ES2299256T3 - Constructos que emiten particulas alfa y sus usos. - Google Patents

Abstract

El uso de un constructo que comprende un isótopo de bismuto que emite partículas alfa quelado a un anticuerpo que reconoce específicamente sitios en células tumorales en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor sólido de un diámetro mayor de 1 mm eliminando secuencialmente una o varias capas externas de las células tumorales bajo la administración repetida de la composición hasta que el tumor sólido sea erradicado.

Description

Constructos que emiten partículas alfa y sus usos.

Antecedentes de la invención Remisión a la solicitud relacionada

Esta solicitud de patente reivindica la protección conferida por la solicitud de patente provisional de EE.UU. número de serie 60/086.772, presentada el 26 de mayo de 1998, ahora abandonada.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general al campo de la radioinmunoterapia. Más específicamente, la presente invención se refiere a constructos que emiten partículas alfa con una alta actividad específica y a sus usos para eliminar grandes tumores u otras células implicadas en estados de enfermedad en seres humanos.

Descripción de la técnica relacionada

En la terapia con anticuerpos radiomarcados, una combinación de anticuerpos/radioisótopos, que ha sido optimizada para afectación masiva, no es óptima para tratar la enfermedad mínima residual (O'Donoghue et al. 1995). Los radionucleidos que emiten partículas beta de largo alcance, por ejemplo, son considerados generalmente apropiados para tratar la afectación masiva porque su alcance compensa la distribución no uniforme del anticuerpo que es típica de la afectación masiva. Estos radionucleidos, sin embargo, son inadecuados para reconocer células aisladas (Willins et al. 1994, Willins et al. 1995).

Formas de anticuerpos, tales como fragmentos que penetran el tumor sólido más rápidamente, lo hacen así debido a la afinidad. En el reconocimiento de grupos más pequeños, más penetrables, tales agentes son usados sólo con la desventaja de una menor afinidad. Esto contrasta con la quimioterapia, en la que una mayor eficacia contra la afectación masiva es también aplicable a la enfermedad mínima residual. La terapia con anticuerpos radiomarcados es fundamentalmente diferente de la quimioterapia en su mecanismo de acción. Aunque esté bien justificada para la quimioterapia, la "barrera del tumor sólido" no es apropiada para la radioinmunoterapia (Sgouros, 1995).

Para tratar la afectación masiva, el anticuerpo administrado intravenosamente debe extravasarse, difundirse a través de un espacio del fluido intersticial y luego distribuirse por todas las células positivas frente al antígeno (Figura 1A). Cada una de estas etapas está asociada a una barrera para el suministro (Gerlowski et al. 1986, Dvorak et al. 1988, Jain et al. 1988, Clauss et al. 1990, Fujimori et al. 1990, Sgouros et al. 1989, Sgouros 1992). Mediante el reconocimiento de células tumorales solas distribuidas hematológicamente o grupos de células tumorales, las barreras para el suministro del anticuerpo son minimizadas (Figura 1B). La dependencia terapéutica aparente con el tamaño del grupo y la carga tumoral es compatible con el análisis mediante modelado y las observaciones experimentales de penetración de anticuerpos (Saga et al. 1995).

En el reconocimiento de células tumorales diseminadas o micrometástasis, cada célula tumoral debe expresar al antígeno. Este requerimiento aparentemente severo puede contarse como una ventaja de los aspectos únicos del reconocimiento micrometastásico. El anticuerpo administrado intravenosamente no será rápidamente accesible a células potencialmente inespecíficas en el lado epitelial del sistema vascular. Es posible, por lo tanto, reducir los requerimientos de especificidad del anticuerpo cuando se trata la enfermedad, rápidamente accesible y hematológicamente distribuida usando radionucleidos de semivida más corta que se habrán descompuesto antes de la extravasación del anticuerpo. Reduciendo el requerimiento de la especificidad, pueden ser seleccionados antígenos que tengan una expresión más alta y más uniforme en las células tumorales (Riethmuller et al. 1994).

Se han propuesto ligandos de IgG que emiten alfa conjugados con bismuto 213 ó 212 para que sean útiles en seres humanos en la eliminación de células aisladas sólo. Hartmann et al. (Cancer Research 54: págs. 4362-70, 1994) describen la prevención de la formación de tumores sólidos cuando se inyecta bismuto radiomarcado en animales a los que les han sido previamente inyectadas células que inducen tumores o agentes. Este documento también sugiere que el bismuto radiomarcado es de uso limitado en el tratamiento de tumores sólidos voluminosos, ampliamente establecidos, debido a su corta semi-vida. Larsen et al. (Brit. J. Cancer, 77, págs. 1115-112, 1998) describen la inyección intra-tumoral de anticuerpos marcados con 211-Astatina pero de nuevo se desvía de esta terapia con grandes tumores debido a la pobre difusión de las partículas radiomarcadas. No se ha pensado que estos ligandos sean útiles en la eliminación de tumores sólidos o pequeñas colecciones micrometastásicas de células simples. Estas células aisladas o grupos de células son encontrados en la sangre, la médula ósea, los nodos de linfa, el hígado y el bazo o en colecciones regionales tales como pequeños depósitos metastásicos tal como en el fluido cerebrospinal, la ascitis o los fluidos pleurales de pacientes con leucemia y otros cánceres (Langmuir, 90; Geerlings, 93, pág. 474: Textualmente traducido "Para el Bi-213, no fue observada una eliminación específica, lo que es una indicación de la limitada aplicabilidad de este radionucleido en el tratamiento de tumores sólidos"; Simonson, 90; Huneke, 92; Macklis, 92; Kozak, 86; Scheinberg, 82). Esta creencia sostenida mundialmente de la aplicación de emisores de partículas alfa para células simples estaba basada en la corta longitud de la trayectoria de las partículas alfa (<100 micrometros), igual a aproximadamente 2-4 diámetros de célula y la corta semivida de los nucleidos (< 1 h). Como los emisores de partículas alfas se desintegran en gran parte entre las 3-4 horas, y el tiempo para que una IgG se difunda en un tumor grande está en el orden de días, según se pensaba, había pocas posibilidades de que una IgG que llevaba Bi-213 o Bi-212 pudiera penetrar más allá de 1 ó 2 células para lograr la eliminación de la célula. A partir de esto, solo células simples en la sangre, médula, hígado o bazo serían dianas razonables. Es por eso que los estudios iniciales se han focalizado hacia las leucemias, metástasis peritoneal, meningitis cancerosa en el fluido cerebrospinal, o depósitos micromestáticos en la médula ósea.

Se han propuesto estrategias para usar pequeñas cantidades (5-20 mCi) (de 1,85 a 740 MBq) de Bi-213 en ligandos marcados para matar células individuales tales como células de cáncer. Esta estrategia implica el uso de dosis simples de anticuerpo marcado con Bi-213 u otros ligandos. Sin embargo, estos métodos solos no permiten el uso de constructos que emitan partículas alfas porque fallan en tener en cuenta la necesidad de ligandos de actividad altamente específica para que la eliminación de células específica ocurra. Esta necesidad proviene de la naturaleza particular de la emisión de partículas alfas (alta transferencia de energía lineal y trayectoria extremadamente corta) que no existe para las emisiones beta o gamma que han sido usadas terapéuticamente previamente en seres humanos. Como consecuencia, mientras que un anticuerpo que emite partículas beta, que mata en un campo de radiación, puede ser eficaz para cualquier número de actividades específicas, un anticuerpo que emite partículas alfa va a ser eficaz sólo si un mínimo de un átomo puede ser proporcionado a cada célula, causando al menos 1 vía alfa por célula.

La técnica anterior es deficiente, primero, en la comprensión de la importancia de (y el requerimiento para) la alta actividad específica en el proceso de eliminación de células con una partícula alfa, y el segundo, en la comprensión de cómo se podrían eliminar tumores de más de un pequeño número de células. Por lo tanto, la técnica anterior es deficiente porque carece de medios eficaces para eliminar tumores grandes (> 1 mm de diámetro) u otras células implicadas en enfermedades humanas o animales usando constructos que emiten partículas alfa altamente específicos. La presente invención satisface esta necesidad y deseo antiguo en la técnica.

Sumario de la invención

La presente invención describe el uso de un constructo que comprende un isótopo de bismuto que emite partículas alfa quelado a un anticuerpo que reconoce específicamente sitios en células tumorales en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor sólido de un diámetro mayor de 1 mm eliminando secuencialmente una o varias capas externas de células tumorales bajo la administración repetida de la composición hasta que el tumor sólido sea erradicado. El isótopo de bismuto que emite partículas alfa puede ser el bismuto 213 o el bismuto 212.

La invención además describe el uso de un constructo que comprende actinio-225 que emite partículas alfa quelado a un anticuerpo que reconoce específicamente sitios en células tumorales en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor sólido de un diámetro mayor de 1 mm eliminando secuencialmente una o varias capas externas de células tumorales bajo la administración repetida de la composición hasta que el tumor sólido sea erradicado. Métodos para eliminar tumores grandes (antes se pensaba que no era posible, debido al corto desplazamiento de las partículas alfa) son descritos y documentados in vitro e in vivo frente a un modelo de cáncer humano. Se muestra la necesidad de constructos de actividad altamente específica (el número de isótopos por molécula de ligando) para permitir resultados terapéuticos. La necesidad de una actividad específica aún más alta para alcanzar la "cura" de un cáncer (también conocido como "probabilidad de control tumoral (TCP)" de uno) también es descrita. Estos conceptos no han sido descritos antes en la técnica, o han sido apartados de la técnica, y de ahí, que sean inesperados.

Los fármacos basados en sustancias que emiten partículas alfa pueden prepararse y administrarse de forma segura y repetida sin toxicidad extramedular. El fármaco hecho a partir de constructos marcados con Bi-213 mostró una farmacocinética compatible con un reconocimiento rápido, específico y estable reconociendo sólo los sitios de células cancerígenas apropiados. Una actividad antileucémica significativa fue vista al nivel más bajo. Los fármacos hechos a partir de constructos marcados con Ac-225 muestran que son más potentes (tanto como 1000 veces más en una base de mCi) que los constructos de Bi-213.

En una realización de la presente invención, el constructo que emite partículas alfa se administra (por medicación repetida) en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/m^{2} a aproximadamente 10 mg/m^{2}.

En otra realización de la presente invención, se proporciona el uso del constructo como se describe más arriba en este documento tal que el isótopo es administrado en una dosis adecuada para suministrar un mínimo de una vía alfa por célula como será descrito más abajo.

Breve descripción de los dibujos

Para que la materia en la que las propiedades anteriormente citadas, ventajas y objetos de la invención, así como otros que se harán claros, sea lograda y pueda ser entendida detalladamente, descripciones más particulares de la invención brevemente resumidas anteriormente pueden ser tenidas en cuenta como referencia a ciertas de sus realizaciones que se ilustran en los dibujos añadidos. Estos dibujos forman parte de la memoria descriptiva. Debe ser apreciado, sin embargo, que los dibujos añadidos ilustran las realizaciones preferidas de la invención y por lo tanto no tienen que ser considerados limitantes en su alcance.

La figura 1 muestra las barreras respecto al reconocimiento de anticuerpos de células tumorales. La figura 1A muestra el reconocimiento de un tumor sólido. El anticuerpo (Y) debe primero extravasar desde el capilar (cilindro), luego difundirse a través de un gradiente de presión fluido intersticial (flechas) para alcanzar las células tumorales (esferas). La figura 1B muestra el reconocimiento de la micrometástasis distribuida hematológicamente. La extravasación del anticuerpo y la difusión a través del fluido intersticial no son necesarias. Las células tumorales solas son directamente accesibles.

La figura 2 muestra la eliminación de esferoides grandes como si se "pelara una cebolla". Ambas secuencias esferoides muestran imágenes obtenidas después de una incubación de una noche con el anticuerpo marcado con Bi-213. La secuencia superior muestra que el tratamiento con el anticuerpo específico de PSMA elimina una capa de células alrededor de un núcleo que no crece más. Rondas adicionales de tratamiento eliminarán entonces el núcleo. De forma contraria, los esferoides en la secuencia inferior fueron tratados con un constructo no específico de control y siguen creciendo.

La figura 3 muestra la potencia de (Bi-213)CHX-A-DTPA-HuM195 y (Bi-212)CHX-A-DTPA-HuM195 en la eliminación de células de leucemia in vitro. La citotoxicidad fue medida usando células HL60 (CD33 +) (líneas de puntos) y células RAJI (CD33-) (líneas sólidas) usando actividades específicas en el intervalo de 0,2 mCi/mg (7,4 MBq/mg) a 30 mCi/mg (1110 MBq/mg). 2 x 10^{5} células en 100 ml fueron colocadas en placas de 96 pocillos. El anticuerpo marcado con bismuto fue añadido en los pocillos en una dilución en serie de modo que las concentraciones finales en los pocillos estuvieran en el intervalo de 0,02 a 20 mCi/ml (de 0,74 a 740 MBq/mg). Las placas fueron incubadas 24 h a 37ºC en 5% de CO_{2}. La viabilidad fue determinada por la incorporación de 3H-timidina, y se representa frente a la actividad específica. La figura 3A muestra la citotoxicidad con (Bi-212)CHA-DTPA-HuM195 como una función de la actividad específica y la dosis: 0,2 mCi/mg (7,4 MBq/mg) (HL60: líneas de puntos, símbolos blancos y RAJI: líneas sólidas, símbolos negros) 0,2 mCi/mg (7,4 MBq/mg) (cruces), 10 mCi/mg (370 MBq/mg) (círculos), 20 mCi/mg (740 MBq/mg) (diamantes) y 30 mCi/mg (1110 MBq/mg) (cuadrados). La figura 3B muestra la citotoxicidad de (Bi-213)CHX-A-DTPA-HuM195 como una función de la actividad específica y la dosis. RAJI: (símbolos negros) 2 mCi/mg (74 MBq/mg) (círculos) y 8 mCi/mg (296 MBq/mg) (triángulos); HL60: (símbolos blancos) 1 mCi/mg (37 MBq/mg) (triángulos), 2 mCi/mg (74 MBq/mg) (círculos), 4 mCi/mg (148 MBq/mg) (diamantes) y 8 mCi/mg (296 MBq/mg) (cuadrados).

La figura 4 muestra la viabilidad de células HL60 como una función del número promedio de átomos de Bi-213 calculado (Figura 4A) y átomos de Bi-212 (Figura 4B) unidos a la superficie de la célula. La línea representa el mejor ajuste lineal para los puntos de datos de citotoxicidad tomados a partir de los marcajes de bismuto que proporcionaron una actividad específica de aproximadamente 10 mCi/mg (370 MBq/mg). Esta actividad específica está en la región de alta eliminación selectiva de células HL60. Curvas con una pendiente similar pueden ser generadas a partir de los datos de citotoxicidad a otras altas actividades específicas (no mostrado).

La figura 5 muestra la potencia de Bi-213-J591 frente a la viabilidad de células LnCaP como una función de la actividad específica. Cuando la actividad específica es disminuida, la capacidad a la misma concentración de isótopo para eliminar las células dianas se reduce drásticamente.

Descripción detallada de la invención

Se han propuesto estrategias para usar pequeñas cantidades (5-20 mCi) (115-740 MBq/mg) de Bi-213 en ligandos marcados para eliminar células individuales tales como células cancerígenas. Esta estrategia implica el uso de dosis simples de anticuerpo marcado con Bi-213 u otros ligandos. Sin embargo, estos métodos solos no permiten el uso de constructos que emiten partículas alfas porque fallan en tener en cuenta la necesidad de ligandos de actividad altamente específica para que la eliminación de células específicas ocurra. Esta necesidad proviene de la naturaleza particular de la emisión de partículas alfas (alta transferencia de energía lineal y desplazamiento extremadamente corto) que no existe para las emisiones beta o gamma que han sido usadas terapéuticamente en seres humanos. Como consecuencia, mientras que un anticuerpo terapéutico que emite partículas beta que mata en un campo de radiación puede ser eficaz para cualquier número de actividades específicas, un anticuerpo que emite partículas alfa sólo será eficaz si un mínimo de un átomo puede ser proporcionado a cada célula. Para calcular la actividad específica requerida (los isótopos por molécula de ligando (o mCi por mg)), se requiere saber (1) el número de sitios diana y (2) la modulación y la farmacología del ligando. El número de sitios solo puede diferir en más de 1000 veces entre sistemas diferentes. Como un ejemplo de los amplios intervalos de sitios diana y características de ligando, véase la Tabla 1:

TABLA 1

1

Los requisitos mínimos para alcanzar la eliminación fiable de células dependen de: (1) el número de dianas receptoras (sitios de unión) en la célula diana; (2) la estabilidad del ligando en el sitio una vez reconocido; (3) la rapidez mediante la cual el ligando alcanza el sitio diana; (4) la afinidad del ligando respecto a su diana; y (5) el número total de sitios diana o sitios de unión no específicos en el huésped (paciente). Con aproximaciones de cada una de estas propiedades es posible estimar la actividad específica necesaria para hacer un agente eficaz en cada aplicación terapéutica. Por ejemplo, si una desintegración de Bi-213 (T1/2 de 46 minuto) es necesaria para alcanzar la eliminación de una célula sola, y el ligando radiactivo es estable en la célula durante al menos 3 horas, y el 50% de las desintegraciones están en la dirección incorrecta y gastan su energía fuera de la célula, y requieren 23 minutos para que el ligando alcance la célula después de la inyección y 23 minutos para preparar la dosis fabricada y administrarla en el paciente, y hay 10.000 sitios de unión por célula, entonces se debe marcar un mínimo de 1 de cada 2500 ligandos con un átomo de Bi-213 en el momento del final de la reacción para producir el radioligando. (Es decir, en el tiempo = 0, hay 1 átomo de Bi para cada 2500 IgG; en el tiempo = 46 minutos hay 1 átomo para cada 5000 IgG. Ya que hay 10.000 sitios posibles por célula, entonces 2 átomos alcanzarán la célula y en 3 horas uno se desintegrará con una partícula alfa en la célula y uno estará lejos de la célula, en promedio).

Éste es un cálculo aproximado de las condiciones para tratar una leucemia con HuM195 IgG marcado con Bi-213 (véase el ejemplo de su uso con éxito en seres humanos más abajo). Así, una actividad específica mínima de aproximadamente 10 mCi/mg (370 MBq/mg) es necesaria. Ya que hay un intervalo de 1-5 x 10^{10} células de leucemia diana posibles (es decir, 0,1-5 x 10^{10} sitios de unión en 10.000 sitios por célula) dependiendo de la etapa de la enfermedad, y aproximadamente el 50% del anticuerpo se une en última instancia a la célula diana debido a su afinidad, un intervalo de dosis de 0,05-2,50 mg de anticuerpo es necesario para saturar todos los sitios de unión disponibles y suministrar una dosis adecuada. Al contrario para un ligando con una farmacología similar y tiempo de preparación, pero 10 veces menos sitios (por ejemplo, un receptor de superficie de célula típico), se requiere una actividad específica de casi 1 átomo por 250 ligandos. Si fuera una IgG, entonces son necesarios aproximadamente 100 mCi (3700 MBq/mg) por mg. El fracaso de usar este nivel de actividad específica produciría que la mayor parte de células no recibirían ningún átomo radiactivo y de ahí una incapacidad para eliminar suficientemente la diana comparado con los tejidos normales. Así, una actividad específica mínima adecuada del constructo radiactivo es una característica integral de su descripción. Sin esta propiedad lo descrito no es posible para que un experto en la técnica prepare una dosis útil. Nótese que este concepto no es necesario para el uso de una "inmunotoxina" porque en este caso cada IgG es marcada con una molécula de toxina; además, el concepto no es necesario para el uso con ligandos marcados con emisores beta (I-131 o Y-90, etc.) porque estos isótopos matan en un campo más grande que a nivel de células individuales. Por lo tanto, este concepto es único y no se ha descrito previamente en radioinmunoterapia.

Un segundo concepto importante es la relación entre la actividad específica y la probabilidad de control tumoral. Las cuestiones radiobiológicas asociadas con la radioinmunoterapia de la micrometástasis son críticas para un diseño del tratamiento apropiado y para la interpretación de los resultados clínicos. El criterio inicial para la eficacia es mucho más difícil de satisfacer en el tratamiento de la micrometástasis que en el tratamiento de la afectación masiva mensurable. En la afectación masiva, el criterio inicial para la eficacia es el logro de una respuesta completa. Si se asume que el límite de detectabilidad en un paciente es 1 gramo o 10^{9} células; una respuesta completa de una lesión de 100 gramos requiere dos logaritmos de muerte celular. Una vez que ha sido lograda una eliminación de células adecuada, la remisión depende de la duración de la erradicación. Las remisiones duraderas son mucho más difíciles de alcanzar. En el tratamiento con adyuvante de micrometástasis, la duración de la remisión será la medida principal de eficacia. Ésta dependerá de la fracción de células que sobreviven después de la radioinmunoterapia y también en el tiempo requerido para que una población de células se duplique cuando la pérdida de células es insignificante, es decir, el tiempo de duplicación potencial. El tiempo de duplicación potencial de la mayor parte de células tumorales está en el intervalo de 2 a 15 días (Steel, 1989). Si el tratamiento inicial proporciona una remisión completa reduciendo la masa del tumor de 100 g a 0,1 g (3 logaritmos de muerte celular), y si el tiempo de duplicación potencial de las células tumorales es 15 días, entonces en aproximadamente 2 meses el tumor habrá crecido de nuevo a 1 gramo y la primera pruebas de una recurrencia será evidente. Si el tratamiento de adyuvante proporciona otros 3 logaritmos de muerte celular, después de 3 logaritmos de muerte inicial, entonces 10^{5} células tumorales permanecerán. Asumiendo, un tiempo de duplicación potencial de 15 días, se requerirán aproximadamente 7 meses antes de que el tumor se vuelva detectable. Si sólo una célula simple sobrevive después del tratamiento con adyuvante, se puede esperar una recurrencia en 15 meses.

Para alcanzar una cura (una supervivencia sin enfermedad de 5 años), la probabilidad de matar todas las células tumorales debe acercarse a 1. Esta probabilidad es equivalente a la probabilidad de control tumoral (TCP) y puede ser calculada a partir de: TCP=e^{-n\text{*}SF}, en la que n es el número inicial de células tumorales, SF es la fracción de supervivencia después del tratamiento y e es el número de Euler (2,71828...). Si, por ejemplo, después de la cirugía o la radioterapia 10^{5} células tumorales permanecen y éstas se reducen a una célula simple (n = 10^{5}; SF = 10^{-5}) entonces la probabilidad de control tumoral es 0,37. Un logaritmo de muerte celular adicional aumenta la probabilidad de control al 90%; una probabilidad del 99% es alcanzada después de 7 logaritmos de muerte celular. Cuatro logaritmos de muerte celular, lo que reduciría el número de células tumorales de 10^{5} a 10 células, sólo proporciona una probabilidad de control tumoral del 0,005%. En términos clínicos, el 37% de pacientes con 10^{5} células tumorales alcanzaría una supervivencia sin enfermedad de 5 años si la potencia del tratamiento fuera tal que 10^{5} células tumorales pudieran reducirse a 1 célula tumoral. Si el tratamiento fuera bastante potente para reducir 10^{7} células a una célula sola, el 99% de pacientes con 10^{5} células estaría sin enfermedad después de 5 años. Si, en la misma población de pacientes, el tratamiento redujera el número total de células a 10 de 10^{5}, sólo 5 de cada 100.000 pacientes sería curado. Aunque el análisis presentado anteriormente es una simplificación que no tiene en cuenta un número grande de factores que operan en la determinación del tiempo de recurrencia y la probabilidad de cura, los ejercicios destacan las diferencias fundamentales entre el criterio usado para evaluar a un agente contra mensurable frente a la enfermedad micrometastásica y entre la remisión y una remisión duradera/"cura". Como es evidente a partir del análisis, el número de células tumorales que permanecen en el paciente después del tratamiento de la metástasis primaria u observable será un determinante crítico de la eficacia.

Todos los constructos que emiten partículas alfa antes descritos fueron de tal baja actividad específica que la construcción de ligando frente a sus especificaciones habría proporcionado agentes ineficaces o agentes incapaces para inducir curas cuando se inyectaran en seres humanos. Además, las consecuencias de esta baja actividad específica no fueron reconocidas hasta el trabajo descrito en este documento porque el campo había confiado exclusivamente en el uso de emisores beta y gamma, y porque nadie ninguna vez había aumentado satisfactoriamente emisores alfa dirigidos para su uso es seres humanos.

Además de Bi-213, también se investiga un radionucleido Ac-225 que emite partículas alfa de larga vida (t_{1/2} =10 días). Ac-225, que emite 4 partículas alfa incluyendo 3 descendientes que emiten partículas alfa, debe ser mucho más potente que el Bi-213 que emite partículas alfa de semivida corta (t_{1/2} = 46 minutos) en la eliminación de células individuales, si se conservara dentro o en la célula, y esferoides multicelulares, si puede penetrar en el esferoide con el tiempo. Estas propiedades de Ac-225 pueden proporcionar una terapia con partículas alfa de tumores sólidos; Bi-213 no es probablemente útil para tratar tumores sólidos a no ser que puedan ser usadas múltiples dosis de fármaco para "pelar" despacio las capas de células tumorales. Se muestran los pros y los contras respectivos respecto a la utilización de Ac-225 y Bi-213 en la Tabla 2.

TABLA 2 Pros y contras del uso clínico de Ac-225 frente a Bi-213

2

La utilización de constructos de IgG-quelato de anticuerpos monoclonales relevantes y de control marcados con Ac-225, la potencia y la especificidad de constructos marcados con Ac-225 son investigadas en la eliminación de células tumorales y esferoides in vitro. El papel los constructos en la internalización celular y el catabolismo, y la retención del nucleido en las células también son evaluados.

Se supone que la generación de partículas alfa in vivo, en el sitio diana, por reconocimiento de un isótopo duradero que se desintegra vía 4 alfas, que puede ser unido y conservado dentro de la célula diana por modulación en un compartimento citoplásmico, proporcionará un fármaco que es aún más potente (tanto como 1000 veces más en una base mCi) que los constructos de Bi-213. Además, la larga semivida permitirá tratar tumores sólidos y lesiones micrometastásicas más grandes que son posibles con el Bi-213 de semivida corta. Los posibles sistemas diana en el estudio incluyen modelos de próstata y pecho. Dosis totales de menos de 1 mCi (37 MBq) son previstas.

En la presente invención, se describen constructos que emiten partículas alfa de alta actividad específica. Además, también son descritos métodos para eliminar tumores grandes u otras células implicadas en enfermedades humanas o animales usando los constructos que emiten partículas alfa.

La presente invención se refiere a un método para eliminar un tumor grande que comprende la etapa de administrar múltiples dosis de un constructo que emite partículas alfa al tumor. Específicamente, el tumor es más grande de 1 mm de diámetro. Preferiblemente, el constructo que emite partículas alfa comprende un anticuerpo, un fragmento, una citoquina, un ligando receptor y otros tales ligandos. Los ejemplos representativos de isótopos que emiten partículas alfa incluyen bismuto-213, bismuto-212 y actino-225. Generalmente, el constructo tiene una alta actividad específica de 0,1 mCi/mg (37 MBq/mg) a 50 mCi/mg (1850 MBq/mg). Es decir, el constructo se administra en una dosis adecuada para suministrar un mínimo de 1 vía alfa por célula. Preferiblemente, el constructo que emite partículas alfa, que se administra por medicación repetida está en una dosis de aproximadamente 0,1 mg/m^{2} a aproximadamente 10 mg/m^{2}.

La presente invención también se refiere a un método para eliminar un tumor por reconocimiento de los antígenos en el sistema vascular del tumor de un individuo en necesidad de tal tratamiento. En cuanto a esto, la presente invención proporciona el uso de un constructo que comprende un isótopo de bismuto que emite partículas alfa quelado a un anticuerpo que reconoce específicamente sitios en células tumorales en la preparación de un medicamento para la eliminación de un tumor por el reconocimiento de antígenos en el sistema vascular de un tumor de un individuo en necesidad de tal tratamiento. Preferiblemente, el isótopo de bismuto que emite partículas alfa es el bismuto-213 o el bismuto-212.

La presente invención proporciona además el uso de un constructo que comprende actinio-225 que emite partículas alfa quelado a un anticuerpo que reconoce específicamente sitios en células tumorales en la preparación de un medicamento para la eliminación de un tumor por el reconocimiento de antígenos en el sistema vascular del tumor de un individuo en necesidad de tal tratamiento.

Preferiblemente, el isótopo que emite partículas alfa es administrado en una dosis adecuada para suministrar un mínimo de 1 vía alfa por célula.

Como se usa en este documento, la "actividad específica (del constructo que emite partículas alfa)" se refiere al número de átomos radiactivos por molécula de ligando. Como se usa en este documento, la "probabilidad de control tumoral (TCP)" se refiere a la probabilidad de que un tumor se reducirá a un tamaño por debajo del cual éste no puede presentarse de nuevo. Como se usa en este documento, la "duración de la remisión" se refiere al tiempo después del tratamiento antes de que el tumor se presente de nuevo. Como se usa en este documento, el "tiempo de duplicado" se refiere al tiempo que le lleva a un tumor a doblar en su tamaño.

Se proporcionan los ejemplos siguientes con el objetivo de ilustrar varias realizaciones de la invención y no significan que limiten la presente invención de ninguna manera.

Ejemplo 1

Materiales y métodos

El Ac-225 es obtenido a partir del instituto europeo para la investigación transuránica, Karlsruhe, Alemania o del Ministerio de Energía de los Estados Unidos (Oak Ridge, TN o Hanford, WA). Aproximadamente 20-25 mCi (740-925 MBq/mg) del residuo Ac-225 fueron secados en la superficie interior de una ampolla de vidrio que estaba unida a un tubo de 1/32 pulgadas de diámetro (0,0793 cm) a un tubo de 5 cm por uno de polipropileno de 0,5 cm con ajustes reductores dentados, tapones de polietileno sinterizados, y alguna lana de vidrio lavada en ácido que contiene aproximadamente 200 mg de resina de AG MP-50 seca, 100-200 de malla, forma H^{+} (Laboratorios BioRad, Hercules, CA). La ampolla y la columna son desconectadas, y la ampolla ajustada con dos llaves de paso de 3 vías. El residuo en la ampolla de vidrio fue expuesto a 0,5 ml de HCl 3 M de calidad óptima (Fisher Scientific), fue añadido con una jeringuilla de 3 ml por una de las llaves de paso. El otro extremo de la ampolla de vidrio que contenía la solución de Ac-225 ácida fue venteado a la atmósfera usando un filtro de 0,22 mm (Corning) permitiendo la liberación de cualquier aumento de presión debido al calor o a la generación de gas. Al ácido 3 M se le permite ponerse en contacto con el residuo en la ampolla de vidrio durante 1 hora con agitación suave para disolver completamente todo el Ac-225. Después de 1 hora, una segunda jeringuilla que contenía 0,5 ml de agua sin metal fue unida, vía la llave de paso, y la solución de cloruro de actinio ácida fue diluida con cuidado. La solución ácida de actinio 1,5 M resultante fue retirada en la jeringuilla, la ampolla fue desconectada con cuidado y la jeringuilla con la solución de Ac-225 unida a la ampolla.

La resina en la columna fue lavada con 10 ml de HCl 1,5 M de calidad óptima, la resina fue retirada por lavado contracorriente y fueron colocados 100 mg en una jeringuilla limpia de 10 ml en 2 ml de una solución de HCl 1,5 M de calidad óptima. De los 100 mg restantes de la resina lavada, fueron cargados 50 mg de nuevo en la columna y un pequeño pedazo de la lana de vidrio de cuarzo lavado con ácido fue añadido para mantener la resina en su lugar. Esta sección de 50 mg de resina sirve como un tapón de captación para capturar cualquier Ac-225 que pudiera abrirse camino durante la elución rutinaria. La columna, la jeringuilla con la solución de Ac-225, y la jeringuilla de 10 ml fueron unidas todas vía una llave de paso de plástico de 3 vías. El extremo de la salida de la columna fue unido a una jeringuilla de 60 ml que será usada para aplicar una presión negativa al rellenar la columna.

La manipulación de la llave de paso de 3 vías permite que la solución de Ac-225 sea introducida en la jeringuilla que contiene la mezcla de resina AG MP-50. Se permitió a esta solución de Ac-225 y la mezcla de resina ponerse en contacto durante 30 minutos con agitación ocasional suave. Después de cargar el lote, el Ac-225 en el soporte de resina, fue manipulada la llave de paso de 3 vías de nuevo para cargar el Ac-225/resina en la columna. El aparato fue colocado de modo que la columna ahora estaba de pie verticalmente para permitir que el Ac-225/resina fluyera hacia abajo. La resina fue mezclada con cuidado antes de sacarla de la jeringuilla de 10 ml con una leve presión negativa para empaquetar la columna. La posición de la llave de paso usada al principio para la jeringuilla con la solución de Ac-225 fue unida después a una jeringuilla limpia con 10 ml de la solución lavadora de HCl 1,5 M de calidad óptima. Este lavado fue introducido en la jeringuilla de 10 ml donde la resina fue cargada, fue agitada ligeramente para aclarar la jeringuilla, y luego fue usada para lavar la columna del generador. La jeringuilla de 60 ml fue usada para tirar la solución de lavado por la columna. La columna fue desconectada de la llave de paso de 3 vías y un pequeño tapón de lana de vidrio de cuarzo lavada con ácido es aplicado para mantener la resina en el lugar. Una capa de 50 mg de resina fue añadida además para servir como segundo tapón para atrapar que es utilizado cuando el flujo de columna es invertido. Un pequeño pedazo de lana de vidrio de cuarzo lavada con ácido fue añadida de nuevo y la columna fue completada por la adición de un ajuste reductor dentado. El generador estaba entonces listo para usar. Se recomienda colocar verticalmente el generador eluyendo de modo que la parte de resina de captación este siempre sobre la parte superior de modo que se permita así que cualquier partícula fina producida no se sedimente y no obstruya
la resina.

Un tampón de HCl 0,1 M/NaI 0,1 M se prepara reciente cada vez y se usa para eluir Bi-213 de la resina. El Bi-213 alcanza el equilibrio secular con el Ac-225 después de aprox. 138-300 minutos (t_{1/2} de Bi-213 6,5). Se requirieron 2,5 ml de tampón de elución HCl 0,1 M/NaI 0,1 M para eluir el 98% del bismuto recuperable y 3,6 ml eluyen todo el bismuto recuperable. Una solución de HCl 0,1 M/NaI 0,1 M recién preparada es incolora sin embargo, después del paso en la resina del generador, ésta se eluye como una solución coloreada amarillo claro. La adición de 0,20 ml de acetato de amonio 3M fue requerida para tamponar 3,6 ml del eluato de HCl 0,1 M/NaI 0,1 M a pH 4-5. Una solución de 150 mg/ml de l-ácido ascórbico fue preparada en agua sin metal y el lote reaccionó con la resina Chelex-100^{TM} durante veinte minutos. Después de veinte minutos, la mezcla de l-ácido ascórbico/Chelex 100^{TM} es filtrada a través de un filtro de 0,45 mm y el eluato de l-ácido ascórbico sin metal fue recogido. Un volumen de este eluato se añade a la mezcla tamponada de Bi-213 para proporcionar una concentración final de l-ácido ascórbico igual a 5 mg/ml. El constructo de anticuerpo, CHX-A-DTPA-HuM195, entonces fue añadido a la solución tamponada de Bi-213 y fue incubado a temperatura ambiente hasta 20 minutos. Las reacciones que tardan más de 4 minutos típicamente causan una mayor pérdida del producto de Bi-213 debido a la desintegración que permitir que la reacción proceda más tiempo y que aumente el rendimiento del producto. Después de esta incubación, 0,020 ml de la solución de EDTA 10 mM fueron añadidos para inactivar la mezcla de reacción y quelar cualquier ión de radiometal reactivo libre. La inactivación fue necesaria cuando la reacción con el vehículo deseado no puede proceder cuantitativamente (incorporación de Bi-213 > 98%) en el producto deseado. Además, también son necesarios medios para separar el producto de reactantes y subproductos. El anticuerpo radiomarcado fue purificado de impurezas de bajo peso molecular rápidamente por cromatografía de exclusión por tamaños.

Ejemplo 2

IgG

HuM195 (Protein Design Labs, Inc., Mountain View, CA) es un anticuerpo monoclonal de IgGl recombinante que fue construido por combinación de las regiones CDR de M195 murino con regiones constantes y marco humanas. Ambos anticuerpos monoclonales de M195 se unen con alta afinidad al antígeno de CD33 (Scheinberg, 89; Caron, 92,94; Schwartz 93; Co, 92). El anticuerpo de J591 (reactivo con el antígeno de la membrana específico de próstata en células cancerígenas de próstata) fue gentileza del Doctor Neil Bander del Hospital de Nueva York.

Ejemplo 3

Conjugación del quelato a IgG

HuM195 fue conjugado a 2-(p-SCN-Bz)-ciclohexil-DTPA (CHX-A-DTPA), una estructura recientemente desarrollada del derivado sustituido de DTPA24, usando un método en una etapa (Nikula, 95a) o métodos convencionales (Mirzadeh, 90). El número promedio de quelatos por anticuerpo estaba en el intervalo de 5 a 10.

Ejemplo 4

Radiomarcaje

Bi-213: el generador de radionucleidos usado para la producción de Bi-213 con bajo nivel de actividad es descrito en otro lugar (Geerlings, 93; Kespersen, 95). La construcción de generadores capaces de producir 10-25 mCi (370-925 MBq) de Bi-213 requirió varias modificaciones. El generador fue lavado con HCl 0,001 M y luego fue eluido con de 0,5 a 1 ml de HCI 0,1 M, NaI 0,1 M para eluir Bi-213. Para el radiomarcaje de proteína, el eluato fue puesto en un intervalo de pH 4-4,5 con acetato de amonio 3 M e inmediatamente fue usado como se describe para Bi-206. Bi-212: El bismuto-212 fue eluido a partir de Ra224/Bi-212-generador 14 y HuM195 fue marcado en condiciones similares como se describe para Bi-213.

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Ejemplo 5

Recuento de Bi-213

La radiactividad de Bi-213 (energía de fotón 440 KeV, abundancia del 28%) fue cuantificada usando un calibrador de radioisótopos Squibb CRC-17 en un ajuste fijo que fue estandartizado usando el analizador de altura de pulso de varios canales Canberra. Un contador gamma de Cobra Packard (ventana de 340-540 KeV) fue usado para determinar que el número relativo de recuentos de Bi-213 incluye ITLC, ATLC, HPLC, proteína A, y muestras de células. Otros nucleidos fueron contados usando métodos estándar.

Ejemplo 6

Purificación de IgG conjugada con el quelato de radiometal

Constructos de CHX-A-DTPA-HuM195 radiomarcados fueron purificados tanto por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) usando una columna de exclusión por tamaños de Bio-Sil-250 (600 x 7,5 mm) con acetato de sodio 20 mM/cloruro de sodio 150 mM, fase móvil con pH 6,5 o usando cromatografía de baja presión empleando una columna de exclusión por tamaños de 10 DG (Laboratorios Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) con una fase móvil de albúmina de suero humano del 1%/cloruro de sodio del 0,9%.

Para determinar la eficacia del marcaje y la pureza de la mezcla de reacción y el producto final, una muestra de 5 ml fue retirada para la cromatografía instantánea en capa fina (ITLC) ((Gelman Science Inc., Ann Arbor, MI)32. Las placas fueron desarrolladas con EDTA 10 mM. En estas condiciones, el anticuerpo monoclonal permanece en el origen y el metal libre migra con el frente del disolvente. Las tiras fueron cortadas a rf=0,5 e incluyeron un contador gamma.

Ejemplo 7

Conjugación de HuM195 a CHX-A-DTPA

La eficacia del marcaje de HuM195 de CHX-A-DTPA con Bi-213 era típicamente mayor del 90% en actividades específicas de hasta 20 mCi/mg (740 MBq/mg), pero la eficacia disminuía en relación directa a la actividad específica deseada. Con actividades específicas de 50 mCi/mg, fueron alcanzadas eficacias del 50-70%. Esta reducción puede haber sido debida a las pequeñas cantidades de anticuerpo usado para alcanzar las actividades específicas más altas. La reacción de quelación corrió hasta casi la terminación (85%) en 6 minutos, pero se permitió que continuara durante 15-20 minutos para optimizar el marcaje. Sin embargo, debido a la corta semivida de Bi-213, la continuación de la reacción más allá de aproximadamente 5 minutos no aumenta el rendimiento final del producto marcado porque el producto es perdido por la desintegración. Estas eficacias de marcaje eran comparables con las vistas con In-111, Bi-206 y Bi-212 usando el constructo CHX-A-DTPA-HUM195.

La conjugación de HuM195 a CHX-A-DTPA causó la unión de hasta 10 moléculas de ligando por anticuerpo. Las altas relaciones de quelato a proteína no afectaron considerablemente la inmunorreactividad. La inmunorreactividad del CHX-A-DTPA-HuM195 marcado con metal varió del 80% al 95% y fue independiente de la actividad específica. Esto es compatible con las secuencias de aminoácidos en las regiones CDR del HuM195 (Nikula, 95b).

Ejemplo 8

Inmunorreactividad

La inmunorreactividad de los constructos de CHX-A-DTPA-HuM195 marcado con bismuto fue determinada como se describe por la incubación de 2 ng de anticuerpo monoclonal radiomarcado en un volumen de 30 ml total con un exceso de 20 a 30 veces de antígeno (10 x 10^{6} o 15 x 10^{6} células HL60 CD33 positivas). Estas células tienen aproximadamente 10.000-20.000 sitios de unión CD33 positivos por célula y tienen la capacidad de unir hasta el 90% del HuM195 añadido). Después de la incubación, las células fueron recogidas por centrifugación y la IgG no unida fue eliminada a un segundo grupo de células y fueron incubadas de nuevo con la misma cantidad de antígeno en exceso que en la primera incubación durante 90 minutos a 0ºC. En estas condiciones de gran exceso de antígeno en un pequeño volumen, la reacción llega casi a la terminación en 60 minutos. El porcentaje de inmunorreactividad fue calculado como igual a (Bi-206-IgG unido a células Nº. 1 más células Nº. 2)/(total unido más Bi-206-IgG unido) veces por 100. La unión específica en estos ensayos de radiounión fue confirmada por la falta de la unión del anticuerpo monoclonal radiomarcado a células RAJI CD33 negativas. Para evitar la unión del receptor de Fc y la no específica y, fueron realizados ensayos en presencia de suero humano del 2%.

Un ensayo rápido de cromatografía de afinidad en capa fina (ATLC) fue puesto en práctica para medir la inmunorreactividad de los constructos de Bi-213 de semivida corta (Zamora, 95). La inmunorreactividad fue evaluada como el porcentaje de constructo radiomarcado unido a la parte de la tira de papel que contiene el antígeno diana que fue preparado a partir de los extractos de células AL67 (transfectantes de CD33).

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Ejemplo 9

Modulación de complejos de anticuerpo-antígeno de la superficie celular

La internalización del complejo anticuerpo-antígeno de la superficie celular fue medida incubando 0,5 mg/ml de anticuerpo monoclonal radiomarcado con 5 x 10^{5} células con el tiempo a 37ºC. Peletes de células fueron lavados dos veces en RPMI, y luego el (Bi-206) CHX-A-DTPA-HuM195 unido a la superficie fue depurado con 1 ml de glicina 50 mM/NaCl 150 mM, pH 2,8, a 24ºC durante 10 minutos. La radiactividad total asociada por célula y la radiactividad resistente al ácido (interiorizada) fueron determinadas. Para evitar la unión no específica y de Fc, fueron realizados ensayos en presencia de suero humano del 2%.

Ejemplo comparativo 1

Eliminación de células

La potencia de (Bi-213)CHX-A-DTPA-HuM195 y (Bi-212)CHX-A-DTPA-HuM195 para matar células de leucemia fue medida usando 2 x 10^{5} células HL60 (CD33 +) o células RAJI (CD33-) en 100 ml en placas de 96 pocillos. Fueron añadidas diluciones en serie de anticuerpo marcado con bismuto a los pocillos para proporcionar la actividad final en los pocillos en el intervalo de 0,02 a 20 mCi/ml (de 0,74 a 740 MBq/mg). Los experimentos fueron hechos con diferentes actividades específicas del anticuerpo de bismuto (de 3 a 20 mCi/mg) (111-740 MBq/mg). Las placas fueron incubadas 24 h a 37ºC en 5% de CO_{2}. Después de la incubación, la viabilidad de las células fue determinada por la incorporación de ^{3}H-timidina. Para evitar la unión del receptor de Fc y no específica durante la incubación, los ensayos fueron realizados en presencia de suero humano del 2%.

Además, un quelato bifuncional, marcado con alta actividad específica, fue conjugado con un isotipo que emitía partículas alfa. La internalización, la alta inmunorreactividad, la eliminación de células tumorales in vitro, la relación entre la eliminación de células y la actividad específica fue demostrada con un total de 5 anticuerpos monoclonales diferentes: anti-CD33 humanizado de HuM195 frente a leucemias mieloides, anti-CD20 quimérico de C2B8 frente a linfomas, anti-PSMA de J591 de ratón frente al cáncer de próstata, anti-CD19 de SJ25C1 de ratón y B4 de ratón frente a leucemia de células B y linfoma. Así, múltiples ejemplos con anticuerpos de ratón, humano y quiméricos en varios sistemas de antígeno de tumor han sido documentados.

Ejemplo 10

Citotoxicidad específica: Eliminación de grupos de tumores grandes in vitro

La figura 2 demuestra, en un modelo de esferoide, la posibilidad de eliminar tumores más grandes por medicación repetida. Como puede ser visto en la figura, una dosis sola ha eliminado de 5 a 6 capas de células, dejando detrás "un núcleo" antes no expuesto de células que entonces pueden ser tratadas por una administración subsecuente. Al contrario, los esferoides de la misma línea celular, expuesta a un anticuerpo marcado con 213Bi no pertinente, siguen creciendo exponencialmente. Estos resultados están en contraste con las observaciones de Langmuir, et al. (1990), sobre la investigación del reconocimiento del anticuerpo marcado con 212Bi de esferoides grandes, que concluyó que debido a su semivida corta y al desplazamiento de las partículas alfa, los emisores alfa no serían eficaces contra tumores más grandes debido al tiempo requerido para la penetración del anticuerpo. La figura 2 ilustra que esto no será un factor restrictivo si es usada una medicación repetida.

Los experimentos de eliminación de células con diferentes actividades específicas de CHX-A-DTPA-HuM195 marcado con Bi-212 o Bi-213 mostraron la eliminación dependiente de la dosis y de la actividad específica de células HL60 CD33 +. El (Bi-212)CHX-A-DTPA-HuM195 fue al menos 10 veces más potente en la eliminación de células HL60 CD33 + comparado con células RAJI negativas con CD33 en 24 horas en ensayos in vitro (Figura 3A). La potencia frente a células HL60 diana específicas dependió directamente de la actividad específica (el número de Bi-212 por molécula de IgG) del anticuerpo marcado, mostrando las actividades específicas más altas (30 mCi/mg) (110 MBq/mg) la potencia más alta. Según la actividad específica fue disminuida hubo una pérdida de eliminación de células selectiva. La potencia para matar células HL60 a una actividad específica de 0,2 mCi/mg (7,4 MBq/mg) se acercó a la potencia para matar las células control de RAJI.

La dependencia de la selectividad sobre la actividad específica puede ser explicada examinando el número de sitios diana de CD33 sobre cada célula HL60 y el número de átomos de bismuto marcados por molécula de IgG de HuM195. A 0,2 mCi/mg (7,4 MBq/mg), sólo aproximadamente una IgG de 100.000 contenía un Bi-212. Como hay sólo 10.000 sitios de CD33 por célula, es improbable que pueda ocurrir la eliminación de células específica. La citotoxicidad no específica a partir de la radiación de partículas alfas en el medio, o a partir de constructos de anticuerpo unidos no específicamente a las células entonces dominan la actividad citolítica. Así, la eliminación de células HL60 a bajas actividades específicas del marcaje se acercó a la de RAJI. A la inversa, a actividades específicas de 20 mCi/mg (740 MBq/mg), aproximadamente una de cada 1000 moléculas de IgG de HuM195 están marcadas, permitiéndose así que un promedio de diez átomos de Bi-212 sean proporcionados a cada célula HL60 en la saturación. Por lo tanto, a altas actividades específicas, la citotoxicidad debe depender directamente de las características de unión de HuM195 para las células HL60. La isoterma de unión muestra el aumento exponencial de la unión desde 10 a 1000 ng/ml. La unión no específica muestra aumentos lineales, que comienzan a concentraciones más altas.

Una eliminación específica similar de células HL60 fue observada para (Bi-213) CHX-A-DTPA-HuM195 (Figura 3B). Con actividades específicas de 8-10 mCi/mg (296-370 MBq/mg), la potencia frente a células HL60 fue aproximadamente 10 veces más alta que frente a células RAJI. Como se esperaba, (Bi-212)CHX-A-DTPA-HuM195 era ligeramente más potente que (Bi-213)CHX-A-DTPHuM195; esto es porque con las mismas actividades específicas, más Bi-212 estaría conjugado por IgG de HuM195 debido a su semivida física más larga. Por lo tanto, para la unión equivalente de HuM195 a cada célula, serían proporcionados más desintegraciones alfa por constructos de Bi-212. Como con Bi-212, la potencia de eliminación de células dependió directamente de la actividad específica de átomos de bismuto por IgG, así como de la dosis total añadida.

Para determinar el número de átomos de bismuto necesarios para eliminar específicamente células HL60, los datos de citotoxicidad fueron representados de nuevo como una función de átomos de bismuto por célula (Figura 4). Se muestran los datos para eliminar a una actividad específica de 10 mCi/mg (370 MBq/mg). La viabilidad de las células HL60 era una función de los átomos de Bi-212 y Bi-213 unidos a la superficie de la célula. Para calcular la cantidad inicial de átomos de bismuto unidos a la superficie de la célula, la actividad específica y el análisis de Scatchard fueron usados para estimar el porcentaje de sitios de unión que son ocupados con HuM195. Las líneas en la Figura 4 representan el mejor ajuste para los puntos de datos que están en la región de eliminación específica. Esto es descrito por la función Y=111,24 x e-ln2x0,419X para Bi-213; en la que Y es la viabilidad y X el número de átomos de bismuto iniciales. La función es Y=87,42 x e-ln2x0,429X para los constructos de anticuerpo marcado con Bi-212. Estos datos proporcionan una dosis de LD50 de Bi-213 y Bi-212 que está en el intervalo de 2 a 2,5 átomos iniciales por célula.

Para mostrar que la eliminación específica no era propiedad única del sistema de leucemia, fueron llevados a cabo experimentos similares con el anticuerpo de J591 marcado con Bi-213 (Liu, 1997) y células cancerígenas de próstata humanas (células LnCaP). La misma dependencia en la actividad específica en este sistema fue observada (Figura 5).

Ejemplo 11

Tratamiento de tumores macroscópicos en animales

Para demostrar que los ligandos que emite partículas alfa tienen un efecto sobre los tumores macroscópicos in vivo, fue llevado a cabo un estudio de terapia en animales usando ratones desnudos a los que les fueron inyectados 15 millones de células tumorales LnCaP de próstata en sus muslos. Se permitió a los tumores crecer hasta hacerse visibles y tenían un diámetro de 3-5 mm. Un grupo de ratones entonces fue tratado con el anticuerpo de J591 marcado con Bi-213 específico para células cancerígenas de próstata y un grupo recibió un anticuerpo control a una dosis ligeramente más grande (Bi-213-HuM195). Como una medida cuantitativa de la actividad antitumoral, fue medido en el suero de ratones el antígeno específico de la próstata (PSA) antes y después del tratamiento. Una semana después del tratamiento, a los ratones que se les administró el anticuerpo control mostraron una subida media del 26% de PSA (n=4) mientras que los ratones tratados con el anticuerpo específico de J591 mostraron sólo un promedio de subida del 6% (n=4).

En un segundo experimento, 6 millones de células cancerígenas de próstata fueron inyectadas en los ratones. Los ratones fueron tratados con un anticuerpo control radiomarcado con Bi-213, ningún anticuerpo, o el anticuerpo específico de próstata J591 radiactivo marcado con Bi-213. A los 28-31 días, ambos grupos de control tenían síntomas de cáncer en el 50% de los animales. De forma contraria, en el grupo de tratamiento, se requirieron 46 días antes de que el 50% de los animales mostraran tumores. Como consecuencia, el anticuerpo de próstata que emite partículas alfa era capaz de reducir la marcha del crecimiento de un tumor macroscópico. Otros tumores que podían formarse por tal método incluyen tumores "benignos" tales como "hipertrofia prostática benigna" causada por el sobrecrecimiento neoplásico (pero no maligno) de la próstata; esta condición aflige a millones de hombres en todo el mundo.

Ejemplo 12

Eliminación de tumores más grandes por eliminación con partículas alfa del sistema vascular

Como el ligando que lleva el isótopo que emite partículas alfa no se difunde probablemente en un tumor grande durante el período en el cual el isótopo es todavía radiactivo (debido a la corta semivida de los isótopos), un método alternativo para eliminar con estos constructos es matar sin necesidad de difusión. Por ejemplo, es posible suministrar rápidamente (en unos minutos) el ligando que emite partículas alfa a la sangre en tejidos y órganos bien vascularizados (véase el ejemplo 14 más abajo). Si se puede tratar el sistema vascular del tumor en sí mismo, mejor que las células tumorales, sería posible eliminar los tumores selectivamente por este método. Tal método ha sido demostrado para ligandos naturales o conjugado con quimioterapia o anticuerpos (Arap et al., Science, 1998). Ninguna sugerencia de usar constructos que emiten partículas alfas fue previsto en esta técnica anterior. Sin embargo, basado en los datos contenidos en este documento, puede ser deducido que tal enfoque sería acertado también. Un tal ligando capaz de tratar el sistema vascular es el anticuerpo J591 (Liu, 1997) (véase la Figura 5). Este anticuerpo reconoce el antígeno PSM encontrado selectivamente en el sistema vascular del tumor así como en células cancerígenas de próstata.

En contraste con las enseñanzas de la técnica anterior, pueden ser tratados tumores sólidos por ligandos conjugados con partículas alfa y es posible eliminar tumores más grandes usando ligandos que emiten partículas alfa de semivida corta. La presente invención demostró en un modelo in vitro usando grupos de tumor "esferoides" (conteniendo muchos miles de células) que es posible primero eliminar selectivamente las capas externas de un tumor (2-4 células de espesor) y así exponer las siguientes capas interiores para la eliminación. De este modo, por dosis repetidas del fármaco, separadas en un tiempo para permitir la eliminación de las capas externas, es posible eliminar tumores más grandes. Este método puede ser comparado con "pelar las capas de una cebolla" y no fue obvio hasta que ha sido demostrado in vitro e in vivo en este documento. Finalmente, se mostró que era verdadero en un modelo in vivo de animal que tenía tumores macroscópicos.

Los experimentos de eliminación de células mostraron que la eliminación de células específicas con los constructos de (Bi-213)CHX-A-DTPA-HuM195, (Bi-212)CHX-A-DTPA-HuM195 y (Bi-213)CHX-A-DTPA-J591 eran dependientes tanto de la dosis como de la actividad específica de marcaje. Ambos isótopos de bismuto mostraron la eliminación de aproximadamente el 50% cuando dos átomos de bismuto eran unidos inicialmente a la superficie de la célula diana. Como hay aproximadamente 10.000 sitios de CD33 por célula, esto implica que sólo 1 anticuerpo monoclonal en varios miles tendrá que ser marcado para conseguir altos niveles de eliminación de células. A causa de la rápida disminución del ángulo sólido ocupado por las células diana en relación con la IgG en la solución, la posibilidad de que las partículas alfa que son emitidas desde puntos de partida más allá de la superficie de la célula diana puedan golpear el núcleo de la célula se hace insignificante a distancias cortas lejos de la célula. Asimismo, la eliminación de células más eficiente ocurrirá a partir de aquellas emisiones que ocurran desde el bismuto interiorizado. Una emisión a partir de una IgG unida a la superficie también puede pasar inofensivamente lejos de la célula. Como aproximadamente el 50% de CHX-A-DTPA-HUM195 radiomarcado es interiorizado en la célula en 60 minutos, estos datos sugieren que es probable que una emisión alfa de un átomo dentro de la célula es capaz de eliminar tal célula. Cuando el número inicial de átomos de bismuto unidos por célula es de 2 a 2,5 y el promedio del tiempo de internalización es de 60 minutos, hay aproximadamente un 60% de células en las cuales ningún átomo de bismuto está dentro, basado en la distribución de Poisson y en la probabilidad de que el átomo de bismuto sea interiorizado. A altas actividades específicas, la eliminación del 50% de células HL60 a las 24 h fue observada con los constructos que emitían partículas alfa a concentraciones de IgG de 3,3-25 ng/ml (20-160 pM). Una conversión a la IgG marcada con bismuto real muestra que sólo 5-10 pg/ml (30-60 fM) del radioinmunoconjugado son requeridos en la dosis eficaz del 50%.

Una característica importante de las curvas que describen la eliminación de células por emisores alfa es la marcada dependencia de la actividad específica del radioconjugado. Se mostró esto con 3 experimentos, usando 2 isótopos diferentes que emitían partículas alfa y tanto en leucemia como en un tumor sólido. Como la eliminación requiere la administración específica del bismuto a o en la célula, como el número de átomos de bismuto por HuM 195 cae a niveles cerca de 1 bismuto por 10.000 moléculas de IgG, la capacidad de reconocer dianas se aproxima a lo visto con una célula no específica diana. En este caso, el HuM195 no marcado compite por los sitios con el CHX-A-DTPA-HuM195 marcado con bismuto. Este efecto es bastante pronunciado en este sistema debido al pequeño número de sitios de unión de reconocimiento (aproximadamente 1-4x10^{4}) en células HL60, y células LnCaP respectivamente.

Ejemplo comparativo 2

Demostración de la utilidad clínica del ligando de alta actividad específica para tratar un cáncer humano en pacientes

A continuación se expone un experimento clínico (protocolo) que describe un uso posible de un constructo de reconocimiento que emite partículas alfa. Este experimento describe el uso de IgGI de HuM195 para tratar con bismuto 213 en células de leucemia y demuestra que los constructos son estables, proporcionarán el isótopo a las células en un ser humano, y matará las células de leucemia sin una toxicidad aparente en los tejidos que no son diana. Tal esquema podría ser usado con otro emisor alfa, tal como el bismuto-212 unido establemente a éste u otro ligando, tal como un anticuerpo o fragmento, citoquina o ligando receptor, cada uno de los cuales que sea capaz de unirse con afinidad específica y alta a una célula diana o tejido. Además, tales ligandos podrían ser usados también selectivamente para eliminar dianas no malignas tales como células linfoides implicadas en un proceso patológico tal como la inflamación o la autoinmunidad, o células de médula ósea normales para permitir un trasplante de médula ósea o trasplante de otro órgano o tejido, o células con crecimientos anormales que tienen que ser eliminadas porque están implicadas en un proceso patológico tal como enfermedad de arteria coronaria u otras enfermedades oclusivas vasculares.

Los objetivos del protocolo clínico son determinar la seguridad y la toxicidad de HuM195 marcado con 213-Bi en pacientes con malignidad mieloide recurrente o reincidente, para determinar la farmacología y la dosimetría de 213-Bi-HuM195 y estudiar los efectos biológicos de 213-Bi-HuM195, incluyendo la capacidad de obtener respuestas con el anticuerpo antihumano humano (HAHA) y respuestas antileucémicas.

La leucemia mielógena aguda (AML) es un tipo predominante de leucemia aguda en adultos. Mientras que la mayor parte de los pacientes son capaces de alcanzar una remisión completa con una quimioterapia que consiste en citosina arabinosida y una antraciclina, la supervivencia prolongada sin enfermedad es de menos del 20%. Las tentativas de una reinducción producirán segundas remisiones en sólo el 20- 25% de los pacientes, con frecuencia con una esperanza de vida de menos de 6 meses. Menos del 5% de los pacientes con recaídas sobrevivirá un año.

La leucemia mieloide crónica (CML) es un trastorno bifásico de precursores hematopoyéticos precoces. La fase crónica (con una duración mediana de 4 años) está asociada con elevaciones marcadas de leucocitos maduros y que maduran y conducen invariablemente a una fase blástica que se parece a la leucemia aguda. Se ha mostrado que el tratamiento con interferón alfa erradica la aparición del cromosoma Filadelfia por análisis citogenético en una minoría de pacientes. El tratamiento con quimioterapia convencional, sin embargo, no ha tenido ningún impacto sobre la historia natural de esta enfermedad. El trasplante alogénico de médula ósea es la única opción potencialmente curativa para estos pacientes. Ya que los pacientes en las fases aceleradas o blásticas de CML generalmente no se benefician del trasplante, se han hecho esfuerzos para trasplantar a estos pacientes durante la fase crónica inicial de su enfermedad.

Clasificada como un síndrome mielodisplásico, la leucemia mielomonocítica crónica (CMMOL) está definida por la presencia de un recuento de monocitos mayor de 1 H 10^{9}/L, monocitosis de la médula ósea, anemia y trombocitopenia. La supervivencia es de varias semanas a años, con una supervivencia mediana de 30 a 41 meses. El tratamiento es sobre todo paliativo; puede ser usada hidroxiurea para controlar los altos recuentos de leucocitos de la sangre periférica.

El antígeno CD33 es distintivo entre los antígenos hematopoyéticos en su distribución restringida, y M195 (anti-CD33) es eficaz en el reconocimiento de células de leucemia in vitro. M195 es un anticuerpo monoclonal de IgG2a derivado de un ratón inmunizado con mieloblastos leucémicos humanos vivos. La especificidad de unión de M195 está restringida a líneas celulares de leucemia mieloide y monocítica y una fracción de monocitos adherentes maduros. Aproximadamente 10.000 sitios de unión del anticuerpo por célula son expresados en líneas celulares de leucemia mieloide o monocítica y 5.000 sitios en monocitos maduros.

El M195 muestra reconocimiento frente a células de leucemia en seres humanos. Diez pacientes con leucemia mieloide fueron tratados en un ensayo en fase I con una intensificación de las dosis de M195 de ratón. El M195 fue marcado con trazas de ^{131}I para proporcionar estudios farmacocinéticos detallados y dosimétricos mediante muestreo en serie de sangre y médula ósea y diagnóstico por imágenes con cámara gamma de cuerpo entero. Dosis totales de hasta 76 mg (40 mg/m^{2}) fueron administradas de forma segura sin ningún efecto inmediato adverso. La adsorción de M195 en células leucémicas in vivo fue demostrada por biopsia, farmacología, citometría de flujo y diagnóstico por imágenes. La saturación de los sitios de unión disponibles ocurrió con dosis mayores de 5 mg/m^{2}. La médula ósea entera fue visualizada específicamente y claramente comenzando a las varias horas después de la inyección. El M195 fue interiorizado rápidamente después de la unión a las células diana. Una dosis estimada de hasta 34 rad/mCi fue suministrada a la médula, indicando que dosis ablativas de médula ósea entera de ^{131}I podían ser llevadas por M195.

El M195 humanizado (HuM195) es un constructo de M195 totalmente humanizado que tiene mejores actividades bioquímicas e inmunológicas. El M195 humanizado injertado con la región determinante de complementariedad (CDR), conservando sólo los CDR y otros aminoácidos estéricamente importantes de M195 de ratón fueron construidos usando marcos de IgGl de ser humano. Fueron cultivadas in vitro lineas celulares de mieloma de ratón Sp2/0 que secretaban M195 humanizado y los anticuerpos fueron purificados en PA-Sepharose por cromatografía de afinidad usando eluciones en paso de pH secuenciales. La pureza fue determinada en geles de SDS-poliacrilamida teñidos con azul brillante de Coomassie. El constructo de HuM195 mantuvo la especificidad de unión confirmada frente a un panel de líneas celulares CD33+ y CD33- y radioinmunoensayos.

El HuM195 muestra el reconocimiento específico de leucemia sin inmunogenicidad in vivo. La toxicidad, la farmacología, la dosimetría, el desarrollo de las respuestas de anticuerpos antihumanos humanos (HAHA) y los efectos antileucémicos de HuM195 fueron estudiados en pacientes con leucemias mieloides recurrentes o reincidentes. Trece pacientes fueron tratados con un programa dos veces semanales durante 3 semanas con 4 niveles de dosis en el intervalo de 0,5 a 10 mg/m^{2}. Los emisores alfa ahora fueron conjugados vía un quelato bifuncional (CHX-A-DTPA) a HuM 195 con una alta eficacia (>90%) y altas actividades específicas (hasta 20 mCi/mg).

Ejemplo 13

Producción del anticuerpo y marcaje

El HuM195 es producido por Protein Design Labs, Inc. (Mountain View, CA). Las líneas celulares de hibridoma Sp2/0 que secretan HuM195 son cultivadas en medio sin suero. El HuM195 es purificado a partir de los sobrenadantes concentrados por cromatografía de afinidad seguido de etapas de purificación adicionales. El HuM195-CHX-A-DTPA se prepara bajo contrato en TSI Washington (Rockville, MD). El HuM195-CHX-A-DTPA es suministrado como una solución a 10,6 mg/ml y es almacenado a -70ºC.

Los generadores de 213-Bi de calidad clínica capaces de producir 25-50 mCi se preparan en Sloan-Kettering. El actinio es suministrado seco en una ampolla de vidrio por el Transuranium Elements Institute en Karlsruhe, Alemania. El 213-Bi es eluido desde el generador y quelado con HuM195-CHX-A-DTPA, seguido por la separación de 213Bi-HuM195 por cromatografía de exclusión por tamaños. Los sensores para OD280 y emisiones gamma son usados para determinar el rendimiento y la actividad específica. Puede ser añadido HuM195 no marcado para ajustar la dosis cuando sea necesario. Esto será realizado en el Instituto de Sloan-Kettering inmediatamente antes de la inyección en los pacientes. El 213Bi-HuM195 se diluye en solución salina normal con albúmina de suero humano del 1% (HSA) en un volumen total de 10 ml por inyección 213Bi-HuM195-CHX-A-DTPA es fabricado y analizado de acuerdo con un IND aprobado por la FDA.

Las requerimientos de elegibilidad de los pacientes son que (1) los pacientes deben tener confirmado patológicamente el diagnóstico de AML (recurrente o reincidente hasta al menos 2 cursos de quimioterapia de inducción estándar), fase acelerada o mieloblástica de CML, o CMMOL; (2) mas del 25% de los blastos de la médula ósea deben ser positivos frente a CD33; (3) los pacientes deben tener una esperanza de vida de al menos 6 semanas y un estado de funcionamiento Karnofsky de > 60%; (4) los pacientes no deben haber recibido quimioterapia o radioterapia durante al menos 3 semanas antes del tratamiento, excepto la hidroxiurea que debe ser abandonada 2 días antes del tratamiento. Los pacientes deben haberse repuesto de los efectos del tratamiento anterior y mostrar signos claros de leucemia activa. Los pacientes no deben tener recuentos de blastos rápidamente acelerantes o enfermedad clínicamente inestable; (5) los pacientes deben tener una creatinina en suero <1,5 veces el límite superior normal, bilirrubina#1,0 mg/dl y fosfatasa alcalina y SGOT #2,5 veces el límite superior normal. (Estos representan grados de toxicidad de 0 ó 1 por los criterios de toxicidad NCI comunes.); (6) los pacientes deben firmar el consentimiento informado.

Los pacientes son tratados en una base de paciente en régimen ambulatorio o paciente hospitalizado. Considerando la corta semivida de 213Bi, la irradiación al personal del hospital es mínima y no se requiere aislamiento de radiación para los pacientes. Los pacientes son controlados por un técnico de seguridad de radiación que es instruido sobre la eliminación apropiada de los restos. Además, los pacientes son descargados durante dos a tres horas después de la infusión, por lo que en este tiempo cualquier radiación gamma restante es trivial. Los pacientes recibirán 213Bi-HuM195 por un pulso IV, en dosis divididas, 1-4 veces a diario, entre 3-4 horas. El esquema con incremento escalonado de dosis siguiente es empleado: nivel de dosis 1 (0,28 mCi/kg) (10,36 MBq/kg); nivel de dosis 2 (0,42 mCi/kg) (15,54 MBq/kg); nivel de dosis 3 (0,56 mCi/kg) (20,72 MBq/kg); nivel de dosis 4 (0,7 mCi/kg) (25,90 MBq/kg), etcétera con otros incrementos escalonados si fuera necesario.

Los signos vitales (pulso, tensión arterial, velocidad respiratoria, temperatura) serán controlados y registrados antes del tratamiento, 30 y 60 minutos después de la infusión, y cada hora a partir de entonces durante 4 horas. Los siguientes análisis serán hechos: CBC, diferencial, recuento de plaquetas: dos veces al día durante el tratamiento, luego Q 4 semanalmente, luego Q 3 mensualmente. Electrólitos, BUN, creatinina, perfil bioquímico: a diario durante el tratamiento, luego Q 4 semanalmente, luego Q 3 mensualmente. Anticuerpos antihumanos humanos: antes del tratamiento y mensualmente después de Q 4. Diagnóstico por imágenes con cámara gamma: Continuamente durante 60 minutos después de la inyección de la primera y última dosis y de nuevo a los 90 minutos después de la inyección de la primera y última dosis. Médula ósea y biopsia, incluyendo inmunofenotipado: 7-10 días y 4 semanas después del tratamiento. Farmacocinética: 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120 y 180 minutos después de la primera y última dosis.

Doce pacientes han entrado en cuatro niveles de dosis. Más de 50 dosis del fármaco fueron sintetizadas de acuerdo con los datos específicos y fueron inyectadas en los pacientes. Las dosis podrían prepararse a partir del generador al menos cada 3-4 horas. El generador proporcionó el fármaco que satisfizo los datos específicos durante al menos nueve días permitiendo el tratamiento de los pacientes. Fue evaluada la farmacocinética en tiempo real mediante diagnóstico por imágenes con cámara gamma y el trabajo de sangre sucesivo. El fármaco reconoció primero los sitios de leucemia y las células de monocito/macrófago en el hígado y el bazo. La médula ósea fue reconocida después. Con el tiempo, con inyecciones sucesivas, la respuesta en el hígado disminuyó al 50% según los sitios fueron saturados, y la respuesta en la médula ósea aumentó al 100%, según más fármaco estaba disponible. Las dosis estimadas de radiación en el REM al cuerpo entero, riñones u otros órganos no diana eran de 0,03; a la sangre 125; al hígado 600; al bazo 1400; 1 y al tuétano rojo 1100. Las relaciones de dosis diana y no diana fueron por lo tanto 25.000-50.000 a uno. No hubo ninguna toxicidad aguda en ningún paciente. No hubo ninguna toxicidad extramedular vista en ningún paciente. En la mayor parte de los pacientes, los recuentos de células en sangre periférica (blastos de leucemia y leucocitos) comenzaron a caer a las 48 horas después del tratamiento y se redujeron hasta el 90%. Los recuentos volvieron a las dos semanas. La médula ósea en una semana mostró una celularidad reducida y se redujeron los porcentajes de blastos de leucemia en la mayoría de los pacientes (hasta una reducción del 70%).

Ejemplo 14

Constructos marcados con Ac-225

Los constructos marcados con Ac-225 son evaluados para determinar su estabilidad in vitro a 37ºC usando un ensayo de perlas de proteína A que evalúa el Ac-225 libre y el Ac-225 unido a Ig (Nikula et al., 1999). La detección de radionucleidos se lleva a cabo usando detección por ionización de gas (GID) o análisis multi-canal de altura de pulso (MCA) con un detector de alta pureza de Ge (HPGe).

La potencia y la especificidad de los constructos marcados con Ac-225 relevantes frente a los constructos de control marcados en la eliminación de células aisladas y esferoides multicelulares son evaluadas in vitro como una función de la actividad específica y la concentración de actividad. Un ensayo de incorporación de ^{3}H-timidina es usado para averiguar el número de células que sobreviven a la exposición del Ac-225 diana (Nikula et al., 1999). La capacidad, y cuando sea aplicable, la tasa de internalización, de constructos de IgG marcados con Ac-225 en líneas celulares diana es investigada como se describe anteriormente para el constructo de HuM195 marcado con Bi-213.

La retención de Ac-225 en células individuales y esferoides multicelulares como una función del tiempo es evaluada exponiendo un exceso de constructo de IgG marcado con Ac-225 frente a antígenos de células, incubando durante un tiempo apropiado, lavando y resuspendiendo en el medio recién preparado. La reactividad que permanece con las células y la actividad en el sobrenadante y el lavado entonces es cuantificado. Las células expuestas y esferoides son mantenidas durante 10 días (una semivida de Ac-225) y cada día las células son centrifugadas y un volumen fijo de sobrenadante y un volumen fijo de células concentradas son probadas para detectar los niveles relativos de Ac-225 y la composición de radionucleido de los componentes respectivos. La cuantificación y la caracterización de radionucleidos se lleva a cabo como se describe antes.

Una variedad de nuevos agentes quelantes que pueden ser potencialmente más estable in vivo que el resto [Ac-225] CHX-A-DTPA será utilizada. Al principio, se investiga la capacidad de quelación para determinar la cinética relativa y la termodinámica de quelación de actinio. La tasa de incorporación de quelato de Ac-225 se evalua por técnicas de cromatografía instantáneas de capa fina usando papel impregnado con gel de sílice y un pH básico, fase móvil acuosa. La estabilidad termodinámica se evalua en una base relativa frente a la exposición a EDTA e incubación en suero o medio a 37ºC durante varios días. Los agentes quelantes se evalúan de esta manera para encontrar aquellos capaces de una Kd rápida en reacción, alta, y una estabilidad adecuada para su utilización in vivo. Además son desarrollados agentes quelantes candidato por la preparación de constructos con el anticuerpo monoclonal estudiado.

Ejemplo 15

Resultados preliminares de constructos de Ac-225

Se han evaluado varias condiciones de marcaje con Ac-225 y se han determinado condiciones para el marcaje rápido. Los rendimientos de [Ac-225]-CHX-AHuM195 son del 30-40% después de 10 minutos a temperatura ambiente. La estabilidad del resto CHX-A-DTPA quelante fue examinada in vitro en 1, 3, 24 y 96 horas, y el porcentaje de Ac-225 unido a HuM195 fue 100 \pm 0, 100 \pm 0,84 \pm 2, y 44 \pm 13, respectivamente para medidas por duplicado.

La eliminación de células HL60 frente a Raji con [Ac-225]HuM195 a actividades específicas de 0,12 y 0,0012 Ci/g (4440 y 44,39 MBq/g) demostró la eliminación de células específicas potentes en un ensayo de exposición de 48 horas. El LD95 fue de aproximadamente 0,5, 50, 50, 50 nCi/ml (18,5, 1850, 1850, 1850 MBq/g) para el HL60 tratado con 0,12 Ci/g, HL60 (0,0012 Ci/g), Raji (0,12 Ci/g) (4440 MBq/g), Raji (0,0012 Ci/g) (44,39 MBq/g), respectivamente. En comparación, el constructo [Bi-213] HuM195 a actividades específicas de 8 Ci/g (295999,99 MBq/g) tenía valores de LD95 de aproximadamente 3 y 10 uCi/ml (0,11 y 0,37 MBq/g) para HL60 y Raji, respectivamente. Esto representa una disminución de 67 veces en la actividad específica de Ac-225 frente a Bi-213 y una disminución de 6000 veces en la cantidad de la actividad necesaria para eliminar el 95% de las células.

Se han llevado a cabo experimentos de eliminación de células esferoides de AL67 y LNCaP.FGC de 0,02 a 8 mCi/ml (de 0,74 a 296 MBq/ml) y la eliminación de células de esferoide específicas se ha demostrado usando los constructos de anticuerpo HuM195 y J591, respectivamente.

Ejemplo 16

Ensayo en fase I de un anticuerpo monoclonal marcado con Ac-225

El ensayo se diseña como un ensayo en fase I de escalada de dosis, esencialmente como el ensayo en fase I con Bismuto-213-HuM195. El sistema de anticuerpos puede ser HuM195-AML, o un sistema de tumor sólido de cáncer de mama usando S193 (anti-lewis-Y humanizado) o Herceptina (humanizado-anti-her-2-neu).

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Claims (6)

1. El uso de un constructo que comprende un isótopo de bismuto que emite partículas alfa quelado a un anticuerpo que reconoce específicamente sitios en células tumorales en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor sólido de un diámetro mayor de 1 mm eliminando secuencialmente una o varias capas externas de las células tumorales bajo la administración repetida de la composición hasta que el tumor sólido sea erradicado.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el isótopo de bismuto que emite partículas alfa es el bismuto-213 o el bismuto-212.

3. El uso de un constructo que comprende actinio-225 que emite partículas alfa quelado a un anticuerpo que reconoce específicamente sitios en células tumorales en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor sólido de un diámetro mayor de 1 mm eliminando secuencialmente una o varias capas externas de células tumorales bajo la administración repetida de la composición hasta que el tumor sólido sea erradicado.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el isótopo que emite partículas alfa es administrado en una dosis adecuada para suministrar un mínimo de 1 vía alfa por célula.

5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la dosis es de aproximadamente 0,1 mg/m^{2} a aproximadamente 10 mg/m^{2}.

6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en la eliminación de un tumor por reconocimiento antigénico en el sistema vascular de un tumor de un individuo en necesidad de tal tratamiento.