CN111735959A - 一种检测pf1022a的酶联免疫试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测PF1022A的酶联免疫试剂盒，本发明还公开了一种检测PF1022A的方法。本发明所提供的检测PF1022A的酶联免疫试剂盒，包括PF1022A的特异性抗体及包被原和酶标记物；所述PF1022A特异性抗体为所述PF1022A的多克隆抗体或单克隆抗体；所述包被原为PF1022A半抗原与载体蛋白的偶联物；本发明试剂盒检测PF1022A的方法，操作简便，对样品的前处理要求低，能同时快速检测大批量样品。因此，利用本发明酶联免疫试剂盒进行检测的方法，能够进行现场监控且适合大量样本的定性和定量筛查。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种检测PF1022A的酶联免疫试剂盒，以及检测PF1022A的方法。
背景技术
PF1022A是新型可驱虫环缩酚酸肽，来自菌株Rosellinia的发酵代谢产物；由四个交替的N-甲基-L-亮氨酸残基和四个D-笨基乳酸或D-乳酸构成。PF1022A不仅可结合latrophilin样跨膜受体，而且还可以结合GABA受体，从而抑制寄生线虫的肌肉蠕动，抑制线虫的头部和咽部的运动。PF1022A作为驱肠虫剂广泛应用于猪、牛、羊、鸡、鸭等家畜。
随着我国畜牧业现代化、集约化和规模化生产，兽药(包括兽药添加剂)在改善动物产品品质起到十分显著的作用。但同时畜牧业中滥用兽药和超标使用兽药的现象普遍存在，动物性食品中兽药的残留严重，因此加强对动物性食品PF1022A的残留检测是非常必要的。
目前，用来检测PF1022A残留量的分析方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、气-质联机、液-质联机等，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，检测成本较高，不适合现场监控和大量样品的筛查。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种检测PF1022A的酶联免疫试剂盒和一种检测PF1022A的方法，此外，本发明还提供了一种PF1022A单克隆抗体，以及PF1022A半抗原的制备方法。
首先，本发明提供了一种检测PF1022A的酶联免疫试剂盒，包括PF1022A半抗原和PF1022A的特异性抗体；所述特异性抗体为所述PF1022A的多克隆抗体或单克隆抗体；所述半抗原的结构式如下：
其中，所述PF1022A半抗原和PF1022A的特异性抗体以下述任一种形式存在：
(1)将所述PF1022A半抗原与载体蛋白进行偶联，得到PF1022A半抗原与载体蛋白的偶联物，将其作为包被原，所述特异性抗体进行酶标记后作为酶标记物；
(2)所述特异性抗体为包被原，所述PF1022A半抗原进行酶标记后作为酶标记物。
进一步的，所述试剂盒还既包括PF1022A半抗原和PF1022A的特异性抗体，还包括抗抗体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体；其中，所述半抗原和抗抗体以下述任一种形式存在：
(1)将所述PF1022A半抗原与载体蛋白进行偶联，得到PF1022A半抗原与载体蛋白的偶联物，将其作为包被原，所述抗抗体进行酶标记后作为酶标记物；
(2)所述抗抗体为包被原，所述PF1022A半抗原进行酶标记后作为酶标记物。
所述PF1022A多克隆抗体或PF1022A单克隆抗体，均是以所述PF1022A半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；所述载体蛋白可以为牛血清蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、兔血清蛋白或卵清蛋白等。
所述单克隆抗体是由对PF1022A的单克隆抗体杂交瘤细胞株C-72分泌产生的抗体。
所述PF1022A多克隆抗体可为鼠源、羊源、兔源或豚鼠源抗体。
为了更方便现场监控和大量样品筛查，所述试剂盒还包括PF1022A标准品溶液、显示液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。
所述浓缩洗涤液为含有0.7-1.5％牛血清蛋白、45-60％(w/w)甘油，pH值为9.2-9.5、0.05-0.1mol/L碳酸盐缓冲液；所述浓缩复溶液为含有0.3-0.6％(w/w)的人血清蛋白，pH为9.1-9.9、0.05-0.1mol/L碳酸盐缓冲液；所述“w/w”是指质量比。
当标记酶为辣根过氧化酶时，所述显色液由显色液A液和显示液B组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1-2mol/L硫酸或盐酸溶液。当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显示剂为硝基磷酸盐缓冲液，终止液为1-2mol/L氢氧化钠溶液。
优选，所述浓缩洗涤液为含有1.2％(w/w)牛血清蛋白、50％(w/w)甘油，pH值为9.3、0.1mol/L碳酸盐缓冲液；所述浓缩复溶液为含有0.5％(w/w)的人血清蛋白，pH为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液；
发明人通过大量的实验设计和条件筛选，意外的发现，在洗涤液中加入一定量的牛血清蛋白能够减少抗体的非特异性吸附，还能对蛋白起到保护作用；
所述抗抗体进行酶标记的方法是采用过碘酸钠将所述标记酶与所述抗抗体进行偶联得到酶标抗抗体；其中，所述标记酶与所述抗抗体的摩尔浓度比为2:1。
PF1022A是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，本发明提供了一种PF1022A半抗原，使其能够与大分子载体蛋白偶联，从而具有免疫原性；所述PF1022A半抗原，其具有如下结构：
本发明还提供了一种PF1022A半抗原的制备方法，包括将PF1022A结构中的两个苯基乳酸的芳香环对位先硝基后还原，从而在分子中引入氨基，合成PF1022A半抗原。其中，PF1022A具有如下结构：
本发明人研究发现，PF1022A半抗原与人血清蛋白结合摩尔比为12-18:1时，对免疫是非常合适的。在制备包被原时，PF1022A半抗原与所述载体蛋白的摩尔配比为10～20:1，优选15:1。
制作包被原的酶标板时，所用的包被缓冲液优选为pH 9.0-9.5、0.1mol/L的碳酸盐缓冲液；所述封闭液优选为含有0.1-0.5％(w/w)的牛血清蛋白、0.2-0.5％(w/w)的脱脂奶粉、0.05mol/L Tris-缓冲液。
另一方面，本发明还提供了一种检测PF1022A的方法，包括以下步骤：
1)样品前处理：向动物组织匀浆物中，加入0.03-0.07M硫酸溶液，混匀，置于温箱孵育，在5-10℃以不低于3000g的速度离心，取上层液，加入1.5-2.5M氢氧化钠，混匀，调pH值为6-8，移取液体，加入等体积的权利要求5-7中一所述复溶液，混匀，取样进行分析；
2)利用上述任一所述的酶联免疫试剂盒检测1)中所述稀释液。
进一步的，优选，步骤1)样品前处理方法为：向每1.0g动物组织匀浆物中，加入9-12ml 0.03-0.07M硫酸溶液，混匀，置于37℃温箱孵育20-40min，在5-10℃下以3000g以上的速度离心5-15min，取上层液3-5ml，加入140-170ml 1.5-2.5M氢氧化钠，混匀，调pH值为6-8，移取液体，加入等体积的权利要求5-7中一所述复溶液，混匀，取样进行分析。
另一方面，本发明还提供了一种PF1022A单克隆抗体，其特征在于，所述PF1022A单克隆抗体是由对PF1022A的单克隆杂交瘤细胞株C-72分泌产生的。
进一步的，本发明还提供了一种PF1022A半抗原，具有如下结构：
进一步的，本发明还提供了一种PF1022A半抗原的制备方法，包括：将PF1022A结构中的两个苯基乳酸的芳香环对位先硝化，然后还原成氨基，得到PF1022A半抗原；其中，PF1022A具有如下结构：
本发明所述的对PF1022A的单克隆杂交瘤细胞株C-72也属于本发明的保护范围。所述的杂交瘤细胞株C-72可以参考本发明实施例部分公开的方法制备得到。
本发明提供的检测PF1022A的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测样品中PF1022A的残留量。本试剂盒中采用高特异性的PF1022A单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性，实验结果表明，本试剂盒具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点；本试剂盒的主要试剂都采用工作液形式，使用方便，成本低廉。用本发明试剂盒检测PF1022A的方法，操作简便，简化了传统检测方法的步骤，缩短了检测的时间，对样品的前处理要求低，能同时快速检测大批量样品。因此，利用本发明酶联免疫试剂盒进行检测的方法，能够进行现场监控且适合大量样品的定性和定量筛查，这将在PF1022A的检测中发挥重要作用。
附图说明
图1显示包被原为PF1022A半抗原与载体蛋白偶联物、酶标记物为酶标抗抗体的试剂盒的标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。本发明所用的“百分比(％)”如无特殊说明均是指“质量百分比”。
实施例1、以PF1022A半抗原与载体蛋白偶联物为包被原、酶标二抗为酶标记物的试剂盒的制备及使用
一、以PF1022A半抗原与载体蛋白偶联物为包被原、酶标二抗为酶标记物的试剂盒的检测原理如下：当在酶标板微孔条上的包被原为PF1022A半抗原与载体蛋白偶联物时，向酶标孔板中加入标准品溶液或样品溶液，再加入PF1022A特异性抗体，样品中残留的PF1022A与酶标板上PF1022A偶联抗原竞争PF1022A特异性抗体，再加入酶标抗抗体，用显色液显色，样品吸光度与PF1022A的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中PF1022A中PF1022A的残留含量。
二、以PF1022A半抗原与载体蛋白偶联物为包被原、酶标二抗为酶标记物的试剂盒一般可以包括如下：
1、包被有包被原(包被原为PF1022A半抗原与载体蛋白的偶联物)的酶标板；包被原浓度可以为0.15-0.25ug/ml；
2、酶标抗抗体工作液：酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体；酶标二抗的稀释液为含有0.2-0.5％的人血清蛋白、pH为9.1-9.9、0.05-0.1mol/L碳酸盐缓冲液，酶标抗抗体工作液稀释度为1:500，所述百分含量为质量百分含量。
3、PF1022A特异性抗体工作液：可以为PF1022A多克隆抗体工作液或PF1022A单克隆抗体工作液；用稀释液将PF1022A特异性抗体稀释3000倍，得到特效性抗体工作液，所述稀释液为含有3.0％酪蛋白和0.003％的叠氮化钠、pH值为5.6、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
4、PF1022A标准品溶液6瓶，浓度分别为0ug/L、0.5ug/L、1.5ug/L、4.5ug/L、13.5ug/L、40.5ug/L；配制标准品的溶液为含有0.2-0.5％的人血清蛋白、pH为9.1-9.9、0.05-0.1mol/L碳酸盐缓冲液。
5、底物显示液由A液和B液组成，底物显示液A为过氧化脲或过氧化氢，7ml/瓶，1瓶；底物显示液B液为四甲基联苯胺或邻苯二胺；7ml/瓶，1瓶；
6、终止液；1-2M硫酸或盐酸；7ml/瓶，1瓶；
7、浓缩洗涤液为含有0.7-1.5％牛血清蛋白、45-60％甘油，pH值为9.2-9.5、0.05-0.1mol/L的碳酸盐缓冲液；50ml/瓶，1瓶；所述百分含量为质量百分含量。
8、复溶液为含有0.3-0.6％的人血清蛋白、pH为9.1-9.9、0.05-0.1mol/L碳酸盐缓冲液；400ml/瓶，1瓶；所述百分含量为质量百分含量。
二、以PF1022A半抗原与载体蛋白偶联物为包被原、酶标二抗为酶标记物的试剂盒的具体组成及其制备：
(一)组成
1、包被有包被原(包被原为PF1022A半抗原与载体蛋白的偶联物)的酶标板；包被原浓度可以为0.2ug/ml；
2、酶标抗抗体工作液：酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体；酶标二抗的稀释液为含有0.4％的人血清蛋白、pH为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液，酶标抗抗体工作液稀释度为1:500，所述百分含量为质量百分含量。
3、PF1022A特异性抗体工作液：可以为PF1022A多克隆抗体工作液或PF1022A单克隆抗体工作液；用稀释液将PF1022A特异性抗体稀释3000倍，得到特效性抗体工作液，所述稀释液为含有3.0％酪蛋白和0.003％的叠氮化钠、pH值为5.6、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
4、PF1022A标准品溶液6瓶，浓度分别为0ug/L、0.5ug/L、1.5ug/L、4.5ug/L、13.5ug/L、40.5ug/L；配制标准品的溶液为含有0.4％的人血清蛋白、pH为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液。
5、底物显示液由A液和B液组成，底物显示液A为过氧化脲，7ml/瓶，1瓶；底物显示液B液为四甲基联苯胺；7ml/瓶，1瓶；
6、终止液；2M硫酸；7ml/瓶，1瓶；
7、浓缩洗涤液为含有1.2％牛血清蛋白、55％甘油，pH值为9.3、0.1mol/L的碳酸盐缓冲液；50ml/瓶，1瓶；所述百分含量为质量百分含量。
8、浓缩复溶液为含有0.5％的人血清蛋白、pH为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液；400ml/瓶，1瓶；所述百分含量为质量百分含量。
(二)制备
1、包被有PF1022A半抗原与人血清蛋白偶联物的酶标板的制备
1)半抗原的制备
合成PF1022A半抗原，方法如下：
将发烟硝酸置于乙醇浴中搅拌，并加入液氮使发烟硝酸温度降至-40℃，缓慢加入PF1022A固体粉末，搅拌一小时，当起始物料低于0.5％时即可终止反应。然后在反应体系加入二氯甲烷进行萃取，收集萃取的有机相，加入饱和的碳酸钠溶液，将有机相浓干，得到固体PF1022A的硝化产物。硝化产物通过进一步加入甲醇、钯碳后在室温25℃左右常压氢化，反应12h后，抽滤回收钯碳，随后浓缩甲醇得到深褐色的稠状物中加入乙腈，搅拌打浆得到的固体，加入80℃的乙醇重新溶解，降温结晶出PF1022A的胺化物，得到PF1022A半抗原。
2)包被原的制备
将PF1022A半抗原与人血清蛋白偶联得到包被原。
包被原的制备过程：用0.1mol/L HCl溶液配制4m mol/L浓度的半抗原，滴加过量1％NaNO2，4℃持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。边搅拌，边加入重氮化的半抗原(防止局部发生酸过量现象)，调节pH到9.5。冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0。用PBS透析2天。-20℃保存(浓度为20mg/mL)。
3)包被有包被原的酶标板的制备
将包被液稀释至1-20ug/ml。以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时；洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。
其中，所用的包被缓冲液是pH值为7.6、0.1mol/L的碳酸盐缓冲液。
封闭液为含有0.3％的人血清白蛋白、0.5％的蔗糖、pH值为7.5、0.05mol/L的Tris-缓冲液；所述百分含量为质量百分含量；
2、PF1022A单克隆抗体的制备
1)免疫原的制备
将PF1022A半抗原与人血清蛋白偶联为免疫原。
2)制备单抗
a.动物免疫
将步骤(1)得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150ug/只，使其产生多克隆抗血清。
b.细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按7:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌PF1022A单克隆抗体对PF1022A药物的单克隆杂交瘤细胞株，将此细胞株命名为C-72，该细胞株保藏于本实验室。
c.细胞冻存和复苏
将杂交瘤细胞C-72用冻存液制成1×107个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速溶，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
d.单克隆抗体的制备与纯化
可以通过以下两种方法制备单抗：
方法1：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，七天后腹腔注射杂交瘤细胞株5×107个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20℃环境保存。
方法2：增量培养法：将杂交瘤细胞置于pH为7.4、0.2％碳酸氢钠、1640+20％小牛血清培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
3、PF1022A多克隆抗体的制备
采用新西兰大白兔作为免疫动物，以半抗原与人血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为1.5mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3-4周取相同剂量免疫原加等量复氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，用硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
4、辣根过氧化物酶标记的抗抗体制备
羊抗鼠抗抗体购自Tiangen公司，羊抗兔抗抗体购自Tiangen公司
将抗抗体与辣根过氧化物酶(HRP)采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。
传统的过碘酸钠法要求反映体系中酶与抗抗体的摩尔浓度比为4:1；由于辣根过氧化物酶在强氧化的作用下产生许多与抗抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体。
本发明利用改良的过碘酸钠法进行了抗体的酶标，其省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少。降低了辣根过氧化物酶：抗抗体的摩尔浓度比率至2:1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶的活性的损失减少。
三、样品中PF1022A的检测
本发明试剂盒可以检测动物组织(如猪、牛、羊、鸡和鸭)和饲料中的PF1022A。
1、样品前处理
向每1.0g动物组织匀浆物中，加入10ml 0.05M硫酸溶液，混匀，置于37℃温箱孵育20-40min，在5-10℃下以3000g以上的速度离心5-15min，取上层液3-5ml，加入140-170ml1.5-2.5M氢氧化钠，混匀，调pH值为6-8，移取液体，加入等体积的复溶液，混匀，取样进行分析；
其中，浓缩复溶液为含有0.5％(w/w)的人血清蛋白，pH为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液。
2、用试剂盒检测
向包被有PF1022A半抗原与牛血清蛋白偶联物的酶标板微孔中加入PF1022A标准品溶液或样品溶液50ul，再加入PF1022A单克隆抗体工作液50ul，用盖板模封板，37℃恒温中反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250ul洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液100ul，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔内液体，重复洗板步骤，每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B四甲基联苯胺(TMB)，轻轻震荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min,每孔加入2mol/L终止液硫酸50ul,轻轻震荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。
3、检测结果分析
用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。
百分吸光度值(％)＝B/B0×100％
公式中B为标准品溶液或样品溶液的平均吸光度值，B0为0μg/L标准品溶液的平均吸光度值。
以PF1022A标准品浓度(μg/L)值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图1。用同样的方法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，可从标准曲线上读出PF1022A的残留量。
四、试剂盒精密度、准确度和保存期检测
1、试剂盒精密度试验
(一)标准品精密度试验：
从实施例1中制备的试剂盒分别取三批次(01批、02批、03批)进行精密度实验，每批试剂盒中各抽取10个试剂盒，从每个试剂盒的酶标板中各抽取20个微孔，测定4.5ug/LPF1022A标准溶液的吸光度值(OD值)，计算变异系数。
实施例1中的三批试剂盒的测定结果如表1所示，表明变异系数范围在19-20％之间。符合精密度小于或等于20％的规定。
表1、标准品可重复性实验(CV％)
(二)样本可重复性试验
每个鸡肉样本按20ug/kg浓度添加PF1022A标准品，分别取实施例1中制备的三个不同批次的试剂盒各三个，每个浓度重复5次，分别计算变异系数。实施例1中的三批试剂盒的测定结果如表2所示，结果表明鸡肉样本变异系数在8.4-17.1％之间，此标准为农业部《农办医《2005》3号文件》关于试剂盒备案标准。
表2、鸡肉样本可重复性试验
1、试剂盒的准确度测定
向不含PF1022A的猪肉、鸡肉、猪肝、鸡肝和牛肉组织中添加PF1022A标准品溶液，使其终浓度分别为4ug/kg(L)和8ug/kg(L)，然后按照实施例1中所述的样本前处理方法进行处理：再用实施例1中所述的试剂盒进行检测，每个浓度做3个平行，分别计算准确度(准确度＝实测值/添加值)。结果如表3所示。结果表明PF1022A以4ug/kg、8ug/kg两个浓度对猪肉、鸡肉、猪肝、鸡肝和牛肉样品添加的准确度在70.9％-98.4％。
表3、试剂盒的准确度
3、试剂盒保存期试验
将实施例1制备的试剂盒分别保存在2-8℃，6个月后，测定试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、PF1022A添加实际测定值均在正常范围内；考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将上述试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明实施例1制备的试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明实施例1制备的试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存6个月以上。
实施例2、以包被原为特异性抗体、酶标记物为酶标半抗原的试剂盒
一、以包被原为特异性抗体、酶标记物为酶标半抗原的试剂盒的检测原理如下：
当在酶标板微孔条上的包被原为PF1022A特异性抗体时，向酶标孔板中加入标准品溶液或样品溶液，再加入PF1022A特异性抗体，样品中残留的PF1022A与酶标记PF1022A半抗原竞争包被在酶标板上的PF1022A特异性抗体，再用显色液显色，样品吸光度与PF1022A的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中PF1022A中PF1022A的残留含量。
二、本试剂盒组成为
1、包被有包被原(包被原为PF1022A单克隆抗体)的酶标板；包被原浓度可以为0.2-0.3ug/ml；
2、酶标记物：酶标PF1022A工作液；标记酶为辣根过氧化物酶。
3、PF1022A标准品溶液6瓶，浓度分别为0ug/L、0.5ug/L、1.5ug/L、4.5ug/L、13.5ug/L、40.5ug/L；配制标准品的溶液为含有0.4％的人血清蛋白、pH为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液。
4、底物显示液由A液和B液组成，底物显示液A为过氧化脲，7ml/瓶，1瓶；底物显示液B液为四甲基联苯胺；7ml/瓶，1瓶；
5、终止液；2M硫酸；7ml/瓶，1瓶；
6、浓缩洗涤液为含有0.7-1.5％牛血清蛋白、40-65％甘油，pH值为9.1-9.6、0.05-0.1mol/L的碳酸盐缓冲液；50ml/瓶，1瓶；所述百分含量为质量百分含量。
7、浓缩复溶液为含有0.5％的人血清蛋白、pH为9.1-9.9、0.05-0.1mol/L碳酸盐缓冲液；400ml/瓶，1瓶；所述百分含量为质量百分含量。
实施例3、包被原为半抗原与载体蛋白偶联物、酶标记物为PF1022A特异性抗体的试剂盒
一、包被原为半抗原与载体蛋白偶联物、酶标记物为PF1022A特异性抗体的试剂盒工作原理：
当在酶标板微孔条上的包被原为半抗原与载体蛋白偶联物时，向酶标孔板中加入标准品溶液或样品溶液，再加入酶标PF1022A特异性抗体溶液，样品中残留的PF1022A与酶标板上包被的PF1022A竞争PF1022A特异性抗体，再用显色液显色，样品吸光度与PF1022A的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中PF1022A中PF1022A的残留含量。
二、本试剂盒组成为
1、包被有包被原(包被原为PF1022A半抗原与载体蛋白偶联物)的酶标板；
2、酶标记物：酶标特异性抗体工作液，标记酶为碱性磷酸酶；特异性抗体为单克隆抗体，有本实验室保藏的对PF1022A药物的单克隆杂交瘤细胞株C-72分泌产生。
3、PF1022A标准品溶液6瓶，浓度分别为0ug/L、0.5ug/L、1.5ug/L、4.5ug/L、13.5ug/L、40.5ug/L；配制标准品的溶液为含有0.4％的人血清蛋白、pH为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液。
4、底物显示液为硝基磷酸盐缓冲液；
5、终止液为1-2mol/L氢氧化钠溶液；
6、浓缩洗涤液为含有0.7-1.5％牛血清蛋白、55％甘油，pH值为9.3、0.1mol/L的碳酸盐缓冲液；50ml/瓶，1瓶；所述百分含量为质量百分含量。
7、浓缩复溶液为含有0.3-0.6％的人血清蛋白、pH为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液；400ml/瓶，1瓶；所述百分含量为质量百分含量。
实施例4、包被原为抗抗体、酶标记物为酶标半抗原
一、包被原为抗抗体、酶标记物为酶标半抗原工作原理：
当在酶标板微孔条上的包被原为抗抗体时，加入PF1022A特异性抗体孵育后，向酶标孔板中加入标准品溶液或样品溶液，再加入酶标PF1022A溶液，样品中残留的PF1022A与酶标PF1022A半抗原竞争PF1022A特异性抗体，再用显色液显色，样品吸光度与PF1022A的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中PF1022A中PF1022A的残留含量。
二、本试剂盒组成为
1、包被有包被原(包被原为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体)的酶标板；包被原浓度可以为0.2-0.3ug/ml；
2、酶标记物：辣根过氧化酶标记的PF1022A
3、PF1022A特异性抗体工作液：特异性抗体为单克隆抗体，有本实验室保藏的对PF1022A药物的单克隆杂交瘤细胞株C-72分泌产生。
4、PF1022A标准品溶液6瓶，浓度分别为0ug/L、0.5ug/L、1.5ug/L、4.5ug/L、13.5ug/L、40.5ug/L；配制标准品的溶液为含有0.4％的人血清蛋白、pH为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液。
5、底物显示液由A液和B液组成，底物显示液A为过氧化脲或过氧化氢，7ml/瓶，1瓶；底物显示液B液为四甲基联苯胺或邻苯二胺；7ml/瓶，1瓶；
6、终止液为1-2mol/L的硫酸或盐酸溶液；
7、浓缩洗涤液为含有0.7-1.5％牛血清蛋白、40-65％甘油，pH值为9.1-9.9、0.05-0.1mol/L的碳酸盐缓冲液；50ml/瓶，1瓶；所述百分含量为质量百分含量。
8、浓缩复溶液为含有0.3-0.6％的人血清蛋白、pH为9.6、0.05-0.1mol/L碳酸盐缓冲液；400ml/瓶，1瓶；所述百分含量为质量百分含量。
Claims (15)
1.一种检测PF1022A的酶联免疫试剂盒，包括PF1022A半抗原及PF1022A的特异性抗体；所述PF1022A的特异性抗体为所述PF1022A的多克隆抗体或单克隆抗体；所述PF1022A半抗原具有如下结构：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述PF1022A半抗原和PF1022A的特异性抗体以下述(1)或(2)任何一种形式存在：
(1)将所述PF1022A半抗原与载体蛋白进行偶联，得到PF1022A半抗原与载体蛋白的偶联物，将其作为包被原，所述特异性抗体进行酶标记后作为酶标记物；
(2)所述特异性抗体为包被原，所述PF1022A半抗原进行酶标记后作为酶标记物。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括抗抗体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PF1022A半抗原和抗抗体以下述(1)或(2)任一种形式存在：
(1)将所述PF1022A半抗原与载体蛋白进行偶联，得到PF1022A半抗原和载体蛋白的偶联物，将其作为包被原，所述抗抗体进行酶标记后作为酶标记物；
(2)所述抗抗体为包被原，所述PF1022A半抗原进行酶标记后作为酶标记物。
5.根据权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述单克隆抗体是对PF1022A半抗原的单克隆杂交瘤细胞株C-72分泌产生的抗体。
6.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PF1022A标准品溶液、显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液；所述浓缩洗涤液为含有0.7-1.5％(w/w)牛血清蛋白、45-60％(w/w)甘油，pH值为9.2-9.5、0.05-0.1mol/L碳酸盐缓冲液；所述浓缩复溶液为含有0.3-0.6％(w/w)的人血清蛋白，pH为9.1-9.9、0.05-0.1mol/L碳酸盐缓冲液。
7.根据权利要求2或4所述试剂盒，其特征在于：所述酶标记中所用的标记酶为辣根过氧化酶或碱性磷酸酯酶。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，当标记酶为辣根过氧化酶时，所述显色液由显色液A液和显示液B组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1-2mol/L硫酸或盐酸溶液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显示剂为硝基磷酸盐缓冲液，终止液为1-2mol/L氢氧化钠溶液。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液为含有1.2％(w/w)牛血清蛋白、50％(w/w)甘油，pH值为9.3、0.1mol/L碳酸盐缓冲液；所述浓缩复溶液为含有0.5％(w/w)的人血清蛋白，pH为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述抗抗体进行酶标记的方法是采用过碘酸钠将所述标记酶与所述抗抗体进行偶联得到酶标抗抗体；优选，所述标记酶与所述抗抗体的摩尔浓度比为2:1。
11.一种检测PF1022A的方法，包括以下步骤：
1)样品前处理：向动物组织匀浆物中，加入0.03-0.07M硫酸溶液，混匀，置于温箱孵育，在5-10℃以不低于3000g的速度离心，取上层液，加入1.5-2.5M氢氧化钠，混匀，调pH值为6-8，移取液体，加入等体积的权利要求5-7中一所述复溶液，混匀，取样进行分析；
2)利用权利要求1-8中任一所述的酶联免疫试剂盒检测1)中所述稀释液；
优选，步骤1)样品前处理方法为：向每1.0g动物组织匀浆物中，加入9-12ml0.03-0.07M硫酸溶液，混匀，置于37℃温箱孵育20-40min，在5-10℃以不低于3000g的速度离心5-15min，取上层液3-5ml，加入140-170ml1.5-2.5M氢氧化钠，混匀，调pH值为6-8，移取液体，加入等体积的权利要求5-7中一所述复溶液，混匀，取样进行分析。
12.一种PF1022A单克隆抗体，其特征在于，所述PF1022A单克隆抗体是由对PF1022A的单克隆杂交瘤细胞株C-72分泌产生的。
13.一种PF1022A半抗原，其特征在于，具有如下结构：
14.一种PF1022A半抗原的制备方法，包括：将PF1022A结构中的两个苯基乳酸的芳香环对位先硝化，然后还原成氨基，得到PF1022A半抗原；其中，PF1022A具有如下结构：
15.一种杂交瘤细胞株C-72，其特征在于，由以下方法制备得到：
(1)将PF1022A半抗原与人血清蛋白偶联为免疫原；
(2)将步骤(1)得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，使其产生多克隆抗血清；
(3)取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按7:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到能稳定分泌PF1022A单克隆抗体对PF1022A单克隆的杂交瘤细胞株，将此细胞株为C-72。
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