NO881077L - Kjemo-radio-immuno-konjugater. - Google Patents

Kjemo-radio-immuno-konjugater.

Info

Publication number
NO881077L
NO881077L NO881077A NO881077A NO881077L NO 881077 L NO881077 L NO 881077L NO 881077 A NO881077 A NO 881077A NO 881077 A NO881077 A NO 881077A NO 881077 L NO881077 L NO 881077L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
conjugate
antibody
agent
radionuclide
group
Prior art date
Application number
NO881077A
Other languages
English (en)
Other versions
NO881077D0 (no
Inventor
Joseph A Sinkule
Donald J Buchsbaum
Original Assignee
Univ Michigan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Michigan filed Critical Univ Michigan
Publication of NO881077D0 publication Critical patent/NO881077D0/no
Publication of NO881077L publication Critical patent/NO881077L/no

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04Organic compounds
    • A61K51/08Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04Organic compounds
    • A61K51/08Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A61K51/1096Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies radioimmunotoxins, i.e. conjugates being structurally as defined in A61K51/1093, and including a radioactive nucleus for use in radiotherapeutic applications
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00Preparations for use in therapy
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00Preparations for testing in vivo

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår antistoff-konjugater egnet ved diagnose og behandling av kreft, AIDS eller andre syk-dommer. Mer spesielt angår den foreliggende oppfinnelse et konjugat av et kjemoterapeutisk middel, en radionuklide og et antistoff som kan anvendes til kontroll av konjugatets farmakokine-tikk in vivo og med hensyn til terapeutisk virkning.
Anvendelsen av radionuklider og kjemiske terapeutiske midler med cytotoksisk virkning har lenge vært kjent når det gjelder behandling av tumorer og andre patologiske tilstander. I
den seneste tid er antistoffer også blitt anvendt mot mange forskjellige mål-antigener, innbefattende tumorceller. Monoklonale antistoffer gir spesielt en høy grad av spesifisitet som gjør ødeleggelsen av kreftceller lettere mens skaden på normale celler minimaliseres.
Kombinasjonen av antistoffer og radionuklider er beskrevet innenfor patentlitteraturen. US-patent nr. 4 472 509 fra 18. september 1984 tilhørende Gansow et al. beskriver metailchelat-konjugerte monoklonale antistoffer. Det chelaterte metall kan være et metall som sender ut alfa-, beta- eller gammastråler eller positroner, og konjugatene er beskrevet å være egnet for diagnostiske og terapeutiske anvendelser. US-patent nr.
4 430 318 fra 7. februar 1984 tilhørende Langone angår en fremgangsmåte for fremstilling av<125>I-merket protein A med høy spesifikk og funksjonell aktivitet. Andre patenter som beskriver radiomerkede antistoffer, innbefatter US-patent nr. 4 331 647 - 25. mai 1982, 4 348 376 - 7. september 1982, 4 361 544 - 30. november 1982, 4 444 744 - 24. april 1984, 4 460 559 - 17. juli 1984 og 4 460 561 - 17. juli 1984; alle tilhørende Goldenberg. Ytterligere radiomerkede antistoffer er beskrevet i US-patent
nr. 4 311 688 fra 19. januar 1982 tilhørende Burchiel et al. og 3 927 193 fra 16. desember 1975 tilhørende Hansen et al.
Komplekser av radionuklider og visse cytotoksiske kjemiske midler er også kjent innenfor patentlitteraturen. US-patent nr.
4 620 971 fra 4. november 1986 tilhørende Hou beskriver et indium-bleamycin-kompleks for klinisk anvendelse som et radio-farmasøytisk middel. US-patent nr. 4 485 086 fra 27. november 1984 tilhørende Wong beskriver en fremgangsmåte for radiomerking av porfyrinforbindelser med m-In og H3mIn. Beskrivelsen av alle de ovennevnte patenter er spesifikt medtatt i det foreliggende som referanse.
Til tross for de ovennevnte fremskritt er det et behov for terapeutiske midler som oppviser større selektivitet eller spesifisitet når det gjelder ødeleggelse av maligne celler, mens skaden på normale vev minimaliseres. Det er også et behov for forbedrede terapeutiske midler som er virkningsfulle overfor celler som har utviklet bestrålings-resistens men ikke kjemote-rapi-resistens, og overfor celler som har utviklet kjemoterapi-resistens men ikke bestrålings-resistens.
Det er nå funnet at et kompleks eller konjugat av et antistoff, en radionuklide og et kjemoterapeutisk middel med forbedret terapeutisk virkningsfullhet kan fremstilles. Ifølge den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt et kjemo-radio-immuno-konjugat. Den radioaktive komponent anvendes til forsterkning av den terapeutiske virkning av det kjemoterapeutiske middel i konjugatet, skjønt den i noen tilfeller også kan anvendes til å kontrollere fordelingen av konjugatet in vivo. Ytterligere forståelse av denne oppfinnelse vil fås ved den følgende beskrivelse.
Et kjemo-radio-immuno-konjugat ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter et konjugat av et kjemoterapeutisk middel, en radionuklide og et antistoff. Det kjemoterapeutiske middel er fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av antitumor-antistoffer, porfyrin og beslektede forbindelser, "vinca"-alkaloider, antitumor-alkyleringsmidler og folinsyre-analoger ("anti-fols"), og antistoffet er fortrinnsvis monoklonalt. For maksimalisering av den terapeutiske virkning av konjugatet er radionuklidet fortrinnsvis en beta- eller alfa-utstråler.
Den foreliggende oppfinnelse angår generelt et kjemo-radio-immuno-konjugat. "Kjemo"-komponenten er et kjemoterapeutisk middel. Med betegnelsen kjemoterapeutisk middel menes et kjemoterapeutisk middel med lav molekylvekt, d.v.s. mindre enn 10.000, klinisk egnet mot faste ("solid") tumorer, leukemier, virusinfeksjoner eller mange forskjellige maligniteter og patologiske tilstander. Det kjemoterapeutiske middel ifølge den foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av antitumor-antibiotika, porfyrin og beslektede for bindelser, "vinca<ll->alkaloider, antitumor-alkyleringsmidler og "anti-fols". Mer foretrukket er det kjemoterapeutiske middel valgt fra gruppen bestående av daunorubicin, doksorubicin, metotreksat, aminopterin, vinblastin, vindesin, bleomycin, blenoksan, hematoporfyrin-derivat, dihematoporfyrineter, milamycin, mitramycin og klorambucil. Disse og andre egnede kjemoterapeutiske midler er velkjent på området og er i alminnelig klinisk anvendelse og kommersielt tilgjengelige.
Ved alternative utførelsesformer av oppfinnelsen kan andre terapeutiske midler festes til et antistoff, og en radionuklide bindes til dette under dannelse av terapeutisk-middel-radio-immuno-konjugater. Det terapeutiske middel som velges for anvendelse, vil variere i henhold til beskaffenheten av den syk-dom som skal behandles, f.eks. den type målceller som skal utryddes in vivo. Eksempler på terapeutiske midler som kan anvendes (i tillegg til de ovenfor beskrevne kjemoterapeutiske legemidler) er blant annet biologisk-respons-modifiseringsmidler, toksiner og fragmenter derav. Forskjellige konjugater omfattende et antistoff, minst ett terapeutisk middel og minst én radionuklide er tilveiebrakt ved den foreliggende oppfinnelse.
Eksempler på biologisk-respons-modifiseringsmidler (BRM'er) er interferoner (alfa, beta og gamma), tumornekrosefaktor, lymfotoksin og interleukiner (IL-1, -2, -3, -4, -5 og -6). Eksempler på toksiner som kan anvendes, er ricin, abrin, difte-ritoksin, Pseudomonas-eksotoksin A, ribosomal-inaktiverende proteiner og mycotoksiner; f.eks. trichotekener. Trichotekener er arter av mycotoksiner dannet av jordsopp ("soil fungi") av klas-sen fungi imperfecti eller isolert fra Baccharus megapotamica (J.R. Bamburg, Proe, Molec. Subcell Bio 8:41-110, 1983; Jarvis & Mazzola, Acc. Chem. Res. 15:338-395, 1982).
Terapeutisk effektive modifiserte toksiner eller biologisk-respons-modif iseringsmidler eller fragmenter derav, såsom slike som er dannet ved gen- eller protein-teknologi, kan anvendes. Hybrider fremstilt ved at man knytter sammen to eller flere toksiner eller to eller flere BRM'er, eller fragmenter derav, kan også anvendes.
Radionuklider, "radio"-komponenten, som kan anvendes ved
den foreliggende oppfinnelse, kan være hvilken som helst radio-
nuklide egnet for terapeutisk anvendelse. Radionuklider innbefatter gamma-utstrålere, positron-utstrålere, røntgen-utstrålere eller fluorescens-utstrålere, men for terapeutisk anvendelse foretrekkes beta- eller alfa-utstrålere. Det kan selvfølgelig være ønskelig å anvende en ikke-terapeutisk radiomerking for avbildnings-formål såvel som en terapeutisk radionuklide. Stort sett er radionuklider velkjente på området og innbefatter<123>I, 125lt 130I§131I§133I? 135If 47Sc>72ASf72Se, 90Yf 88Yf 97Ru>100pdf lOln<i>R<h,>119sbt128Ba>197Hg>211Atf212Bi>212pbf109pd>lllln, 67Ca>68Ga>67Cu>75Br>77Br>99mTc>llc>13N>150og<18>F. De radionuklider som er egnet for terapeutisk anvendelse, er velkjente på området. Foretrukkede radionuklider er 125I, 131If 90y>67Cu>18<8>Re>186Ret 211At og 212Bi.
Når det gjelder "immuno"-komponenten ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan generelt hvilket som helst antistoff anvendes, innbefattende polyklonale og monoklonale antistoffer. Monoklonale antistoffer er imidlertid foretrukket fordi monoklonale antistoffer, i motsetning til de heterogene blandinger av immun-globuliner som består av polyklonale antistoffer, har en velde-finert homogen struktur. På grunn av denne homogenitet oppviser monoklonale antistoffer en høy grad av reproduserbarhet når det gjelder funksjon og spesifisitet.Fremgangsmåter for oppnåelse av monoklonale antistoffer er blitt omtalt i stor utstrekning og er velkjente på området. Monoklonale antistoffer er allerede utviklet når det gjelder mange forskjellige mål-antigener, innbefattende tumorceller. Utvelgingen av monoklonalt antistoff for utførelse av denne oppfinnelse vil avhenge av den sluttan-vendelse som konjugatet vil anvendes for, og en slik utvelging er innenfor fagkunnskapen.
Det må være klart at skjønt beskrivelsen for enkelthets skyld når det gjelder omtalen, omtaler konjugatet ifølge oppfinnelsen som omfattende et enkelt kjemoterapeutisk middel, radionuklide og antistoff, kan mer enn én av hver av disse komponenter inkorporeres i konjugatet. Konjugatet kan for eksempel omfatte mer enn én type radionuklide. Konjugatet kan dessuten omfatte mer enn ett terapeutisk middel. Ved én utførelsesform av oppfinnelsen kan et kjemoterapeutisk legemiddel, et terapeutisk toksin og en radionuklide alle festes til et antistoffmolekyl under dannelse av et konjugat. Andre utførelsesformer av oppfinnelsen er rettet mot konjugater omfattende forskjellige kom-binasjoner av diagnostiske radionuklider, terapeutiske radionuklider, toksiner eler terapeutisk effektive fragmenter derav, biologisk-respons-modifiseringsmidler eller terapeutisk effektive fragmenter derav, og kjemoterapeutiske midler, hvor konjugatet omfatter et antistoff, minst ett terapeutisk middel og minst én radionuklide.
Konjugatets terapeutiske/cytotoksiske virkning kan oppnås ved hjelp av en mangfoldighet av mekanismer. Konjugatets virk-ningsmekanisme vil selvfølgelig avhenge av hvilke komponenter som utvelges for dannelse av konjugatet og deres respektive virkningsmekanismer, såvel som av det spesifikke mål som konjugatet virker på. De kjemoterapeutiske midlers virkningsmekanismer innbefatter for eksempel enzyminhibering eller annen pro-teinbinding eller en virkning på nukleinsyrer som kan føre til celledød eller forhindre celleformering. Ioniseringsutstråling fra radionuklidet i konjugatet kan for eksempel påvirke DNA og/eller RNA og/eller cellens membran, idet celleformeringen også forhindres og virkningen av det kjemoterapeutiske middel forsterkes.
De terapeutiske virkninger av det terapeutiske middel og radicukliden kan være synergistisk snarere enn bare additiv, i noen tilfeller. Mekanismene for den synergistiske virkning kan variere ifølge kombinasjonen av terapeutisk middel og radionuklide som er tilstede på et spesielt immunokonjugat ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan visse målceller som kan overleve den cytotoksiske virkning hos én av de terapeutiske deler, f.eks. "kjemo"- eller "radio"-delen, være tilstrekkelig svekket til å bukke under for virkningene av den annen terapeutiske del. Dessuten omfatter tumorer ofte heterogene populasjoner av kreftceller, hvorav noen kan utryddes mer effektivt ved hjelp av én av effektor-delene enn den annen. Således kan avgivelse av begge typer av effektorer øke sjansene til å ødelegge forskjellige populasjoner av kreftceller innenfor en tumor.
Den terapeutiske virkning av konjugatet in vivo er lokalisert ved antistoffet, som er valgt på grunn av sin spesifisitet når det gjelder målcellen eller biomaterialet. Kjemo-radio-immuno- konjugatene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan således anvendes ved behandlingen av hvilken som helst patologisk tilstand hvor ødeleggelsen av et mål-område eller biomateriale er ønskelig for terapi, så lenge et antistoff mot målmaterialet kan dannes.
Alternativt kan andre måltilbindingsproteiner enn antistoffer anvendes for tilføring av de terapeutiske midler og radionukli-dene til et ønsket målsted i ét menneske eller et pattedyr. Betegnelsen "måltilbindingsprotein" som anvendt i det foreliggende beskriver proteiner som kan bindes til et ønsket målsted in vivo. Måltilbindingsproteinet kan bindes til en reseptor, et substrat, en antigen determinant eller annet bindingssted på en målcelle eller annet målsted. Eksempler på måltilbindingsproteiner innbefatter, men er ikke begrenset til, antistoffer eller antistoff-fragmenter, visse serumproteiner og hormoner. Disse proteiner kan modifiseres f.eks. for dannelse av varianter og fragmenter av proteinene så lenge den ønskede biologiske egenskap (d.v.s. evnen til å bindes til målstedet) beholdes. Proteinene kan modifiseres ved anvendelse av forskjellige gen-sløyd- eller proteinoppbygnings-teknikker.
Mål-stedet kan omfatte målceller som skal utryddes. Ved én utførelsesform av oppfinnelsen er de målceller som skal utryddes, kreftceller. En rekke monoklonale antistoffer og fragmenter derav som er spesifikke for forskjellige kreftcelle-tilknyttede antigener, er blitt utviklet. Valget av antistoff vil avhenge av den type kreft som pasienten lider av.
De terapeutiske virkninger av konjugatet kan utøves på mål-materialet på forskjellige måter. Konjugatet kan for eksemptl forbli på overflaten av en målcelle og frigjøre det kjemoterapeutiske middel i en pro-aktiv tilstand som tas opp av cellen. Alternativt kan det intakte konjugat moduleres og komme inn i cellen ved endocytose, hvoretter konjugatet spaltes og midlet utøver sin virkning. Konjugatet kan selvfølgelig også være tok-sisk uten at det kommer inn i cellen. Radionukliden i konjugatet vil, enten det er inne i eller-utenfor cellen, også utøve sin bestrålende virkning under forsterkning av konjugatets terapeutiske virkning.
De forskjellige konjugater ifølge den foreliggende oppfinnelse kan i tillegg omfatte en diagnostisk effektiv radionuklide. En fordel ved anvendelse av slike konjugater er at biofordelingen av konjugatet in vivo kan kontrolleres. En rekke diagnostisk effektive radionuklider som kan påvises ved ytre hjelpemidler, kan anvendes, såsom blant annet 99mTc, 123i og<11]>-In.Biofordelingen av disse radionuklider kan påvises ved at pasienten undersøkes ved avsøkning med et gamma-kamera etter at det har fått gå en passende tid for lokalisering av konjugatet på mål-stedet. Visse terapeutisk effektive radionuklider kan også fungere som diagnostisk effektive radionuklider. To slike radionuklider er 18<6>Re og 18<8>Re som har terapeutisk anvendelse, men som også kan påvises ved hjelp av gamma-kamera.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte til kontrollering av biofordelingen av et terapeutisk effektivt konjugat in vivo, omfattende følgende trinn: a) en diagnostisk effektiv radionuklide festes til et konjugat omfattende et antistoff, et terapeutisk middel og en terapeutisk effektiv radionuklide, b) det resulterende konjugat som omfatter den diagnostisk effektive radionuklide, administreres til et menneske eller et
pattedyr, og
c) biofordelingen av den diagnostisk effektive radionuklide i verten påvises.
Kontrollering av biofordelingen av det administrerte konjugat gjør det mulig for legen å bestemme hvorvidt konjugatet er blitt lokalisert på alle mål-steder (innbefattende metastaser) in vivo (mål-stedene er blitt identifisert på forhånd under en diagnostisk metode). Muligheten til å kontrollere biofordelingen kan være særlig viktig når det anvendes visse terapeutiske midler (f.eks. forholdsvis store midler såsom protein-toksiner) for å sikre at festingen av det terapeutiske middel til måltilbindingsproteinet ikke har forandret evnen hos måltilbindingsproteinet til å bindes til målstedene.
Den foreliggende oppfinnelse kan for eksempel anvendes ved behandling av tumorer, AIDS og virusinfeksjoner. Ved behandlingen av slike tilstander anvendes konjugatene ifølge den foreliggende oppfinnelse i terapeutisk sikre og effektive mengder, d.v.s. mengder som oppnår det ønskede kliniske resultat uten unødvendig toksisitet. Konjugatene kan administreres ved hvilken som helst konvensjonell fremgangsmåte, topisk, oralt, intravenøst, parenteralt og liknende. I tillegg til kjemo-radio-immuno-konjugat, kan farmasøytiske blandinger videre inne-holde komponenter såsom farmasøytisk tilfredsstillende bærer, eksipienser, additiver eller andre konjugater ifølge den foreliggende oppfinnelse. Passende konsentrasjoner av bioaktive terapeutiske materialer, såsom slike som er påtenkt ved den foreliggende oppfinnelse, i slike farmasøytiske blandinger vil avhenge av flere faktorer og kan rutinemessig bestemmes av fag-folk på området. Den effektive dose av et kjemo-radio-immuno-konjugat ifølge den foreliggende oppfinnelse ved hvilken som helst anvendelse vil avhenge av de nærmere enkeltheter ved denne anvendelse. Ved behandling av tumorer vil for eksempel dosen blant annet avhenge av tumormassen, tilgjengeligheten og andre variabler.
Det er viktig at konjugatet ifølge den foreliggende oppfinnelse fremstilles ved en fremgangsmåte som: (a) bibeholder den terapeutiske aktivitet, (b) bibeholder antistoff-aktiviteten og -spesifisiteten, (c) muliggjør tilstrekkelig molart inkorporerings-forhold for avgivelse av toksiske mengder av kjemoterapeutisk middel og radionuklide til mål-materialet, (d) minimaliserer polymerisering eller aggregering av konjugater og (e) er teknisk reproduserbare. Siden konjugatet må avgis til målcellene i en form som er bioaktiv, må man utvise forsiktighet for å unngå å påvirke reaktive grupper på komponentene som på en skadelig måte kunne forandre konjugatets biologiske aktivitet. For eksempel må kloretylamin-gruppene på alkyleringsmidler såsom L-fenylalanin-"mustard", klorambucil- eller uracil-"mustard" og de utgående kloridgrupper på cisplatin, beskyttes under syntesen for oppnåelse av aktive konjugater. På liknende måte må den aktive del av anti-fol, metotreksat (MTX), ikke modifiseres for konservering av binding til målenzym-dihydrofolat-reduktase.
Det er en rekke reaktive funksjonelle grupper tilgjengelige for binding til antistoffet. Reaktive grupper tilgjengelige på aminosyrene hos antistoffer innbefatter: (a) de C-terminale karboksylgrupper på asparaginsyre- og glutaminsyre-rester, (b) gua- nidino-gruppen på arginin, (c) imidazol-funksjonen hos histidin, (d) den fenoliske hydroksylgruppe på tyrosin, (e) aminogruppene på de N-terminale og lysin-restene, (f) sulfhydrylgruppene på cystein og tioeteren på metionin. Hydroksylgrupper på serin eller protetiske karbohydratgrupper gir ytterligere steder for binding.
Utvelgingen av en fremgangsmåte for binding av et kjemoterapeutisk middel, en radionuklide og et antistoff er vanligvis avhengig av den type binding som fordres (f.eks. kovalent eller ikke-kovalent) og de reaktive deler som deltar. Reaktive grupper som allerede finnes på komponentene i konjugatet, kan anvendes for direkte binding av disse komponenter. Alternativt kan reaktive deler innføres i én eller flere av konjugat-komponentene for tilveiebringelse av en bindingsmekanisme. For eksempel kan det innføres avstandsdeler for tilveiebringelse av en gun-stigere sterisk orientering av det kjemoterapeutiske middel og/eller radionukliden i forhold til konjugatet. Mellomledd som kan inkorporere og/eller binde komponentene i konjugatet mens konjugatets bioaktivitet konserveres, kan også anvendes. Binding kan også oppnås ved ikke-kovalente gjensidige påvirkninger mellom komponentene.
Fremgangsmåter for binding mellom et kjemoterapeutisk middel, en radionuklide og et antistoff kan således generelt grup-peres som: (1) direkte, kovalent kopling, som kan fordre modifisering av én eller flere av komponentene i konjugatet, (2) indi-rekte binding av det kjemoterapeutiske middel og/eller radionukliden til antistoffet gjennom en avstandsdel eller bro, eller når det gjelder radiometaller, gjennom en chelator, (3) kopling av komponentene gjennom nedbrytbare eller ikke-nedbrytbare mellomledd såsom dekstranene, poly-glutaminsyre og poly-lysin, eller serumalbumin eller liposomer, og (4) ikke-kovalent binding, f.eks. ved gjensidig ionisk eller hydrofob påvirkning.
Som en illustrasjon av den første fremgangsmåte kan direkte binding meilom et kjemoterapeutisk middel og et antistoff oppnås ved start-modifisering enten av antistoffet eller midlet, fulgt av direkte innbyrdes påvirkning og kovalent binding til de modifiserte grupper. For eksempel gir hydrazinolyse av kjemoterapeutisk vinblastin-middel ("Velban") deacetylvinblastin-hydra- zid. Denne forbindelse kan så omdannes til syreazidet ved innvirkning av salpetersyrling, og syreazidgruppen kan så reagere med nukleofile områder på et antistoff såsom amino- og sulfhydrylgrupper på immunglobulin G (IgG). 4-8 molekyler av vinblastin kan koples pr. IgG-molekyl ved denne fremgangsmåte. Alternativt kan N-hydroksy-suksinimidesteren av vinblastin syn-tetiseres og koples til aminogrupper på KSI/4, et IgG2a som gjenkjenner et epitelial-antigen på 40 k dalton som finnes på humane lunge- bryst- og tykktarms-adenokarsinomer.
Et annet eksempel på direkte binding er bindingen mellom metotreksat og antistoff ved behandling av metotreksat med eddiksyreanhydrid under dannelse av blandet anhydrid, hvoretter det resulterende produkt tilsettes direkte til et antistoff.
En annen form for direkte binding mellom visse kjemoterapeutiske midler og antistoffer innbefatter kjemisk konjugering mellom en karbohydratgruppe på antistoffet og en aminogruppe på det kjemoterapeutiske middel eller omvendt, ved perjodat-oksydasjon av vicinalt hydroksyl på karbohydrat-delen. Kjemoterapeutiske midler som kan underkastes denne bindingsmetode, innbefatter antracyklin-antiobiotika såsom doksorubicin og daunorubucin, som inneholder en daunosamin-sukkerart. Toksiske ribonukleosider eller ribonukleosid-analoger som inneholder nabo-hydroksylgrupper, kan også koples direkte til antistoffer under anvendelse av milde, vandige reaksjonsbetingelser. For eksempel ville 2'- og 3'-hydroksylgruppene på ribosesukker-delene hos kjemoterapeutiske midler såsom cytosin-arabinosid, fluordeoksyuridin eller andre nukleosid-analoger kunne underkastes denne type binding. Alter-i.acivt kunne 5'-hydroksylgruppene katalytisk oksyderes til den tilsvarende 5'-karboksylsyre og deretter koples som ved en karboksylsyrebinding. Hydroksylgruppene på ribosesukker-holdige analoger kan perjodat-oksyderes til aldehyder og koples direkte til aminholdige proteiner såsom antistoffer.
På liknende måte kan karbohydrat-funksjoner på antistoff-immunglobuliner modifiseres for områdespesifikk kopling av aminoholdige kjemoterapeutiske midler. Det er velkjent at antistoffer inneholder variable mengder av karbohydrater, for eksempel mannose, N-acetylglukosamin, galaktose, fucose og sialinsyre. Karbohydrat-delene hos antistoffet finnes vanligvis i Fc-delen på immunglobulinet og sjelden i det variable område, idet det således blir mulig med område-spesifikk modifikasjon av immunglobulin-karbohydrater uten å bryte antigenbindingen. Perjodat-oksydasjon av nabo-hydroksylgrupper (dioler) på antistoff-karbohydrat-deler gir et aldehyd som er reaktivt med funksjonelle amino- og sulfhydryl-grupper. Andre alternative kjemiske fremgangsmåter for aktivering av karbohydratgrupper for binding er: (1) omdannelse av monosakkarider og reduksjon av oligosakkarider til aldonsyrer med Br2- eller I2-oksydasjon fulgt av direkte kopling; (2) binding av glykosider som har et p-nitro- eller p-aminofenyl-aglykon, til proteiner ved diazotering; eller (3) cyanursyreklorid kan anvendes og karboksyl- eller sulfhydryl-grupper kan innføres.
Det vil forstås at modifiseringer, såsom slike som er omtalt ovenfor, av grupper på komponentene av konjugatet under oppnåelse av reaktive områder for binding kan anvendes ikke bare for direkte å binde komponentene, men for å innføre nye grupper (innbefattende mellomledd og bindere omtalt ovenfor) på de reaktive steder, som i sin tur kan anvendes for binding av komponentene. For eksempel kan aldehydgruppene dannet ved oksydasjon av hydroksylfunksjoner på karbohydratgrupper på antistoffet anvendes for innføring av nye grupper på antistoffet for binding.
Som et ytterligere eksempel kan cyanursyreklorid (triklor-S-triazin) eller diklor-S-triazin substituert med karboksylmetyl-amingrupper anvendes til kopling av hydroksylholdige kjemoterapeutiske midler til antistoffer i en totrinns-reaksjon. En eter dannes ved omsetning av hydroksylgruppen med cyanursyre, og siden hydroksylgruppen ikke er tilstrekkelig nukleofil og ikke lett reagerer med kloridene, er det annet trinn å kople aminogruppene på antistoffet til triazin-delen på det modifiserte middel.
Radionukliden kan også bindes direkte til det kjemoterapeutiske middel eller til antistoffet. For eksempel kan radioiso-toper av jod, såsom<125>i eller<131>I, bindes til det kjemoterapeutiske middel eller antistoff ved monoklorid-mikro-fremgangsmåten beskrevet av Contreras et al. i "Iodine Monochloride (ICI) Iodination Technigues", Methods in Enzymology 92:277-292, 1983.
Som en illustrasjon av den annen fremgangsmåte kan kjemoterapeutiske midler koples til antistoffer gjennom avstandsdeler eller broer med variert men definert lengde og sammensetning. Kjemoterapeutiske midler som kan underkastes denne bindingsfrem-gangsmåte, innbefatter metotreksat, klorambucil, bleomycin og mitamycin såvel som antracyklin-derivater. Under anvendelse av denne fremgangsmåte kan det anvendes tverrbindings-reagenser,
for eksempel de bifunksjonelle tverrbindingsmidler p-benzokinon, bisoksiran og gluteraldehyd, for dannelse av broer og/eller avstands-deler mellom reaktive områder (f.eks. amino- eller sulfhydrylgruppe) på antistoffet og det kjemoterapeutiske middel. Denne fremgangsmåte er spesielt egnet for overvinning av sterisk hindring mellom disse komponenter ved at midlet "brobin-des" i en fastsatt avstand fra proteinoverflaten under tilveiebringelse av en bedre orientering av midlet. Visse bifunksjonelle reagenser, såsom bisoksiran, muliggjør også samtidig inn-føring av en avstandsgruppe i koplingsprosessen og er egnet når ytterligere avstand mellom bundne komponenter i konjugatet ønskes.
I tillegg til de typer broer og avstands-deler som er
omtalt ovenfor, kan en chelaterende brodannende mekanisme også anvendes for binding av et radiometall til konjugatet. Generelt sett bindes et metall-chelateringsmiddel eller en ligand, som binder det radioaktive metall til konjugatet, til antistoffet.
Se US-patent nr. 4 472 509 fra 18. september 1984 tilhørende Cansow et al. og US-patent nr. 4 485 086 fra 27. november 1984 tilhørende Wong. Kjemo-radio-immuno-konjugatene kan for eksempel fremstilles med mange forskjellige beta-utstrålende metalliske radionuklider under anvendelse av det bisykliske anhydrid av DTPA som det chelaterende middel. Se D.J. Hnatowich et al. i "RadioactiveLabeling of Antibody: A Simple and Efficient Method", Science 220:613-615 (1983) og D.J. Hnatowich et al. i "The Preparation of DTPA Coupled Antibodies Radiolabeled with Metallic Radionuclides: An Improved Method", J. Immunol. Methods 65:147-157 (1983). Diamid-dimerkaptid-chelaterende forbindelser egnet for binding av radionuklider såsom 99mTc, 186Re og<188>Re til antistoffer er beskrevet i publisert europeisk patentsøknad nr. 188 256. Valget av chelator eller ligand vil selvfølgelig avhenge av det metall som skal chelateres, og det chelaterte metall kan være hvilket som helst radioaktivt metall som utstråler alfa- beta- eller gammastråling eller positroner, eller alternativt et fluorogent eller paramagnetisk metall. Man må også være klar over at visse chelatorer, såsom porfyriner, bleomyciner og beslektede forbindelser selv fungerer som kjemoterapeutiske midler og kan således også omfatte "kjemo<11->kompo-nenten i konjugatet. De kjemoterapeutiske midler bleomycin, hematoporfyrin-derivat og dihematoporfyrin-eter kan for eksempel anvendes som ligander for den forholdsvis stabile festing av visse radionuklide-metaller (f.eks. 6<7>Cu, 9<0>Y og 113-In) til et antistoff.
Den tredje konjugerings-fremgangsmåte, med binding gjennom et mellomledd, innbefatter vanligvis at man fester flere molekyler av kjemoterapeutisk middel og/eller radionuklide til forholdsvis inerte polymere mellomledd og deretter kopler agens-mellomledd-komplekset til antistoffet. Fordelene ved denne kon-juger ingsmekanisme er todobbelt: for det første økes mengden av kjemoterapeutisk middel pr. konjugat og den tilsvarende cytotoksisitet hos konjugatet, og for det annet konserveres konjugatets bioaktivitet. For eksempel er metotreksat-(MTX)-antihumant-melanom-(ZME018)-konjugater dannet under anvendelse av humane serumalbumin-(HSA)-mellomledd, nylig vist å ha forbedret spesifisitet og en vesentlig økning i cytotoksisitet sammenliknet med direkte binding eller avstandsdel-(EDCI)-formidlet binding. Det skal bemerkes at anvendelse av et mellomledd for konjugering også kan anvendes i forbindelse med brodannelses- og avstands-mekanismene omtalt ovenfor.
Mellomledd som er egnet ved den foreliggende oppfinnelse, innbefatter polysakkarider såsom dekstranene, polyglutaminsyre og polylysin, serumalbumin og andre polymerer såsom mikrokuler eller liposomer. Fremstillingen av cytotoksisk-middel-bundne mellomledd og deres kopling til antistoffmolekyler innbefatter i en overveiende grad mange av de samme kjemier som er omtalt ovenfor. For eksempel kan kjemoterapeutiske midler bindes til dekstraner ved direkte forestring av dekstran-hydroksylgrupper eller ved aktivering av hydroksylgruppene ved hjelp av perjodat, cyanogenbromid, hydrazider, organiske cyanater eller halogenpro-pyl-epoksyder. Perjodat-oksydasjon og cyanogenbromid-aktivering er de fremgangsmåter som anvendes i størst utstrekning når det gjelder kopling av kjemoterapeutiske midler til dekstraner. Blant de fremgangsmåter som kan anvendes for binding av terapeutiske midler til polymere mellomledd, som i sin tur er bundet til antistoffer, er de som er beskrevet i US-patent 4 699 794 og 4 046 722.
Endelig kan komponentene i konjugatet bindes sammen ved ikke-kovalente bindinger såsom ved innbyrdes ionisk påvirkning eller hydrofob adsorpsjon av det kjemoterapeutiske middel eller radionukliden til antistoffet. For eksempel kan porfyriner bindes til antistoff ved gjensidig ionisk påvirkning.
Ved den foreliggende oppfinnelse er det dessuten tilveiebrakt en fremgangsmåte for å feste et agens til et protein, omfattende følgende trinn: a) proteinet omsettes med et molart overskudd av agenset under et første sett av reaksjonsbetingelser slik at agenset reagerer med en første funksjonell gruppe på proteinet under binding av en første del av agens-molekylene til proteinet, og b) reaksjonsbetingelsene forandres slik at ubundne agens-molekyler reagerer med en andre funksjonell gruppe på proteinet,
hvorved en ytterligere andre del av agens-molekylet bindes til proteinet.
En fordel ved å anvende denne fremgangsmåte er at flere molekyler av agenset kan festes til hvert proteinmolekyl, sammenliknet med bindings-fremgangsmåter som bare skyter inn én funksjonell gruppe på proteinet. Agenset kan være hvilket som helst av de diagnostiske eller terapeutiske midler beskrevet ovenfor, innbefattende, men ikke begrenset til, legemidler og bifunksjonelle chelaterende forbindelser. Det trinn å forandre reaksjonsbetingelsene kan innbefatte hvilken som helst forandring av betingelsene i reaksjonsblandingen som bevirker at agenset reagerer med en annen funksjonell gruppe på proteinet. Fremgangsmåter til forandring av reaksjonsbetingelsene innbefatter, men er ikke begrenset til, forandring av pH eller tempera-turen i reaksjonsblandingen, eller tilsetting av et bifunksjo-nelt bindermolekyl som er reaktivt både med agenset og den annen funksjonelle gruppe på proteinet. Forandringen i reaksjonsbetingelsene som skal utføres, vil avhenge av slike faktorer som agensets kjemiske struktur. Gruppen på agenset som reagerer med proteinet, kan være den samme eller forskjellig i det første og annet trinn, og kan reagere med proteinet direkte eller gjennom en binder.
Én utførelsesform av denne fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen er illustrert i Eksempel 10 nedenfor. I det første trinn bindes doksorubian til et antistoff under anvendelse av en vannløselig karbodiimid-binder ved en pH på ca. 5,5-6,0 og et 100-dobbelt overskudd eller mer av doksorubicin. Legemidlet festes (gjennom karbodiimid-binder) til -COOH-grupper på antistoffet. Reaksjonsblandingens pH økes så til ca. 8,0-8,5, og glutaraldehyd, et tverrbindingsreagens, tilsettes. Det ubundne legemiddel i reaksjonsblandingen (derivatisert ved hjelp av glutaraldehyd) reagerer med frie amingrupper på lysin-restene på antistoffet, hvorved en ytterligere del av legemidlet bindes til antistoffet.
En videre forståelse av den foreliggende oppfinnelse kan fås ved de følgende eksempler. I disse eksempler fås de anti-neoplastiske legemidler, d.v.s. kjemoterapeutiske midler, fra kommersielle kilder som produkter med farmasøytisk kvalitet i ampuller, bortsett fra der hvor annet er angitt. Reagenser og kjemikalier fås fra Sigma Chemical Co., (St. Louis, Mo.), PD-10-(Sephadex G-25)-kolonner fås fra Pharmacia (Uppsala, Sverige), og semi-preparative gelfiltrerings-, ionebytter- og hydroksyl-apatitt-HPLC-kolonner fås fra henholdsvis Beckman, Waters/Milli-pore og Biorad.
EKSEMPLER
Eksempel 1
Et doksorubicin-(DOX)-immunokonjugat for radionuklide-binding fremstilles ved to forskjellige fremgangsmåter: en 5-karbon-avstandsdel mellom det frie amin på daunosaminsukkeret på DOX med amino- og sulfhydrylgrupper på antistoffet og et syre-følsomt cis-aconitinsyreanhydrid (cis-AA) og karbodiimid-binder som vil muliggjøre frigjøring av DOX intracellulært etter nedbrytning i lysosomene. Doksorubicin (DOX) (100 mM sluttkon-sentrasjon) koples deretter til 443A6, et antistoff (IgG^) mot pulmonar-adenokarsinom (10 mM endelig reaksjonskonsentrasjon i PBS med pH 8,5). Se Lee et al., Cancer Research 45:5813 (1985). Fortynnet glutaraldehyd (0,125%) tilsettes dråpevis (100 pl til 900 pl DOX og antistoff i PBS med pH 8,5) i løpet av 2 minutter ved romtemperatur i mørke. Reaksjonsblandingen anbringes over en kolonne med Sephadex G-25 (PD-10) for isolering av konjugatet fra reaktantene, og konjugatfraksjonen sterilfiltreres og kvantifiseres. Konjugat-fraksjonen analyseres ved UV/synlige spektroskopiske analyser og proteinanalyser for beregning av den molare inkorporering avDOX i antistoffet. Den syre-følsomme binder, cis-AA, koples først til DOX ved tilsetning av 5 mg cis-AA til en omrørt oppløsning av DOX (5 mg i 1 ml destillert vann) justert til pH 9 med NaOH. Etter 10 minutter ved romtemperatur fortynnes oppløsningen ytterligere med 2 ml vann og anbringes på is. Saltsyre (HCl) (0,5 N) tilsettes til den kalde, omrørte oppløsning inntil det dannes en tung utfeining. Utfeiningen isoleres, oppløses i 4 ml destillert vann og surgjøres på nytt/utfelles med HCl. Slutt-utfeiningen oppløses i 0,5 ml destillert vann og pH justeres til 8,0 med natriumhydroksyd (NaOH). Antistoffet (10 mg i 0,5 ml PBS med pH 8) tilsettes til DOX-aconitinsyreanhydrid-oppløsningen og 20 mg l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid (EDCI) tilsettes langsomt under omrøring. Blandingen inkuberes i ca. 2 timer ved pH 7,0 og inkorporeringen kontrolleres ved gelfiltrering-HPLC ved detektor-bølgelengder på 280 nm og 475 nm. Blandingen ledes gjennom en PD-10-kolonne, og konjugatfraksjonen oppsamles. Inkorporerings-forholdet kvantifiseres etter sterilfiltrering og konsentrasjon.
Eksempel 2
Klorambucil-(CBL)-immunokonjugater for radionuklide-tilbin-ding fremstilles ved kovalent binding av CBL's karboksylgruppe til aminer på antistoff ifølge Eksempel 1 ved (1) vannløselig 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid (EDCI) eller (2) ved dannelse av det blandede anhydrid av CBL ved lav temperatur og alkalisk pH. Ved den første fremgangsmåte behandles CBL (62 mg i 2 ml metanol) med 12 mg natriummetoksyd under dannelse av nat-riumsaltet av CBL. Metanolen fjernes og 3 mg av saltet oppløses i 1,5 ml PBS inneholdende 15 mg antistoff, og EDCI tilsettes (3 mg). Blandingen omrøres i 2 timer ved 4°C og renses på Sephadex G-25-kolonne (PD-10). Ved den andre fremgangsmåte dannes det blandede anhydrid av CBL ved 4°C ved at CBL først omsettes med butyl-klorformiat (molart forhold 1/1) i trietylamin. Antistoff i PBS med pH 9 tilsettes dråpevis til den omrørte, urensede blanding ved 4°C (molart forhold mellom anhydrid og antistoff 50/1) og inkuberes i 1-2 timer. Etter sentrifugering ved høy hastighet (10.000 xg) renses supernatanten på en PD-10-kolonne, og eluatet undersøkes ved HPLC og nitrobenzylpyridin-(NBP)-alky-leringsanalyse.
Eksempel 3
Metotreksat (MTX) koples til antistoff ifølge Eksempel 1 via gamroa-karboksylgruppen på MTX med retensjon av biologisk aktivitet. MTX (0,1 mmol i 1 ml tørt dimetylformamid (DMF)), N-hydroksysuksinamid (0,1 mmol i 0,5 ml tørt DMF) og EDCI (0,1 mmol i 0,5 ml DMF) tilsettes i rekkefølge i en ravgul ("amber") reaksjonsflaske. Blandingen omrøres ved romtemperatur i 1 time og anbringes deretter i kjøleskapet (4°C) i 20 timer. Blandingen sentrifugeres (10.000 xg) og den oransje supernatant fjernes, kvantifiseres og lagres under N2ved -80°C inntil det er klart for konjugering. Den aktive ester av MTX (0,2 ml) tilsettes deretter til en omrørt oppløsning av antistoff (20 mg i 4 ml PBS med pH 7 og 2 ml DMF). Komponentene inkuberes i 4 timer ved 4°C og blandingen sentrifugeres så (10.000 xg) i 20 minutter. Supernatanten anbringes på en PD-10-kolonne og MTX-antistoff-konjugatet oppsamles og analyseres.
Eksempel 4
Doksorubicin-(DOX)-radio-immuno-konjugater fremstilles ved at man tilsetter DOX (5-10 mg i 1 ml vann) til MB-1, et monoklonalt muse-antistoff (IgG^underklasse) utviklet av Link et al.
(J. Immunology 137-3013, 1986) i en 5 ml reaksjonsflaske som inneholder en magnetisk rørestav. Antistoffet er på forhånd dialysert mot 4x4 liter PBS med pH 7, konsentrert til ca. 20 mg/ml, og 20 mg tilsettes til 5-ia mg DOX under omrøring ved 25°C. Etter 15 minutter tilsettes 10 mg l-etyl-3-(3-dimetylami-nopropyl) -karbodiimid (EDCI) eller 8 mg l-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)-karbodiimid-(CMC)-meto-p-toluensulfonat, og det
omrøres i mørke i 3 0 minutter ved 25°C. En oppløsning av friskt 0,1% glutaraldehyd tilsettes (100 pl/ml reaksjonsvolum) dråpevis i løpet av 60 sekunder med hurtig omrøring. Blandingen inkuberes i ytterligere 4-5 minutter, og deretter anbringes hele reak-sjonsoppløsningen over en kolonne av Sephadex G-25 (PD-10) som på forhånd er blitt ekvilibrert i boratbufret saltoppløsning (BBS) med pH 7,8. DOX/MB-1-konjugatet oppsamles i fjerde-syvende-ml fraksjonene (tomvolumet) fra kolonnen. En porsjon på 10-20 pl av 4 ml-fraksjonen (inneholdende ca. 15 mg MG-1 og 0,5 mg DOX pr. ml) tilsettes til en syrevasket 5 ml reaksjonsflaske, og NaI-125, NaI-123 eller NaI-131 (lav eller høy spesifikk aktivitet) tilsettes (begynnelses-volumet på 10-20 pl av porsjonen økes til 100 pl med PBS og alle de 100 pl tilsettes til reaksjonsflasken). Jodmonoklorid (ICI) ble fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Contreras et al. (Methods in Enzymology 92:277, 1983) og 5 ekvivalenter ble anvendt når det gjaldt MB-1 som for de fleste andre IgG (mens det anvendes 10-12 ekvivalenter for IgM). Ca. 60 sekunder senere tilsettes humant serumalbumin (HSA) (2% endelig konsentrasjon) som et beskyttende protein, og kjemo-radio-immuno-konjugatet renses over en PD-10-kolonne ekvilibrert med PBS pH 7,4, og fjerde-syvende-ml oppsamles. Alternativt renses konjugatet over en Dowex-kolonne (1x4, 150 mesh, 5 ml kolonnesjikt, BioRad) for fjerning av fritt, ikke-konjugert radiojod.
Eksempel 5
Et radiometall-porfyrin-antistoff-konjugat fremstilles ved at man først tilsetter i:L1InCl3 eller<90>YC13(5-10 mCi) i 0,05 N HCl til 1 ml natriumacetatbuffer med pH 4,0 og omrører i en syrevasket ravgul reaksjonsflaske i 10 minutter. Hematoporfyrin-derivat (HPD) og/eller dihematoporfyrineter (DHE) (10 mg) tilsettes og oppløsningen omrøres og oppvarmes til 80°C på en varm plate i 1-24 timer. Oppløsningen avkjøles, justeres til pH 6,0 med 1 N NaOH, og 20 mg EDCI eller 15 mg CMC tilsettes for derivatisering av de frie karboksylgrupper på HPD eller DME. MB-l-antistoff (40-50 mg i PBS med pH 7,4) tilsettes dråpevis til den omrørte oppløsning i løpet av 1 minutt og inkuberes i ytterligere 30 minutter. De derivatiserte karboksylgrupper på radiometall-porfyrinet bindes til amino- og hydroksylgrupper på antistoffet ved hjelp av EDCI. Radiometall-porfyrin/antistoff-konjugatet renses over en Sephadex-G-25-kolonne (PD-10) ekvilibrert med PBS med pH 7,4, og 4 ml-fraksjonen inneholdende maksi-mal absorbans ved 505 nm, radioaktivitet og immunglobulinprotein oppsamles (ved HPLC og naturlig PAGE). Produktet er stabilt i sterilt PBS pH 7 i opp til 2 uker.
Eksempel 6
Bleomycin-antistoff-konjugat fremstilles som følger: bleomycin (BLEO) (10 enheter eller mg BLEO av Sigma-kvalitet) oppløst i acetatbuffer med pH 4,0 og Y-90 (5 mCi/100 pl 0,05 N HCl, Oak Ridge, Tenn.) tilsettes til en syrevasket reaksjonsflaske under omrøring ved 25°C og inkuberes i 1-2 timer. MB-l-antistoff (20 mg i 1 ml PBS pH 8,0) tilsettes, fulgt av 10 mg EDCI eller CMC, og reaksjonsblandingen omrøres i ytterligere 20 minutter
ved 25°C. Reaksjonsflasken sentrifugeres (3000 rpm i 20 minutter) og supernatanen anbringes over en kolonne av typen Sephadex G-25 (PD-10) og renses.
Eksempel 7
Doksorubicin bindes til et monoklonalt antistoff betegnet NR-LU-10, som bindes til et 37-40 kilodalton pankarsinom-glyko-protein, og det resulterende legemiddel-antistoff-konjugat blir så radioaktivt merket. Antistoffet er på forhånd dialysert mot 4x4 liter PBS med pH 7, konsentrert til ca. 20 mg/ml, og 20 mg tilsettes til 5 mg DOX (5 mg/ml i vann) i en 5 ml reaksjonsflaske som inneholder en magnetisk rørestav, under omrøring ved 25°C. Etter 15 minutter tilsettes 10 mg l-etyl-3-(3-dimetylaminopro-pyl)karbodiimid (EDCI) eller 8 mg l-cykloheksyl-3-(2-morfolino-etyl) karbodiimid- (CMC) -meto-p-toluensulf onat , og det omrøres i mørke i 60 minutter ved 37°C. Reaksjonsblandingens pH justeres deretter til ca. 8,0-8,5 ved tilsetning av bufret 1 N NaOH, pH 8,5, eller en annen egnet bufret oppløsning ved pH 8,5. En oppløsning av friskt 0,1% glutaraldehyd tilsettes (100 pl/ml reaksjonsvolum) dråpevis i løpet av 60 sekunder med hurtig omrøring. Blandingen inkuberes i ytterligere 4-5 minutter, og deretter anbringes hele reaksjonsoppløsningen over en kolonne av typen Sephadex G-25 (PD-10) som på forhånd er blitt ekvilibrert i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) med pH 8,5. DOX/NR-LU-10-konjugatet oppsamles i fjerde-syvende-ml fraksjonene (tomvolum) fra kolonnen og dialyseres i natriumbikarbonatbuffer, pH 9,5.
Legemiddel-antistoff-konjugatet merkes radioaktivt med<21>1At,1<25>i eller<131>i under anvendelse av de radiohalogenerte molekyler og fremgangsmåter som er beskrevet i publisert europeisk patentsøknad nr. 203 764. Radiomerkings-fremgangsmåten kan for eksempel innbefatte anvendelse av en para-jod-fenyl-forbindelse omfattende en kortkjedet substituent med en funksjonell gruppe som er reaktiv med et antistoff. Den funksjonelle gruppe kan være en estergruppe som reagerer med en fri amingruppe på antistoffet under binding av den radiohalogenerte forbindelse til denne. Det radiohalogenerte molekyl kan fremstilles ved substituering av den organometalliske gruppe Sn(n-Bu)3eller SnMe3på en halogenaromatisk forbindelse som omfatter kortkjede-funksjonell-gruppe-substituenten. Den organometalliske gruppe substitueres deretter med en radioisotop av et halogen ved halogen-avmetallisering.
Alternativt radiomerkes legemiddel-antistoff-konjugatet med 99<m>Tc, 18<8>Re eller 186Re under anvendelse av de ,,N2S2,,-chelaterende forbindelser og fremgangsmåter beskrevet i publisert europeisk patentsøknad nr. 188 256. I utgangspunktet bringes radio-nuklidene i form av pertechnetat eller perrhenat i kontakt med den chelaterende forbindelse i nærvær av et reduksjonsmiddel såsom et tinn(II)-ion. De resulterende radionuklidemetall-che-later festes til antistoffet ved at en funksjonell gruppe på chelat-forbindelsen (f.eks. en aktiv ester) omsettes med en funksjonell gruppe på antistoffer (f.eks. en fri aminogruppe).
Eksempel 8
Et kjemo-radio-toksin-immunokonjugat fremstilles som føl-ger. Pseudomonas-eksotoksin A (PE) konjugeres til et monoklonalt antistoff betegnet NR-ML-05 ved en tioeterbinding. Dette monoklonale antistoff bindes til et 250 kilodalton humant melanom-tilknyttet proteoglykan.
PE omsettes først med suksinimidyl-4-(N-maleimidometyl)cyk-loheksan-l-karboksylat (SMCC) i et molart forhold på 1:10 (pro tein:binder). Overskudd av heterobifunksjonelt reagens fjernes fra derivatisert PE ved gelfiltrering. NR-ML-05 behandles med 25 mM ditiotreitol (DTT) i 0,01 M fosfatbufret saltoppløsning, pH 7,5 (PBS), og overskudd av DTT fjernes ved gelfiltrering.
Det derivatiserte toksin og de reduserte antistoff-komponenter blandes og inkuberes ved romtemperatur i ytterligere 15 minutter. Konjugerings-reaksjonsblandingen blir deretter fraksjonert ved FPLC-gelfiltrering på en kolonne av typen TSK 3000 med 0,5 ml/min. under fraskillelse av konjugat fra ukonjugert antistoff og ureagert derivatisert PE.
PE/NR-ML-05-konjugatet omsettes med doksorubicin ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i Eksempel 4 (d.v.s. omsetting med EDCI fulgt av glutaraldehyd). Den samme fremgangsmåte anvendes ved to kontrollreaksjoner for fremstilling av et doksorubicin-PE-konjugat og et doksorubicin-NR-ML-05-konjugat. Antallet doksorubucin-molekyler festet til PE var 3, 10 var festet til NR-ML-05, mens antallet legemiddelmolekyler festet til PE/NR-ML-05 er lik 20.
En radionuklide festes til PE/NR-ML-05/doksorubicin-konjugatet under fremstilling av kjemo-radio-toksin-immunokonjugatet. Én av radiomerkings-fremgangsmåtene beskrevet i Eksempel 4 eller 7 ovenfor kan anvendes.
Eksempel 9
Fire legemidler festes hvert til et monoklonalt antistoff (MAb) betegnet NR-ML-05 i atskilte reaksjonsblandinger. NR-ML-05 bindes til et 250 kd humant melanom-tilknyttet proteoglykan. Legemidlene er anti-kreft-legemidlene doksorubicin, actinomycin D, bisantren og mitoksantron.
Reagens-oppløsninger fremstilles: en konsentrert antistoff-oppløsning (>5 mg/ml i PBS), konsentrert legemiddel (10 mg/ml i dH20) og et vannløselig karbodiimid (f.eks. EDCI) med 10 mg/ml i dH20. Fire mg (800 pl) MAb omsettes først med 2 mg (200 pl) legemiddel i 15 minutter ved 37°C i et vannbad. To mg (200 pl) karbodiimid tilsettes og omrøres i 30 minutter ved pH 5,5-6,0-Boratbuffer (pH 9) tilsettes (700 pl), og pH bør justeres til pH 8,5 (>pH 9 = purpurfarge). Fortynnet (0,25%) glutaraldehyd tilsettes (100 pl pr. 2 ml reaksjonsvolum og 4 mg protein) for å bringe sluttvolumet opp til 2 ml. Dette får reagere med legemidlet/antistoffet inntil oppløsningen begynner å bli uklar slik at en ikke lenger kan se gjennom den (ca. 15 minutter). To-ml reaksjonsblandingen anbringes over en PBS-ekvilibrert PD-10-Pharmacia-kolonne eller en HPLC/GC-kolonne, og 4 ml-fraksjonen som inneholder legemiddel/antistoff-konjugatet, oppsamles. Hvis det finner sted en omfattende utfelling, er det nødvendig med et sentrifugeringstrinn (3000 rpm ved 4°C i 20 minutter). Supernatanten anbringes over PD-10-kolonnen, og man måler proteininn-holdet (BioRad-fremgangsmåte sammenliknet med gammaglobulin-standard ved 595 nm) og legemiddelkonsentrasjonen (sammenliknet med fritt legemiddel med standard i 3 konsentrasjoner ved synlig bølgelengde ved 495 nm). Hvis nødvendig, kan produktet konsent-reres og renses ved ultrafiltrering eller kromatografisk.
Antallet legemiddel-molekyler pr. antistoffmolekyl, d.v.s. det "molare inkorporerings-forhold" (MIR) ble målt for NR-ML-05-doksorubucin-konjugatet ved synlige avsøknings-spektra oppnådd ved 400, 450, 475, 495 og 550 nm. Legemidlet var blitt tilsatt til reaksjonsblandingen med et 100 molart overskudd sammenliknet med MAb-protein, og de resulterende molare inkorporerings-forhold har et gjennomsnitt på 12 (min. 8 - maks. 18, n=10 kjørin-ger) . Konjugeringsutbyttet og MTR forbedres ved at reaksjonens slutt-pH bringes til 8,0-8,5 før glutaraldehyd-tilsetningen. MIR med glutaraldehyd alene gir et gjennomsnitt på 7-10 mens den første binder (det vannløselige karbodiimid, EDCI) bidrar med ytterligere 2-4 Dox-molekyler til proteinet, antakelig via en peptidbinding.
Denne "to-trinns"-fremgangsmåte (d.v.s. karbodiimid ved en pH på ca. 5,5-6,0 og glutaraldehyd ved en pH på ca. 8,0-8,5) kan anvendes til å binde legemidlene til andre proteiner enn antistoffer. Slike proteiner innbefatter andre måltilbindingsproteiner eller polymere mellomledd (f.eks. humant serumalbumin).
Radiomerking utføres under anvendelse av hvilken som helst egnet fremgangsmåte såsom én av de fremgangsmåter som er beskrevet i Eksempler 4 eller 7 ovenfor.
Ett konjugat fremstilt ved de ovenfor beskrevne fremgangsmåter, er doksorubicin-antistoff-<125>I, hvor antistoffet ér et F(ab)'2-fragment av monoklonalt antistoff NR-ML-05. Fremgangs måtene beskrevet i publisert europeisk patentsøknad nr. 203 764 (og p-jod-fenyl-reagensene omfattende en protein-konjugerings-gruppe beskrevet deri) ble anvendt for radio-jodering av konjugatet. Kjemo-radio-immuno-konjugatet ble funnet effektivt å lokaliseres på melanom-målceller ved biofordelings-undersøkelser under anvendelse av "nakne" mus med transplanterte tumorer. Konjugatet utryddet effektivt melanom-celler ved cytotoksisitets-analyser in vitro (f.eks. MTT-analyser).

Claims (14)

1. Konjugat, karakterisert ved at det omfatter et antistoff, minst ett terapeutisk middel og minst én radionuklide.
2. Konjugat ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter minst ett terapeutisk middel valgt fra gruppen bestående av kjemoterapeutiske midler, toksiner eller terapeutisk effektive fragmenter derav, og biologisk-respons-modifiseringsmidler eller terapeutisk effektive fragmenter derav.
3. Konjugat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at konjugatet omfatter minst én radionuklide valgt fra gruppen bestående av alfa-utstrålere og beta-utstrålere.
4. Konjugat ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter en diagnostisk effektiv radionuklide.
5. Konjugat ifølge krav 1, karakterisert ved at konjugatet omfatter et toksin, et kjemoterapeutisk middel, en terapeutisk effektiv radionuklide og et monoklonalt antistoff.
6. Materialblanding omfattende et konjugat av et kjemoterapeutisk middel og et antistoff, karakterisert ved at konjugatet har en effektiv mengde av en terapeutisk radionuklide bundet til seg.
7. Blanding ifølge krav 6, karakterisert ved at det kjemoterapeutiske middel er valgt fra gruppen bestående av antitumor-antibiotika, porfyrin og porfyrin-derivater, antitumor-alkyleringsmidler, "vinca" alkaloider og folinsyre-analoger.
8. Blanding ifølge krav 7, karakterisert ved at det kjemoterapeutiske middel er valgt fra gruppen bestående av doksorubicin, daunorubicin, andre antracyklin-derivater, metotreksat, aminopterin, vinblastin, vindesin, bleomycin, hema toporfyrin-derivat, dihematoporfyrin-eter, mitramycin, mitomycin, klorambucil, cytosin-arabinosid og fluordeoksyuridin.
9. Blanding ifølge krav 6, karakterisert ved at radionukliden er valgt fra gruppen bestående av alfa-utstrålere og beta-utstrålere.
10. Blanding ifølge krav 9, karakterisert ved at radionukliden er valgt fra gruppen bestående av 125I, 131I, 90Y, 67Cu, 188Re, 186Re, 211At og 212 Bi.
11. Konjugat ifølge krav 1 eller 6, karakterisert ved at antistoffet er et monoklonalt antistoff eller et fragment av et monoklonalt antistoff spesifikt for kreftceller.
12. Konjugat, karakterisert ved at det omfatter doksorubicin, en terapeutisk effektiv radionuklide valgt fra gruppen bestående av 125I, 131I, 90Y, 67Cu, <188> Re, 18 <6> Re, 21 <1> At og 21 <2> Bi, og et monoklonalt antistoff eller et fragment derav spesifikt for kreftceller.
13. Fremgangsmåte for utrydding av målceller hos et menneske eller et pattedyr, karakterisert ved at man til verten administrerer et konjugat ifølge krav 1 eller 6, hvor antistoffet er spesifikt for målcellene.
14. Fremgangsmåte for å feste et agens til et protein, karakterisert ved følgende trinn: a) proteinet omsettes med et molart overskudd av agenset under et første sett av reaksjonsbetingelser slik at agenset reagerer med en første funksjonell gruppe på proteinet under binding av én første del av agens-molekylene til proteinet, og b) reaksjonsbetingelsene forandres slik at ubundne agens-molekyler reagerer med en andre funksjonell gruppe på proteinet, hvorved en andre del av agens-molekylene bindes til proteinet.
NO881077A 1987-03-11 1988-03-10 Kjemo-radio-immuno-konjugater. NO881077L (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3070087A 1987-03-11 1987-03-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO881077D0 NO881077D0 (no) 1988-03-10
NO881077L true NO881077L (no) 1988-09-12

Family

ID=21855550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO881077A NO881077L (no) 1987-03-11 1988-03-10 Kjemo-radio-immuno-konjugater.

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0282057A3 (no)
JP (1) JPS63301833A (no)
CN (1) CN88102026A (no)
AU (1) AU1301788A (no)
DK (1) DK134288A (no)
NO (1) NO881077L (no)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0337598A3 (en) * 1988-02-26 1991-07-03 Georgia State University Foundation, Inc. Use of porphyrins and metalloporphyrins in the treatment of diseases caused by human immunodeficiency viruses
US5094950A (en) * 1988-06-07 1992-03-10 Nihon Medi-Physics Co., Ltd. Diethylenetriamine pentaacetic acid derivatives
US5135736A (en) * 1988-08-15 1992-08-04 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
IE63847B1 (en) * 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
EP0429624B1 (en) * 1989-06-19 1994-03-16 Akzo Nobel N.V. RADIOIMMUNOTHERAPY USING $g(a)-PARTICLES EMISSION
US5030450A (en) * 1989-11-28 1991-07-09 Abbott Laboratories Method for inhibiting nematode infection of plants with Nematostatic trichothecene compositions
WO1991013633A1 (en) * 1990-03-12 1991-09-19 Cancer Research Campaign Technology Limited Improvements relating to immunoradiotherapy
DE19514088A1 (de) * 1995-04-13 1996-10-17 Deutsches Krebsforsch Konjugat zur Behandlung von Entzünduns-, Infektions- und/oder Hauterkrankungen
JP2000506494A (ja) * 1995-10-18 2000-05-30 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 良性前立腺過形成の治療に有用な複合体
WO1998009651A1 (fr) * 1996-09-03 1998-03-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPLEXES D'ANTICORPS ANTI-INTEGRINE α3
CA2333125C (en) * 1998-05-26 2009-12-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Alpha emitting constructs and uses thereof
US7736651B1 (en) 2000-11-24 2010-06-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Alpha emitting constructs and uses thereof
CN1110322C (zh) * 1999-07-21 2003-06-04 中国医学科学院医药生物技术研究所 单克隆抗体Fab'-平阳霉素偶联物及其抗肿瘤作用
NO314537B1 (no) 1999-12-06 2003-04-07 Anticancer Therapeutic Inv Sa Reseptorbindende konjugater
ZA200305980B (en) 2001-02-12 2007-01-31 Res Dev Foundation Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof
JP2004535202A (ja) 2001-07-17 2004-11-25 リサーチ ディベロップメント ファンデーション アポトーシス促進性蛋白質を含む治療剤
DE102004016355A1 (de) * 2004-04-02 2005-11-03 Rösner Research GmbH & Co.KG Herstellung und Verwendung des Konjugats Methotrexat-Albumin als Mittel zur Immunosuppression bei GVHD
DE102004057196A1 (de) * 2004-11-26 2006-06-01 Rösner Research GmbH & Co.KG Verfahren zur Herstellung von Albumin-Konjugaten mit Nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR)
CA2666184A1 (en) * 2006-10-11 2008-04-17 Medvet Science Pty. Ltd. The use of a dna damaging agent and a ligand for the treatment of cancer
CN108226531A (zh) * 2017-12-27 2018-06-29 三诺生物传感股份有限公司 一种β2-微球蛋白检测试剂盒

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1986001720A1 (en) * 1984-09-13 1986-03-27 Cytogen Corporation Antibody therapeutic agent conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
DK134288A (da) 1988-09-12
DK134288D0 (da) 1988-03-11
EP0282057A2 (en) 1988-09-14
CN88102026A (zh) 1988-09-28
AU1301788A (en) 1988-09-15
JPS63301833A (ja) 1988-12-08
EP0282057A3 (en) 1990-03-07
NO881077D0 (no) 1988-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO881077L (no) Kjemo-radio-immuno-konjugater.
EP0732939B1 (en) Preparation and use of immunoconjugates comprising a VL-chain glycosylated at the Asn in position 18
US5194594A (en) Modified antibodies
US5990286A (en) Antibodies with reduced net positive charge
JPS6270377A (ja) ハプテンで修飾された診断薬および治療薬の抗体コンプレツクス
JPH0762032B2 (ja) 改良された放射性核種抗体カツプリング
JPS63503138A (ja) 診断および治療用抗体複合体
Casey et al. Preparation, characterisation and tumour targeting of cross-linked divalent and trivalent anti-tumour Fab'fragments
JP2012131808A (ja) 減少した正味の正電荷を有する抗体
Hudecz et al. Immunoconjugate design: a predictive approach for coupling of daunomycin to monoclonal antibodies
US20030235534A1 (en) Methods and compositions for radioimmunotherapy of brain and CNS tumors
US5380513A (en) Methods for reducing non-target retention of immunoconjugates and metabolites thereof
Hawkins et al. Delivery of radionuclides to pretargeted monoclonal antibodies using dihydrofolate reductase and methotrexate in an affinity system
WO1987004164A1 (en) Technetium-antibody conjugate
Foxwell et al. Conjugation of monoclonal antibodies to a synthetic peptide substrate for protein kinase: a method for labelling antibodies with 32P
JP4680387B2 (ja) ジスルフィド含有標的ベクターの部位特異的標識化
Ranadive et al. A new method of technetium-99m labeling of monoclonal antibodies through sugar residues. A study with TAG-72 specific CC-49 antibody
AU687145C (en) Preparation and use of immunoconjugates
Wu Novel bifunctional linkers for antibody chelation with radiometals
Frey Preparation, characterization and biological evaluation of cellobiose and dextran carriers of prosthetically labeled iodine-125 for use in radioimmunotherapy of tumors of glial origin
AU6843287A (en) Technetium-antibody conjugate