고; 및
    (b) 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인 및 상기 제 2 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인은 gpA33의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 형성하는,
    이중특이성 1가 디아바디.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드 사슬은 알부민-결합 도메인 (SEQ ID NO:34)을 포함하고, 상기 도메인은 상기 도메인 2에 대해 C-말단 쪽에 위치하고 있으며 링커 3 (SEQ ID NO:32)에 의해 상기 도메인 2와 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 이중특이성 1가 디아바디.
  3. gpA33의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고 IgG Fc 도메인을 가지는 이중특이성 1가 Fc 디아바디로서, 상기 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 제 1 폴리펩티드 사슬, 제 2 폴리펩티드 사슬 및 제 3 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 이때 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유 결합되어 있으며 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유 결합되어 있고,
    A. 제 1 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
    i. gpA33에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26)을 포함하는 하위도메인 (1A) 및 CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHCD3) (SEQ ID NO:25)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하며, 상기 하위도메인들 (1A 및 1B)은 펩티드 링커 (SEQ ID NO:1)에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1;
    ii. E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3) 또는 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4)인 도메인 2로서, 상기 도메인 2는 펩티드 링커 (SEQ ID NO:2)에 의해 도메인 1과 분리되어 있는 도메인 2; 및
    iii. 시스테인-함유 펩티드 (펩티드 1) (SEQ ID NO:39)를 포함하는 하위도메인 (3A) 및 IgG 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인을 가지는 IgG Fc 도메인의 폴리펩티드 부분을 포함하는 하위 도메인 (3B)을 포함하는 도메인 3으로서, 상기 도메인 3과 도메인 2는 스페이서 펩티드 (링커 5)(SEQ ID NO:33)에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 3을 포함하고;
    B. 제 2 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
    i. CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLCD3) (SEQ ID NO:5)을 포함하는 하위도메인 (1A) 및 gpA33에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHgpA33) (SEQ ID NO:27)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하며; 상기 하위도메인들 (1A 및 1B)은 펩티드 링커 (SEQ ID NO:1)에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1;
    ii. K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4) 또는 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3)인 도메인 2로서, 상기 도메인 2는 펩티드 링커 (SEQ ID NO:2)에 의해 도메인 1과 분리되어 있고; 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 도메인 2 및 상기 제 2 폴리펩티드 사슬의 도메인 2는 둘 다 E-코일 도메인이 아니거나 둘 다 K-코일 도메인이 아닌 도메인 2를 포함하며;
    C. 제 3 폴리펩티드 사슬은 N-말단 방향에서 C-말단 방향으로:
    (1) 시스테인-함유 펩티드 (펩티드 1) (SEQ ID NO:39)를 포함하는 하위도메인 (3A); 및
    (2) IgG 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인을 가지는 IgG Fc 도메인의 폴리펩티드 부분을 포함하는 하위도메인 (3B)을 포함하는 도메인 3을 포함하고;
    (a) 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 IgG Fc 도메인들의 폴리펩티드 부분은 상기 IgG Fc 도메인을 형성하며;
    (b) 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인 및 상기 제 2 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인은 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 형성하고;
    (c) 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인 및 상기 제 2 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인은 gpA33의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 형성하는,
    이중특이성 1가 Fc 디아바디.
  4. gpA33의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고 IgG Fc 도메인을 가지는 이중특이성 1가 Fc 디아바디로서, 상기 이중특이성 1가 Fc 디아바디는 제 1 폴리펩티드 사슬, 제 2 폴리펩티드 사슬 및 제 3 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 이때 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유 결합되어 있으며 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유 결합되어 있고,
    A. 제 1 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
    i. 시스테인-함유 펩티드 (펩티드 1) (SEQ ID NO:39)를 포함하는 하위도메인 (3A) 및 IgG 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인을 가지는 IgG Fc 도메인의 폴리펩티드 부분을 포함하는 하위 도메인 (3B)을 포함하는 도메인 3;
    ii. gpA33에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26)을 포함하는 하위도메인 (1A) 및 CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHCD3) (SEQ ID NO:25)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하며, 상기 하위도메인들 (1A 및 1B)은 펩티드 링커 (SEQ ID NO:1)에 의해 서로 분리되어 있고; 상기 도메인 1 및 3은 스페이서 펩티드 (링커 4) (SEQ ID NO:38)에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1;
    iii. E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3) 또는 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4)인 도메인 2로서, 상기 도메인 2는 펩티드 링커 (SEQ ID NO:2)에 의해 도메인 1과 분리되어 있는 도메인 2를 포함하고;
    B. 제 2 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
    i. CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLCD3) (SEQ ID NO:5)을 포함하는 하위도메인 (1A) 및 gpA33에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHgpA33) (SEQ ID NO:27)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하며; 상기 하위도메인들 (1A 및 1B)은 펩티드 링커 (SEQ ID NO:1)에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1;
    ii. K-코일 도메인 (SEQ ID NO:4) 또는 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:3)인 도메인 2로서, 상기 도메인 2는 펩티드 링커 (SEQ ID NO:2)에 의해 도메인 1과 분리되어 있고; 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 도메인 2 및 상기 제 2 폴리펩티드 사슬의 도메인 2는 둘 다 E-코일 도메인이 아니거나 둘 다 K-코일 도메인이 아닌 도메인 2를 포함하며;
    C. 제 3 폴리펩티드 사슬은 N-말단 방향에서 C-말단 방향으로:
    (1) 시스테인-함유 펩티드 (펩티드 1) (SEQ ID NO:39)를 포함하는 하위도메인 (3A); 및
    (2) IgG 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인을 가지는 IgG Fc 도메인의 폴리펩티드 부분을 포함하는 하위도메인 (3B)을 포함하는 도메인 3을 포함하고;
    (a) 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 IgG Fc 도메인들의 폴리펩티드 부분은 상기 IgG Fc 도메인을 형성하며;
    (b) 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인 및 상기 제 2 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인은 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 형성하고;
    (c) 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인 및 상기 제 2 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인은 gpA33의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 형성하는,
    이중특이성 1가 Fc 디아바디.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 하위도메인 (3B)은 상기 제 3 폴리펩티드 사슬의 하위도메인 (3B)과 상이한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이성 1가 Fc 디아바디.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 하위도메인 (3B)은 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 가지고, 상기 제 3 폴리펩티드 사슬의 하위도메인 (3B)은 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 이중특이성 1가 Fc 디아바디.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 하위도메인 (3B)은 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 가지고, 상기 제 3 폴리펩티드 사슬의 하위도메인 (3B)은 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 이중특이성 1가 Fc 디아바디.
  8. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 도메인 3 및/또는 상기 제 3 폴리펩티드 사슬의 도메인 3은 Fcγ 수용체에 대해 변경된 결합을 나타내는 변이 CH2-CH3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이성 1가 Fc 디아바디.
  9. 제 1항 또는 제 2항의 이중특이성 1가 디아바디 또는 제 3항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 이중특이성 1가 Fc 디아바디에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 도메인 2는 E-코일 (SEQ ID NO:3)을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드 사슬의 도메인 2는 K-코일 (SEQ ID NO:4)을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이성 1가 디아바디 또는 이중특이성 1가 Fc 디아바디.
  10. 제 1항 또는 제 2항의 이중특이성 1가 디아바디 또는 제 3항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 이중특이성 1가 Fc 디아바디에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 도메인 2는 K-코일 (SEQ ID NO:4)을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드 사슬의 도메인 2는 E-코일 (SEQ ID NO:3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이성 1가 디아바디 또는 이중특이성 1가 Fc 디아바디.
  11. CD3의 에피토프 및 gpA33의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이성 1가 디아바디로서, 상기 이중특이성 1가 디아바디는:
    (1) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 가지는 제 1 폴리펩티드 사슬 및 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 가지는 제 2 폴리펩티드 사슬; 또는
    (2) SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 가지는 제 1 폴리펩티드 사슬 및 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 가지는 제 2 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
    이때 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 이황화 결합에 의해 서로에 공유 결합되어 있는, 이중특이성 1가 디아바디.
  12. CD3의 에피토프 및 gpA33의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고 IgG Fc 도메인을 가지는 이중특이성 1가 Fc 디아바디로서, 상기 이중특이성 1가 Fc 디아바디는:
    (1) SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 가지는 제 1 폴리펩티드 사슬, SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 가지는 제 2 폴리펩티드 사슬 및 SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 가지는 제 3 폴리펩티드 사슬; 또는
    (2) SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 가지는 제 1 폴리펩티드 사슬, SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 가지는 제 2 폴리펩티드 사슬 및 SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 가지는 제 3 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
    이때 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 제 1 이황화 결합에 의해 서로에 공유 결합되어 있으며 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 제 2 이황화 결합에 의해 서로에 공유 결합되어 있는, 이중특이성 1가 Fc 디아바디.
  13. 제 1항 또는 제 2항 또는 제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 이중특이성 1가 디아바디 또는 제 3항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 이중특이성 1가 Fc 디아바디; 및 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  14. gpA33의 발현을 특징으로 하는 암의 치료에 사용되는 제 13항의 약학 조성물의 용도.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 암은 결장직장암, 결장암, 위암 또는 췌장암인 것을 특징으로 하는 용도.
  16. 제 1항 또는 제 2항 또는 제 9항 내지 제 12항의 이중특이성 1가 디아바디들 중 어느 하나의 폴리펩티드 사슬 또는 제 3항 내지 제 10항의 이중특이성 1가 Fc 디아바디들 중 어느 하나의 폴리펩티드 사슬을 발현하는 세포.
  17. 제 16항의 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 항체 또는 그것의 폴리펩티드 부분 또는 단편을 발현하는 세포로서, 상기 항체는 gpA33에 결합하고, 항체 또는 그것의 폴리펩티드 부분 또는 단편은:
    (1) 항-인간 gpA33 항체의 경쇄의 CDR1 (SEQ ID NO:14), CDR2 (SEQ ID NO:15) 및 CDR3 (SEQ ID NO:16);
    (2) 항-인간 gpA33 항체의 중쇄의 CDR1 (SEQ ID NO:18), CDR2 (SEQ ID NO:19) 및 CDR3 (SEQ ID NO:20); 또는
    (3) (1) 및 (2) 둘 다를 포함하는, 항체 또는 그것의 폴리펩티드 부분 또는 단편을 발현하는 세포.
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