JPS63301833A - 抗体接合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮栗上■且■分団 本発明は、癌、ＡＩＤＳ又は他の疾患の診断及び処置に
有用な抗体接合体に関する。より詳しくは、本発明は、
化学療法剤、放射性核種及び接合体の薬理動態をインビ
ボでモニターするために及び治療効果のために使用され
得る抗体の前記接合体に関する。

鴛１Ｊ刈支得 細胞毒性効果を有する放射性核種及び化学治療剤の使用
は、腫瘍及び他の疾患状態の処置において長く知られて
来た。最近、抗体もまた、広い範囲の種類の標的抗原、
たとえば腫瘍細胞に対して使用されて来た。特にモノク
ローナル抗体は、正常な細胞の損傷を最少にしながら、
癌細胞の破壊を促進する高度の特異性を捉供する。

抗体及び放射性核種の組合せは、特許文献に教示されて
いる。アメリカ特許第４，４７２，５０９号（１９８４
年、９月１８日、Ｇａｎ５ｏ−など）は、金属キレート
に接合したモノクローナル抗体を開示する。そのキレー
ト金属は、α、β又はγ放射線又は陽電子を放す金属で
あり、そしてその接合体は診断及び治療上の使用のため
に適切であることが教示されている。アメリカ特許第４
．４３０．３１８号（１９８４年、２月７日、Ｌａｎｇ
ｏｎｅ）は、非常に特異的で且つ機能的活性を有する１
２５１〜ラベルのプロティンＡの調製方法を言及する。

放射性ラベルされた抗体を開示する他の特許として、ア
メリカ特許第４．３３１．６４７号（１９８２年、５月
２５日）；第４，３４８，３７６号（１９８２年、９月
７日）；第４，３６１．５４４号（１９８２年、１１月
３０日）；第４，４４４，７４４号（１９８４年、４月
２４日）；第４，４６０．５５９号（１９８４年、７月
１７日）；及び第４，４６０．５６１号（１９８４年、
７月１７日）（これらのすべてはＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ
による）を列挙することができる。さらに、放射性ラベ
ルされた抗体は、アメリカ特許第４．３１１．６８８号
（１９８２年、１月１９日、Ｂｕｒｃｈｉｅｌなど）及
び第３．９２７．１９３号（１９７５年、１２月１６日
、Ｈａｎｓｅｎなど）に開示されている。

放射性核種及びある細胞毒性化学薬剤の接合体ちまた、
特許文献に知られている。アメリカ特許第４．６２０，
９７１号（１９８６年、１１月４日、１ｌｏｕによる）
は、臨床的使用のために放射性薬物としてインジウムー
プレアマイシン複合体を開示する。アメリカ特許第４，
４８５．０８６号（１９８４年、１１月２７日、Ｗｏｎ
ｇ）は、＋１１１０及び１３′″Ｉｎによるポルフィリ
ンの放射ラベル法を開示する。上記特許のすべての開示
は、特に引用により本明細書中に組み入れられる。

上記進歩にもかかわらず、正常なｍ織に対する損傷を最
少にしながら、悪性細胞を破壊するための高い選択性又
は特異性を示す治療薬剤についての必要性が残存する。

放射線耐性を示すが、しかし化学療法耐性を示ない細胞
、及び化学療耐法を示すが、しかし放射線耐性は示さな
い細胞に対して有効である改良された治療薬剤について
の必要性が残存する。

又皿■盟封 改良された治療効果を有する、抗体、放射性核種及び化
学療法剤の複合体又は接合体が製造され得ることが今や
見出された。本発明によれば、ケモーラジオーイムノー
接合体が提供される。放射性成分は、ある場合、不／旦
±で接合体の分布をモニターするためにも使用され得る
が、接合体の化学療法剤の治療効果を増強するために使
用され得る。さらに、本発明は、次の開示から理解され
るであろう。

本発明のケモーラジオーイムノー接合体は、化学療法剤
、放射性核種及び抗体の接合体を含んで成る。好ましく
は、前記化学療法剤は、抗腫瘍性抗体、ポルフィリン及
び関連化合物、ビンカアルカロイド、抗腫瘍性アルキル
化剤及び葉酸類似体（抗−フォルス）から成る群から選
択され、そして前記抗体は好ましくは、モノクローナル
抗体である。接合体の治療効果を最大にするために、前
記放射性核種は、好ましくはβ−線又はα−線放射物質
である。

以下余白 ′ＥＬ　Ｖな　　炉 本発明は一般的に、ケモ〜ラジオーイムノー接合体に関
する。“ケモ”成分は、化学療法剤である。化学療法剤
とは、固体腫瘍、白血病、ウィルス感染又は種々の悪性
及び疾患状態に対しで臨床的に有用な、低分子量、すな
わち１０，０００以下の分子量の化学療法剤を意味する
０本発明の化学療法剤は好ましくは、抗腫瘍性抗体、ポ
ルフィリン及び関連化合物、ビンカアルカロイド、抗Ｉ
ｔｉ　ｍ　性フルキル化剤及び抗−フォルスから成る群
から選択される。さらに好ましくは、その化学療法剤は
、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキ
ソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）　、メトトレキ
セート（ｍｅ　ｔｈｏ　ｔｒｅｘａ　ｔｅ）、アミノプ
テリン（ａｎ＋１ｎｏｐｔｅｒｉｎ）　、ビンブラスチ
ン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）　％ビンデシン（ｖｉｎ
ｄｅｓｉｎｅ）　、プレオマイシン（ｂｌｅｏＩｌｙｃ
ｉｎ）　、ブレツキサン（ｂｌｅｏｘａｎｅ）、ヘマト
ポルフィリン（ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）誘導
体、ジヘマトポルフィリンエーテル（ｄｉｈｅｍａｔｏ
ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｅ　ｔｈｅｒ）、ミタマイシン（＋
＋＋ｉｔａｍｙｃｉｎ）　、ミスラマイシン（ｍｉｔｈ
ｒａｍｉｃｉｎ）及びクロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍ
−ｂｕｃｉｌ）から成る群から選択される。これらの及
び他の適切な化学療法剤は当業界において良く知られて
いて、そして一般に臨床的に使用され、そして市販され
ている。

本発明の他の態様においては、他の療法剤が抗体に付着
され得、そして放射性核種がそれらに結合され、療法剤
−ラジオ−イムノ接合体を形成する。使用のために選択
される療法剤は、処置されるべき疾患の性質、たとえば
不ｌ　旦主で撲滅されるべき標的細胞のタイプに従って
変化するであろう。使用され得る療法剤（上記の化学療
法剤の他の）の例は、特に生物応答調節剤（ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、毒素（
ｔｏｘｉｎ）及びその断片である。抗体、少なくとも１
種の療法剤及び少なくとも１種の放射性核種を含んで成
る種々の接合体が、本発明によって提供される。

生物応答調節剤（ＢＲＭ）の例は、インターフェロン（
α、β及びγ）、腫瘍壊死因子、リンフォトキシン及び
インターロイキン（ＩＬ−１，−２、−３、−４、−５
及び−６）である。使用され得る毒素の例は、リシン（
ｒｉｃｉｎ）　、アブリン（ａｂｒｉｎ）　、ジフテリ
ア毒素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エ
キソトキシンＡ、リポソーム不活性化蛋白質及びマイコ
トキシン（ｍｙｃｏｔｏｘｉｎ）　（たとえばトリコテ
セン）である。トリコテセンは、不完全菌旦肌れ　ｎＬ
ａ匹旦）ｖ４の土壌菌によって生成され又はバカラス　
メガボタミ力（Ｂａｃｃｈａｒｕｓ　　煕■凹旦畦■）
から単離されるマイコトキシンの種類である（Ｂａｍｂ
ｕｒｇ、　Ｊ、　Ｒ，、Ｐｒｏｃ。

Ｍｏ１ｅｃ、５ｕｂｃｅｌｌ　Ｂｉｏ、　８　：　４１
〜ｌｌＯ，１９８３；　Ｊａｒｖｉｓ　＆Ｍａｚｚｏｌ
ａ、Ａｃｃ、Ｃｈｅｍ、Ｒｅｓ、　Ｉ５：３３８〜３９
５．１９８２）。

療法的に有効な変性された毒素又は生物応答調節剤もし
くはそのフラグメント、たとえば遺伝子工学又は蛋白質
質工学技法により産生されたものが使用され得る。複数
の毒素又は複数のＢＲＭ、もしくはそのフラグメントを
連結することによって調製されたハイブリッドもまた使
用され得る。

本発明に使用され得る放射性核種、すなわち“ラジオ”
成分は、療法的に使用するために適切ないずれかの放射
性核種であることができる。放射性核種は、γ−線放射
物質、陽電子−放射物質、Ｘ−線放射物質又は螢光−放
射物質を含むが、しかし療法的に使用するためには、好
ましくはβ−又はα−線放射物質である。もちろん、イ
メージング目的のために非療法用放射性ラベル及び療法
用放射性核種を使用することが望まれる。広く言えば、
放射性核種は当業界で良く知られていて、そして１２コ
１％ｔｓｌ、１１０３１３１　ｉ、ＩゴＪ、Ｉ３Ｊ。

４フＳ　ｃ、”　Ａ　ｓ、マ”Ｓｅ、”Ｙ　　、”Ｙ　
　、’フＲｕ　１　　”　’　Ｐ　ｃ　ｌ　＋１１１１
１ＲＲｈ、　＋１９３ｂ、　１２１１Ｂ、　　１９フＨ
ｇ　＋　　”　”　Ａ　ｔ　＋””Ｂｉｌ　””Ｐｂ、
　１２５Ｐｄ、　Ｉ”　Ｉｎ、”Ｇａ、”Ｇａ。

”Ｃｕ＋フＳＢｒ、フッＢｒ、　　””Ｔｃ、目Ｃ，１
３Ｎ　　、　　＋５０及び１ｌｉｐ’を含む。療法的に
使用するために適切なこれらの放射性核種は当業界にお
いて良く知られている。好ましい放射性核種は、Ｉｔｓ
　ｌ　、　１：１１１゜”Ｙ、”Ｃｕ、””Ｒｅ、１２
５Ｒｅ、１２５Ａｔ及び２目Ｂｉである。

本発明の“イムノ”成分に関しては、一般的にポリクロ
ーナル抗体及びモノクローナル抗体を含むいずれかの抗
体が使用され得る。しかしながら、モノクローナル抗体
が好ましい、なぜならば、ポリクローナル類を構成する
免疫グロブリンの不均一混合物とは対照に、モノクロー
ナル抗体は十分に定義された均質構造を有するからであ
る。この均質性により、モノクローナル抗体は、機能及
び特異性の高度の再現性を示す。モノクローナル抗体を
得るための方法は、広範に検討され、そして当業界にお
いて良く知られている。モノクローナル抗体は、腫瘍細
胞を含む、広範囲の種類の標的抗原のためにすでに開発
されて来た。本発明の実施のためのモノクローナル抗体
の選択は、接合体が使用されるであろう最終使用に依存
し、そしてそのような選択は当業界に既知であろう。

論議を単純にするために、この記載は、単一の化学療法
剤、放射性核種及び抗体を含有するものとして本発明の
接合体を論議するけれども、１以上のそれらの成分のそ
れぞれがその接合体中に導入され得ることが認識される
べきである。たとえば、接合体は１つよりも多くのタイ
プの放射性核種を含有することができる。また、接合体
はｌ以上の療法剤を含有することができる。本発明の１
つの態様において、化学療法剤、療法的毒素及び放射性
核種が、抗体分子にすべて付着され、接合体が形成され
る。本発明の他の態様は、診断用放射性接種、療法的放
射性核種、毒素又は療法的に有効なそのフラグメント、
生物応答調節剤又は療法的に有効なそのフラグメント、
及び化学療法剤の種々の組合せを含んで成る接合体に向
けられ、ここでその接合体は、抗体、少なくとも１種の
療法剤及び少なくとも１種の放射性核種を含有する。

接合ｊ村治療／細胞毒性作用は、完全な宿主の機構によ
り達成され得る。６その接合体の作用の機構は、もちろ
ん、接合体を形成するために選択された成分及びそれら
のそれぞれの作用の機構、並びに接合体が作用する特定
の目標物に依存するであろう。たとえば、化学療法剤の
作用の機構は、細胞の死を導びき又は細胞の増殖を妨げ
ることができる酵素阻害又は他の蛋白質結合もしくは核
酸に対する効果を含む。たとえば、接合体の放射性核種
からの電離性放射線は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／
又は細胞の膜に影響を及ぼし、また細胞の増殖を妨げ、
そして化学療法剤の効果を増強することができる。

この療法剤および放射性核種の治療効果は、ある場合は
相加的というよりはむしろ相乗的である。

この相乗作用のメカニズムは、本発明の特定の免疫接合
体に存在する療法剤と放射性核種の組み合せにより異な
る０例えば、療法剤成分の１種、例えば「ケモ（ｃｈｅ
ｍｏ）　Ｊあるいは「ラジオ」成分の細胞毒作用から生
き残ることのできるある種の標的細胞は、第２の治療成
分の作用に負けるほど十分弱っているであろう。さらに
、腫瘍は不均一の癌細胞の集団を含んでなり、そのうち
あるものは、有効な成分の１１１により、他のものより
効果的に撲滅される。従って両方のタイプの有効性分の
供給は、腫瘍内の癌細胞の異なる集団を破壊するチャン
スを増す。

生体内におけるこの接合体の治療活性は、標的細胞ある
いは生物物質に対するその特異性について選択される抗
体により極在化される。従って、本発明のケモーラジオ
イムノー接合を、標的に対する抗体が製造される限り標
的部位あるいは生物物質の破壊が治療に望ましいような
どんな病理学条件の治療においてでも用いてもよい。

この他に、抗体以外の標的蛋白質を人あるいは哺乳動物
の宿主内の望ましい標的部位に療法剤および放射核種を
運ぶために用いてもよい、ここで用いた「標的蛋白質」
という語は、生体内において望む標的部に結合できる蛋
白質のことを言う。

この標的蛋白質は受容体、基質、抗原決定基、あるいは
標的細胞上の他の結合部位または他の標的部位に結合し
てもよい。標的蛋白質の例として、限定するものではな
いが、抗体並びに抗体フラグメント、ある種の血清蛋白
およびホルモンを含む。

これらの蛋白質を、例えばこの蛋白質の変種およびフラ
グメントを調製するため、望む生物特性（すなわち標的
部位への結合能）が保たれている限り、修飾してもよい
。この蛋白を種々の遺伝子工学あるいは蛋白工学法を用
いて修飾してもよい。

標的部位は、撲滅されるべき標的細胞を含んでなる０本
発明の１つの実施態様において、撲滅されるべき標的細
胞は癌細胞である。異なる癌細胞に関連した抗原に特異
的な多くのモノクローナル抗体およびそのフラグメント
が開発されてきた。

抗体の選択は患者が苦しんでいる癌のタイプにより異な
る。

この接合体の治療効果は、多くの方法でこの標的に及ぶ
。例えば、この接合体は標的細胞の表面に残り、この細
胞により取り込まれる前活性状態の化学治療剤を放出す
る。この他に、無傷の接合体が調節され、エンドサイト
−シスにより細胞内に入り、その後この接合体が開裂し
、薬剤がその作用を発揮する。もちろん、この接合体は
細胞に入らなくても有毒である。細胞内あるいは外にか
かわらず、接合体の放射性核種は、接合体の治療効果を
強化するその照射効果を発揮する。

本発明の種々の接合体は、さらに診断に有効な放射核種
を含んでなる。そのような接合体を用いる利点は、生体
内におけるその接合体の生物分布を検知できることであ
る。外部からの方法により検出可能な多くの診断に有効
な放射核種を用いてもよく、例えば９９＊Ｔｃ、　１２
ｆｆ　１および１１１１ｎ等である。これらの放射核種
の生物分布は、標的部位におけるこの接合体の分布に適
当な長さの時間の後、ガンマカメラで患者を走査するこ
とにより検出される。ある種の治療に有効な放射核種は
、診断に有効な放射核種としても作用する。そのような
放射核種のうち２種はＩ　Ｉｆ　ｈ　Ｒｅおよび＋　１
１１１　Ｒｅであり、これは治療用途を有するが、ガン
マカメラにより検出することもできる。

本発明は、生体内において治療に効果的な接合体の生物
分布を検知する方法を提供し、その方法は、 ａ）診断に有効な放射核種を、抗体、療法剤、および療
法的に有効な放射核種を含んでなる接合に付着させ、 ｂ）大または哺乳動物の宿主に対し、診断上有効な放射
核種を含んでなる得られる接合を投与し、そして Ｃ）宿主内において診断上有効な放射核種の生物分布を
検出する、 工程を含んでなる。

投与した接合の生物分布を検出することによって、医者
が、この接合が生体内のすべての標的部位（診断法によ
りあらかじめＴＩｍ認された標的部位）に集っているか
どうかを調べることを可能にする。

生物分布を検知する能力は、特にある種の療法剤（例え
ば、蛋白毒素のような比較的大きな薬剤）を用いる場合
、標的蛋白質への療法剤の付着が、標的部位へ結合する
標的蛋白の能力を変えないことを確認するために重要で
ある。

例えば、本発明は腫瘍、ＡＩＤＳ、およびウィルス病の
治療に用いてもよい。そのような状態の治療において、
本発明の接合体は、治療上安全な、そして有効な量、す
なわちひどい毒性を示さず望む臨床結果を達成する量で
用いられる。この接合体を、どんな従来の方法、典型的
には経口、静注、非経口等により投与してもよい。ケモ
ーラジオーイムノー接合体に加え、薬剤組成物はさらに
例えば薬学的に許容される担体、賦形剤、添加剤あるい
は本発明の他の接合のような成分を含んでもよい。その
ような薬剤組成物における生物活性な治療物質、例えば
本発明により企図されたものの適切な濃度は、多くの要
因に依存しており、当業者により、型通りに決定される
。あらゆる適用における本発明の化学放射免疫接合の有
効投与量は、その適用の特色によって異なる。例えば腫
瘍の治療においては、投与量は腫瘍の程度、接近性およ
び他の変化により異なる。

モー−ジオ−イムノ　人　の’１′告 本発明の接合体は、（ａ）治療活性を保持し、（ｂ）抗
体活性および特異性を保持し、（ｃ）有毒な量の化学治
療剤および放射核種を標的に運ぶに十分なモル混入比を
可能にし、（ｄ）接合体の重合あるいは凝集を最小にし
、そして（ｅ）技術的に再現性のある方法によって製造
されることが重要である。この接合体は生物学的に活性
である形態で標的細胞に運ばれなければならないので、
この接合体の生物活性を低下させるような成分の反応性
基に影響を及ぼすことを避けるよう注意しなければなら
ない０例えばアルキル化剤のクロロエチルアミン基、例
えばＬ−フェニルアラニンマスタード、クロロアンプシ
ル（ｃｈ　Ｉｏｒａｍｂｕｃ　ｉ　ｌ）あるいはウラシ
ルマスタードおよびシスプラチンの塩素脱＃基（ｌｅａ
ｖｉｎｇ　ｇｒｏｕｐｓ）は合成の間活性接合を得るた
め保護されなければならない。同様に、アンチフォール
（ａｎｔｉ−ｆｏｌ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）の
活性部を、標的酵素ジヒドロフオレート（ｄｉｈｙｄｒ
ｏｆｏｌａｔｅ）レダクターゼへの結合を保つよう修飾
してはいけない。

抗体への結合に役に立つ多くの反応性官能基が存在する
。抗体のアミノ酸に利用できる反応性基は、（ａ）アス
パラギン酸およびグルタミン酸残基のＣ末端カルボキシ
ル基；　（ｂ）アルギニンのグアニジン基；（、Ｃ）ヒ
スチジンのイミダゾ−ルミ能；　　（ｄ　）チロシン上
のフェノールヒドロキシル基；　　（ｅ）Ｎ末端および
リジン残基のアミノ基；（ｆ）シスチンのスルフヒドリ
ル基およびメチオニンのチオエーテルを含む。セリンの
ヒドロキシル基あるいはカルボヒトレート補欠分子族は
、結合のための付加サイトを提供する。

化学療法剤、放射核種および抗体の結合法の選択は、通
常必要な結合のタイプ（例えば共有あるは非共有）およ
び含ま、れる反応性成分に依存する。

すでに接合体の成分に現存している反応性基をこれらの
成分の直接結合に用いてよい。この他に、反応性成分を
１種あるいはそれ以上の接合成分に入れ、結合メカニズ
ムを提供してもよい。例えば、スペーサー（ｓｐａｃｅ
ｒ）を入れ、この接合に対する化学療法剤および／また
は放射核種のより好ましい立体配列を与えてもよい。接
合体の生物活性を保ちながら、接合体の成分を混入およ
び／または結合する中介体を用いてもよい。結合は、成
分の非共有相互作用によっても達成され得る。

従って、化学療法剤、放射核種および抗体の間の結合の
方法は、通常（１）接合の１！あるいはそれ以上の成分
の変性を必要とする、直接共有結合；　（２）化学療法
剤および／または放射核種のスペーサーまたは架橋によ
る、あるいは放射性金属の場合、キレート化剤による抗
体への間接結合：（３）分解性あるいは非分解性中介体
、例えばデキストラン、ポリグルタミンおよびポリリジ
ン、あるいは血清アルブミンまたはリポソームによる成
分の結合；および（４）非共有結合、例えばイオン性あ
るいは疎水性相互作用による、として分類される。

第１の方法を例示すると、抗体への化学療法剤の直接的
な結合は、初ず抗体又は化学療法剤のいずれか一方を変
性し、次いで変性した基に直接的に相互作用及び共有結
合をすることによって達成し得る。例えば、化学療法剤
ビンブラスチン〔ベルパン（Ｖｅｌｂａｎ１２５　）　
）のヒドラジン分解は、脱アセチルビンブラスチンヒド
ラジドを生ずる。次いで、この化合物は亜硝酸の作用に
より酸アジドに転換され、そしてその後酸アジド基は、
抗体上の求核部位、例えば免疫グロブリンＧ　（ＩｇＧ
）上のアミノ基及びスルフヒドリル基と反応し得る。こ
の手段によりモルＩｇＧ当たり４−８モルのビンブラス
チンが結合され得る。他方、ビンブラスチンのＮ−ヒド
ロキシサクシニイミドエステルが合成され、次いでヒト
の肺、乳及び結腸の腺癌に見い出される４０にダルトン
の上皮抗原を認識するＩｇＧ２ａであるＫＳＩ／４上の
アミノ基に結合され得る。

直接的な結合の別の例は、無水酢酸でメトトレキセート
を処理して混酸無水物とし、次いで抗体にその得られた
生成物が直接添加された後のメトトレキセートと抗体間
の結合である。

特定の化学療法剤と抗体間の直接的な結合形成の他のも
のは、炭水化物部上の隣接する水酸基の過ヨウ素酸塩酸
化を通し１．抗体上の炭水化物残基と化学療法剤上のア
ミノ基又はその逆の組合わせの間の化学的接合を包含す
る。この結合方法で処理できる化学療法剤は、アントラ
サイクリン抗生物質、例えばダウノサミン糖を有してい
るドキソルビシン及びダウノルビシンを包含する。また
さらに、隣接した水酸基を有している毒性のりボヌクレ
オシド又はリボヌクレオシド類似化合物は、温和な水系
の反応条件を用いて抗体に直接的に結合され得る０例え
ば、シトシンアラビノシド、フルオロデオキシウリジン
又は他のヌクレオシド類似化合物のような化学療法剤の
リボース糖残基上の２′−及び３′−水酸基は、上記タ
イプの結合を月差して処理し得るだろう、別の方法とし
て、５′−水酸基は対応する５′−カルボン酸に触媒的
に酸化することができ、そしてその後カルボン酸結合に
より結合され得る。リボース糖残基を含有する類４Ｑ化
合物の水酸基は、アルデヒド基に過ヨウ素酸塩酸化され
、そしてアミノ基を含有するタンパク類、例えば抗体に
直接的に結合され得る。

同様に、抗体免疫グロブリン上の炭水化物の官能基は、
アミノ基を含有する化学療法剤の座位特異的結合のため
に変性され得る。抗体が可変的な量の炭水化物、例えば
マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース
、フコース及びシアル酸を含有することは周知である。

抗体の炭水化物部は、一般に免疫グロブリンのＦＣ領域
にそして稀に可変領域に位置する。従って、抗原結合性
を崩壊することな（免疫グロブリン炭水化物の座位特異
的変性を許容している。抗体の炭水化物部上の隣接する
水酸基（ジオール）の過ヨウ素酸塩酸化は、アミノ及び
スルフヒドリル官能基と反応性であるアルデヒドを生じ
る。結合のために炭水化物残基を活性化するためのその
他の方法は：（１）Ｂｒ、又は■２酸化により単糖類及
び還元オリゴ糖類をアルドン酸に転換し、次いで直接カ
ップリングする；　　（２）ｐ−ニトロフェニル又はｐ
−アミノフェニルアグリコンを有するグリコシド類をジ
アゾ化によりタンパク類に結合する；か又は（３）シア
ヌル酸クロライドが使用されそしてカルボキシル又はス
ルフヒドリル基が導入され得る。

結合のための反応部位をもたらす接合の構成成分におけ
る残基の変性、例えば上記したものは、単に該構成成分
に直接結合することだけでなく、次々に該構成成分に結
合するために使用し得る反応部位上に、新規な基（中間
体類そして以下に説明するリンカ−）を導入するために
も利用されるだろう。例えば、抗体の炭水化物残基の水
酸基を酸化することにより生じるアルデヒド基は、結合
用の新規な基を抗体上に導入するために使用し得る０例
えばさらに、カルボキシルメチルアミン基で置換したシ
アヌル酸クロライド（トリクロロ−ｓ−トリアジン）又
はジクロロ−３−）リアジンは、抗体に水酸基を含有す
る化学療法剤を２段階反応で結合するために使用され得
る。水酸基は求核性が乏しく、そして塩素とは簡単には
反応しないため、シアヌル酸と水酸基の反応でエーテル
が形成され、そして第２段階として変性した化学療法剤
上のトリアジン部分に抗体上のアミノ基を結合すること
である。

またさらに、放射性核種が直接的に化学療法剤又は抗体
に結合され得る０例えば、ヨウ素の同位原素、例えば＋
！Ｊ又は１３１１がＣｏｎ　ｔｒｅｒａｓらにより開示
されたモノクロライドマイクロメソッド軸ｏｎｏｃｈｌ
ｏｒｉｄｅ　ｍ１ｃｒｏ　＋ｍｅｔｈｏｄ）によって化
学療法剤又は抗体に結合され得る（Ｉｏｄｉｎｅ　Ｍｏ
ｎｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＩＣＩ）　Ｉｏｄｉｎａｔｉｏ
ｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　　”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎハＵ艶旦■、男１２７７−２９２．１９８３．参照〕
。

第２の方法を例示すると、化学療法剤がさまざまな、し
かし長さ及び構成要素が限定されたスペーサー又は架４
＞ｉ　（ｂｒ　ｉｄｇｅｓ　）を介して抗体に結合され
得る。この結合方法で処理することができる化学療法剤
は、メトトレキセート、クロラムブシル、プレオマイシ
ン及びマイトマイシン、そして同様にアントラサイクリ
ン誘導体類を包含する。この方法で使用する架橋剤、例
えば二官能性クロス−リンカ−ｐ−ベンゾキノン、ビス
オキシラン、及びゲルタールアルデヒドが、抗体及び化
学療法剤上の反応部位（例えば、アミノもしくはスルフ
ヒドリル基）の間に架橋及び／又はスペーサーを形成す
るために使用され得る。特にこの方法は、化学療法剤の
よりよい配向性を与えるためにタンパク表面と該化学療
法剤の距離を固定しない“架橋”によりこれらの構成成
分間の立体障害を克服する場合に有用である。一定の二
官能性試薬、例えばビスオキシランは、またさらにカン
プリング工程中でスペーサー基を同時に導入することを
許容し、そしてこれらは接合物の結合した構成部分の間
に付加的なスペースをとることが望まれる場合に有用で
ある。

上記に説明した架橋及びスペーサー形式に加え、またさ
らに接合物に放射性金属を結合するためにキレート架橋
機構が通用され得る。一般的に言えば、接合物に放射活
性金属を結合する金属キレート剤又はリガンドは、抗体
に結合されている（Ｇａｎｓｏｗ等の米国特許第４，４
７２．５０９号（１９８４，９゜１８）そして−ｏｎＨ
の米国特許第４，４８５，０８６号（１９８４゜１１、
２７）参照〕。例えば、ケモーラジオーイムノーコンジ
ュゲート（ｃｈｅｎ＋ｏ−ｒａｄ　ｉｏ−ｉｍｍｕｎｏ
−ｃｏｎｊｕｇａ　ｔｅｓ）は、キレーテング剤として
ＤＴＰＡの二環式無水物を用いて種々のβ−線放射性金
属によって調製され得る（ｌｌｎａｔｏｗｉｃｈ、　Ｄ
、Ｊ等、、　”　ＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅＬａｂｅｌｉ
ｎｇ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　：　Ａ　Ｓｉｍｐｌｅ
　ａｎｄ　ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＭｅｔｈｏｄ、”　５ｃ
ｉｅｎｃｅ　　２２０　　：６１３−６１５（１９８３
）及びＨｎａｔｏｗｉｃｈ、　Ｄ、Ｊ、等＋　”Ｔｈｅ
　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＴＰＡＣｏｕｐｌ
ｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅ
ｄ　ｗｉｔ、ｈ　ＭｅｔａｌｌｉｃＲａｄｉｏｎｕｃｌ
ｉｄｅｓ：八ｎ　　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　　ＭｅＬｈｏｄ
、”Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　　６５　：　１４７−１５７　（１９
８３）参照〕。抗体に放耐性核種、例えば９９′″Ｔｃ
、１２５Ｒ６及び””Ｒｅを結合するために有用なジア
ミドジメル力プチドキレーテング化合物は、ヨーロッパ
特許出願公開第１８８．２５６号公報に記載されている
。もちろん、キレート剤又はリガンドの選択は、キレー
トされる金属に依存し、そして該キレート化金属は、α
−１β−１もしくはγ−放射線又は陽電子を放射する任
意の放射性金属であってもよく、また別に螢光発光性又
は常磁性金属であってもよい。また、一定のキレート剤
、例えばポルフィリン、プレオマイシン及び関連化合物
はそれ自体が化学療法剤としての機能を利用することが
でき、従ってまたさらに、上記結合の“ｃｈｅｓ＋ｏ”
構成要素を占めることができる。例えば、化学療法剤プ
レオマイシン、ヘマトポルフィリン誘導体及びジヘマト
ポルフィリンエーテルは、抗体と一定の放射性核種金属
（例えば、”Ｃｕ　　、　”Ｙ　、及びＩｌ’１ｌｎ）
との比較的に安定な付着のためのリガンドとして使用さ
れ得る。

第３の接合方法は、中間体を介して結合するもの、−ａ
に、比較的に不活性なポリメリック中間体に対して様々
な化学療法剤分子及び／又は放射線核種の付着をもたら
し、そしてその後抗体に化学療法剤と中間体の複合体を
カップリングするものである。この接合機構の利点は２
つ挙げられる：第１に、接合物当たりの化学療法剤の量
そして該接合物の対応する細胞毒性が増大され、そして
第２に、該接合物の生物活性が接続される。例えば、ヒ
ト血清アルブミン（ＩＳＡ）を中間体として用いて調製
されたメトトレキセート　（ＭＴＸ）抗ヒト黒色腫（Ｚ
ＭＥ０１８）結合物は、最近、直接的な結合物又はスペ
ーサー（ＥＤＣＩ）を介した結合物に比較して細胞毒性
の特異的な改善そして細胞毒性が実質的に増大すること
が示された。また、接合のための中間体の使用は、上記
に説明した架橋及びスペーサー機構による接合において
も使用され得ることが特に言及される。

本発明における有用な中間体は多ｔＪ！　１’！、例え
ばデキストラン、ポリグルタミン酸及びポリリジン、血
清アルブミンそしてマイクロスフェア−又はリボソーム
のような他のポリマーを包含する。細胞毒性剤を結合し
た中間体の調製次いでそれらの抗体分子へのカップリン
グの大部分は、上記に説明した同じ化学的諸性状の多く
を伴う０例えば、デキストラン水酸基の直接的エステル
化によるか、又は過ヨウ素酸塩、臭化シアン、ヒドラジ
ド類、もしくは有機シアン酸塩のハロプロピルエポキシ
ドにより処理して活性化することによって化学療法剤は
デキストランに結合され得る。過ヨウ素酸塩酸化及び臭
化シアン活性化は、デキストランに化学療法剤をカップ
リングするための方法として最も広汎に使用される。高
分子状の中間体に化学療法剤を結合するために用いられ
る手段、そして続いて抗体に結合される手段の一例は開
示されている（米国特許第４．６９９，７９４号及び同
４，０４６，７２２号参照）。

最後に、上記接合の構成部分は非共有結合、例えばイオ
ン相互作用又は疎水性吸着を通して抗体上に化学療法剤
又は放射性核種を結合しうるものでもよい。例えば、ポ
ルフィリンはイオン互作用を通して抗体に結合され得る
。

本発明によって、薬剤を蛋白質に結合する方法であって
、 ａ）薬剤が蛋白質上の第１の官能基と反応して薬剤分子
群の第１の部分群を蛋白質に結合させるような、第１の
反応条件下で蛋白質をモル過剰量の薬剤と反応させる工
程；および ｂ）反応条件を変化させて、未結合の薬剤分子が蛋白質
上の第２官能基と反応しそれによって薬剤分子群の他の
第２部分群を蛋白質に結合させるように、工程 を含んでなる方法も提供する。

この方法を用いることの好都合は、蛋白質上のただ１つ
の官能基を標的にする連結法と比較して、より多くの薬
剤分子を各蛋白質分子に結合させ得ることにある。薬剤
は、限定されないが薬薬および二価性キレート化合物を
含み、上述した診断剤または療法剤のいずれであっても
よい。反応を変化させる工程は、薬剤を蛋白質上の異な
る官能基と反応させる、反応混合物の条件のいかなる変
更をも含んでいることができる。反応条件を変化させる
方法は、反応混合物のｐＨまたは温度を変化させること
、または薬剤および蛋白質上の第２の官能基の両方と反
応性である二価性リンカ−分子を添加することを含んで
いるがこれらに限定されない。実施される反応条件の変
化は、剤の化学構造・のような因子に依存している。蛋
白質と反応する削土の基は第１および第２の工程におい
て同一または異なっていてよく、そして直接にまたはリ
ンカ−を介して蛋白質と反応することができる。

本発明の方法の一態様は下記実施例１０において説明す
る。第１の工程において、約５．５〜６．０のｐＨで水
溶性のカルボジイミドリンカ−をおよび１００倍以上過
剰量のドキソルビシンを用いてドキソルビシンを抗体に
結合する。この薬剤は、抗体上の−ｃｏｏ＋＋ｌに（カ
ルボジイミドリンカ−を介して）結合する。次いで、反
応混合物のｐＨを約８．０〜８．５まで上げ、そして架
橋剤であるグルタルアルデヒドを添加する。反応混合物
（グルタルアルデヒドによって誘導されたもの）中の未
結合の薬は抗体のりシン残基上の遊離アミン基と反応し
、それによって追加部分の薬を抗体に結合させる。

本発明は、下記の実施例によって一層よく理解されよう
。これらの実施例において、抗腫瘍剤、すなわち化学療
法剤は、他に断らない限り、製薬グレードのバイアルに
入いった製品として商業的供給所から得られるものであ
る。試薬および化学薬品はシグマケミカル社（Ｓｉｇａ
＋ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）（米国ミズーリ州セ
ントルイス在）から入手し、ＰＤ−１０（セファデック
ス−Ｇ−２５）カラムはファーマシア社（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）　（スウェーデン、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ
）在〕から購入し、そして半調製（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐ
ａｒａｔｉｖｅ）ゲル濾過カラム、イオン交換カラムお
よびヒドロキシアパタイトＩＰＬＣカラムをそれぞれベ
ックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）、ウォーターズ／ミリボア
（Ｗａｔｅｒｓ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびバイオラ
ンド（Ｂｉｏｒａｄ）から得た。

以下余白 失施拠 放射性核種結合用ドキソルビシン（ＤＯＸ）免疫接合体
（イムノコンジュゲート）を２つの異なる方法によって
調製する：リソソーム中での消化後細胞内的にＤＯＸの
放出を許容し得るカルボジイミドリンカ−および酸感受
性ｃｉｓ−アコニ・ノド酸無水物（ｃｉｓ−ＡＡ）およ
び抗体上のスルフヒドリル基およびアミノを有するＤＯ
Ｘのダウノサミン糖上の遊離アミンとの間の５炭素スペ
ーサー。次いで、ドキソルビシン（Ｄ　ＯＸ）　（１０
０ｎ＋Ｍ最終濃度）を、肺腺癌に対する抗体（ＩｇＧ＋
）である４４３Ａ６（ｐＨ８，５のＰＢＳ中１０ｍＭ最
終反応濃度）に結合させる。リー（Ｌｅｅ）等、キャン
サー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）
　４５　：　５８１３　（１９８５年）参照。

稀グルタルアルデヒド（０，１２５％）を暗中で室温に
おいて２分間にわたって滴下して加える（ｐＨＢ、　５
のＰＢＳ中１００ｍ〜９００１１１Ｄ　ＯＸおよび抗体
）。

この反応混合物をセファデックス−〇−２５（ＰＤ−１
０）カラムにのせ反応体から結合体を単離し、この結合
体画分を滅菌濾過し定量する。この結合体画分を紫外／
可視分光分析および蛋白質分析によって分析して、抗体
上に取込まれたＤＯＸのモル量を計算する。５■のｃｉ
ｓ−ＡＡを、Ｎ　ａ　Ｑ　ＨでｐＨ９に調整したＤＯＸ
の撹拌溶液（１＋ｄの蒸留水中５■）に添加することに
よって、酸感受性リンカ−であるｃｉｓ−ＡＡを最初に
ＤＯＸに結合する。室温で１０分後、この溶液をさらに
２−の水で稀釈しそして氷上におく、塩酸（ＨＣ１）（
０，５Ｎ）を、重い沈殿が形成されるまで冷撹拌溶液に
添加する。この沈殿を単離し、４Ｉｔ１蒸留水中に溶か
しそしてＨＣＩで再酸性化／沈殿させる。最終沈殿を０
．５−蒸留中に溶かしそして水酸化ナトリウム（ＮａＯ
ｌｌ）で８．０にｐＨ１ＰＩ整する。抗体（０，５−の
ｐＨ８ＰＩＩＳ中１０■）をＤＯＸ−アコニット酸無水
物溶液に添加し、２０■の１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド（ＨＤＣＩ）を撹
拌しながら徐々に加える。この混合物をｐＨ７，０で約
２時間インキュベーションし、そして取込みを２８０ｎ
ａ＋および４７５ｎｍ検出器波長でのゲル濾過＋１ＰＬ
Ｃによってモニターする。この混合物をＰＤ−１０カラ
ムに通しそして結合体画分を集める。滅菌濾過および濃
縮後に取込み割合を定量する。

去隻尉Ｉ 放射性核種結合用クロラムブシル（ＣＢＬ）免疫結合体
を、（１）水溶性ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）による、また
は（２）低温およびアルカリ性ｐＨにおけるＣＢＬの混
合無水物の形成による実施例１の抗体のアミンへのＣＢ
Ｌのカルボキシル基の共有結合によって調製する。第１
の方法において、ＣＢＬ（２Ｗｆメタノール中６２■）
を１２■のナトリウムメトキシドで処理してＣＢＬのナ
トリウム塩を形成する。メタノールを除去しそして３■
の前記塩を、１５■の抗体を含有する１、５Ｗ１１のＰ
ＢＳ中に溶解しそしてＩＩＥＤｃＩを添加する（３■）
、この混合物を４℃で２時間攪拌しそしてセファデック
スＧ−２５（ＰＣ−１０）カラム上で精製する。第２の
方法において、最初にトリエチルアミン中でＣＢＬをブ
チルクロロホルメート（１／１モル比）と反応させるこ
とによって４℃においてＣＢＬの混合無水物を形成する
。ｐＨ９のＰＢＳ中抗体を、この未精製の撹拌混合物に
４°Ｃで滴下して加え（５０／１の無水物／抗体モル比
）１〜２時間インキュベーションする。高速遠心分離（
１０，ＯＯＯｘｇ）の後、上澄をｐｏ　−ｔｏカラム上
で精製し、そして溶出液を）ＩＰＬｃおよびニトロベン
ジルピリジン（ＮＢＰ）アルキル化アッセイによってチ
ェックする。

ス星貞１ メトトレキセー）　（ＭＴＸ）を、ＭＴＸのガンマ−カ
ルボキシル基を介して実施例１の抗体に生物学的活性を
維持しながら結合する。　ＭＴＸ　（１−の乾燥ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）中０．１ミリモル）、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンアミド（０，５−の乾燥ＤＭＦ中０．
１ミリモル）およびＨＤＣＩ（０，５−のＤＭＦ中０．
１ミリモル）を順番に琥珀色の反応バイアル中に加える
。この混合物を室温で１時間攪拌し、次いで２０時間冷
蔵庫（４℃）に入れる。この混合物を遠心分離しく１０
．０００ｘｇ）そしてオレンジ色の上澄を取り出し、定
量しそして結合に用いるまでＮ、下、−８０℃で保存す
る。次いで、ＭＴＸの反応性エステル（０，２ｍ）を、
抗体の撹拌溶液（４ｄｐＨ７ＰＢＳおよび２ｄＤＭＦ中
２０■）に添加する。これらの成分を４℃で４時間イン
キエベーションした後、この混合物を２０分間遠心分離
する（１０，０００ｘｇ）　＊この上澄をＰＤ　−１０
カラム上にのせ、ＭＸＴ−抗体結合体を集めそして分析
する。

大施開↓ ドキソルビシン（ＤＯＸ）放射性−免疫−結合体を、磁
石撹拌棒を含む５１Ｒ１の反応バイアル中で、リンク（
Ｌｉｎｋ）等（ジェイ、イムノロジー（ム釦艶肚旦■）
　１３７　　：　３０１３．１９８６年〕によって開発
されたネズミ（＋５ｕｒｉｎｅ）モノクロナール抗体（
ＩｇＧ＋サブクラス）であるＭＢ−１にＤＯＸ　（１−
水中５〜ｌＯ■）を添加することによって調製する。

抗体は予め４　Ｘ　４１　ｐＨ７ＰＢＳ交換体に対して
透析を行なって約２０■／１ｍｌまで濃縮しておきそし
てこの２０■を２５℃で撹拌下に５〜ｌＯ■ＤＯＸに添
加する。１５分後、１０■の１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノピロピル）カルボジイミド（ＨＤＣＩ）ま
たは８■の１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノ
エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）メト−ｐ−トルエン
スルホネートを添加し暗中で２５℃において３０分間攪
拌する。新鮮な０、１％グルタルアルデヒドの溶液を迅
速な撹拌下に６０秒間にわたって滴下して加える（反応
容積１−当り１００ｊ１り　、この混合物をさらに４〜
５分間インキュベーションした後、この全反応溶液を、
予めｐＨ７，８の硼酸緩衝溶液（Ｂ　Ｂ　Ｓ）中で平衡
化しておいたセファデックスＧ−２５カラム（ＰＤ−１
０）上にのせる。　　ＤＯＸ／ＭＢ−１結合体をカラム
から３／７ｗｔ１画分〔空容積（ｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍ
ｅ））中に集める。４ＩＲ１画分（ｌＩＩｔ１当り約１
５■のＭＧ−１および０．５■のＤＯＸを含んでいる）
の１０〜２０ｍアリコートを、酸洗浄した５艷の反応バ
イアルに添加し、そしてＮａｌ−１２５、Ｎａｌ−１２
３またはＮａｐ−１３１（低いまたは高い比治性）を添
加する（初期ｌＯ〜２０ｔｒｌ容量のアリコートをＰＢ
Ｓを用いて１００Ｉまで増加させそしてこの全１００μ
！を反応バイアルに添加する）。−塩化沃素（ＩＣｊ２
）をコントレラス（Ｃｏｎ　ｔｒｅｒａｓ　）等の方法
〔メソソズ・イン・エンザイモロジー（すＭ用匙ｊユ１
井Ｐ且幻ｕ−）敦：２７７．１９８３年〕によって調製
し、その５当量を大部分の他のＩｇＧに対してと同様に
ＭＢ−１に対して用いた（一方、［ｇＭに対しては１０
−１２当量を用いた）。

約６０秒後、ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）（２％最終
濃度）を保護蛋白質として添加し、そして化学−放射性
一免疫一結合体を、ｐ）１７．４のＰＢＳで平衡化した
ＰＤ　−１０カラム上で精製し３／７−を集める。これ
に代えて、この結合体をドウエックス（Ｄｏｗｅｘ）　
（Ｉ　Ｘ　４．１５０メッシェ５−カラム床、バイオラ
ンド（Ｂｉｏｒａｄ）　）カラム上で精製して、遊離の
結合していない放射性沃素を取り出す。

貫工 放射性金属ポルフィリン抗体接合体の調製は、９１１４
．０（７）酢酸ナトリウムＩＩＩＩｌ中に、０．０５Ｎ
（７）ＨＣｊ！中（７）”ＪｎＣ１３又は”ＹＣｌ　ｓ
　（５〜１０　ｓ＋ｃｉ）をまず最初に加え、酸洗浄し
たアンバー反応ビン中で１０分間攪拌することによイて
行う、ヘマトポルフィリン誘導体（ＨＰ　Ｄ）及び／又
はジヘマトポルフィリンエーテル（ＤＩＩＥ）（１０■
）を加え、溶液を攪拌し、そして熱板上で１〜２４時間
８０℃に加熱する。この溶液を冷却し、ＩＮのＮａ０１
１でｐｕｓ、ｏに調製し、ＥＤＣｊ！　２０ｇ又はＣＭ
Ｃ１５ｍｇを加えてＨＰ　Ｄ又はＤＨＥの遊離カルボキ
シル基を誘導する。放射性金属ポルフィリンの誘導され
たカルボキシル基を、ＥＤＣ１’によって抗体のアミノ
基及びヒドロキシル基に結合させる。ｐＨ７，４のＰＢ
Ｓ平衡化５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（ＰＤ　−
１０）上で放射性ポルフィリン／抗体接合体の精製を行
い、５０５ｎｉ＊での最大吸収と放射性活性を免疫グロ
ブリンタンパク質とを含有する分画４−を収集する（Ｉ
ＩＰＬｃ及びネイティブＰＡＧＥによる）。生成物は、
ｐＨ７の滅菌ＰＢＳ中で２週間までの期間は安定である
。

劃」ニ ブレオマイシン抗体接合体の調製を以下のとおりに行う
。ｐｔｉ４．ｏの酢酸緩衝液及びＹ　−９０（５ｍｃｉ
／１００ｍ　Ｏ，０５Ｎ　ｔｌｃｌ；　Ｏａｋ　Ｒｉｄ
ｇｅ、テネシー州）中に溶解したプレオマイシン（ＢＬ
ＥＯ）　（１０単位又は■シグマ等級ＢＬＥＯ）を、２
５℃で撹拌下に酸洗浄反応ビンに加え、１〜２時間時間
インバエベート。

ＭＢ−１抗体（ｐＨ８，ＯＰＢＳ　Ｉ　Ｗｉ中の２０■
）を加え、続いてＥＤＣＩ又はＣＭＣ１０■を加え、反
応混合物を更に２０分間２５℃で攪拌する。反応ビンを
遠心（３０００ＲＰＭで２０分間）し、上清を５ｅｐｈ
ａｄｅｘ　Ｇ−２５（ＰＤ　−１０）カラムに通して精
製する。

ドキソルビシンを、ＮＲ−１，Ｕ−１０と称するモノク
ローナル抗体（これは３７〜４０キロダルトンのパンカ
ルシツマ糖タンパク質に結合している）に結合させ、続
いて、得られた医薬抗体接合体を放射能で標識する。抗
体は予め、４１のｐＨ１のＰＢＳ交換に対して４回透析
し、濃縮して約２０■／−とし、その２０■を、２５℃
で撹拌下に、５−反応ビン（磁石撹拌棒を含んでいる）
中のＤＯＸ　（水ｌ−当り５■）　５■に加える。１５
分後に、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド（ＥＤ（Ｊ）１０■又は１−シクロ
ヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）−カルボジイ
ミド（ＣＭＣ）メト−ｐ　＝）ルエンスルホネート８■
を加え、暗所で６０分間３７℃で攪拌する。

次に、反応混合物のｐＨを、緩衝化ＩＮ　Ｎａ０１１（
ｐＨ８，５）又は他の適当な緩衝化溶液（ｐＨ８，５）
を加えることによって、約８．０〜８．５に調整する。

新しい０、１％グルタルアルデヒド溶液を、急速撹拌下
に６０秒間かけて滴加する（反応容積１−当り１００Ｉ
）。混合物を更に４〜５分間インキュベートし、５ｅｐ
ｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（ＰＤ−１０）　（これは
、ｐｌ＋８．５のリン酸塩緩衝化塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中
で予め平衡化しである〕上に置く。ＤＯＸ／ＮＲ−ＬＵ
−１０抱合体を、カラムから出る第３番目〜第７番目の
一分画（空隙容積）に集め、炭酸水素ナトリウム緩衝後
（ｐＨ９，５）中に透析する。

放射性ハロゲン化分子及び欧州特許公開第２０３、７６
４号明細書記載の方法を用い、前記の医薬−抗体抱合体
を２１１　Ａ　ｔ、目５■又は１３．１１で放射性標識
化する。例えば、前記の放射性標識操作には、抗体に対
して反応性の官能性基を担持する短鎖置換基を含むバラ
−ヨードフェニル／化合物の使用を含めることができる
。前記の官能性基は、抗体上の遊離アミノ基と反応して
抗体と放射性ハロゲン化化合物とを結合させるエステル
基であることができる。放射性ハロゲン化分子の調製は
、短鎖官能性置換基をもつハロゲン化芳香族化合物上の
有機金属基Ｓｎ　（ｎ−Ｏｎ）、又はＳｎＭｅ、を置換
することによって行うことができる。続いて、その有機
金属基をハロゲン化脱金属化によってハロゲン原子の放
射性同位体で置換する。

あるいは、９９１１Ｔｃ、１ｌｌｌｌＲｅ又は１ｓｂＲ
ｅによる医薬−抗体接合体の放射性標識は、“Ｎｚ５ｚ
”キレート形成化合物及び欧州特許公開第１８８，２５
６号明細書記載の方法を使用して行う。基本的には、ペ
ルテクネテート又はベルレネート（ｐｅｒｒｈｅｎａ　
ｔｅ）の形の放射性核種とキレート形成化合物とを、還
元剤例えば第一スズイオンの存在下で接触させる。

得られる放射性核種金属キレートは、キレート化合物上
の官能性基（例えば活性エステル）と抗体上の官能性基
（例えばアミノ基）との反応により、抗体と結合させる
。

■工 化学（ｃｈｅｍｏ）−放射一毒素一免疫接合体の調製を
以下のとおりに行う。チオエーテル連絡基を介して、シ
ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素＾（Ｐ
ＩＥ）と、ＮＲ−ＭＬ　−０５と称するモノクローナル
抗体とを抱合させる。このモノクローナル抗体は、２５
０キロダルトンのヒトメラノマ関連プロテログリカンと
結合している。

ＰＥを最初にスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣ
Ｃ）ト、−Ｅ／Ｌ／比１：１０　（タンパクｒｎ：連結
体）で反応させる。誘導されるＰＥから、過剰のヘテロ
ユ官能性試薬をゲル濾過によって除去する。ＮＲ−ＭＬ
　−０５を、０．０１Ｍリン酸塩緩衝化塩溶液（ｐＨ７
，５）　（ＰＢＳ）中のジチオトレイトール（ＤＴＴ）
２５ｓ＋Ｍで処理し、過剰のＤＴＴをゲル濾過で除去す
る。誘導される毒素及び還元化抗体成分を混合し、１５
分間室温でインキュベーションする。次に、抱合反応混
合物をＴＳＫ　３０００カラム上のＦＰＬＣゲル濾過（
０，５ｄ／分）によって分画し、非接合化抗体及び未反
応誘導化ＰＥから接合体を分離する。

例４に記載の方法に従って、ＰＥ／ＮＲ−ＭＬ　−０５
接合体とドキソルビシンとを反応させる（すなわち、Ｈ
Ｄ（Ｊと、そして続いてグルタルアルデヒドと反応させ
る）。２種の対照反応において同じ方法を用いて、ドキ
ソルビシン−ＰＥ接合体とドキソルビシン＝ＮＲ−ＭＬ
　−０５接合体とを生成する。ＰＥに結合したドキソル
ビシン分子の数は３であった。

Ｎｉ２−　ＭＬ　−０５へ結合した数は１０であった。

これに対してＰＥ／ＮＲ−ＭＬ　−０５へ結合した医薬
分子の数は２０になる。

放射性核種はＰＥ／Ｎｌ？　−ＭＬ　−０５／ドキソル
ビシン抱合体に結合させて化学−゛放射−毒素−免疫接
合体を生成する。前記例４又は７に記載の放射性標識方
法の１つを使用することができる。

■工 ４種の医薬の各々を、別々の反応混合物中でＮＲ−ＭＬ
　−０５と称するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）に結合
させる。Ｎｌ２−　ＭＬ　−０５は、２５０ｋｄ　ヒト
メラノマ関連プロテオグリカンと結合する。前記医薬は
抗癌剤のドキソルビシン、アクチノマイシンＤ、ビサン
トロン及びミドキサントロンである。

濃抗体溶液（ＰＢＳ中の＞５■／Ｗｄ）、濃医薬ＣｄＨ
２Ｏ中の１０■／−）及び水溶性カルボジイミド（例え
ばＥＤＣｆ　）　（ｄｌｌ□０中の１０曙／−）から、
試薬溶液を調製する。最初にＭＡｂ　４■（８００ｕｌ
）と医薬２■（２００ＪＩＩ）とを、水溶中で３７℃に
おいて１５分間反応させる。カルボジイミド２■（２０
０ｄ　）を加え、３０分間ｐＨ５，５〜６．０で攪拌す
る。ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９）を加え（７００Ｉ１１）
　、ｐｌ＋８．５に調整する（＞ｐＨ９で染色）。希（
０，２５％）グルタルアルデヒドを加え（タンパク質４
■及び反応容積２ｄ当り１ＯＯＪ１１）、最終容積を２
１Ｒ１とする。溶液が曇って肉眼で透視することができ
なくなるまで、医薬／抗体との反応を行わせる（約１５
分間）。

反応混合物２ｗｄをＰＢＳ平衡化Ｐｈａｒｍａｃｉａ　
ＰＤ−１０カラム又はＨＰＬＣ／ＧＰＣカラム上に置き
、医薬／抗体接合体を含有する分画４−を集める。沈殿
がかなり起きる場合には遠心工程（３０００ｒｐｍで４
℃で２０分間）が必要である。上清をＰＤ−１０カラム
上に置く。タンパク質含量（５９５ｎｍにおけるガンマ
グロブリン標準に対するＢｉｏＲａｄ法）及び医薬濃度
（４９５ｍｎにおけるＶｉｓによる３つの濃度標準にお
ける遊離医薬に対するもの）を測定する。必要な場合に
は、限外濾過又はクロマトグラフィーによって生成物を
濃縮及び精製することができる。

ＮＲ−ＭＬ　−０５−ドキソルビシン接合体に関して、
抗体分子１個当りの医薬分子の数すなわち「モル導入比
（Ｍ　Ｉ　Ｒ：　ＩＩＩｏｌａｒ　１ｎｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ　ｒａｔｉｏ）Ｊの測定を、４００ｎｍ　　、
４５０ｎｍ　　、４７５ｎｍ　　、４９５ｎｍ及び５５
０ｎｍで得られたＶｉｓスペクトルを走査することによ
って行った。医薬はＭＡｂタンパク質に対して１００モ
ル過剰で反応混合物に加えられていた。

得られたモル導入比の平均は１２（最小８、最大１８、
実験数１０）であった。抱合収量及びＭＩＲの改良は、
グルタルアルデヒド添加前に反応の最終ｐｌ＋を８．０
〜８．５にすることによって行う。グルタルアルデヒド
単独によるＭＩＲは平均７〜ＩＯであるが、最初の連結
体（水溶性カルボジイミド、ＥＤＣｌ）の寄与により、
恐らくはペプチド結合によってタンパク質へＤｏｘ分子
２〜４個が追加される。

この「２工程」方法（すなわち、ｐＨ約５．５〜６．０
でカルボジイミド、そしてｐＨ約８．０〜８．５でグル
タルアルデヒド）を使用して、抗体以外のタンパク質に
医薬を連結することができる。このようなタンパク質と
しては、他のターゲットタンパク質又は高分子中間体（
すなわち、ヒト血清アルブミン）を挙げることができる
。

放射性標識化は、任意の適当な方法例えば前記例４又は
７に記載の１つの方法によって実施する。

前記の方法で調製される１つの抱合体は、ドキソルビシ
ン−抗体−１！Ｊ　（ここで、抗体はモノクロメール抗
体ＮＲ−ＭＬ　−０５のＦ　（ａｂ）　’　２フラグメ
ントである）である、欧州特許公開筒２０３．７６４号
明細書記載の方法（及びその明細書に記載の、タンパク
抱合基を含むｐ−ヨード−フェニル試薬）を使用して、
抱合体を放射性ヨード化した。移植腫瘍をもつヌードマ
ウスを用いる生体分布（ｂｉｏ−ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉ
ｏｎ）研究において、前記の化学−放射一免疫一接合体
がメラノマターゲット細胞に局部的に有効に食い止める
ことが見出された。インビトロの細胞毒性検査（例えば
ＭＴＴアッセイ）において、前記の接合体はメラノマ細
胞を有効に撲滅した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗体、少なくとも１種類の療法剤、及び少なくとも
   １種類の放射性核種を含んで成る接合体。 ２、前記療法剤が化学療法剤である請求項１に記載の接
   合体。 ３、前記化学療法剤が抗腫瘍性抗生物質、ポルフィリン
   及びポルフィリン誘導体、抗腫療性アルキル化剤、ビン
   カアルカロイド、ヌクレオシド類似体、並びに葉酸類似
   体から成る群から選択されたものである請求項１に記載
   の接合体。 ４、前記化学療法剤がドキソルビシン、ダウノルビシン
   、他のアンスラサイクリン誘導体、メトトレキセート、
   アミノプテリン、ビンブラスチン、ビンデシン、プレオ
   マイシン、ヘマトポルフィリン誘導体、ジヘマトポルフ
   ィリンエーテル、ミスラマイシン、マイトマイシン、ク
   ロラムブシル、シトシンアラビノシド、及びフルオロデ
   オキシウリジンから成る群から選択されたものである請
   求項３に記載の接合体。 ５、前記接合体が、α−線放射物質及びβ−線放射物質
   から成る群から選択された少なくとも１種類の療法的に
   有効な放射性核種を含んで成る、請求項１に記載の接合
   体。 ６、化学療法剤、並びにα−線放出物質及びβ−線放出
   物質から成る群から選択された少なくとも１種類の療法
   的に有効な放射性核種を含んで成る請求項１に記載の接
   合体。 ７、前記接合体が毒素（トキシン）又は療法的に有効な
   その断片を含んで成る請求項１に記載の接合体。 ８、前記接合体が毒素又はその療法的に有効な断片、及
   び化学療法剤を含んで成る請求項１に記載の接合体。 ９、前記接合体が毒素又はその療法的に有効な断片、並
   びにα−線放射物質及びβ−線放射物質から成る群から
   選択された療法的に有効な断片を含んで成る、請求項１
   に記載の接合体。 １０、前記接合体が化学療法剤をさらに含んで成る請求
   項９に記載の接合体。 １１、前記毒素が、リシン、アブリン、ジフテリア毒素
   、シュードモナス・エキソトキシンＡ、リボゾーム不活
   性化蛋白質、マイコトキシン、トリコテセン、及び療法
   的に活性なその断片から成る群から選択されたものであ
   る、請求項７、８、９、又は１０に記載の接合体。 １２、前記接合体が生物応答調節物質又は療法的に有効
   なその断片を含んで成る、請求項１又は２に記載の接合
   体。 １３、前記接合体が療法的に有効な放射性核種、及び生
   物応答調節物質又は療法的に有効なその断片を含んで成
   る、請求項１に記載の接合体。 １４、前記接合体が診断的に有効な放射性核種をさらに
   含んで成る請求項１、２、５、６、７、８、９、１０、
   又は１３項に記載の接合体。 １５、前記診断的に有効な放射性核種が、＾９＾９＾ｍ
   Ｔｃ、＾１＾２＾３Ｉ、及び＾１＾１＾１Ｉｎから成る
   群から選択されたものである、請求項１４に記載の接合
   体。 １６、前記接合体が診断的に有効な放射性核種をさらに
   含んで成る請求項１２に記載の接合体。 １７、前記療法的に有効な放射性核種が＾１＾２＾３Ｉ
   、＾１＾３＾１Ｉ、＾９＾０Ｙ、＾６＾７Ｃｕ、＾１＾
   ８＾９Ｒｅ、＾１＾８＾６Ｒｅ、＾２＾１＾２Ｂｉ、及
   び＾２＾１＾１Ａｔから成る群から選択されたものであ
   る、請求項５、６、９、１０、又は１３に記載の接合体
   。 １８、抗体に付加されたポリマー介在物に複数の療法剤
   又は放射性核種が付加されている、請求項１に記載の接
   合体。 １９、前記接体がモノクローナル抗体又はモノクローナ
   ル抗体断片である、請求項１、２、５、又は７に記載の
   接合体。 ２０、前記モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体
   断片が癌細胞に対して特異的である、請求項１９に記載
   の接合体。 ２１、化学療法剤と抗体との接合体を含んで成る組成物
   であって、該接合体がその上に結合した有効量の療法的
   放射性核種を有することを特徴とする組成物。 ２２、前記化学療法剤が、抗腫瘍性抗生物質、ポルフィ
   リン及びポルフィリン誘導体、抗腫瘍性アルキル化剤、
   ビンカアルカロイド、ヌクレオシド類似体、及び葉酸類
   似体から成る群から選択されたものである、請求項２１
   に記載の組成物。 ２３、前記放射性核種がα−線放射物質及びβ−線放射
   物質から成る群から選択されたものである、請求項２１
   に記載の組成物。 ２４、前記化学療法剤がメトトレキセート、アミノプテ
   リン、ビンブラスチン、ビンデシン、プレオマイシン、
   ヘマトポルフィリン誘導体、ジヘマトポルフィリンエー
   テル、ミスラマイシン、マイトマイシン、クロラムブシ
   ル、アンスラサイクリン誘導体、ドキソルビシン、ダウ
   ノルビシン、シトシンアラビノシド及びフルオロデオキ
   シウリジンから成る群から選択されたものである、請求
   項２１に記載の組成物。 ２５、前記放射性核種が＾１＾２＾５Ｉ、＾１＾３＾１
   Ｉ、＾９＾０Ｙ、＾６＾７Ｃｕ、＾１＾８＾９Ｒｅ、＾
   １＾８＾６Ｒｅ、＾２＾１＾１Ａｔ、及び２１２Ｂｉか
   ら成る群から選択されたものである、請求項２３に記載
   の組成物。 ２６、前記放射性核種がキレートの形態にある、請求項
   ２１、２３、又は２５に記載の組成物。 ２７、前記抗体がモノクローナル抗体又はモノクローナ
   ル抗体断片である、請求項２１又は２２に記載の組成物
   。 ２８、前記モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体
   断片が癌細胞に対して特異的である、請求項２７に記載
   の組成物。 ２９、抗体、ドキソルビシン、並びに＾１＾２＾５Ｉ、
   ＾１＾２＾３Ｉ、＾１＾３＾１Ｉ、＾１＾１＾１Ｉｎ、
   ＾９＾９ｍＴｃ、＾１＾８＾６Ｒｅ、＾１＾８＾８Ｒｅ
   、＾２＾１＾１Ａｔ、＾９＾０Ｙ、＾６＾７Ｃｕ及び＾
   ２＾１＾２Ｂｉから成る群から選択された少なくとも１
   種類の放射性核種を含んで成る接合体。 ３０、ドキソルビシン、並びに＾１＾２＾５Ｉ、＾１＾
   ２＾３Ｉ及び＾１＾３＾１Ｉから成る群から選択された
   、モノクローナル抗体に付加された放射性核種を含んで
   成る請求項２９に記載の接合体。 ３１、モノクローナル抗体に付加されたヘマトポルフィ
   リンに付加された、＾１＾１＾１Ｉｎ又は＾９＾０Ｙか
   ら選択された放射性核種を含んで成る接合体。 ３２、モノクローナル抗体に付加されたプレオマイシン
   に付加された＾９＾０Ｙを含んで成る接合体。 ３３、少なくとも１種類の療法剤と、少なくとも１種類
   の療法的に有効な放射性核種と、標的細胞に結合する抗
   体との接合体とを含んで成る、ヒト又は哺乳類において
   標的細胞を根絶するために使用するための組成物。 ３４、前記接合体が化学療法剤を含んで成る請求項３３
   に記載の組成物。 ３５、抗体、化学療法剤及び放射性核種の接合体の有効
   量に標的細胞を暴露する段階を含んで成る、標的細胞の
   増殖を防止する方法。 ３６、前記化学療法剤が抗腫瘍抗生物質、ポルフィリン
   及びポルフィリン誘導体、抗腫瘍性アルキル化剤、ビン
   カアルカロイド及び葉酸類似体から成る群から選択され
   たものである、請求項３４又は３５に記載の方法。 ３７、前記放射性核種がα−線放射物質及びβ−線放射
   物質から成る群から選択されたものである請求項３３又
   は３５項に記載の方法。 ３８、前記標的細胞が癌細胞であり、そして前記抗体が
   該癌細胞に結合するモノクローナル抗体又はその断片で
   ある、請求項３３又は３５のいずれか１項に記載の方法
   。 ３９、化学療法剤を抗体に結合せしめる段階、並びに放
   射性核種を該化学療法剤及び該抗体の一方に結合せしめ
   る段階を含んで成る抗合体の製造方法。 ４０、複数の化学療法剤を前記抗体に結合せしめる、請
   求項３９に記載の方法。 ４１、複数の化学療法剤を、抗体に付加されたポリマー
   中介体に結合せしめる、請求項４０に記載の方法。 ４２、複数の放射性核種を、抗体に付加されたポリマー
   中介体に結合せしめる、請求項３３、３５又は３９項に
   記載の方法。 ４３、療法的に有効な接合体の生体内分布をモニターす
   る方法であって、 ａ）抗体と療法剤と療法的に有効な放射性核種とを含ん
   で成る接合体に、診断的に有効な放射性核種を付加し； ｂ）診断的に有効な放射性核種を含んで成る前記接合体
   をヒト以外の哺乳類宿主に投与し；そして ｃ）前記宿主中の前記診断的に有効な放射性核種の生物
   分布を検出する； 段階を含んで成る方法。 ４４、薬剤を蛋白質に付加する方法であって、ａ）薬剤
   が蛋白質上の第一の官能基と反応するような第一の反応
   条件下で該蛋白質と該薬剤のモル過剰量とを反応せしめ
   ることにより該薬剤分子群の第一の部分群を該蛋白質に
   結合せしめ；そして、 ｂ）未結合の薬剤分子群が前記蛋白質上の第二の官能基
   と反応するように反応条件を変化せしめ、これによって
   前記薬剤分子群の第二の部分群を前記蛋白質に結合せし
   める； 段階を含んで成る方法。