TWI675845B - 能夠結合ｇｐＡ３３和ＣＤ３的雙特異性單價雙抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及雙特異性單價雙抗體，其包括兩條多肽鏈並且其至少具有對CD3的抗原決定部位特異的一個結合位點和對gpA33的抗原決定部位特異的一個結合位點(即，“gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體”)。本發明也涉及雙特異性單價雙抗體，其包括免疫球蛋白Fc結構域(“雙特異性單價Fc雙抗體”)和由三條多肽鏈組成並且至少具有對gpA33的抗原決定部位特異的一個結合位點和對CD3抗原決定部位特異的一個結合位點(即，“gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體”)。於此，雙特異性單價雙抗體和雙特異性單價Fc雙抗體能夠同時結合gpA33和CD3。本發明涉及包含這類雙特異性單價雙抗體或這類雙特異性單價Fc雙抗體的藥學組合物。本發明另外涉及使用這類雙抗體治療癌症和其他疾病和病況的方法。

Description

能夠結合gpA33和CD3的雙特異性單價雙抗體及其用途
本發明涉及包括兩條多肽鏈並且具有對gpA33的抗原決定部位特異的一個結合位點和對CD3抗原決定部位特異的一個結合位點的雙特異性單價雙抗體(即，“gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體”)。本發明也涉及包括免疫球蛋白Fc結構域(“雙特異性單價Fc雙抗體”)並且由三條多肽鏈組成以及具有對gpA33的抗原決定部位特異的一個結合位點和對CD3抗原決定部位特異的一個結合位點的雙特異性單價雙抗體(即，“gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體”)。根據本發明的雙特異性單價雙抗體和雙特異性單價Fc雙抗體具有同時結合gpA33和CD3的能力。本發明涉及包含這種雙特異性單價雙抗體或這種雙特異性單價Fc雙抗體的藥學組合物。本發明另外涉及使用這種雙抗體治療癌症和其他疾病和病況(condition)的方法。
I. gpA33
結直腸癌是西方世界最常見的惡性腫瘤之一並且是癌症死亡的主要原因(Silverberg，E.等(1989)“癌症統計(Cancer Statistics)，1989,”CA Cancer J Clin.39(1)：3-20)。結腸癌一種潛在有用的靶標是43kD跨膜糖蛋 白A33(gpA33)((Heath，J.K，等(1997)“人A33抗原是跨膜糖蛋白和免疫球蛋白超家族的新成員(The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily),”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)94(2)：469-474；Ritter，G.等(1997)“人A33抗原翻譯後修飾的表徵，人胃腸上皮細胞新的棕櫚醯化的表面糖蛋白(Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen，A Novel Palmitoylatedl Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium)”Biochem.Biophys.Res.Commun.236(3)：682-686)。通過飼養抗人胰腺癌衍生細胞系ASPC1的單克隆鼠抗體首次發現了gpA33。發現一種抗體(MAb A33)與43kDa的表面細胞蛋白質反應，所以稱其為“gpA33”(Wong，N.A.等(2006)“EpCAM和gpA33是巴雷特化生的標記物(EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia)”J.Clin.Pathol.59(3)：260-263)。
gpA33是連接粘附分子家族的跨膜蛋白質；Abud，H.E.等(2000)“在發育期間在兩個不同的位點表現鼠A33抗原，胚泡和腸道上皮細胞的ICM(The Murine A33 Antigen Is Expressed At Two Distinct Sites During Development，The ICM Of The Blastocyst And The Intestinal Epithelium),”Mech.Dev.98(1-2)：111-114；Barendswaard，E.C.等(1998)“將單克隆抗體A33快速和特異性靶向裸鼠中的結腸癌異種移植物(Rapid And Specific Targeting Of Monoclonal Antibody A33 To A Colon Cancer Xenograft In Nude Mice)”Int.J.Oncol.12(1)：45-53；Panjideh，H.等(2008)“用於結腸癌的重組體抗體-酶蛋白質的[131I]A33scFv：：CDy的生物分佈和效力(Biodistribution And Efficacy Of[131I]A33scFv：：CDy，A Recombinant Antibody-Enzyme Protein For Colon Cancer),”Int.J.Oncol.32(4)：925-930)。儘管還沒瞭解A33抗原的功能重要性，但是已經顯示介導結腸炎動物模型中結腸粘膜修復並且在>95%的所有結直腸癌中均勻表現。在整個疾病階段和組織學分化程度中A33表現是均勻的，並且抗原不可察覺地分泌或散落在血流中(Infante，J.R.等(2013)“患晚期結直腸癌的患者中抗A33全人單克隆抗體，KRN330的安全性、藥物動力學和藥代學(Safety，Pharmacokinetics And Pharmacodynamics Of The Anti-A33 Fully-Human Monoclonal Antibody，KRN330，In Patients With Advanced Colorectal Cancer),”Eur.J.Cancer.49(6)：1169-1175；Panjideh，H.等(2008)“用於結腸癌的重組體抗體-酶蛋白質的[131I]A33scFv：：CDy的生物分佈和效力(Biodistribution And Efficacy Of[131I]A33scFv：：CDy，A Recombinant Antibody-Enzyme Protein For Colon Cancer),”Int.J.Oncol.32(4)：925-930)。相反地，僅僅已經鑒定了少數非胃腸A33抗原表現的例子(Johnstone，C.N.等(2000)“腸道上皮細胞基底外側表面的確定的標記物小鼠A33抗原的表徵(Characterization Of Mouse A33 Antigen，A Definitive Marker For Basolateral Surfaces Of Intestinal Epithelial Cells),”Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.279(3)：G500-G510)。
鑒於A33抗原高度限制的表現，研究人員已經研究了用抗體治療A33相關癌症的可能性(Infante，J.R.等(2013)“患晚期結直腸癌的患者中抗A33全人單克隆抗體，KRN330的安全性、藥物動力學和藥代學(Safety，Pharmacokinetics And Pharmacodynamics Of The Anti-A33 Fully-Human Monoclonal Antibody，KRN330，In Patients With Advanced Colorectal Cancer),”Eur.J.Cancer.49(6)：1169-1175；Ackerman，M.E.等(2008)“A33抗 原顯示持久的表面表現(A33 Antigen Displays Persistent Surface Expression)”Cancer Immunol.Immunother.57(7)：1017-1027；Barendswaard，E.C.等(2001)“(125)I-和(131)I-標記的單克隆抗體A33在人結腸癌異種移植物中相對的治療性效力(Relative Therapeutic Efficacy Of(125)I- And (131)I-Labeled Monoclonal Antibody A33 In A Human Colon Cancer Xenograft)”J.Nucl.Med.42(8)：1251-1256；Carrasquillo，J.A.等(2011)“結直腸癌的(124)I-huA33抗體PET((124)I-huA33 Antibody PET Of Colorectal Cance)”J.Nucl.Med.52(8)：1173-1180；Chong，G..等(2005)“131I-HuA33在患晚期結直腸癌的患者中的I期試驗(Phase I Trial Of 131I-HuA33 In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma),”Clin.Cancer Res.11(13)：4818-4826；Deckert，P.M.等(2000)“靶向結腸癌異種移植物的聚乙二醇-修飾的人源化A33抗體的藥物動力學和微分布(Pharmacokinetics And Microdistribution Of Polyethylene Glycol-Modified Humanized A33 Antibody Targeting Colon Cancer Xenografts)”Int.J.Cancer.87(3)：382-390；Johnston，A.P.等(2012)“靶向癌症細胞：控制抗體-功能化膠囊的結合和內在化(Targeting Cancer Cells：Controlling The Binding And Internalization Of Antibody-Functionalized Capsules)”ACS Nano.6(8)：6667-6674；Koppe，M.J.等(2005)“放射免疫療法和結直腸癌(Radioimmunotherapy And Colorectal Cancer),”Br.J.Surg.Mar；92(3)：264-276；Sakamoto，J.等(2006)“人源化單克隆抗體HuA33在患胃癌患者中的I期放射免疫定位試驗(A Phase I Radioimmunolocalization Trial Of Humanized Monoclonal Antibody HuA33 In Patients With Gastric Carcinoma),”Cancer Sci.97(11)：1248-1254；Scott，A.M.等(2005)“人源化單 克隆抗體A33在患結直腸癌患者中的I期試驗：生物分佈、藥物動力學和定量的腫瘤吸收(A Phase I Trial Of Humanized Monoclonal Antibody A33 In Patients With Colorectal Carcinoma：Biodistribution，Pharmacokinetics，And Quantitative Tumor Uptake)”Clin.Cancer Res.11(13)：4810-4817；Tschmelitsch，J.等(1997)“放射免疫療法(131I-標記的單克隆抗體A33)與化療(氟尿嘧啶)組合的增強的抗腫瘤活性(Enhanced Antitumor Activity Of Combination Radioimmunotherapy(131I-Labeled Monoclonal Antibody A33)With Chemotherapy(Fluorouracil))”Cancer Res.57(11)：2181-2186)。而且，也已經評估了這種抗體的片段的潛在的治療性作用(Coelho，V.等(2007)“結腸癌中抗體-定向的酶前藥療法的重組體融合蛋白A33scFv：：CDy的設計、構建、和體外分析(Design，Construction，And In Vitro Analysis Of A33scFv：：CDy，ARecombinant Fusion Protein For Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy In Colon Cancer),”Int.J.Oncol.31(4)：951-957)。
II. CD3
CD3是由四條不同鏈組成的T細胞共受體(Wucherpfennig，K.W。等(2010)“T-細胞受體的結構生物學：受體裝配、配體鑒定和信號傳導啟動的觀察(Structural Biology Of The T-Cell Receptor：Insights Into Receptor Assembly，Ligand Recognition，And Initiation Of Signaling),”Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2(4)：a005140；1-14頁)；Chetty，R.等(1994)“CD3：結構、功能和作用免疫染色臨床實踐(CD3：Structure，Function And The Role Of Immunostaining In Clinical Practice)”J.Pathol.173：303-307)。
哺乳動物中，CD3複合物包含CD3γ鏈、CD3δ鏈和兩條CD3ε 鏈。這些鏈結合稱為T細胞受體(TCR)的分子，以便在T淋巴細胞中產生活化信號。在沒有CD3的情況下，TCR不能適當裝配並且降解(Thomas，S.等(2010)來自治療性T-細胞受體基因轉移的分子免疫學教示(Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer)”，Immunology 129(2)：170-177)。發現CD3結合所有成熟T細胞的膜，並且實際上不結合其他細胞類型的膜(見，Janeway，C.A.等(2005)“免疫生物學：健康和疾病中的免疫系統(Immunobiology：The Immune System In Health And Disease)”第六版Garland Science Publishing，NY，214-216頁；Sun，Z.J.等(2001)“CD3ε：γ異源二聚物胞外域片段的溶液結構揭示的有助於T細胞受體信號傳導和裝配的機制(Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of CD3ε：γHeterodimer)”Cell 105(7)：913-923；Kuhns，M.S.等(2006)“TCR/CD3複合物形式和功能的解構(Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex)”Immunity，2006年2月；24(2)：133-139)。
III.雙特異性雙抗體
完整的未修飾的抗體(例如，IgG)結合抗原的抗原決定部位的能力取決於免疫球蛋白輕鏈和重鏈上存在的可變結構域(即，分別為VL和VH結構域)。雙抗體的設計基於單鏈Fv構造(scFv)(見，例如，Holliger等(1993)‘‘‘雙抗體’：小的二價和雙特異性抗體片段(Diabodies’：Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments)”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90：6444-6448；美國專利公開號2004/0058400(Hollinger等)；US 2004/0220388(Mertens等)；Alt等(1999)FEBS Lett.454(1-2)：90-94；Lu，D. 等(2005)“針對表皮生長因數受體和胰島素樣生長因數受體的全人重組體IgG樣雙特異性抗體用於增強的抗腫瘤活性(A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity),”J.Biol.Chem.280(20)：19665-19672；WO 02/02781(Mertens等)；Olafsen，T.等(2004)“共價二硫連接的抗CEA雙抗體允許位元點特異性結合和放射性標記用於腫瘤靶向應用(Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications),”Protein Eng.Des Sel。17(1)：21-27；Wu，A.等(2001)“嵌合抗CD20單鏈Fv-Fv融合蛋白的多聚化通過可變結構域交換介導(Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange),”Protein Engineering 14(2)：1025-1033；Asano等(2004)“用於癌症免疫療法的雙抗體和其通過人Fc區域融合的功能增強(A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region)”摘要3P-683，J.Biochem.76(8)：992；Takemura，S.等(2000)“雙抗體(小重組體雙特異性抗體)使用重折疊系統的構建(Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System),”Protein Eng.13(8)：583-588；Baeuerle，P.A.等(2009)“用於癌症療法的雙特異性T-細胞結合抗體(Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy),”Cancer Res.69(12)：4941-4944)。
抗體輕鏈和抗體重鏈的相互作用，尤其是其VL和VH結構域 的相互作用形成抗體的一個抗原決定部位結合位點。相反，scFv構建體包括單個多肽鏈中包含的抗體的VL和VH結構域，其中結構域由足夠長度的靈活連接體分開，以允許兩個結構域自裝配成功能性抗原決定部位結合位點。在VL和VH結構域的自裝配由於不足夠長(小於約12個氨基酸殘基)的連接體而變得不可能的情況下，兩個scFv構建體彼此相互作用以形成二價分子，其中一條鏈的VL結合另一條鏈的VH(在Marvin等(2005)“IgG樣雙特異性抗體的重組方法(Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies),”Acta Pharmacol.Sin.26：649-658中被論述)。
天然抗體僅僅能夠結合一個抗原決定部位種類(即，單特異性)，雖然它們可結合此種類的多個拷貝(即，展示二價或多價)。現有技術已經指出了產生這樣的雙抗體的能力，所述雙抗體與這類天然抗體的不同之處在於能夠結合兩個或更多個不同的抗原決定部位種類(即，展示雙特異性或多特異性，以及二價或多價)(見，例如，Holliger等(1993)‘‘‘雙抗體’：小的二價和雙特異性抗體片段(‘Diabodies’：Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments),”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90：6444-6448；US 2004/0058400(Hollinger等)；US 2004/0220388(Mertens等)；Alt等(1999)FEBS Lett.454(1-2)：90-94；Lu，D.等(2005)“針對表皮生長因數受體和胰島素樣生長因數受體的全人重組體IgG樣雙特異性抗體用於增強的抗腫瘤活性(A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity),”J.Biol.Chem.280(20)：19665-19672；WO 02/02781(Mertens等)；Mertens，N.等，“新重組雙特 異性和三特異性抗體衍生物(New Recombinant Bi- and Trispecific Antibody Derivatives),”In：Novel Frontiers In The Production Of Compounds For Biomedical Use，A。VanBroekhoven等(Eds.)，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，Netherlands(2001)，頁195-208；Wu，A.等(2001)“嵌合抗CD20單鏈Fv-Fv融合蛋白的多聚化通過可變結構域交換介導(Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange),”Protein Engineering 14(2)：1025-1033；Asano等(2004)“用於癌症免疫療法的雙抗體和其通過人Fc區域融合的功能增強(ADiabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region)”摘要3P-683，J.Biochem.76(8)：992；Takemura，S.等(2000)“雙抗體(小重組體雙特異性抗體)使用重折疊系統的構建(Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System),”Protein Eng.13(8)：583-588；Baeuerle，P.A.等(2009)“用於癌症療法的雙特異性T-細胞結合抗體(Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy),”Cancer Res.69(12)：4941-4944)。
非單特異性雙抗體的供應提供明顯的優勢：共連接和共定位表現不同抗原決定部位的細胞的能力。雙價雙抗體因此具有廣泛的應用，包括治療和免疫診斷。雙價使得在各種應用中設計和改造雙抗體的具有很大的靈活性，提供對多聚抗原增強的親和力、不同抗原的交聯和依賴於存在兩個靶抗原的引導靶向特異性細胞類型。由於它們的價增加、解離速率低和從迴圈中快速清除(對於~50kDa或低於~50kDa的小尺寸的雙抗體)，本領域已知的雙抗體分子在腫瘤成像領域中也顯示特定的應用(Fitzgerald等 (1997)“通過畢赤酵母菌表現的二硫化穩定的雙抗體改善的腫瘤靶向(Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris)”Protein Eng.10：1221)。尤其重要的是共連接不同的細胞，例如，使細胞毒性T細胞與腫瘤細胞交聯(Staerz等(1985)“雜交抗體可靶向T細胞攻擊的位點(Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells),”Nature 314：628-631，和Holliger等(1996)“雙特異性雙抗體介導的細胞毒素性T-細胞特異性殺死淋巴瘤細胞(Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody),”Protein Eng.9：299-305)。
雙抗體抗原決定部位結合結構域也可導向任何免疫效應細胞的表面決定簇，所述效應細胞比如CD3、CD16、CD32或CD64，所述結合結構域在T淋巴細胞、天然殺傷(NK)細胞或其他單核細胞上表現。在許多研究中，也發現結合效應細胞決定簇，例如，Fcγ受體(FcγR)的雙抗體啟動效應細胞(Holliger等(1996)“雙特異性雙抗體介導的細胞毒素T-細胞特異性殺死淋巴瘤細胞(Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody),”Protein Eng.9：299-305；Holliger等(1999)“抗CD3 x抗CEA雙特異性雙抗體和B7 x抗CEA雙特異性融合蛋白誘導的結腸癌中胚胎抗原(CEA)特異性T-細胞活化(Carcinoembryonic Antigen(CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins)”Cancer Res.59：2909-2916；WO 2006/113665；WO 2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO 2012/162068)。通常，效應細胞 活化通過結合抗原的抗體經Fc-FcγR相互作用與效應細胞的結合而觸發；因此，就此而言，根據本發明的雙抗體分子可展示Ig樣功能性，無論它們是否包括Fc結構域(例如，如本領域已知的或本文示例的任何效應器功能試驗(例如，ADCC試驗)所驗證的)。通過交聯腫瘤和效應細胞，雙抗體不僅僅使效應細胞接近腫瘤細胞，而且導致有效的腫瘤殺傷(見例如，Cao等(2003)“療法中的雙特異性抗體綴合物(Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics),”Adv.Drug.Deliv.Rev.55：171-197)。
但是，上述優勢是以高成本為代價的。形成此類非單特異性雙抗體需要成功裝配兩個或更多個獨特且不同的多肽(即，這種形成需要通過不同多肽鏈種類的異源二聚化形成雙抗體)。此事實與通過相同多肽鏈的同源二聚化形成的單特異性雙抗體形成對比。因為必須提供至少兩條不同的多肽(即，兩個多肽種類)以便形成非單特異性雙抗體，和因為這種多肽的同源二聚化導致失活的分子(Takemura，S.等(2000)“雙抗體(小重組體雙特異性抗體)使用重折疊系統的構建(Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System),”Protein Eng.13(8)：583-588)，所以產生這種多肽必須以防止相同種類的多肽之間共價鍵合的方式完成(Takemura，S.等(2000)“雙抗體(小重組體雙特異性抗體)使用重折疊系統的構建(Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System),”Protein Eng.13(8)：583-588)。所以，現有技術已經教導了這種多肽的非共價結合(見，例如，Olafsen等(2004)“共價二硫連接的抗CEA雙抗體允許位元點特異性結合和放射性標記用於腫瘤靶向應用(Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications),”Prot.Engr.Des.Sel.17：21-27；Asano等(2004)“用於癌症免疫療法的雙抗體和其通過人Fc區域融合的功能增強(A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region)”摘要3P-683，J.Biochem.76(8)：992；Takemura，S.等(2000)“雙抗體(小重組體雙特異性抗體)使用重折疊系統的構建(Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System),”Protein Eng.13(8)：583-588；Lu，D.等(2005)“針對表皮生長因數受體和胰島素樣生長因數受體的全人重組體IgG樣雙特異性抗體用於增強的抗腫瘤活性(A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity),”J.Biol.Chem.280(20)：19665-19672)。
但是，現有技術已經認識到由非共價結合的多肽組成的雙特異性單價雙抗體不穩定並且容易解離成非功能單體(見，例如，Lu，D.等(2005)“針對表皮生長因數受體和胰島素樣生長因數受體的全人重組體IgG樣雙特異性抗體用於增強的抗腫瘤活性(A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity),”J.Biol.Chem.280(20)：19665-19672)。
在面臨此挑戰的時候，現有技術已經成功開發了穩定的共價結合的異源二聚非單特異性雙抗體(見，例如，WO 2006/113665、WO/2008/157379、WO 2010/080538、WO 2012/018687、WO/2012/162068、 Johnson，S.等(2010)“用新型Fv基雙-親和性重定向蛋白質的效應細胞募集導產生有力的腫瘤細胞溶解和體內B-細胞損耗(Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion),”J.Molec.Biol.399(3)：436-449；Veri,M.C.等(2010)“用新的雙特異性抗體支架經募集Fcγ受體IIb(CD32B)抑制功能治療性控制B細胞活化(Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb(CD32B)Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold),”Arthritis Rheum.62(7)：1933-1943；Moore，P.A.等(2011)“雙親和性重定向分子的應用以實現最佳修飾的B-細胞淋巴瘤的T-細胞殺傷(Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma)”Blood 117(17)：4542-4551；美國專利公開號2012/0294796和2013/0149236)。此類方法涉及將一個或多個半胱氨酸殘基改造到每個採用的多肽種類中。例如，已經顯示將半胱氨酸殘基添加至這種構建體的C-末端允許在多肽鏈之間形成二硫鍵合，使所得異源二聚物穩定，而不干擾二價分子的結合特徵。
雙抗體和其他免疫球蛋白被描述為意圖對gpA33和CD3的每一個或二者都有特異性(見，例如，美國專利公開號2012/0014957、2012/0034160、2012/0087858、2012/0189541、2012/0195900、2012/0201746、2012/0237442、2012/0263722、2012/0258108和2012/0276608)。
儘管有樣的成功，但是穩定的功能性異源二聚非單特異性雙抗體的產生可以通過仔細考慮和在多肽鏈中佈置採用的結構域而得到進一步改善。因此，本發明涉及提供特異性多肽，其尤其被設計來經共價鍵合 形成異源二聚雙抗體和異源二聚Fc雙抗體，所述雙抗體具有同時結合gpA33和CD3的能力。
本發明涉及“gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體”。在具體的實施方式中，根據本發明的雙抗體進一步具有免疫球蛋白Fc區域的結構域(即，“Fc結構域”)(“gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體”)或白蛋白結合結構域(“ABD”)(“具有ABD的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體”)，以延長體內半衰期。根據本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體和根據本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體包括兩條不同的多肽鏈，此二多肽鏈彼此以異源二聚方式結合，以形成對gpA33的抗原決定部位特異的一個結合位點和對CD3抗原決定部位特異的一個結合位點。因此，根據本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體和gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體是單價的，在於它們僅僅能夠結合一個拷貝的gpA33的抗原決定部位和僅僅能夠結合一個拷貝的CD3的抗原決定部位，但是是雙特異性的，在於單個雙抗體具有同時結合gpA33的抗原決定部位和CD3的抗原決定部位的能力。
根據本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體由彼此共價結合(例如：通過位於每條多肽鏈內的半胱氨酸殘基的二硫鍵合)的兩條多肽鏈(“第一”多肽鏈和“第二”多肽鏈)組成。根據本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體由三條多肽鏈(“第一”、“第二”和“第三”多肽鏈)組成，其中第一和第二多肽鏈彼此共價結合以及第一和第三多肽鏈彼此共價結合。根據本發明的雙特異性單價雙抗體和雙特異性單價Fc雙抗體具有同時結合gpA33和CD3的能力。本發明涉及這類gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體和 雙特異性單價gpA33 x CD3 Fc雙抗體，並且涉及包含這類雙特異性單價雙抗體或這類雙特異性單價Fc雙抗體的藥學組合物。本發明另外涉及使用這類雙抗體治療癌症和其他疾病和病況的方法。
具體地，本發明提供雙特異性單價雙抗體，其中雙特異性單價雙抗體具有特異性結合gpA33的抗原決定部位和CD3的抗原決定部位的能力，其中雙特異性單價雙抗體包括第一多肽鏈和第二多肽鏈，並且第一和第二多肽鏈彼此共價結合，以及其中：A.第一多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括：i.結構域1，其包括亞結構域1A和亞結構域1B，所述亞結構域1A包括具有結合CD3的能力之單克隆抗體的VL結構域(VLCD3)(SEQ ID NO：5)；所述亞結構域1B包括具有結合gpA33的能力之單克隆抗體的VH結構域(VHgpA33)(SEQ ID NO：27)；其中亞結構域1A和亞結構域1B彼此通過肽連接體(SEQ ID NO：1)分開；ii.結構域2，其中結構域2是K-螺旋(coil)結構域(SEQ ID NO：4)或E-螺旋結構域(SEQ ID NO：3)，其中結構域2通過肽連接體(SEQ ID NO：2)與結構域1分開；B.第二多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括：i.結構域1，其包括亞結構域1A和亞結構域1B，所述亞結構域1A包括具有結合gpA33的能力之單克隆抗體的VL結構域(VLgpA33)(SEQ ID NO：26)，所述亞結構域1B包括具有結合CD3的能力之單克隆抗體的VH結構域(VHCD3)(SEQ ID NO：25)，其中亞結構域1A和亞結構域1B彼此通過肽連接體(SEQ ID NO：1)分開； ii.結構域2，其中結構域2是E-螺旋結構域(SEQ ID NO：3)或K-螺旋結構域(SEQ ID NO：4)，其中結構域2通過肽連接體(SEQ ID NO：2)與結構域1分開；和其中第一多肽鏈的結構域2和第二多肽鏈的結構域2不都是E-螺旋結構域或不都是K-螺旋結構域；和其中：(a)第一多肽鏈的VL結構域和第二多肽鏈的VH結構域形成具有特異性結合CD3的抗原決定部位的能力之抗原結合結構域；和(b)第一多肽鏈的VH結構域和第二多肽鏈的VL結構域形成具有特異性結合gpA33的抗原決定部位的能力之抗原結合結構域。
本發明另外考慮上述雙特異性單價雙抗體的實施方式，其中第一多肽鏈或第二多肽鏈包括白蛋白結合結構域(SEQ ID NO：34)，其經連接體3(SEQ ID NO：32)連接至結構域2的C-末端或連接至結構域1A的N-末端。
本發明另外考慮雙特異性單價Fc雙抗體，其中雙特異性單價Fc雙抗體具有特異性結合gpA33的抗原決定部位和CD3的抗原決定部位的能力，並且具有IgG Fc結構域，其中雙特異性單價Fc雙抗體包括第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈，其中第一和第二多肽鏈彼此共價結合以及第一和第三多肽鏈彼此共價結合，和其中：A.第一多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括：i.結構域1，其包括亞結構域1A和亞結構域1B，所述亞結構域1A包括具有結合gpA33的能力之單克隆抗體的VL結構域(VLgpA33)(SEQ ID NO：26)，所述亞結構域1B包括具有結合CD3的能力之單克隆抗體的VH結構域(VHCD3)(SEQ ID NO：25)，其中亞結構域1A和亞結構域1B彼此通過肽連接 體(SEQ ID NO：1)分開；ii.結構域2，其中結構域2是E-螺旋結構域(SEQ ID NO：3)或K-螺旋結構域(SEQ ID NO：4)，其中結構域2通過肽連接體(SEQ ID NO：2)與結構域1分開；和iii.結構域3，其包括亞結構域3A和亞結構域3B，所述亞結構域3A包括含半胱氨酸的肽(肽1)(SEQ ID NO：39)，所述亞結構域3B包括具有IgG免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域的IgG Fc結構域的多肽部分；其中結構域3和2彼此由間隔肽(連接體5)(GGG)分開；B.第二多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括：i.結構域1，其包括亞結構域1A和亞結構域1B，亞結構域1A包括具有結合CD3的能力之單克隆抗體的VL結構域(VLCD3)(SEQ ID NO：5)，亞結構域1B包括具有結合gpA33的能力之單克隆抗體的VH結構域(VHgpA33)(SEQ ID NO：27)；其中亞結構域1A和亞結構域1B彼此通過肽連接體(SEQ ID NO：1)分開；ii.結構域2，其中結構域2是K-螺旋結構域(SEQ ID NO：4)或E-螺旋結構域(SEQ ID NO：3)，其中結構域2通過肽連接體(SEQ ID NO：2)與結構域1分開；和其中第一多肽鏈的結構域2和第二多肽鏈的結構域2不都是E-螺旋結構域或不都是K-螺旋結構域；和C.第三多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括結構域3，其包括：(1)亞結構域3A，其包括含半胱氨酸的肽(肽1)(SEQ ID NO：39)；和(2)亞結構域3B，其包括具有IgG免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域的IgG Fc結構域的多肽部分； 和其中：(a)第一和第三多肽鏈的IgG Fc結構域的多肽部分形成IgG Fc結構域；(b)第一多肽鏈的VL結構域和第二多肽鏈的VH結構域形成具有特異性結合CD3的抗原決定部位的能力之抗原結合結構域；和(c)第一多肽鏈的VH結構域和第二多肽鏈的VL結構域形成具有特異性結合gpA33的抗原決定部位的能力之抗原結合結構域。
本發明另外考慮雙特異性單價Fc雙抗體，其中雙特異性單價Fc雙抗體具有特異性結合gpA33的抗原決定部位和CD3的抗原決定部位的能力，並且具有IgG Fc結構域，其中雙特異性單價Fc雙抗體包括第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈，其中第一和第二多肽鏈彼此共價結合以及第一和第三多肽鏈彼此共價結合，和其中：A.第一多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括：i.結構域3，其包括亞結構域3A和亞結構域3B，所述亞結構域3A包括含半胱氨酸的肽(肽1)(SEQ ID NO：39)，所述亞結構域3B包括具有IgG免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域的IgG Fc結構域的多肽部分；ii.結構域1，其包括亞結構域1A和亞結構域1B，所述亞結構域1A包括具有結合gpA33的能力之單克隆抗體的VL結構域(VLgpA33)(SEQ ID NO：26)，所述亞結構域(1B)包括具有結合CD3的能力之單克隆抗體的VH結構域(VHCD3)(SEQ ID NO：25)，其中亞結構域1A和亞結構域1B彼此通過肽連接體(SEQ ID NO：1)分開；其中結構域1和3彼此通過間隔肽(連接體4)(SEQ ID NO：38)分開； iii.結構域2，其中結構域2是E-螺旋結構域(SEQ ID NO：3)或K-螺旋結構域(SEQ ID NO：4)，其中結構域2通過肽連接體(SEQ ID NO：2)與結構域1分開；和B.第二多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括：i.結構域1，其包括亞結構域1A和亞結構域1B，所述亞結構域1A包括具有結合CD3的能力之單克隆抗體的VL結構域(VLCD3)(SEQ ID NO：5)；所述亞結構域1B包括具有結合gpA33的能力之單克隆抗體的VH結構域(VHgpA33)(SEQ ID NO：27)；其中亞結構域1A和亞結構域1B彼此通過肽連接體(SEQ ID NO：1)分開；ii.結構域2，其中結構域2是K-螺旋結構域(SEQ ID NO：4)或E-螺旋結構域(SEQ ID NO：3)，其中結構域2通過肽連接體(SEQ ID NO：2)與結構域1分開；和其中第一多肽鏈的結構域2和第二多肽鏈的結構域2不都是E-螺旋結構域或不都是K-螺旋結構域；和C.第三多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括結構域3，其包括：(1)亞結構域3A，其包括含半胱氨酸的肽(肽1)(SEQ ID NO：39)；和(2)亞結構域3B，其包括具有IgG免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域的IgG Fc結構域的多肽部分，此多肽部分；和其中：(a)第一和第三多肽鏈的IgG Fc結構域的多肽部分形成IgG Fc結構域；(b)第一多肽鏈的VL結構域和第二多肽鏈的VH結構域形成具有特異性結合CD3的抗原決定部位的能力之抗原結合結構域；和 (c)第一多肽鏈的VH結構域和第二多肽鏈的VL結構域形成具有特異性結合gpA33的抗原決定部位的能力之抗原結合結構域。
本發明進一步考慮任何上述雙特異性單價Fc雙抗體的實施方式，其中第一多肽鏈的亞結構域3B包括與第三多肽鏈的亞結構域3B的序列不同的序列。
本發明進一步考慮這種上述雙特異性單價Fc雙抗體的實施方式，其中第一多肽鏈的亞結構域3B的氨基酸序列為SEQ ID NO：40，和第三多肽鏈的亞結構域3B的氨基酸序列為SEQ ID NO：41。
本發明進一步考慮這種上述雙特異性單價Fc雙抗體的實施方式，其中第一多肽鏈的亞結構域3B的氨基酸序列為SEQ ID NO：41，和第三多肽鏈的亞結構域3B的氨基酸序列為SEQ ID NO：40。
本發明進一步考慮這種上述雙特異性單價Fc雙抗體的實施方式，其中第一多肽鏈的結構域3和/或第三多肽鏈的結構域3包括變體CH2-CH3序列，其顯示與Fcγ受體改變的結合。
本發明進一步考慮任何上述雙特異性單價雙抗體或任何上述雙特異性單價Fc雙抗體的實施方式，其中第一多肽鏈的結構域2包括E-螺旋(SEQ ID NO：3)，和第二多肽鏈的結構域2包括K-螺旋(SEQ ID NO：4)。
本發明進一步考慮任何上述雙特異性單價雙抗體或任何上述雙特異性單價Fc雙抗體的實施方式，其中第一多肽鏈的結構域2包括K-螺旋(SEQ ID NO：4)，和第二多肽鏈的結構域2包括E-螺旋(SEQ ID NO：3)。
本發明進一步考慮雙特異性單價雙抗體，其中雙特異性單價雙抗體能夠特異性結合CD3的抗原決定部位和gpA33的抗原決定部位，其中 雙特異性單價雙抗體包括：(1)第一多肽鏈，其氨基酸序列為SEQ ID NO：28，和第二多肽鏈，其氨基酸序列為SEQ ID NO：30；或(2)第一多肽鏈，其氨基酸序列為SEQ ID NO：35，和第二多肽鏈，其氨基酸序列為SEQ ID NO：30；其中第一和第二多肽鏈通過二硫鍵彼此共價結合。
本發明進一步考慮雙特異性單價Fc雙抗體，其中雙特異性單價Fc雙抗體具有特異性結合CD3的抗原決定部位和gpA33的抗原決定部位的能力，並且具有IgG Fc結構域，其中雙特異性單價Fc雙抗體包括：(1)第一多肽鏈，其氨基酸序列為SEQ ID NO：42，第二多肽鏈，其氨基酸序列為SEQ ID NO：44，和第三多肽鏈，其氨基酸序列為SEQ ID NO：46；或(2)第一多肽鏈，其氨基酸序列為SEQ ID NO：48，第二多肽鏈，其氨基酸序列為SEQ ID NO：28，和第三多肽鏈，其氨基酸序列為SEQ ID NO：46；其中第一和第二多肽鏈通過第一二硫鍵彼此共價結合以及第一和第三多肽鏈通過第二二硫鍵彼此共價結合。
本發明進一步考慮包括任何上述雙特異性單價雙抗體或任何上述雙特異性單價Fc雙抗體和生理學上可接受的載體的藥學組合物。
本發明進一步考慮上述藥學組合物在治療特徵在於表現gpA33的癌症中的用途，尤其其中癌症是結直腸癌、結腸癌、胃癌或胰腺癌的這類用途。
本發明進一步考慮表現任何上述雙特異性單價雙抗體或任 何上述雙特異性單價Fc雙抗體的多肽鏈的細胞，以及編碼這種表現的多肽的多核苷酸。
本發明進一步考慮表現抗體或其多肽部分或其片段的細胞，其中抗體結合gpA33，和其中抗體或其多肽部分或其片段包括：(1)抗人gpA33抗體輕鏈的CDR1(SEQ ID NO：14)、CDR2(SEQ ID NO：15)和CDR3(SEQ ID NO：16)；(2)抗人gpA33抗體重鏈的CDR1(SEQ ID NO：18)、CDR2(SEQ ID NO：19)和CDR3(SEQ ID NO：20)；或(3)(1)和(2)二者。
VL‧‧‧結構域
VH‧‧‧結構域
E：T‧‧‧效應器：靶
PBMC‧‧‧周邊血液單核球細胞
DART-1‧‧‧gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體
DART-2‧‧‧gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體
MFI‧‧‧單位面積螢光強度
LDH‧‧‧乳酸去氫酶
RU‧‧‧共振單位
圖1闡釋根據本發明的雙鏈gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體的第一和第二多肽鏈的結構。
圖2A和2B闡釋根據本發明的三鏈gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第一、第二和第三多肽鏈的兩種形式的結構(圖2A圖解形式1；圖2B圖解形式2)。
圖3表明根據本發明的雙抗體能夠同時結合CD3和gpA33。
圖4A-4C圖解根據本發明的雙抗體治療癌症的能力。在存在gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-1)和人PBMC(E：T=25：1)或活化的人T細胞(E：T=10：1)的情況下溫育(incubate)結直腸或胰腺癌細胞，並且測量細胞毒性，其中圖4A顯示結腸CSLC結直腸細胞的實驗結果、圖4B顯示Colo205結直腸細胞的實驗結果、以及圖4C顯示ASPC-1胰腺癌細胞的實驗結果。
圖5A-5F顯示僅僅在癌症細胞存在的情況下，在CD3雙特異性單價雙抗體(DART-1)存在的情況下所發生之CD8 T細胞的活化，其中圖5A顯示CD8 T細胞+colo205細胞的實驗結果、圖5B顯示CD8 T細胞+ASPC-1細胞的實驗結果、圖5C顯示單獨CD8 T細胞的實驗結果、圖5D顯示CD4 T細胞+colo205細胞的實驗結果、圖5E顯示CD4 T細胞+ASPC-1細胞的實驗結果、以及圖5F顯示單獨CD8 T細胞的實驗結果。
圖6A-6D表明gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-1和DART-2)針對SW948結直腸腺癌細胞(圖6A)和colo205細胞(圖6B)和Colo205-Luc細胞(圖6C)介導等同的細胞毒性，並且沒有雙抗體介導gpA33-陰性癌症細胞系HCT116的細胞毒性(圖6D)。
圖7A-7D表明gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-2)、具有白蛋白結合結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(具有ABD的DART-2“w/ABD”)和具有免疫球蛋白IgG Fc結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(具有Fc的DART-2“w/Fc”)在存在人或食蟹猴PBMC的情況下促進癌症細胞的細胞毒性的能力。
圖8表明gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-1)體內減小鼠Colo205結腸癌模型中腫瘤體積的能力。
圖9A-9D顯示在接收媒介(圖9A)或gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體之後兩天(DART-1)(圖9B)，和接收媒介(圖9C)或DART-1之後12天(圖9D)，植入(implant)Colo205細胞的NOD scid γ(NSG)小鼠的腫瘤成像數據。
圖10表明gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-1)體內減小鼠ASPC-1胰腺癌模型中腫瘤體積的能力。
圖11顯示具有免疫球蛋白IgG Fc結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-2 w/Fc，形式1)介導體內結腸癌模型中腫瘤體積急劇下降的能力。
圖12顯示具有免疫球蛋白IgG Fc結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-2 w/Fc，形式1)甚至在非常低的劑量下介導體內結腸癌模型中腫瘤體積減小的能力。
圖13顯示gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-2)和具有免疫球蛋白IgG Fc結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-2 w/Fc，形式1)雙抗體在食蟹猴中的藥代動力學。
圖14A-14B顯示DART-2 w/Fc形式1與固定的人和食蟹猴CD3結合的SPR(表面薄膜共振)分析。黑色虛線表示對在0、6.25、12.5、25、50或100nM的DART-2 w/Fc濃度下獲得的結合曲線的1：1 Langmuir模型的整體擬合。資料是三個獨立實驗的代表。
圖15A-15B顯示DART-2 w/Fc形式1與捕獲的人和食蟹猴gpA33結合的SPR分析。黑色虛線表示對以0、6.25、12.5、25、50或100nM的DART-2w/Fc形式1濃度獲得的結合曲線的1：1 Langmuir模型的整體擬合。資料是三個獨立實驗的代表。
本發明涉及包括兩條多肽鏈並且具有對gpA33的抗原決定部位特異的一個結合位點和對CD3抗原決定部位特異的一個結合位點的雙特異性單價雙抗體(即，“gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體”)。本發明也涉及包括免疫球蛋白Fc結構域(“雙特異性單價Fc雙抗體”)並且由三條多肽鏈 組成以及有對gpA33的抗原決定部位特異的一個結合位點和對CD3抗原決定部位特異的一個結合位點的雙特異性單價雙抗體(即，“gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體”)。根據本發明的雙特異性單價雙抗體和雙特異性單價Fc雙抗體具有同時結合gpA33和CD3的能力。本發明涉及包含這類雙特異性單價雙抗體或這類雙特異性單價Fc雙抗體的藥學組合物。本發明另外涉及使用這類雙抗體治療癌症和其他疾病和病況的方法。
根據本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體由彼此結合以形成對gpA33的抗原決定部位特異的一個結合位點和對CD3抗原決定部位特異的一個結合位點兩條多肽鏈組成。雙抗體的各條多肽鏈彼此共價結合，例如：通過位於每條多肽鏈內的半胱氨酸殘基的二硫鍵合。每條多肽鏈包含輕鏈可變結構域的抗原結合結構域、重鏈可變結構域的抗原結合結構域和異源二聚化結構域。間插連接體肽(連接體1)將輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與重鏈可變結構域的抗原結合結構域分開。第一多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與第二多肽鏈的重鏈可變結構域的抗原結合結構域相互作用，以便形成對第一抗原(即，gpA33或CD3)特異的第一功能性抗原結合位點。同樣地，第二多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與第一多肽鏈的重鏈可變結構域的抗原結合結構域相互作用，以便形成對第二抗原(即，gpA33或CD3，這取決於第一抗原的確定)特異的第二功能性抗原結合位點。因此，第一和第二多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域和重鏈可變結構域的抗原結合結構域的選擇是協調的，使得兩條多肽鏈總共包括能夠結合gpA33和CD3的輕鏈和重鏈可變結構域的抗原結合結構域。
根據本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體由第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈組成。第一和第二多肽鏈彼此結合，以形成對gpA33的抗原決定部位特異的一個結合位點和對CD3抗原決定部位特異的一個結合位點。第一多肽鏈和第三多肽鏈彼此結合，以形成免疫球蛋白Fc結構域。雙特異性單價Fc雙抗體的第一和第二多肽鏈彼此共價結合，例如：通過位於每條多肽鏈內的半胱氨酸殘基的二硫鍵合。第一和第三多肽鏈彼此共價結合，例如：通過位於每條多肽鏈內的半胱氨酸殘基的二硫鍵合。第一和第二多肽鏈各包含輕鏈可變結構域的抗原結合結構域、重鏈可變結構域的抗原結合結構域和異源二聚化結構域。間插連接體肽(連接體1)將輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與重鏈可變結構域的抗原結合結構域分開。第一多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與第二多肽鏈的重鏈可變結構域的抗原結合結構域相互作用，以便形成對第一抗原(即，gpA33或CD3)特異的第一功能性抗原結合位點。同樣地，第二多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與第一多肽鏈的重鏈可變結構域的抗原結合結構域相互作用，以便形成對第二抗原(即，gpA33或CD3，這取決於第一抗原的確定)特異的第二功能性抗原結合位點。因此，第一和第二多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域和重鏈可變結構域的抗原結合結構域的選擇是協調的，使得兩條多肽鏈總共包括能夠結合gpA33和CD3的輕鏈和重鏈可變結構域的抗原結合結構域。第一和第三多肽鏈各包含含序列為SEQ ID NO：39之半胱氨酸的肽(肽1)和完整免疫球蛋白Fc結構域和含半胱氨酸的肽的一些或所有的CH2結構域和/或一些或所有的CH3結構域。一些或所有的CH2結構域和/或一些或所有的CH3結構域結合，以形成根據本發 明的雙特異性單價Fc雙抗體的免疫球蛋白Fc結構域。根據本發明的雙特異性單價Fc雙抗體的第一和第三多肽鏈彼此共價結合，例如：通過位於多肽鏈的含半胱氨酸的肽中的半胱氨酸殘基的二硫鍵合。
可通過異源二聚化結構域驅動雙特異性單價雙抗體或雙特異性單價Fc雙抗體的第一和第二多肽鏈的異源二聚物的形成。這樣的結構域包括一條多肽鏈上的GVEPKSC(SEQ ID NO：54)(或VEPKSC；SEQ ID NO：55)和另一條多肽鏈上的GFNRGEC(SEQ ID NO：56)(或FNRGEC；SEQ ID NO：57)(US2007/0004909)。可選地，這樣的結構域可被改造，以包含具有相反電荷的螺旋。一條多肽鏈的異源二聚化結構域包括具有至少六個、至少七個或至少八個帶負電荷氨基酸的序列，而另一條多肽鏈的異源二聚化結構域包括具有至少六個、至少七個或至少八個帶正電荷氨基酸的序列。例如，第一或第二異源二聚化結構域可包括的序列包括八個帶正電荷的氨基酸和另一異源二聚化結構域可包括的序列包括八個帶負電荷的氨基酸。帶正電荷的氨基酸可以是賴氨酸、精氨酸、組氨酸等和/或帶負電荷的氨基酸可以是谷氨酸、天冬氨酸等。帶正電荷的氨基酸優選地是賴氨酸和/或帶負電荷的氨基酸優選地是谷氨酸。
根據本發明的雙特異性單價雙抗體和雙特異性單價Fc雙抗體被改造，從而這樣的第一和第二多肽鏈沿著它們的長度經半胱氨酸殘基彼此共價鍵合。這樣的半胱氨酸殘基可引入至間插連接體中，所述間插連接體將多肽的VL和VH結構域分開。可選地，和更優選地，第二肽(連接體2)被引入至每條多肽鏈，例如，在多肽鏈的氨基-末端或在異源二聚化結構域和輕鏈可變結構域或重鏈可變結構域的抗原結合結構域之間佈置連接體 2的位置。
如上指出，結直腸細胞表現gpA33。具有免疫特異性結合gpA33的能力之抗體能夠結合這樣的細胞。CD3在T細胞上被表現。因此，具有免疫特異性結合gpA33和CD3二者的能力之抗體能夠將T細胞靶向結直腸癌細胞和表現gpA33的其他癌症細胞(例如，結腸癌細胞、胰腺癌細胞等),並且因此能夠提供此類癌症改進的療法。
I.優選的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體
A. gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體
在本發明的一實施方式中，gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體由第一多肽鏈和第二多肽鏈組成，且此gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體的序列允許多肽鏈彼此共價結合，以形成具有同時結合gpA33和CD3的能力之共價結合的複合物。
優選的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體的第一多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括一N-末端、具有結合CD3或gpA33的能力知單克隆抗體的VL結構域(即，VLCD3或VLgpA33)、第一間插間隔肽(連接體1)、具有結合gpA33(如果這種第一多肽鏈包含VLCD3)或CD3(如果這種第一多肽鏈包含VLgpA33)的能力之單克隆抗體的VH結構域、含半胱氨酸的第二間插間隔肽(連接體2)、促進異源二聚物的(heterodimer-promoting)結構域以及一C-末端(如圖1所示)。
優選的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體的第二多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括一N-末端、具有結合gpA33或CD3的能力之單克隆抗體的VL結構域(即，VLgpA33或VLCD3，這取決於雙抗體的第一多肽鏈 的VL結構域選擇)、間插連接體肽(連接體1)、具有結合CD3(如果這種第二多肽鏈包含VLgpA33)或CD3(如果這種第二多肽鏈包含VLCD3)的能力之單克隆抗體的VH結構域、含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)、促進異源二聚物的結構域和一C-末端(如圖1所示)。
優選的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體的第一多肽鏈的VL結構域與優選的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體的第二多肽鏈的VH結構域相互作用，以便形成對第一抗原(即，CD3或gpA33)特異的第一功能抗原結合位點。同樣地，第二多肽鏈的VL結構域與第一多肽鏈的VH結構域相互作用，以便形成對第二抗原(即，gpA33或CD3，這取決於第一抗原的確定)特異的第二功能抗原結合位點。因此，第一和第二多肽鏈的VL結構域和VH結構域的選擇是協調的，使得優選的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體的兩條多肽鏈總共包括具有結合gpA33和CD3的能力之VL結構域和VH結構域(即，它們包括VLCD3/VHCD3和VLgpA33/VHgpA33)。
最優選地，選擇間插連接體肽(連接體1，其將這樣的VL結構域和VH結構域分開)的長度，以基本上或完全防止多肽鏈的VL結構域和VH結構域彼此結合。因此第一多肽鏈的VL結構域和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。同樣地，第二多肽鏈的VL結構域和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。優選的間插間隔肽(連接體1)的序列為SEQ ID NO：1：GGGSGGGG。
含半胱氨酸的第二間插間隔肽(連接體2)包含1、2、3或更多個半胱氨酸。優選的含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)的序列是SEQ ID NO：2：GGCGGG。
第一和第二多肽的促進異源二聚物的結構域彼此不同並且設計為彼此結合，以便促進第一和第二多肽鏈結合。因此，在優選的實施方式中，多肽鏈之一可被改造以包含促進異源二聚物的“E-螺旋”結構域(SEQ ID NO：3)：EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK其殘基在pH 7形成負電荷，而兩條多肽鏈的另一條可被改造以包含促進異源二聚物的“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO：4)：KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE其殘基在pH 7形成正電荷。這種帶電結構域的存在促進第一和第二多肽之間的結合，並且因此促進異源二聚化。於此，哪條鏈提供哪種螺旋不重要，只要在第一和第二多肽鏈上採用的螺旋不同以便促進這樣的鏈之間的異源二聚化即可。
1. gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體，“DART-1”
優選的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(於此稱之為“DART-1”)的第一和第二多肽鏈包括具有下述序列的多肽結構域：結合CD3的抗體的VL結構域(VLCD3)(SEQ ID NO：5)：
Figure TWI675845B_D0001
VLCD3的抗原結合結構域包括CDR1、CDR2以及、CDR3，其中CDR1的序列為SEQ ID NO：6：RSSTGAVTTSNYAN、CDR2的序列為SEQ ID NO：7：GTNKRAP和CDR3的序列為SEQ ID NO：8：ALWYSNLWV。
結合CD3的抗體的VH結構域(VHCD3)(SEQ ID NO：9)：
Figure TWI675845B_D0002
VHCD3的抗原結合結構域包括：CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1的序列為SEQ ID NO：10：TYAMN、CDR2的序列為SEQ ID NO：11：RIRSKYNNYATYYADSVKD和CDR3的序列為SEQ ID NO：12：HGNFGNSYVSWFAY。
結合gpA33的鼠抗體的VL結構域(VLgpA33)(SEQ ID NO：13)：
Figure TWI675845B_D0003
VLgpA33的抗原結合結構域包括CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1的序列為SEQ ID NO：14：SARSSISFMY、CDR2的序列為SEQ ID NO：15：DTSNLAS和CDR3的序列為SEQ ID NO：16：QQWSSYPLT。
結合gpA33的鼠抗體的VH結構域(VHgpA33)(SEQ ID NO：17)：
Figure TWI675845B_D0004
VHgpA33的抗原結合結構域包括CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1的序列為(SEQ ID NO：18)：GSWMN、CDR2的序列為(SEQ ID NO：19)：RIYPGDGETNYNGKFKD和CDR3的序列為(SEQ ID NO：20)： IYGNNVYFDV。
第一間插間隔肽(連接體1)的序列為SEQ ID NO：1：GGGSGGGG。含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)的序列為SEQ ID NO：2：GGCGGG。
第一多肽鏈的促進異源二聚物的結構域是“E-螺旋”結構域(SEQ ID NO：3)。第二多肽鏈的促進異源二聚物的結構域是“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO：4)。
因此，DART-1的第一多肽鏈的序列為SEQ ID NO：21：
Figure TWI675845B_D0005
如將認識到的，SEQ ID NO：21的殘基1-110是結合CD3的抗體的VL結構域(VLCD3)(SEQ ID NO：5)；SEQ ID NO：21的殘基111-118是第一間插間隔肽(連接體1)(SEQ ID NO：1)；SEQ ID NO：21的殘基119-237是結合gpA33的鼠抗體的VH結構域(VHgpA33)(SEQ ID NO：17)；SEQ ID NO：21的殘基238-243是含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)(SEQ ID NO：2)；和SEQ ID NO：21的殘基244-271是促進異源二聚物的“E-螺旋”結構域(SEQ ID NO：3)。
編碼DART-1的第一多肽鏈的優選多核苷酸的序列為SEQ ID NO：22：
Figure TWI675845B_D0006
DART-1的第二多肽鏈的序列為SEQ ID NO：23：
Figure TWI675845B_D0007
如將認識到的，SEQ ID NO：23的殘基1-107是結合gpA33的鼠抗體的VL結構域(VLgpA33)(SEQ ID NO：13)；SEQ ID NO：23的殘基108-115是第一間插間隔肽(連接體1)(SEQ ID NO：1)；SEQ ID NO：23的殘基116-240是結合CD3的抗體的VH結構域(VHCD3)(SEQ ID NO：9)；SEQ ID NO：23的殘基241-246是含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)(SEQ ID NO：2)；和SEQ ID NO：23的殘基247-274是促進異源二聚物的“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO：4)。
編碼DART-1的第二多肽鏈的優選的多核苷酸的序列為SEQ ID NO：24：
Figure TWI675845B_D0008
2. gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體“DART-2”
第二優選的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(於此稱之為“DART-2”)的第一和第二多肽鏈包括具有下述序列的多肽結構域：
結合CD3的抗體的VL結構域(VLCD3)(SEQ ID NO：5)：
Figure TWI675845B_D0009
VLCD3的抗原結合結構域包括CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1的序列為SEQ ID NO：6：RSSTGAVTTSNYAN、CDR2的序列為SEQ ID NO：7：GTNKRAP、和CDR3的序列為SEQ ID NO：8：ALWYSNLWV
結合CD3的抗體的VH結構域(VHCD3)(SEQ ID NO：25)：
Figure TWI675845B_D0010
VHCD3的抗原結合結構域包括CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1的序列為SEQ ID NO：10：TYAMN、CDR2的序列為SEQ ID NO：11：RIRSKYNNYATYYADSVKD、和CDR3的序列為SEQ ID NO：12：HGNFGNSYVSWFAY。
上面討論的結合人gpA33的鼠抗體被人源化，以提供優選的雙抗體DART-2的VL和VH結構域。這些人源化結構域如下：結合gpA33的人源化抗體的VL結構域(VLgpA33)(SEQ ID NO：26)：
Figure TWI675845B_D0011
VLgpA33的抗原結合結構域包括CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1的序列為SEQ ID NO：14：SARSSISFMY、CDR2的序列為SEQ ID NO：15：DTSNLAS、和CDR3的序列為SEQ ID NO：16：QQWSSYPLT。
結合gpA33的人源化抗體的VH結構域(VHgpA33)(SEQ ID NO：27)：
Figure TWI675845B_D0012
Figure TWI675845B_D0013
VHgpA33的抗原結合結構域包括CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1的序列為SEQ ID NO：18：GSWMN、CDR2的序列為SEQ ID NO：19：RIYPGDGETNYNGKFKD、和CDR3的序列為SEQ ID NO：20：IYGNNVYFDV。
第一間插間隔肽(連接體1)的序列為SEQ ID NO：1：GGGSGGGG。含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)的序列為SEQ ID NO：2：GGCGGG。
第一多肽鏈的促進異源二聚物的結構域是“E-螺旋”結構域(SEQ ID NO：3)。第二多肽鏈的促進異源二聚物的結構域是“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO：4)。
因此，DART-2的第一多肽鏈的序列為SEQ ID NO：28：
Figure TWI675845B_D0014
如將認識到的，SEQ ID NO：28的殘基1-110是結合CD3的抗體的VL結構域(VLCD3)(SEQ ID NO：5)；SEQ ID NO：28的殘基111-118是第一間插間隔肽(連接體1)(SEQ ID NO：1)；SEQ ID NO：28的殘基119-237是結合 gpA33的抗體的VH結構域(VHgpA33)(SEQ ID NO：27)；SEQ ID NO：28的殘基238-243是含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)(SEQ ID NO：2)；和SEQ ID NO：28的殘基244-271是促進異源二聚物的“E-螺旋”結構域(SEQ ID NO：3)。
編碼DART-2的第一多肽鏈的優選的多核苷酸的序列為SEQ ID NO：29：
Figure TWI675845B_D0015
DART-2的第二多肽鏈的序列為SEQ ID NO：30：
Figure TWI675845B_D0016
如將認識到的，SEQ ID NO：30的殘基1-106是結合gpA33的抗體的VL結構域(VLgpA33)(SEQ ID NO：26)；SEQ ID NO：30的殘基107-114是第一間插間隔肽(連接體1)(SEQ ID NO：1)；SEQ ID NO：30的殘基115-239是結合CD3的抗體的VH結構域(VHCD3)(SEQ ID NO：25)；SEQ ID NO：30的殘基240-245是含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)(SEQ ID NO：2)；和SEQ ID NO：30的殘基246-273是促進異源二聚物的“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO：4)。
編碼DART-2的第二多肽鏈的優選的多核苷酸的序列為SEQ ID NO：31：
Figure TWI675845B_D0017
3.具有白蛋白結合結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(ABD)(“DART-2 w/ABD”)
在另一實施方式中，gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體包括白蛋白結合結構域(“ABD”)(具有ABD的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗 體”)。
如WO 2012/018687中所公開，為了改善雙抗體分子的體內藥物代謝動力學性質，此些分子可修飾以在雙抗體分子的一個或多個末端包含血清結合蛋白的多肽部分。最優選地，這種血清結合蛋白的多肽部分安置在雙抗體分子的C-末端。為此，尤其優選的血清結合蛋白的多肽部分是來自鏈球菌蛋白質G的白蛋白結合結構域(ABD)。鏈球菌屬(Streptococcus)菌株G148的蛋白質G的白蛋白結合結構域3(ABD3)是尤其優選的。
鏈球菌屬菌株G148的蛋白質G的白蛋白結合結構域3(ABD3)由形成穩定三-螺旋束並且具有廣泛白蛋白結合特異性的46個氨基酸殘基組成(Johansson,M.U.等(2002)“細菌白蛋白結合元件的結構、特異性和相互作用的模式(Structure，Specificity，And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules)”J.Biol.Chem.277(10)：8114-8120)。白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質並且人中的半衰期為19天。白蛋白具有數個小分子結合位點，其允許它非共價結合其他蛋白質，從而延長它們的血清半衰期。
因此，具有白蛋白結合結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體的第一多肽鏈或第二多肽鏈包含第三連接體(連接體3)，其將這種多肽鏈的E-螺旋(或K-螺旋)與白蛋白結合結構域分開。這種連接體3的優選的序列是GGGS(SEQ ID NO：32)或GGGNS(SEQ ID NO：33)。優選的白蛋白結合結構域(ABD)的氨基酸序列為SEQ ID NO：34：
Figure TWI675845B_D0018
為了闡釋本發明的此方面，上述DART-2的第一多肽鏈被修 飾，以包含白蛋白結合結構域，因而產生具有ABD的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(於此稱之為“DART-2 w/ABD”)。
這種DART-2 w/ABD的第一多肽鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO：35：
Figure TWI675845B_D0019
如將認識到的，SEQ ID NO：35的殘基1-271與DART-2的殘基1-271相同，因此在N-末端至C-末端方向上提供結合CD3的抗體的VL結構域(VLCD3)(SEQ ID NO：5)、第一間插間隔肽(連接體1)(SEQ ID NO：1)、結合gpA33的抗體的VH結構域(VHgpA33)(SEQ ID NO：27)、含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)(SEQ ID NO：2)、促進異源二聚物的“E-螺旋”結構域(SEQ ID NO：3)和C-末端。連接體3的殘基272-275(SEQ ID NO：32)和殘基276-321是白蛋白結合結構域(SEQ ID NO：34)。
編碼DART-2 w/ABD的第一多肽鏈的優選的多核苷酸的序列為SEQ ID NO：36：
Figure TWI675845B_D0020
Figure TWI675845B_D0021
DART-2 w/ABD的第二多肽鏈與上面討論的DART-2的第二多肽鏈相同(SEQ ID NO：30)。
B.具有IgG Fc結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(“DART-2 w/Fc”)
在本發明的進一步實施方式中，提供了具有IgG Fc結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體。這種雙抗體在本文被稱為“gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體”。根據本發明的Fc雙抗體的Fc結構域可以是完整的Fc區域(例如，完整的IgG Fc區域)或僅僅是完整Fc區域的片段。儘管根據本發明的雙特異性單價Fc雙抗體的Fc結構域可具有結合一個或多個Fc受體(例如，FcγR(一個或多個))的能力，但更優選地這樣的Fc結構域造成與FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)的結合降低(相對於野生型Fc區域展示的結合)或基本上消除這樣的 Fc結構域結合這類受體(一個或多個)的能力。根據本發明的雙特異性單價Fc雙抗體的Fc結構域可包括完整Fc區域的一些或所有的CH2結構域和/或一些或所有的CH3結構域，或可包括變體CH2和/或變體CH3序列(相對於完整Fc區域的CH2或CH3結構域，其可包括，例如，一個或多個插入和/或一個或多個缺失)。根據本發明的雙特異性單價Fc雙抗體的Fc結構域可包括非Fc多肽部分，或可包括非天然完整Fc區域的一部分，或可包括非天然存在方向的CH2和/或CH3結構域(比如，例如，兩個CH2結構域或兩個CH3結構域，或在N-末端至C-末端方向上，與CH2結構域連接的CH3結構域等)。
在第一實施方式中，標記為“形式1”並且顯示在圖2A中，示例性gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第一多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括N-末端、具有結合gpA33或CD3的能力之單克隆抗體的VL結構域(即，VLgpA33或VLCD3)、間插間隔肽(連接體1)、具有結合gpA33(如果這種第一多肽鏈包含VLCD3)或CD3(如果這種第一多肽鏈包含VLgpA33)的能力之單克隆抗體的VH結構域、含半胱氨酸的第二間插間隔肽(連接體2)、促進異源二聚物的結構域、間隔肽(連接體5)、含半胱氨酸的肽(肽1)、IgG Fc結構域(優選地，抗體Fc區域的所有或一部分CH2和CH3結構域)和C-末端。
在第二種實施方式中，標記為“形式2”並且顯示在圖2B中，示例性gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第一多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括N-末端、含半胱氨酸的肽(肽1)、IgG Fc結構域(優選地，抗體Fc區域的所有或一部分CH2和CH3結構域)、間插間隔肽(連接體4)、具有結合gpA33或CD3的能力之單克隆抗體的VL結構域(即，VLgpA33或VLCD3)、間插間隔肽(連接體1)、具有結合gpA33(如果這種第一多肽鏈包含VLCD3)或 CD3(如果這種第一多肽鏈包含VLgpA33)的能力之單克隆抗體的VH結構域、含半胱氨酸的第二間插間隔肽(連接體2)、促進異源二聚物的結構域和C-末端。
優選地，在每個實施方式中，第一多肽鏈的Fc結構域造成與FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)的結合降低(相對於野生型Fc區域展示的結合)或基本上消除這種Fc結構域與這類受體(一個或多個)結合的能力。能夠介導這種改變的結合的Fc變體和突變體形式是本領域熟知的並且包括在234和235位的氨基酸置換、在265位的置換或在297位的置換(見，例如，美國專利號5,624,821，其通過引用併入本文)。在優選的實施方式中，CH2和CH3結構域包括在234位用丙氨酸的置換和在235位用丙氨酸的置換。
這種示例性gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體(形式1和形式2)的第二多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括N-末端、具有結合gpA33或CD3的能力之單克隆抗體的VL結構域(即，VLgpA33或VLCD3，這取決於雙抗體的第一多肽鏈的VL結構域選擇)、間插連接體肽(連接體1)、具有結合CD3(如果這種第二多肽鏈包含VLgpA33)或CD3(如果這種第二多肽鏈包含VLCD3)的能力之單克隆抗體的VH結構域、含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)、促進異源二聚物的結構域(優選地K-螺旋結構域)和C-末端。
示例性gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體(形式1和形式2)將另外包括第三多肽鏈，其在從N-末端至C-末端方向上包括N-末端、含半胱氨酸的肽(肽1)、具有與第一多肽鏈的Fc結構域的相同同種型的IgG Fc結構域(優選地，抗體Fc區域的所有或一部分CH2和CH3結構域)和C-末端。優 選地，相對於示例性gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第一多肽鏈而言，第三多肽鏈的Fc結構域將造成與FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)的結合降低(相對於野生型Fc區域展示的結合)或將基本上消除這種Fc結構域結合這類受體(一個或多個)的能力，如上討論。
任選地間插間隔肽(連接體4)優選地包括氨基酸序列(SEQ ID NO：37)：APSSS，和更優選地具有氨基酸序列(SEQ ID NO：38)：APSSSPME。
第一和第三多肽鏈的含半胱氨酸的肽(肽1)可由相同氨基酸序列或不同氨基酸序列組成，並且包含1、2、3個或更多個半胱氨酸殘基。尤其優選的肽1的氨基酸序列為SEQ ID NO：39：DKTHTCPPCP。
間插間隔肽(連接體1)優選地的序列為上述SEQ ID NO：1。含半胱氨酸的第二間插間隔肽(連接體2)優選地序列為上述SEQ ID NO：2。
gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第一和第二多肽鏈的促進異源二聚物的結構域優選地是上述E-螺旋結構域(SEQ ID NO：3)和K-螺旋結構域(SEQ ID NO：4)，並且將被選擇從而這種多肽鏈的一條具有E-螺旋結構域，而另一條具有K-螺旋結構域，如上所討論。
優選的間隔肽(連接體5)的序列為GGG。
第一和第三多肽的CH2和/或CH3結構域不必相同，並且有利地被修飾以促進兩條多肽之間的複合。例如，可以將氨基酸置換(優選用包含形成‘突出物(knob)’的大側基的氨基酸，例如色氨酸，進行的置換)引入CH2或CH3結構域中，從而使得空間干擾會防止與類似突變的結構域的相互 作用，並且會迫使突變的結構域與這樣的結構域配對：在所述結構域中，改造進了互補或適應性突變，即‘孔(hole)’，(例如：用甘氨酸進行置換)。這類突變組可以被改造進任何包含雙特異性單價Fc雙抗體分子的多肽對中，並且進一步改造進所述對的多肽鏈的任何部分中。偏愛異源二聚化而不喜歡同源二聚化的蛋白質工程的方法在本領域中是熟知的，特別是相對於免疫球蛋白樣分子的改造而言，並且包括在本文中這種組的突變可被改造成任何對的多肽包括雙特異性單價Fc雙抗體分子，和此外，改造成所述的多肽鏈的任何部分。相比同二聚利於異源二聚化的蛋白質改造的方法是本領域熟知的，尤其就免疫球蛋白樣分子的改造而言，並且包括在本文中(見例如，Ridgway等(1996)“抗體CH3結構域用於重鏈異源二聚化的‘突出物-進入-孔’改造(‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization)”Proteins Engr.9：617-621，Atwell等(1997)“使用噬菌體展示文庫的來自重塑同源二聚物的結構域介面的穩定異源二聚物(Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library)”J.Mol.Biol.270：26-35，和Xie等(2005)“新形式的雙特異性抗體：非常有效的異源二聚化、表現和腫瘤細胞溶解(A New Format Of Bispecific Antibody：Highly Efficient Heterodimerization，Expression And Tumor Cell Lysis)”J.Immunol.Methods 296：95-101；其每一篇通過參考以其整體併入本文)。優選將‘突出物’改造到第一多肽鏈的CH2-CH3結構域中，並將‘孔’改造到第三多肽鏈的CH2-CH3結構域中。因此‘突出物’會有助於防止第一多肽鏈通過其CH2和/或CH3結構域同源二聚化。因為第三多肽鏈優選含有‘孔’置換，其會與第一多肽鏈異源 二聚化以及與自身同源二聚化。通過將天然IgG Fc區域的Fc結構域修飾為含有修飾T366W，產生優選的突出物。通過將天然IgG Fc區域的Fc結構域修飾為含有修飾T366S、L368A以及Y407V，產生優選的孔為了幫助從包括第一、第二和第三多肽鏈的最終雙特異性單價Fc雙抗體純化第三多肽鏈同源二聚物，第三多肽鏈的CH2和CH3結構域的蛋白A結合位點優選地經氨基酸置換在435位突變(H435R)。為了幫助從包括第一、第二和第三多肽鏈的最終雙特異性單價Fc雙抗體純化第三多肽鏈同源二聚物，第三多肽鏈的CH2和CH3結構域的蛋白A結合位點優選地經氨基酸置換而被突變。因此，第三多肽鏈同源二聚物不會結合蛋白A，而雙特異性單價Fc雙抗體會保留其通過第一多肽鏈上的蛋白A結合位點結合蛋白A的能力。
第一多肽鏈中存在的抗體Fc結構域的CH2和CH3結構域的優選序列是SEQ ID NO：40：
Figure TWI675845B_D0022
第三多肽鏈中存在的抗體Fc結構域的CH2和CH3結構域的優選序列是SEQ ID NO：41：
Figure TWI675845B_D0023
Figure TWI675845B_D0024
1. DART-2 w/Fc形式1
優選的gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體(於此稱之為“DART-2 w/Fc形式1”)的第一、第二和第三多肽鏈包括具有下述序列的多肽結構域： 這樣的DART-2 w/Fc形式1的第一多肽鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO：42：
Figure TWI675845B_D0025
如將認識到的，SEQ ID NO：42的殘基1-106是結合gpA33的抗體的VL結構域(VLgpA33)(SEQ ID NO：26)；SEQ ID NO：42的殘基107-114是第一間插間隔肽(連接體1)(SEQ ID NO：1)；SEQ ID NO：42的殘基115-239是結合CD3的抗體的VH結構域(VHCD3)(SEQ ID NO：25)；SEQ ID NO：42的殘 基240-245是含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)(SEQ ID NO：2)；SEQ ID NO：42的殘基246-273是促進異源二聚物的“E-螺旋”結構域(SEQ ID NO：3)；殘基274-276是間隔肽GGG(連接體5)；殘基277-286是肽1(SEQ ID NO：39)；以及殘基277-503是抗體Fc結構域的CH2和CH3結構域的序列(SEQ ID NO：40)。
編碼DART-2 w/Fc形式1的第一多肽鏈的優選的多核苷酸的序列為SEQ ID NO：43：
Figure TWI675845B_D0026
Figure TWI675845B_D0027
這樣的DART-2 w/Fc形式1的第二多肽鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO：44：
Figure TWI675845B_D0028
如將認識到的，SEQ ID NO：44的殘基1-110是結合CD3的抗體的VL結構域(VLCD3)(SEQ ID NO：5)；SEQ ID NO：44的殘基111-118是第一間插間隔肽(連接體1)(SEQ ID NO：1)；SEQ ID NO：44的殘基119-237是結合gpA33的抗體的VH結構域(VHgpA33)(SEQ ID NO：27)；SEQ ID NO：44的殘基238-243是含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)(SEQ ID NO：2)；和SEQ ID NO：44的殘基244-271是促進異源二聚物的“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO：4)。
編碼DART-2 w/Fc形式1的第二多肽鏈的優選的多核苷酸的序列為SEQ ID NO：45：
Figure TWI675845B_D0029
Figure TWI675845B_D0030
這樣的DART-2 w/Fc形式1的第三多肽鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO：46：
Figure TWI675845B_D0031
如將認識到的，SEQ ID NO：46的殘基1-10是肽1(SEQ ID NO：39)；和殘基11-227是抗體Fc結構域的CH2和CH3結構域(SEQ ID NO：41)。
編碼DART-2 w/Fc形式1的第三多肽鏈的優選的多核苷酸是序列為SEQ ID NO：47：
Figure TWI675845B_D0032
Figure TWI675845B_D0033
2. DART-2 w/Fc形式2
第二優選的gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體(於此稱之為“DART-2 w/Fc形式2”)的第一、第二和第三多肽鏈包括具有下述序列的多肽結構域。除了其他不同之外，DART-2 w/Fc形式1與DART-2 w/Fc形式22的差異在於第一多肽鏈的CH2和CH3序列的佈置；這些序列C-末端接近DART-2 w/Fc形式1的VL和VH序列，而它們被佈置在DART-2 w/Fc形式2的VL和VH序列的N-末端。
這樣的DART-2 w/Fc形式2的第一多肽鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO：48：
Figure TWI675845B_D0034
Figure TWI675845B_D0035
如將認識到的，SEQ ID NO：48的殘基1-10是肽1(SEQ ID NO：39)；SEQ ID NO：48的殘基11-227是抗體Fc結構域的CH2和CH3結構域的序列(SEQ ID NO：40)；SEQ ID NO：48的殘基228-235是間插間隔肽(連接體4)(SEQ ID NO：38)；SEQ ID NO：48的殘基236-341是結合gpA33的抗體的VL結構域(VLgpA33)(SEQ ID NO：26)；SEQ ID NO：48的殘基342-349是第一間插間隔肽(連接體1)(SEQ ID NO：1)；SEQ ID NO：48的殘基350-474是結合CD3的抗體的VH結構域(VHCD3)(SEQ ID NO：25)；SEQ ID NO：48的殘基475-480是含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)(SEQ ID NO：2)；和SEQ ID NO：48的殘基481-508是促進異源二聚物的“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO：4)。
這樣的DART-2 w/Fc形式2的第二多肽鏈具有DART-2的第一多肽鏈的氨基酸序列(即，SEQ ID NO：28)(如上述)。
這樣的DART-2 w/Fc形式2的第三多肽鏈具有SEQ ID NO：46的氨基酸序列(如上述)。
II.藥學組合物
根據本發明的組合物包括可用於製造藥物組合物(例如不純的或非無菌的組合物)和藥物組合物(即適合施用於受試者或患者的組合物)的散裝(bulk)藥物組合物，其可用來製備單位劑型。這樣的組合物包括本文公開的預防或治療有效量的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體或gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體和另外的治療劑)和藥學上可接受的載體。優選地，根據本發明的組合物包括預防或治療有效量的一種或多種分子和藥學上可接受的載體。
本發明也涉及藥學組合物，其包括這樣的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體或gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體和對癌症相關的具體抗原特異的第二治療性抗體(例如，癌症-抗原特異性單克隆抗體)，和藥學上可接受的載體。
在具體實施方式中，術語“藥學上可接受的”表示獲得聯邦政府或州政府管理結構的許可或列於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他通常獲得認可的藥典中，供用於動物，特別是用於人類。術語“載體”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全)、賦形劑或媒介。這類藥用載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物油、植物油或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥物組合物時，水是優選的載體。鹽水溶液和含水右旋糖以及甘油溶液可以用作液體載體，特別是對於可注射溶液而言。合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、滑石粉(chalk)、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉(dried skim milk)、甘油、丙烯、1,2-乙二醇、水、乙醇等。若需要，組合物也可以含有小量濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸浮劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋製劑等形式。
通常，根據本發明的組合物的成分被單獨提供或以單位劑型的形式混合在一起，例如：作為標明活性劑量的密封容器中的凍乾粉或無 水濃縮物，所述容器如安剖或袋(sachette)。當通過輸注施用組合物時，其可以用含有無菌的藥物級水或鹽水的輸注瓶分配。如果通過注射施用所述組合物，則可以提供一安剖注射用無菌水或鹽水，以便可以在施用前混合所述組分。
可以將根據本發明的組合物配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括但不限於用陰離子形成的鹽，所述陰離子例如來源於鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子，以及用陽離子形成的鹽，所述陽離子例如來自氫氧化納、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
本發明也提供藥物包裝或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器填充以這種公開的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體或gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體(單獨或結合另外的治療劑(一種或多種))和這樣的藥學上可接受的載體。另外，用於治療疾病的一種或多種其他預防性或治療性劑也可以包括於所述藥物包裝或試劑盒中。本發明還提供了藥物包裝或試劑盒，其包含一個或多個容器，所述容器填充以根據本發明的藥物組合物的一種或多種成分。任選地與這類容器關聯的可以是採用管理藥物或生物產品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形的佈告(notice)，所述佈告反映了管理機構許可製造、使用或銷售，供施用於人類。
本發明提供可用於上述方法的試劑盒。在一種實施方式中，試劑盒包括根據本發明的一種或多種分子。在另一實施方式中，試劑盒在一個或多個容器中進一步包括用於治療癌症的一種或多種其他預防劑或治療劑。在另一實施方式中，試劑盒進一步包括結合與癌症相關的一種或多 種抗原的一種或多種抗體。在某些實施方式中，其他預防劑或治療劑是化療劑。在其他實施方式中，預防劑或治療劑是生物或激素治療劑。
III.組合物的用途
根據本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體或gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體具有治療與gpA33的表現相關或特徵在於gpA33的表現的任何疾病或病況的能力。因此，不受限制地，包括這樣的分子的藥學組合物可用於診斷或治療結腸癌、結直腸癌和胰腺癌。
IV.施用方法
通過向受試者施用有效量的根據本發明的藥物組合物，可以提供上述之根據本發明的組合物用來治療、預防和改善與疾病、病症或感染相關的一種或多種症狀。在優選的方面，這類組合物基本上是純的(即基本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。在具體實施方式中，受試者是動物，優選哺乳動物，如非靈長類(例如牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴子，如食蟹猴、人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。
各種送遞系統是已知的，並且可以用於施用根據本發明的組合物，例如：封裝於脂質體中、微粒、微膠囊、能表現抗體或融合蛋白的重組細胞、受體介導的內吞作用(見，例如，Wu等(1987)“通過可溶性DNA載體系統的受體介導的體外基因轉化(Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System)”J.Biol.Chem.262：4429-4432)，構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分等。
施用根據本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體或 gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的方法包括、但不限於腸胃外施用(例如真皮內、肌肉內、腹腔內、靜脈內以及皮下)、硬膜外以及粘膜(例如鼻內和口腔途徑)。在具體實施方式中，肌肉內、靜脈內或皮下施用根據本發明的分子。組合物可以通過任何方便途徑施用，例如：通過輸注或大丸劑注射、通過上皮膜或粘膜與皮膚膜(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，並且可以與其他生物活性劑一起施用。給藥可以是全身的或局部的。另外，也可以應用肺給藥，例如通過使用吸入器或噴霧器，並且與煙霧化劑一起配製。見，例如，美國專利號6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公開號WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其每一篇通過參考以其整體併入本文。
根據本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體或gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體亦可被包裝在密封容器中，比如指示這種分子的量的安瓿或袋中。在一種實施方式中，根據本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體或gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體作為凍幹無菌粉或無水濃縮物提供於密封容器中，並且可以用例諸如水或鹽水等溶液重構至施用於受試者的適當濃度。優選地，根據本發明的gpA33 x CD3雙抗體或gpA33 x CD3 Fc雙抗體作為凍幹無菌粉提供於密封容器中，其單位劑量為至少5μg、更優選地至少10μg、至少15μg、至少25μg、至少50μg、至少100μg、或至少200μg。
根據本發明的凍幹的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體或gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體應在它們的來源容器中儲存在2和8℃ 之間，並且分子應在重構之後的12小時，優選地6小時，5小時，3小時，或1小時內施用。在可選的實施方式中，的本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體或gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體以液體形式提供在指示分子、融合蛋白或綴合分子的數量和濃度的密封容器中。優選地，這樣的液體形式的雙特異性單價雙抗體或雙特異性單價Fc雙抗體提供在密封容器中，其中分子存在的濃度為至少1μg/ml，更優選地至少2.5μg/ml，至少5μg/ml，至少10μg/ml，至少50μg/ml，或至少100μg/ml。
可通過標準臨床技術測定的本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體或gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體有效治療、預防或改善與病症相關的一個或多個症狀的量。劑型中採用的精確劑量也取決於施用的路徑，和病況的嚴重性，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況決定。有效的劑量可從源自體外或動物模型測試系統的劑量回應曲線推斷。
對於本發明涉及的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體或gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，施用至患者的劑量通常至少約0.01μg/kg，至少約0.05μg/kg，至少約0.1μg/kg，至少約0.2μg/kg，至少約0.5μg/kg，至少約1μg/kg，至少約2μg/kg，至少約3μg/kg，至少約5μg/kg，至少約10μg/kg，至少約20μg/kg，至少約30μg/kg，至少約50μg/kg，至少約0.1mg/kg，至少約0.15mg/kg受試者的體重，或更多。
根據本發明的雙特異性單價雙抗體或雙特異性單價Fc雙抗體的施用劑量和頻率可通過修飾比如，例如：脂質化而增強雙特異性單價Fc雙抗體的吸收和組織滲透來降低或改變。
在一種實施方式中，可計算施用至患者的根據本發明的 gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體或gpA33 x CD3 Fc雙特異性單價雙抗體的劑量，以用作單一劑療法。在另一實施方式中，根據本發明的雙特異性單價雙抗體或雙特異性單價Fc雙抗體結合其他治療性組合物使用，並且施用至患者的劑量小於當這種雙特異性單價雙抗體或雙特異性單價Fc雙抗體作為單個試劑療法使用時的劑量。
在具體的實施方式中，可期望局部施用根據本發明的藥學組合物至需要治療的區域；這可通過例如，但不限於下述實現局部注入、通過注射、或通過植入物，所述植入物是多孔的、非多孔的，或凝膠狀材料，包括膜，比如矽橡膠膜，或纖維。優選地，當施用根據本發明的分子時，必須注意使用不吸收此分子的材料。
在另一實施方式中，組合物可在泡，尤其脂質體中遞送(見Langer(1990)“藥物遞送的新方法(New Methods Of Drug Delivery),”Science 249：1527-1533)；Treat等，在傳染病和癌症療法中的脂質體(Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer)，Lopez-Berestein和Fidler(eds.)，Liss，New York，353-365頁(1989)；Lopez-Berestein，同上，317-327頁；通常參見同上)。
在仍另一實施方式中，可在控釋或緩釋系統中遞送組合物。可以使用本領域技術人員已知的任何技術產生包括根據本發明的一種或多種分子的緩釋製劑。見，例如，美國專利號4,526,938、PCT公開WO 91/05548、PCT公開WO 96/20698；Ning等(1996)“使用持續釋放凝膠人結腸癌異種移植物的瘤內放射免疫療法(Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel)”Radiotherapy & Oncology 39：179-189，Song等(1995)“長期迴圈乳液的抗體介導肺靶向(Antibody Mediated Lung Targeting Of Long Circulating Emulsions),”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50：372-397；Cleek等(1997)“心血管應用的bFGF抗體的生物可降解的聚合載體(Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application),”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；和Lam等(1997)“用於局部遞送的重組體人源化的單克隆抗體的微封裝(Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery),”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，其每一篇通過參考以其整體併入本文。在一種實施方式中，泵可用於控釋系統(見Langer，上文；Sefton，(1987)“可植入泵(Implantable Pumps),”CRC CRC Crit.Rev.Biomed.Eng.14：201-240；Buchwald等(1980)“通過患有復發靜脈血栓形成的走動患者可植入注入泵長期、連續的靜脈內類肝素施用(Long-Term，Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis),”Surgery 88：507-516；和Saudek等(1989)“用於胰島素遞送的可程式設計可植入藥物系統的初步試驗(A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery),”N.Engl.J.Med.321：574-579)。在另一實施方式中，聚合材料可用於實現抗體的控釋(見例如，控釋的醫學應用(MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE)，Langer和Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；受控的藥物生物利用度、藥物產品設計和性能(CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY，DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE)，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Levy等(1985)“通過局部控釋二磷酸鹽的生物人工心臟瓣膜的鈣化的抑制(Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate),”Science 228：190-192；During等(1989)“來自聚合腦植入物的多巴胺的控釋：體內表徵(Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant：In Vivo Characterization),”Ann.Neurol.25：351-356；Howard等(1989)“具有損傷-誘導記憶缺陷的大鼠中的腦內藥物遞送(Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits),”J.Neurosurg.7(1)：105-112)；美國專利號5,679,377；美國專利號5,916,597；美國專利號5,912,015；美國專利號5,989,463；美國專利號5,128,326；PCT公開號WO 99/15154；和PCT公開號WO 99/20253)。緩釋製劑所用的聚合物的實例包括但不限於聚(2-甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)以及聚原酸酯(polyorthoeste)。在另一實施方式中，控釋系統可接近治療靶標(例如，肺)佈置，因此僅僅需要全身劑量的一部分(見，例如，Goodson，控釋的醫學應用(MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE)，上文，2卷，115-138頁(1984))。在另一實施方式中，根據Dunn等(見U.S.5,945,155)，使用可用作控釋移植物的聚合物組合物。此特定方法基於聚合物系統中生物活性材料原位控釋的治療效果。移植通常發生于患者身體內需要治療的任何地方。使用非聚合物持續送遞 系統，由此受試者身體內的非聚合物移植物被用作藥物送遞系統。一旦移植到身體中，移植物的有機溶劑會從組合物中消散、分散或滲漏到周圍組織液中，並且非聚合物材料會逐漸凝結或沉澱，形成固體微孔基質(參見U.S.5,888,533)。
控釋系統在Langer(1990,“藥物遞送的新方法(New Methods Of Drug Delivery),”Science 249：1527-1533)的綜述中有論述。可以使用本領域技術人員已知的任何技術來生產包含根據本發明的一種或多種治療劑的緩釋製劑。見，例如，美國專利號4,526,938；國際公開號WO 91/05548和WO 96/20698；Ning等(1996)“使用持續釋放凝膠人結腸癌異種移植物的瘤內放射免疫療法(Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel)”Radiotherapy & Oncology 39：179-189，Song等(1995)“長期迴圈乳液的抗體介導肺靶向(Antibody Mediated Lung Targeting Of Long Circulating Emulsions),”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50：372-397；Cleek等(1997)“心血管應用的bFGF抗體的生物可降解的聚合載體(Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application),”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；和Lam等(1997)“用於局部遞送的重組體人源化的單克隆抗體的微封裝(Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery),”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，其每一篇通過參考以其整體併入本文。
在根據本發明的組合物是編碼根據本發明的雙特異性單價 雙抗體或雙特異性單價Fc雙抗體的核酸的具體實施方式中，核酸可體內施用，以通過如下促進其編碼的雙特異性單價雙抗體或雙特異性單價Fc雙抗體的表現：通過將其構建為適當的核酸表現載體的一部分並且施用它從而其成為細胞內的，例如，通過使用逆轉錄病毒載體(見美國專利號4,980,286)，或通過直接注射，或通過使用微粒轟擊(例如，基因槍；生物彈道技術(Biolistic)，Dupont)，或用脂質或細胞-表面受體或轉染試劑塗覆，或通過與已知進入核的同源框樣肽一起施用(見例如，Joliot等(1991)“觸角足同源框肽調節神經形態發生(Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis),”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：1864-1868)等。可選地，可以將核酸引入細胞內並通過同源重組整合到宿主細胞DNA中，以進行表現。
用治療或預防有效量的根據本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體或gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體治療受試者可包括單一治療或，優選地，可包括一系列治療。在優選的實施方式中，用根據本發明的分子每週治療受試者一次持續約1至10周，優選地2至8周，更優選地約3至7周，和甚至更優選地約4、5或6周。在其他實施方式中，根據本發明的藥學組合物一天施用一次，一天兩次，或一天三次。在其他實施方式中，藥學組合物一周施用一次，一周兩次，每兩週一次，一個月一次，每六週一次，每兩個月一次，一年兩次或每年一次。應當認識到，用於治療的分子的有效劑量可以隨著具體治療的過程增加或降低。
已經一般性描述了本發明，通過參考下述範例本發明將更容易理解，通過示例的方式提供所述範例並且不旨在限制本發明，除非另外 說明。
V.範例1
抗人gpA33單克隆抗體的特徵
使能夠特異性結合人gpA33的鼠單克隆抗體嵌合和人源化。初始鼠抗體的VL和VH鏈的序列分別為SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：17。人源化抗體的VL和VH鏈的序列分別為SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27。
VLgpA33的抗原結合結構域包括CDR1、CDR2以及、CDR3，其中CDR1的序列為SEQ ID NO：14：SARSSISFMY、CDR2的序列為SEQ ID NO：15：DTSNLAS、和CDR3的序列為SEQ ID NO：16：QQWSSYPLT。
VHgpA33的抗原結合結構域包括CDR1、CDR2以及、CDR3，其中CDR1的序列為SEQ ID NO：18：GSWMN、CDR2的序列為SEQ ID NO：19：RIYPGDGETNYNGKFKD、和CDR3的序列為SEQ ID NO：20：IYGNNVYFDV。
表1顯示這樣的改變對結合動力學的影響。
資料指示導致抗體VL和VH結構域人源化的修飾基本上不影響gpA33結合動力學。
VI.範例2
gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體和Fc雙抗體以及對照雙抗體的構建
表2包含表現和純化的優選的gpA33 x CD3雙抗體和gpA33 x CD3 Fc雙抗體多肽鏈序列的列表。發現雙抗體能夠同時結合gpA33和CD3，如通過示例性gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體、DART-1和DART-2，和通過示例性gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體(DART-2 w/Fc)檢測這種同時結合所判斷的。另外，產生對照雙特異性單價雙抗體(“對照DART”)，其對CD3和FITC是雙特異性單價的，並且發現能夠同時結合CD3和FITC.
gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體是由兩條多肽鏈(每條敘述的序列的一條鏈)組成的異源二聚物，並且gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體是由三條多肽鏈(每條敘述的氨基酸序列的一條鏈)組成的異源三聚物。形成雙特異性單價雙抗體的方法提供在WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/080538、WO 2012/018687、WO 2012/162068和WO 2012/162067中。
發現對照CD3 x FITC雙特異性單價雙抗體能夠同時結合CD3和結合FITC。發現上述gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體和gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體能夠同時結合gpA33和CD3。為了證明這種同時結合，在存在已經固定至固體支持物的可溶性CD3片段的情況下溫育gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體DART-1。通過固定的抗體另外結合gpA33的能力分析結合的檢測。結果確認上述gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體和gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體介導同時結合gpA33和CD3的能力(圖3)。
VII.範例3
gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體對癌症細胞是細胞毒性的
通過在存在gpA33 x CD3雙特異性單價DART-1和人PBMC(E：T=25：1)或活化的人T細胞(E：T=10：1)的情況下溫育結直腸或胰腺癌細胞，闡釋本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體治療癌症的能力。 gpA33x CD3雙特異性單價雙抗體DART-1以亞ng/mL(sub-ng/mL)至約1ng/mL範圍實現50%最大活性(EC50)需要的濃度顯示有效的重定向殺傷能力。相反，當採用gpA33-陰性癌症細胞系(例如，HCT116)時，沒有觀察到細胞毒性。研究的結果顯示在圖4A(結直腸癌幹樣細胞(stem-like cell)(結腸CSCL細胞)、圖4B(Colo205結直腸細胞)和圖4C(ASPC-1胰腺癌細胞)中。結果總結在表3。
VIII.範例4
在存在gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體的情況下的T細胞活化
為了進一步證明根據本發明的雙抗體具有治療癌症的能力，在存在或沒有癌症細胞(colo205或ASPC-1)的情況下，將靜息人T細胞與gpA33 x CD3雙特異性單價DART-1一起溫育。為了表徵gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-1)介導的重定向殺傷過程期間的T細胞活化，來自重定向殺傷試驗的T細胞針對T細胞活化標記物CD25被染色，並且通過FACS被分析。CD25在CD8(圖5A-5B)和CD4(圖5D-5E)T細胞中以劑量依賴性方式被上調，表明重定向殺傷過程中gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體誘導T細 胞活化。相反地，在沒有靶細胞的情況下沒有CD8(圖5C)或CD4(圖5F)T細胞的活化，指示gp-A33 x CD3雙抗體在沒有靶細胞的情況下不啟動T細胞。同樣地，當與靶細胞和對照雙特異性單價雙抗體(對照DART)一起溫育時，CD8或CD4 T細胞不被啟動(分別為圖5A-5B，和圖5D-5F)，表明需要用gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體交聯T細胞和靶細胞。
IX.範例5
具有鼠抗人gpA33可變結構域序列的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-1)和具有人源化抗人gpA33可變結構域序列的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-2)的等價性(equivalency)
如上討論，gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體DART-1包含鼠單克隆抗體的VLgpA33和VHgpA33結構域，而gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體DART-2包含相同鼠抗體的人源化VLgpA33和人源化VHgpA33結構域。為了證明人源化VLgpA33和VHgpA33結構域促進T細胞靶向表現gpA33的癌症細胞的能力，在存在靜息T細胞(LDH試驗；E：T=10：1)的情況下在存在DART-1、DART-1或對照雙特異性單價雙抗體(對照DART)的情況下溫育表現gpA33的癌症細胞。此分析的結果(圖6A-6D中顯示)表明DART-1和DART-2介導對SW948結直腸腺癌細胞(圖6A)和colo205細胞(圖6B)等同的細胞毒性。DART-1和DART-2都介導表現螢光素酶的Colo205細胞系的細胞毒性，如通過降低的發光所測量的(圖6C)，所述Colo205細胞系用螢火蟲螢光素酶基因(luc2)穩定轉染(Colo205-Luc)。DART-1或DART-2都不介導gpA33-陰性癌症細胞系、HCT116的細胞毒性(圖6D)。如表4中所顯示，DART-1和DART-2展示對抗多種腫瘤細胞系的類似等同的生物活性。
X.範例6
gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體、具有白蛋白結合結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體和具有IgG Fc結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體與食蟹猴的PBMCs的交叉反應性
如上所顯示，gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體DART-2的人源化VLgpA33和人源化VHgpA33結構域在存在人T細胞的情況下介導表現gpA33的癌症細胞的細胞毒性。出人意料地發現根據本發明的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體的VLCD3和VHCD3結構域也能夠結合食蟹猴T細胞的CD3並且重定向這些細胞，以殺傷表現gpA33的細胞。
如圖7A-7D中所顯示，發現gpA33 x CD3雙特異性單價DART-2雙抗體、具有白蛋白結合結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗 體(DART-2 w/ABD)和具有IgG Fc結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價DART-2雙抗體(DART-2 w/Fc)在存在人或食蟹猴PBMC的情況下能夠促進癌症細胞的細胞毒性。圖7A-7B顯示三種雙抗體介導與人PBMC一起溫育的Colo205-Luc細胞的細胞毒性的能力，如通過LDH試驗(圖7A)或螢光素酶(圖7B)所測量的。圖7C-7D顯示三種雙抗體介導與食蟹猴PBMC一起溫育的Colo205-Luc細胞的細胞毒性的相應能力，如通過LDH試驗(圖7A)或螢光素酶(圖7B)所測量的。
如表5中所顯示，gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體DART-2和具有白蛋白結合結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-2 w/ABD)顯示相當的CTL活性。雙特異性單價雙抗體顯示與人和食蟹猴(cyno)PBMC效應細胞一致的活性。
XI.範例7
鼠結腸腫瘤模型中gpA33 x CD3雙抗體的體內反應性
為了表明根據本發明的gpA33 x CD3雙抗體提供癌症治療的體內能力，將colo205細胞與活化的T細胞共植入到免疫缺陷NSG(NOD scid γ)小鼠中(Agliano，A.等(2008)“與其他NOD/Scid相關菌株相比，NOD/Ltsz-Scid/IL-2Rγ Null小鼠中注入的人急性白血病細胞產生更快速和更高效的疾病(Human Acute Leukemia Cells Injected In NOD/Ltsz-Scid/IL-2Rgamma Null Mice Generate A Faster And More Efficient Disease Compared To Other NOD/Scid-Related Strains)”Int.J.Cancer 123(9)：2222-2227；Sanchez,P.V.等(2009)“急性髓系白血病的剛健的異源移植模型(A Robust Xenotransplantation Model For Acute Myeloid Leukemia)”Leukemia 23(11)：2109-2117；Racki,W.J.等(2010)“人皮膚移植和同種異體移植排斥的NOD-Scid IL2r γ(Null)小鼠模型(NOD-Scid IL2rgamma(Null)Mouse Model Of Human Skin Transplantation And Allograft Rejection)”Transplantation 89(5)：527-536；Choi,B.等(2011)“白消安條件化的人源化NOD/SCID/IL-2Rγ(Null)(NSG)小鼠中的人B細胞發育和抗體產生(Human B Cell Development And Antibody Production In Humanized NOD/SCID/IL-2Rγ(Null)(NSG)Mice Conditioned By Busulfan)”J.Clin.Immunol.31(2)：253-264；Sartelet，H.等(2012)“使用NOD/SCID/I12rg Null(NSG)小鼠轉移的成神經細胞瘤的新異種移植模型的描述(Description Of A New Xenograft Model Of Metastatic Neuroblastoma Using NOD/SCID/I12rg Null(NSG)Mice)”In Vivo 26(1)：19-29；Spranger,S.等(2012)“NOD/scid IL-2Rg(null)小鼠：評估基於人樹突細胞疫苗體內策略的臨床前模型系統(NOD/scid IL-2Rg(null)Mice：A Preclinical Model System To Evaluate Human Dendritic Cell-Based Vaccine Strategies in vivo)”J.Transl.Med.10：30；von Bonin,M.等(2013)“共移植的T細胞的體內擴展對腫瘤再啟動NSG小鼠中人急性髓系白血病活性的影響(in vivoExpansion Of Co-Transplanted T Cells Impacts On Tumor Re-Initiating Activity Of Human Acute Myeloid Leukemia In NSG Mice)”PLoS One.8(4)：e60680)。
在植入開始時，每天一次將gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體DART-1 IV施用至小鼠，共4天(QDx4)。發現在接收媒介對照的小鼠中Colo205腫瘤體積增加(圖8)。但是，發現接收DART-1的動物表現較低或沒有Colo205腫瘤體積(圖8)。
植入Colo205細胞的NSG小鼠的成像顯示接收媒介(圖9A)或gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體DART-1(圖9B)的小鼠在處理第2天具有明顯的腫瘤。但是，接收gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體DART-1的小鼠在處理第12天具有顯著降低的腫瘤體積(圖9D)。在處理的第12天，接收媒介的小鼠顯示增加的腫瘤體積(圖9C)。
作為根據本發明的gpA33 x CD3雙抗體提供癌症治療的體內能力的進一步證據，使用ASPC-1胰腺腫瘤細胞和活化的人T細胞(E：T=1：1)進行上述腫瘤模型。植入開始時每天一次IV施用gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體DART-1、對照雙特異性單價雙抗體(對照DART)、或媒介，共9 天(QDx9)。發現接收媒介對照的小鼠中ASPC-1腫瘤體積增加(圖10)。但是，發現接收DART-1的動物以劑量依賴性方式展示更低的腫瘤體積(圖10)。
XII.範例8
具有IgG Fc結構域形式1的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-2 w/Fc形式1)的效力測定
為了測定具有IgG Fc結構域形式1的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-2 w/Fc形式1)的效力，用各種劑量水準的上述DART-2 w/Fc形式1輸注(使用滲透泵)小鼠共7天。泵植入後48h(即，在存在穩態迴圈水準的DART-2 w/Fc形式1的情況下)，將Colo205腫瘤細胞和T細胞的混合物皮下植入至小鼠中，並且監測腫瘤生長的程度。表6總結了研究的設計方案；每個組包含8只雌性小鼠.
此研究的結果顯示在圖11中，並且指示以所有測試的劑量施用上述具有IgG Fc結構域的gpA33 xCD3雙特異性單價雙抗體(DART-2 w/Fc形式1)介導腫瘤體積急劇下降。
鑒於上面研究中獲得的腫瘤體積的急劇下降，進行進一步的研究，以評估在更低劑量下的效力。表7總結了此進一步研究的設計方案；每組包含8只雌性小鼠。
進一步研究的結果顯示在圖12中。在圖12中，每個符號表示接收指示劑量的上述具有IgG Fc結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-2 w/Fc形式1)或媒介的動物。資料顯示在所有測試劑量下的效力。
XIII.範例9
gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-2)和具有IgG Fc結 構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-2 w/Fc)在食蟹猴中的藥物代謝動力學曲線
根據本發明的雙抗體的VLCD3和VHCD3結構域結合食蟹猴CD3的能力允許使用這種動物測量本發明的雙抗體的體內藥物動力學。
為了測量這種藥物動力學，將上述gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-2)或具有IgG Fc結構域的gpA33 x CD3雙特異性單價雙抗體(DART-2 w/Fc形式1)注入食蟹猴(10μg/kg/天)並且監測在迴圈中保留的這樣的分子的濃度。圖13顯示此研究的結果，並且指示DART-2和DART-2w/Fc形式1展示第一級(first-order)消除動力學。
XIV.範例10
gpA33 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體(DART-1 w/Fc形式1)結合人和食蟹猴CD3和gpA33的SPR分析
通過SPR在BIAcore 3000生物感測器(GE，Healthcare)上分析結合可溶性形式人和食蟹猴CD3受體的gpA33 x CD3雙特異性Fc雙抗體(DART-2 w/Fc形式1)。根據製造商推薦的程式，將受體固定在CM5感測器晶片上。簡言之，通過注射包含0.2M N-乙基-N-(3二乙氨基-丙基)碳二亞胺和0.05M N-羥基-琥珀醯亞胺的溶液活化感測器晶片表面上的羧基基團。然後將可溶性CD3受體(1μg/ml)注射到在10mM鈉-乙酸酯，pH 5.0中的活化的CM5表面上，流速為5μL/min，隨後注射1M乙醇胺用於鈍化。
此分析中採用的可溶性形式的食蟹猴和人CD3在哺乳動物的細胞中表現為CD3ε/CD3δ異源二聚物，通過它們的C-末端帶相反電荷的促進異源二聚物的E-螺旋和K-螺旋序列而得到穩定。可溶性食蟹猴CD3ε包 含食蟹猴CD3ε的前118個氨基酸殘基，在羧基末端是V35等位基因(FN18+)，然後是上述E-螺旋結構域(SEQ ID NO：3)。食蟹猴CD3ε的V35等位基因(FN18+)的氨基酸序列是SEQ ID NO：49：
Figure TWI675845B_D0047
可溶性食蟹猴CD3δ包含食蟹猴CD3δ的前101個氨基酸殘基，隨後是在羧基末端的上述K-螺旋結構域(SEQ ID NO：4)。食蟹猴CD3δ的氨基酸序列是SEQ ID NO：50：
Figure TWI675845B_D0048
兩個蛋白質在哺乳類的CHO-S細胞中共表現並且使用偶合至SEPHAROSE®的抗E/K-螺旋mAb純化。
可溶性人CD3ε包含具有C119S和C122S的人CD3ε的殘基1-127，隨後是在羧基末端的上述E-螺旋結構域(SEQ ID NO：3)。人CD3ε的氨基酸序列是SEQ ID NO：51：
Figure TWI675845B_D0049
Figure TWI675845B_D0050
可溶性人CD3δ包含人CD3δ的殘基1-101，隨後是在羧基末端的上述K-螺旋結構域(SEQ ID NO：4)。兩個蛋白質在哺乳動物的CHO-S細胞中共表現並且使用抗E/K-螺旋親和柱純化。人CD3δ的氨基酸序列是SEQ ID NO：52：
Figure TWI675845B_D0051
可溶性人gpA33包含在羧基末端具有(SEQ ID NO：53)HHHHHH(“6His”)重複序列的人gpA33的殘基1-235。可溶性食蟹猴gpA33包含食蟹猴gpA33的殘基1-314，Met 1至Gln 314，其中在羧基末端具有6個His重複序列。蛋白質在哺乳動物CHO-S細胞中表現並且使用Ni SEPHAROSE®純化。
在包含10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA和0.005% P20表面活性劑的HBS-EP緩衝液中進行結合實驗。以0、6.25、12.5、25、50和100nM的濃度分析DART-2 w/Fc形式1的結合(重複一次)，以30μL/min的流速注射120sec。
通過脈衝注射10mM甘氨酸，pH 1.5，進行固定的受體表面 的再生。通過在沒有固定蛋白的處理表面上注射每種DART-2 w/Fc的稀釋物獲得參考曲線。作為空白減去在零濃度的結合曲線。通過將結合曲線整體擬合至Langmuir 1：1結合模型測定KD值(BIA評估TM(BIAevaluationTM)軟體v4.1)。
結合人和食蟹猴CD3和gpA33的gpA33 x CD3雙特異性Fc雙抗體(DART-2 w/Fc形式1)的SPR分析表明來自兩個不同物種的分子的基本上的相似性(圖14A-14B；圖15A-15B)。表8提供平衡解離常數(KDs)，其通過將DART-2 w/Fc相互作用的親和性和動力學常數整體擬合至1：1 Langmuir模型來計算。人和食蟹猴CD3的DART-2 w/Fc形式1的KD值在23和26nM分別幾乎一致，儘管在兩個抗原之間最大結合回應方面存在一些差異。直接固定在表面上的、具有不同氨基酸序列的抗原的隨機定向可導致表面上可用結合位元點的不同密度。DART-2 w/Fc形式1與人和猴子gpA33的相互作用的KD值分別是2.2nM和12nM(表8)。親和性的差異是DART-2 w/Fc形式1與食蟹猴gpA33相互作用的結合速率常數的相對小的下降和解離速率常數的增加的結果(表8)。資料是三個獨立實驗，每個實驗重複一次，的平均值(SD=標準差；h，人；cyno，食蟹猴).
本說明書提到的所有出版物和專利通過參考併入本文，如同好像具體和單獨指出每個單個出版物或專利申請通過參考以其整體併入的程度。儘管已經結合其具體實施方式描述了本發明，但是應當理解，其能夠被進一步修飾並且本申請旨在覆蓋根據本發明原理的本發明的任何變型、用途或改變，並且包括與本公開的偏離，只要在本發明所屬領域的已知或習慣實踐內並且如可應用至本文之前所闡釋的本質特徵。
<110> 宏觀基因股份有限公司
<120> 能夠結合gpA33和CD3的雙特異性單價雙抗體及其用途
<130> 1301.0112PCT
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<150> US 61/907,691
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<160> 57
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體1多肽
<400> 1
Figure TWI675845B_D0053
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體2多肽
<400> 2
Figure TWI675845B_D0054
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E-螺旋結構域
<400> 3
Figure TWI675845B_D0055
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K-螺旋結構域
<400> 4
Figure TWI675845B_D0056
<210> 5
<211> 110
<212> PRT
<213> 小白鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> 鼠抗-CD3抗體的輕鏈可變結構域
<400> 5
Figure TWI675845B_D0057
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> 鼠抗-CD3抗體的輕鏈可變結構域的CDR1
<400> 6
Figure TWI675845B_D0058
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 鼠抗-CD3抗體的輕鏈可變結構域的CDR2
<400> 7
Figure TWI675845B_D0059
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> 鼠抗-CD3抗體的輕鏈可變結構域的CDR3
<400> 8
Figure TWI675845B_D0060
<210> 9
<211> 125
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(125)
<223> 鼠抗-CD3抗體的重鏈可變結構域
<400> 9
Figure TWI675845B_D0061
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 鼠抗-CD3抗體的重鏈可變結構域的CDR1
<400> 10
Figure TWI675845B_D0062
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> 鼠抗-CD3抗體的重鏈可變結構域的CDR2
<400> 11
Figure TWI675845B_D0063
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> 鼠抗-CD3抗體的重鏈可變結構域的CDR3
<400> 12
Figure TWI675845B_D0064
<210> 13
<211> 106
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 鼠抗-gpA33抗體的輕鏈可變結構域
<400> 13
Figure TWI675845B_D0065
Figure TWI675845B_D0066
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> 的CDR1鼠抗-gpA33抗體的輕鏈可變結構域
<400> 14
Figure TWI675845B_D0067
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> 鼠抗-gpA33抗體的輕鏈可變結構域的CDR2
<400> 15
Figure TWI675845B_D0068
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> 鼠抗-gpA33抗體的輕鏈可變結構域的CDR3
<400> 16
Figure TWI675845B_D0069
<210> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(119)
<223> 鼠抗-gpA33抗體的重鏈可變結構域
<400> 17
Figure TWI675845B_D0070
Figure TWI675845B_D0071
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 鼠抗-gpA33抗體的重鏈可變結構域的CDR1
<400> 18
Figure TWI675845B_D0072
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 鼠抗-gpA33抗體的重鏈可變結構域的CDR2
<400> 19
Figure TWI675845B_D0073
Figure TWI675845B_D0074
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 鼠抗-gpA33抗體的重鏈可變結構域的CDR3
<400> 20
Figure TWI675845B_D0075
<210> 21
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART-1的第一多肽鏈
<400> 21
Figure TWI675845B_D0076
Figure TWI675845B_D0077
Figure TWI675845B_D0078
<210> 22
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼DART-1的第一多肽鏈的核酸分子
<400> 22
Figure TWI675845B_D0079
Figure TWI675845B_D0080
<210> 23
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART-1的第二多肽鏈
<400> 23
Figure TWI675845B_D0081
Figure TWI675845B_D0082
<210> 24
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼DART-1的第二多肽鏈的核酸分子
<400> 24
Figure TWI675845B_D0083
<210> 25
<211> 125
<212> PRT
<213> 小白鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(125)
<223> 抗-CD3抗體的重鏈可變結構域
<400> 25
Figure TWI675845B_D0084
<210> 26
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-gpA33抗體的輕鏈可變結構域
<400> 26
Figure TWI675845B_D0085
<210> 27
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-gpA33抗體的重鏈可變結構域
<400> 27
Figure TWI675845B_D0086
Figure TWI675845B_D0087
<210> 28
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART-2的第一多肽鏈
<400> 28
Figure TWI675845B_D0088
Figure TWI675845B_D0089
Figure TWI675845B_D0090
<210> 29
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼DART-2的第一多肽鏈的核酸分子
<400> 29
Figure TWI675845B_D0091
Figure TWI675845B_D0092
<210> 30
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART-2的第二多肽鏈
<400> 30
Figure TWI675845B_D0093
Figure TWI675845B_D0094
Figure TWI675845B_D0095
<210> 31
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼DART-2的第二多肽鏈的核酸分子
<400> 31
Figure TWI675845B_D0096
Figure TWI675845B_D0097
<210> 32
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體3多肽
<400> 32
Figure TWI675845B_D0098
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體3多肽
<400> 33
Figure TWI675845B_D0099
<210> 34
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白結合結構域
<400> 34
Figure TWI675845B_D0100
Figure TWI675845B_D0101
<210> 35
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART-2 w/ABD的第一多肽鏈
<400> 35
Figure TWI675845B_D0102
Figure TWI675845B_D0103
Figure TWI675845B_D0104
<210> 36
<211> 963
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼DART-2 w/ABD的第一多肽鏈的核酸分子
<400> 36
Figure TWI675845B_D0105
Figure TWI675845B_D0106
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體4多肽
<400> 37
Figure TWI675845B_D0107
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體4多肽
<400> 38
Figure TWI675845B_D0108
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽1
<400> 39
Figure TWI675845B_D0109
<210> 40
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一DART多肽鏈的修飾的Fc結構域的CH2和CH3結構域
<400> 40
Figure TWI675845B_D0110
Figure TWI675845B_D0111
<210> 41
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第三DART多肽鏈的修飾的Fc結構域的CH2和CH3結構域
<400> 41
Figure TWI675845B_D0112
Figure TWI675845B_D0113
<210> 42
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART-2 w/Fc形式1構建體的第一多肽鏈
<400> 42
Figure TWI675845B_D0114
Figure TWI675845B_D0115
Figure TWI675845B_D0116
Figure TWI675845B_D0117
<210> 43
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼DART-2 w/Fc形式1構建體的第一多肽鏈的核酸分子
<400> 43
Figure TWI675845B_D0118
Figure TWI675845B_D0119
<210> 44
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART-2 w/Fc形式1構建體的第二多肽鏈
<400> 44
Figure TWI675845B_D0120
Figure TWI675845B_D0121
<210> 45
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼DART-2 w/Fc形式1構建體的第二多肽鏈的核酸分子
<400> 45
Figure TWI675845B_D0122
Figure TWI675845B_D0123
<210> 46
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART-2 w/Fc形式1構建體的第三多肽鏈
<400> 46
Figure TWI675845B_D0124
Figure TWI675845B_D0125
Figure TWI675845B_D0126
<210> 47
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼DART-2 w/Fc形式1構建體的第三多肽鏈的核酸分子
<400> 47
Figure TWI675845B_D0127
<210> 48
<211> 508
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART-2 w/Fc形式2構建體的第一多肽鏈
<400> 48
Figure TWI675845B_D0128
Figure TWI675845B_D0129
Figure TWI675845B_D0130
<210> 49
<211> 198
<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(198)
<223> CD3 ε的V35等位基因(FN18+)
<400> 49
Figure TWI675845B_D0131
Figure TWI675845B_D0132
<210> 50
<211> 171
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(171)
<223> CD3 δ
<400> 50
Figure TWI675845B_D0133
Figure TWI675845B_D0134
<210> 51
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(207)
<223> CD3 ε
<400> 51
Figure TWI675845B_D0135
Figure TWI675845B_D0136
<210> 52
<211> 150
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(150)
<223> CD3 δ
<400> 52
Figure TWI675845B_D0137
Figure TWI675845B_D0138
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6His肽
<400> 53
Figure TWI675845B_D0139
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 異源二聚化結構域
<400> 54
Figure TWI675845B_D0140
Figure TWI675845B_D0141
<210> 55
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 異源二聚化結構域
<400> 55
Figure TWI675845B_D0142
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 異源二聚化結構域
<400> 56
Figure TWI675845B_D0143
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 異源二聚化結構域
<400> 57
Figure TWI675845B_D0144

Claims (19)

  1. 一種雙特異性雙抗體，其中該雙特異性雙抗體具有特異性結合gpA33的抗原決定部位和結合CD3的抗原決定部位的能力，其中該雙特異性雙抗體包括第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈和該第二多肽鏈彼此共價結合，和其中：A.該第一多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括：i.結構域1，包括亞結構域1A和亞結構域1B，該亞結構域1A包括具有結合CD3的能力之單克隆抗體的VL結構域VLCD3，其中該VLCD3具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列；該亞結構域1B包括具有結合gpA33的能力之單克隆抗體的VH結構域VHgpA33，其中該VHgpA33具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列；其中該亞結構域1A和該亞結構域1B彼此通過具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽連接體分開；ii.結構域2，其中該結構域2是具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的K-螺旋結構域或具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的E-螺旋結構域，其中該結構域2和該結構域1通過具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的肽連接體分開；B.該第二多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括：i.結構域1，包括亞結構域1A和亞結構域1B，該第二多肽鏈的該亞結構域1A包括具有結合gpA33的能力之單克隆抗體的VL結構域VLgpA33，其中該VLgpA33具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列，該第二多肽鏈的該亞結構域1B包括具有結合CD3的能力之單克隆抗體的VH結構域VHCD3，其中該VHCD3具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列，其中該第二多肽鏈的該亞結構域1A和該第二多肽鏈的該亞結構域1B彼此通過具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽連接體分開；ii.結構域2，其中該第二多肽鏈的該結構域2是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的E-螺旋結構域或具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的K-螺旋結構域，其中該第二多肽鏈的該結構域2和該第二多肽鏈的該結構域1通過具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的肽連接體分開；和其中該第一多肽鏈的該結構域2和該第二多肽鏈的該結構域2不都是E-螺旋結構域或不都是K-螺旋結構域；和其中：(a)該第一多肽鏈的該VL結構域和該第二多肽鏈的該VH結構域形成具有特異性結合CD3的抗原決定部位的能力之單價抗原結合結構域；和(b)該第一多肽鏈的該VH結構域和該第二多肽鏈的該VL結構域形成具有特異性結合gpA33的抗原決定部位的能力之單價抗原結合結構域。
  2. 如請求項1所述的雙特異性雙抗體，其中該第一多肽鏈包括具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的白蛋白結合結構域，該白蛋白結合結構域被佈置在該第一多肽鏈的該結構域2的C-末端，並且通過具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的連接體3與該第一多肽鏈的該結構域2分開。
  3. 一種雙特異性Fc雙抗體，其中該雙特異性Fc雙抗體具有特異性結合gpA33的抗原決定部位和結合CD33的抗原決定部位的能力，並且具有IgG Fc結構域，其中該雙特異性Fc雙抗體包括第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈，其中該第一多肽鏈和該第二多肽鏈彼此共價結合和該第一多肽鏈和該第三多肽鏈彼此共價結合，和其中：A.該第一多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括：i.結構域1，包括亞結構域1A和亞結構域1B，該亞結構域1A包括具有結合gpA33的能力之單克隆抗體的VL結構域VLgpA33，其中該VLgpA33具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列，該亞結構域1B包括具有結合CD3的能力之單克隆抗體的VH結構域VHCD3，其中該VHCD3具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列，其中該亞結構域1A和該亞結構域1B彼此通過具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽連接體分開；ii.結構域2，其中該結構域2是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的E-螺旋結構域或具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的K-螺旋結構域，其中該結構域2和該結構域1通過具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的肽連接體分開；和iii.結構域3，包括亞結構域3A和亞結構域3B，該亞結構域3A包括含半胱氨酸的肽1，該含半胱氨酸的肽1具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列，該亞結構域3B包括具有IgG免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域的IgG Fc結構域的多肽部分；其中該結構域3和該結構域2彼此通過具有序列GGG的間隔肽連接體5分開；B.該第二多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括：i.結構域1，包括亞結構域1A和亞結構域1B，該第二多肽鏈的該亞結構域1A包括具有結合CD3的能力之單克隆抗體的VL結構域VLCD3，該VLCD3具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，該第二多肽鏈的該亞結構域1B包括具有結合gpA33的能力之單克隆抗體的VH結構域VHgpA33，該VHgpA33具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列；其中該第二多肽鏈的該亞結構域1A和該第二多肽鏈的該亞結構域1B彼此通過具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽連接體分開；ii.結構域2，其中該第二多肽鏈的該結構域2是具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的K-螺旋結構域或具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的E-螺旋結構域，其中該第二多肽鏈的該結構域2和該第二多肽鏈的該結構域1通過具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的肽連接體分開；和其中該第一多肽鏈的該結構域2和該第二多肽鏈的該結構域2不都是E-螺旋結構域或不都是K-螺旋結構域；和C.第三多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括結構域3，包括：(1)亞結構域3A，其包括含半胱氨酸的肽1，該含半胱氨酸的肽1具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列；和(2)亞結構域3B，其包括具有IgG免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域的IgG Fc結構域的多肽部分；和其中：(a)該第一多肽鏈該IgG Fc結構域的該多肽部分和該第三多肽鏈的該IgG Fc結構域的該多肽部分形成該IgG Fc結構域；(b)該第一多肽鏈的該VL結構域和該第二多肽鏈的該VH結構域形成具有特異性結合gpA33的抗原決定部位的能力之單價抗原結合結構域；和(c)該第一多肽鏈的該VH結構域和該第二多肽鏈的該VL結構域形成具有特異性結合CD3的抗原決定部位的能力之單價抗原結合結構域。
  4. 一種雙特異性Fc雙抗體，其中該雙特異性Fc雙抗體具有特異性結合gpA33的抗原決定部位和結合CD3的抗原決定部位的能力，並且具有IgG Fc結構域，其中該雙特異性Fc雙抗體包括第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈，其中該第一多肽鏈和該第二多肽鏈彼此共價結合和該第一多肽鏈和該第三多肽鏈彼此共價結合，和其中：A.該第一多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括：i.結構域3，包括亞結構域3A和亞結構域3B，該亞結構域3A包括含半胱氨酸的肽1，該含半胱氨酸的肽1具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列，該亞結構域3B包括具有IgG免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域的IgG Fc結構域的多肽部分；ii.結構域1，包括亞結構域1A和亞結構域1B，該亞結構域1A包括具有結合gpA33的能力之單克隆抗體的VL結構域VLgpA33，該VLgpA33具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列，該亞結構域1B包括具有結合CD3的能力之單克隆抗體的VH結構域VHCD3，該VHCD3具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列，其中該亞結構域1A和該亞結構域1B通過具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽連接體彼此分開；其中，該結構域1和該結構域3彼此通過具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的間隔肽連接體4分開；iii.結構域2，其中該結構域2是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的E-螺旋結構域或具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的K-螺旋結構域，其中該結構域2和該結構域1通過具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的肽連接體分開；和B.該第二多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括：i.結構域1，包括亞結構域1A和亞結構域1B，該第二多肽鏈的該亞結構域1A包括具有結合CD3的能力之單克隆抗體的VL結構域VLCD3，該VLCD3具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列；該第二多肽鏈的該亞結構域1B包括具有結合gpA33的能力之單克隆抗體的VH結構域VHgpA33，該VHgpA33具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列；其中該第二多肽鏈的該亞結構域1A和該第二多肽鏈的該亞結構域1B彼此通過具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽連接體分開；ii.結構域2，其中該第二多肽鏈的該結構域2是具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的K-螺旋結構域或具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的E-螺旋結構域，其中該第二多肽鏈的該結構域2和該第二多肽鏈的該結構域1通過具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的肽連接體分開；和其中該第一多肽鏈的該結構域2和該第二多肽鏈的該結構域2不都是E-螺旋結構域或不都是K-螺旋結構域；和C.該第三多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括結構域3，其包括：(1)亞結構域3A，包括含半胱氨酸的肽1，該含半胱氨酸的肽1具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列；和(2)亞結構域3B，包括具有IgG免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域的IgG Fc結構域的多肽部分；和其中：(a)該第一多肽鏈的該IgG Fc結構域的該多肽部分和該第三多肽鏈的該IgG Fc結構域的該多肽部分形成該IgG Fc結構域；(b)該第一多肽鏈的該VL結構域和該第二多肽鏈的該VH結構域形成具有特異性結合gpA33的抗原決定部位的能力之單價抗原結合結構域；和(c)該第一多肽鏈的該VH結構域和該第二多肽鏈的該VL結構域形成具有特異性結合CD3的抗原決定部位的能力之單價抗原結合結構域。
  5. 如請求項3-4中之任一項所述的雙特異性Fc雙抗體，其中該第一多肽鏈的該亞結構域3B包括與該第三多肽鏈的該亞結構域3B不同的序列。
  6. 如請求項5所述的雙特異性Fc雙抗體，其中該第一多肽鏈的該亞結構域3B包含氨基酸序列SEQ ID NO：40，和該第三多肽鏈的該亞結構域3B包含氨基酸序列SEQ ID NO：41。
  7. 如請求項5所述的雙特異性Fc雙抗體，其中該第一多肽鏈的該亞結構域3B包含氨基酸序列SEQ ID NO：41，和該第三多肽鏈的該亞結構域3B包含氨基酸序列SEQ ID NO：40。
  8. 如請求項3-4中之任一項所述的雙特異性Fc雙抗體，其中該第一多肽鏈的該結構域3和/或該第三多肽鏈的該結構域3包括變體CH2-CH3序列，該變體CH2-CH3序列顯示與Fcγ受體改變的結合。
  9. 如請求項1-2中之任一項所述的雙特異性雙抗體或如請求項3-8中之任一項所述的雙特異性Fc雙抗體，其中該第一多肽鏈的該結構域2包括具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的E-螺旋，和該第二多肽鏈的該結構域2包括具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的K-螺旋。
  10. 如請求項1-2中之任一項所述的雙特異性雙抗體或如請求項3-8中之任一項所述的雙特異性Fc雙抗體，其中該第一多肽鏈的該結構域2包括具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的K-螺旋，和該第二多肽鏈的該結構域2包括具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的E-螺旋。
  11. 一種雙特異性雙抗體，其中該雙特異性雙抗體具有特異性結合CD3的抗原決定部位和結合gpA33的抗原決定部位的能力，其中該雙特異性雙抗體包括：(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO：28的第一多肽鏈，和包含氨基酸序列SEQ ID NO：30的第二多肽鏈；或(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：35的第一多肽鏈，和包含氨基酸序列SEQ ID NO：30的第二多肽鏈；其中，該第一多肽鏈和該第二多肽鏈通過二硫鍵彼此共價結合。
  12. 一種雙特異性Fc雙抗體，其中該雙特異性Fc雙抗體具有特異性結合CD3的抗原決定部位和結合gpA33的抗原決定部位的能力，並且具有IgG Fc結構域，其中該雙特異性Fc雙抗體包括：(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO：42的第一多肽鏈、包含氨基酸序列SEQ ID NO：44的第二多肽鏈，和包含氨基酸序列SEQ ID NO：46的第三多肽鏈；或(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：48的第一多肽鏈、包含氨基酸序列SEQ ID NO：28的第二多肽鏈，和包含氨基酸序列SEQ ID NO：46的第三多肽鏈；其中，該第一多肽鏈和該第二多肽鏈通過第一二硫鍵彼此共價結合，和該第一多肽鏈和該第三多肽鏈通過第二二硫鍵彼此共價結合。
  13. 一種藥學組合物，包括如請求項1-2或9-11中之任一項所述的雙特異性雙抗體或根據請求項3-8或12中之任一項所述的雙特異性Fc雙抗體；和生理學上可接受的載體。
  14. 如請求項13所述的藥學組合物在製備用於治療以gpA33表現為特徵的癌症的藥物中的用途。
  15. 如請求項14所述的用途，其中該癌症是結直腸癌、結腸癌、胃癌或胰腺癌。
  16. 如請求項1-2或9-11中之任一項所述的雙特異性雙抗體或根據請求項3-8或12中之任一項所述的雙特異性Fc雙抗體在製備用於治療以gpA33表現為特徵的癌症的藥物中的用途。
  17. 如請求項16所述的用途，其中該癌症是結直腸癌、結腸癌、胃癌或胰腺癌。
  18. 一種細胞在製備用於治療以gpA33表現為特徵的癌症的藥物中的用途，其中該細胞表現如請求項1-2或9-11中之任一項所述的任一雙特異性雙抗體的或如請求項3-8或12中之任一項所述的任一雙特異性Fc雙抗體的所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈。
  19. 一種多核苷酸，該多核苷酸編碼如請求項1-2或9-11中之任一項所述的雙特異性雙抗體的所述第一多肽鏈或所述第二多肽鏈、或如請求項3-10或12中之任一項所述的雙特異性Fc雙抗體的所述第一多肽鏈或所述第二多肽鏈。
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